Спосіб діагностики аутоімунного гастриту

Спосіб діагностики аутоімунного гастриту, який включає виявлення специфічних для даного захворювання антитіл проти парієтальних клітин шлунка, який відрізняється тим, що додатково оцінюють гістоструктуру слизової оболонки фундального і антрального відділів шлунка, а також в гістологічних зрізах вивчають наявність мікроорганізмів Helicobacter pylori. (19) (21) u200903473 (22) 10.04.2009 (24) 25.08.2009 (46) 25.08.2009, Бюл.№ 16, 2009 р. (72) ГАЙДАР ЮРІЙ АДОЛЬФОВИЧ, ОСТРОВСЬКИЙ ОЛЕКСІЙ СТАНІСЛАВОВИЧ, ЗАК МАКСИМ ЮРІЙОВИЧ, ЧЕЛКАН ВІРА ВОЛОДИМИРІВНА (73) ДЕРЖАВНА УСТАНОВА ІНСТИТУТ ГАСТРОЕНТЕРОЛОГІЇ АМН УКРАЇНИ 3 робка і вдосконалення діагностики аутоімунного гастриту з урахуванням структури слизової оболонки є актуальним завданням медичної науки. Відомий спосіб діагностики аутоімунного гастриту, заснований на застосуванні непрямої реакції для виявлення в плазмі крові аутоантитіл к парієтальним клітинам шлунка [Пат 23700А Укр. МПК А61 В 10/00. Спосіб діагностики аутоімунного гастриту. Опубл. 31.08.98, Бюл. №4.]. Цей спосіб як найближчий за суттєвими ознаками обраний за прототип. Недоліками прототипу є відсутність оцінки індивідуальних гісто-топографічних особливостей будови слизової оболонки шлунка та неможливість оцінити внесок інфекції Helicobacter pylori в розвиток структурних пошкоджень слизової оболонки шлунка. В основу корисної моделі поставлено завдання розробити спосіб, що дозволяє індивідуалізувати діагностику захворювання, враховуючи особливості гістологічної побудови слизової оболонки фундального і антрального відділу шлунка і врахувати вплив мікроорганізмів Helicobacter pylori на структуру слизової оболонки шлунка, що дозволить підвищити точність і надійність діагностики. Поставлене завдання вирішується шляхом використання непрямої реакції імунофлюоресценції для виявлення аутоантитіл к парієтальним клітинам шлунка, вивченню гістоструктури слизової оболонки головних відділів шлунка - фундального і антрального (для діагностики ступеню атрофії, наявності метаплазії і дисплазії слизової оболонки шлунка). При співставленні відомого способу (прототипу) і пропонованого способу діагностики аутоімунного гастриту виявлені загальні ознаки: - як джерела антигенів використовують кріостатні зрізи слизової оболонки фундального відділу шлунка людини чи лабораторного щура; - для виявлення антитіл проти парієтальних клітин використовують непряму реакцію імунофлуоресценції. Відмінні ознаки заявленого способу діагностики від способу-прототипу: - оцінюється гістоструктура слизової оболонки фундального і антарального відділу шлунка для виявлення ступеню атрофії, наявності метаплазії і дисплазії, - в гістологічних зрізах вивчається наявність мікроорганізмів Helicobacter pylori. Відзначена сукупність ознак, які характеризують заявлений спосіб, в відомій техніці не виявлена. Суть способу не випливає з відомою рівня техніки. Таким чином, заявлений спосіб відповідає критеріям патентоздатності, новизни і винахідницького рівня. Заявлений спосіб діагностики здійснюється таким чином: 1. Кусочки слизової оболонки фундального відділу шлунка людини або білого лабораторного щура розміром 0,5´0,5мм фіксують в 4% розчині параформальдегіду, при кімнатній температурі, протягом 4-х годин. 2. Після фіксації тканинні блоки відмивають в трьох порціях забуференого фізіологічного розчи 43699 4 ну (ЗФР), рН=7,4, протягом 15 хвилин і занурюють в рідкий азот на 5 хвилин. 3. Із фіксованої тканини слизової оболонки фундального відділу шлунка готують кріостати! зрізи товщиною 5-8мкм. Зрізи розташовують на обезжиреному предметному склі. 4. На зрізи наносять сироватку крові досліджуваного хворого, розбавлену в 20 раз ЗФР. Інкубацію зрізів з сироваткою крові проводять у вологій камері, при кімнатній температурі, протягом однієї години. 5. Після споліскування в дистильованій воді зрізи відмивають в трьох порціях ЗФР протягом 15 хвилин. 6. Надлишки ЗФР видаляють і на зрізи наносять антитіла проти імуноглобулінів крові людини, мічені флуорохромом. Інкубацію зрізів з міченими антитілами проводять у вологій камері, при кімнатній температурі, протягом однієї години. 7. Після інкубації зрізи відмивають в трьох порціях ЗФР на протязі 15 хвилин. 8. На зрізи наносять 50мкл забуференого гліцерину (1 частина гліцерину і 3 частини ЗФР) і вивчають за допомогою люмінесцентного мікроскопу. При імунофлуоресценції секреторних канальних парієтальних клітин шлунка діагностують аутоімунний хронічний гастрит (хронічний гастрит типу А). Для проведення контрольної реакції використовують сироватку крові донорів, яка не містить циркулюючих антитіл. Для вивчення гістологічної побудови слизової оболонки шлунка біоптати отримували у хворих під час планових езофагогастродуоденоскопій. Матеріал фіксували в розчині 10% нейтрального формаліну. Біоптати проводили по стандартній схемі і заключали в парафін. Тонкі гістологічні зрізи товщиною 3-5мкм фарбували гематоксіліном та еозіном. Мікроорганізми Helicobacter pylori виявляли в зрізах біоптатів пофарбованих 1% розчином толуідінового синього. Обстежено 140 хворих які знаходяться на лікуванні в клініці інститута. Аутоімунний гастрит знайдено у 12 пацієнтів, з них мікроорганізми Helicobacter pylori знайдені у 8 випадках (75% спостережень). Розпізнавали три типу змін гістоструктури слизової оболонки. Перший тип супроводжувався високою частотою зустрічаємості мікроорганізмів Helicobacter pylori, явищами глибокого хронічного гастрита, збереженням структури слизової оболонки, частою зустрічаємістю поодиноких лімфатичних фолікулів і мітозів в камбіальній зоні залоз. В слизовій оболонці антрального відділу шлунка домінували явища поверхневого гастрита. Другий тип змін слизової оболонки характеризувався інфікуванням шлунка мікроорганізмами Helicobacter pylori, помірною атрофією слизової оболонки фундального відділу шлунка з /без вогнищевою кишковою метаплазією, активацією лимфоїдної тканини шлунка. В антральному відділі шлунка з рівною частотою виявлявся поверхневий гастрит, легкий або помірний атрофічний гастрит. Третій тип змін слизової оболонки характеризувався атрофічним пангастритом асоційованим з Helicobacter pylori і супроводжувався явищами багатовогнищевої кишкової метаплазії. Спостері 5 43699 гаємі типи змін слизової оболонки шлунка розцінюються нами як послідовні стадії розвитку аутоімунного гастриту. Використання заявленого способу ілюструється наступним прикладом. Хвора P., 45 років. Попередній клінічний діагноз: хронічний гастрит з зовнішньосекреторною недостатністю. Макроцитарна анемія. Дані серологічного дослідження: в плазмі крові знайдені аутоантитіла к парієтальним клітинам шлунка. Гістологічне дослідження: тяжка атрофія слизової оболонки фундального відділу шлунка; Комп’ютерна верстка А. Крижанівський 6 помірна атрофія слизової оболонки антрального відділу шлунка. В відбитках біоптатів шлунка знайдені мікрооганізми Helicobacter pylori. Заключний діагноз: аутоімунний гастрит, Helicobacter pylori асоційована форма. Стан перніциозної анемії. Таким чином заявлений спосіб підвищує чутливість і специфічність результатів досліджень, забезпечує високу точність діагностики даного захворювання. Спосіб промислове здійснимий і може бути використаний в практичній охороні здоров'я. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601