Штам бактерій enterococсus faecium нм-5 для виготовлення бактерійних препаратів

Штам Enterococcus faecium для виготовлення бактерійних препаратів, депонований у Депозитарії Інституту мікробіологи і вірусології НАН України під номером 1MB В-7029. Корисна модель належить до мікробіологи, конкретніше до штамів мікроорганізмів, утримування або консервування мікроорганізмів і може бути використаний для виробництва біологічно активних добавок антагоністичних бактерійних препаратів тощо. Ентерококи широко поширені у природі; живуть у кишечнику різних хребетних. Вони належать до умовно патогенних мікроорганізмів УПМ, які можуть вступати з організмом людини або у відношення, що є корисними для обох, або в конкурентні взаємини, коли мікроорганізм викликає захворювання макроорганізму. В організмі людини УПМ є представниками постійної мікрофлори. Здатні виявляти патогенні властивості тільки при зниженні імунозахисних функцій організму. Клінічна картина захворювання, що викликане УПМ, мало специфічна і залежить більше від ураженого органу, ніж від етіологічного агента Ефективність лікування таких захворювань антибіотиками низька, бо УПМ проявляють високу стійкість до антибіотиків. УПМ генетично неоднорідні, мають велике число варіантів, що відрізняються за патогенністю Така відмінність УПМ за патогенністю знайшла використання для лікування та профілактики захворювань, що викликані УПМ' в організм хворого вводять непатогенні форми УПМ, які поступово заміщають патогенні форми. Тому актуальною проблемою є пошук, виділення та концентрування непатогенних форм УПМ. Раніше ентерококи систематизували як стрептококи групи D. Порівняно недавно (з 1984року) вони виділені в окремий рід Enterococcus. Відомі представники роду Enterococcus Enterococcus faecium (Медицинская микробиология / Гл. ред В.И. Покровский, O.K. Поздеев - М.: ГЭО-ТАР МЕДИЦИНА, 1999. - 1200 с : стр. 206 207). Бактерії мають овальну форму розміром 0,62,0х0,6-2,5мкм, у мазках з культур, вирощених на рідких середовищах, розташовуються парами або короткими ланцюжками. Спор не утворюють, обмежено рухливі, капсул не мають. Факультативні анаероби. Розщеплюють різні вуглеводи з утворенням кислоти (переважно молочної) без газу. Ростуть в інтервалі 10-45°С (оптимум - при 37°С). Enterococcus faecium входять до складу мікрофлори ротової порожнини, кишечнику і сечостатевої системи дорослих. Е. faecium виділяють з випорожнень у 25% КЛІНІЧНО здорових осіб. Проте ентерококи часто викликають ураження сечостатевої системи в пацієнтів з довгостроково функціонуючими катетерами, подібні ураження в клінічно здорових осіб спостерігають значно рідше. Також вони викликають 10-20% усіх бактеріальних ендокардитів, які частіше реєструють в осіб похилого віку з різною патологією, у наркоманів і в осіб, яким потрібні регулярні внутрішньовенні ін'єкції, і 5% бактерієнмій. За прототип вибрано відомий штам непатогенних ентерококів, що депонований у колекції культур промислових мікроорганізмів ВНИИгенетика під номером В-4054 (А. с. СРСР №1497211, СО О) 4t CM 2493 4 МПК C12N1/20, А61К39/09 // (C12N1/20, G12R1 46) ЗО 07 88, бюл №28) Цей штам виділений з кишечнику здорової людини і характеризується наступними властивостями Культурально-морфолопчні властивості КЛІТИНИ КОКОВИДНОІ форми, розташовуються в мазку попарно або короткими ланцюжками, грампозитивні, спор і капсул не утворюють При рості в м'ясопептонному бульйоні з глюкозою і дріжджовим екстрактом (МПБ) дають рівномірне помутніння й осад На щільному середовищі (кров'яний агар, м'ясо-пептонний агар) ростуть у вигляді непрозорих сіруватих колоній з рівними краями діаметром 1-2мм Колони легко знімаються з агару, рівномірно емульгуються у фізіологічному розчині хлористого натрію На середовищі Калини ростуть у вигляді блакитних непрозорих колоній з рівними краями ФІЗІОЛОГІЧНІ властивості Аероби, при культивуванні в МПБ при 37°С через 18-20 год після посіву в 1 мл середовища виростає 510s—1 109 живих клітин В міру росту культури знижується рН середовища, кислотність по Тернеру за 24год культивування досягає 250-270Т БІОХІМІЧНІ властивості Зброджує мальтозу, целобіозу, сахарозу, лактозу, маніт, саліцин, манозу, L-арабінозу, не зброджує D-арабінозу, сорбіт, рафінозу, рамнозу, гліцерин, ксилозу, інозит, дульцит Штам добре росте на середовищах з додаванням жовчі Не дає гемолізу при рості на кров'яному агарі СТІЙКІСТЬ штаму ВКПМ № В-4054 до антибіотиків Мінімальна інгібуюча концентрація, мкг/мл лінкоміцин 1,0, левоміцетин 10,0, нітроксолін 100,0, гентаміцин 4,0, ністатин 100,0, олеандоміцин 1000,0, пол їм ікси н 5000,0, канамщин 10000,0, клафоран 1000,0, ампіцилін 1,0 Штам має антагоністичну активність стосовно St aureus, Klebsiella oxytoca, E coll Om, Sh Zonnae, Pr mirab Склад середовищ для вирощування М'ясо-пептонний бульйон 1л Глюкоза 10г Дріжджовий екстракт 20г рН 7,0-7 4 Стерилізація ЗОхвил при 0,5атм Середовище Brain Heart Infusion (Difco) Середовище Brain Heart Infusion (Difco) з додаванням 2% агару Середовище Калини/ Кров'яний агар Лабораторна перевірка показала непатогенність для експериментальних тварин (мишей, пацюків, морських свинок), а також для людей Препарат з ентерококів може бути отриманий у ліофілізованому вигляді (ампули, флакони, таблетки) Причинами, що перешкоджають одержанню потрібного технічного результату є географічна віддаленість від України місця створення прототипу і, відповідно, проблематичність ефективного використання прототипу в регіонах Україні В основу корисної моделі поставлено задачу віднайти такий штам виду Enterococcus faecium для виготовлення бактерійних препаратів, який здатний бути ефективним пробютиком для регіонів України при лікуванні дисбактеріозі в і хвороб, обумовлених порушеннями нормального балансу мікрофлори організму Поставлена задачу вирішує штам Enterococcus faecium HM-5 для виготовлення бактерійних препаратів, депонований у ДепозитарГі Інституту мікробіологи і вірусологи НАН України під номером 1МВВ-7029 Далі наведено ВІДОМОСТІ про штам, що заявляється Штам Enterococcus faecium HM-5 ідентифіковано і вивчено авторами в лабораторії науковометодичного центру «Бюкорекція» м Київ, узвіз Прота-сів Яр Штам Enterococcus faecium HM-5 депонований у Депозитарії Інституту мікробіологи і вірусологи НАН України під номером 1MB В-7029 26 червня 2002 року Родовід штаму Штам ізольований у 2001 році в лабораторії «Бюкорекція», м Київ із мікрофлори кишкового тракту підлітка Спосіб одержання штаму Штам культивований в поживному середовищі МПА шляхом пересівів з окремих колоній 1-2 рази на тиждень з експозицією в термостаті при 38±0,5°С Клонування проведено двадцятьма пасажами з уокремлених колоній з розведення щільного росту, яке відповідає 1 100млн Штам виявив антагонізм до поширених умовно-патогенних та патогенних мікробів, має високий рівень адгезії до слизової оболонки кишечнику, достатню для виробництва швидкість накопичення біомаси Культурально-морфолопчні та фізюлогобюхімічні особливості штаму Морфологія Грампозитивні коки 0,3-1,0мкм діаметром, ІНОДІ витягнуті у напрямку ланцюжків до 1,2мкм, розміщуються попарно, групами і ланцюжками (останні превалюють при рості у рідкому та напіврідкому середовищі) Нерухомі, спор не утворюють Культуральні властивості Штам Enterococcus faecium HM-5 є факультативним анаеробом При вирощуванні на поверхні живильних агаризованих середовищ (МРС, МПА) утворюються білуваті круглі блискучі колонії з рівними краями діаметром 0,5-1,0мм Глибинні колони мають вигляд білих дисків діаметром до 1мм У бульйоні утворюють однорідну каламуть Фізюлого-бюхімічні властивості Желатину не розріджують, утворюють аміак із аргініну Не містять каталази, не утворюють індол, не мають нітрат-редуктази Ростуть при 40% жовчі, при 6,5% NaCI, при рН 9,6, при температурі +10, +15, +45 та слабо при +50°С Молоко сквашують Гідролізують ескулін, не гідролізують крохмаль Виживають у рідкому середовищі при рН 7,0 після прогріву при 60°С протягом ЗО хвилин Не гемолітичні Хороший ріст в зоні 25-45°С, Оптимум росту - при 37°С Оптимальне для росту значення рН 6,3-6,6 Зброджують вуглеводи до лактату без продукування вуглекислого газу Зброджують широкий спектр вуглеводів і спиртів глюкозу, лактозу, галактозу, мальтозу, манозу, трегалозу, фруктозу, саліцин, сахарозу, целобіозу, маніт, гліцерин, Не зброджують рамнозу, сорбіт Галузь використання штаму штам призначений для виготовлення бактерійних препаратів, сумішей і біологічно активних добавок, що вихори 2493 стовуються для корекції порушень мікробіоценозів І лікування кишкових захворювань людей І свійських тварин. Продукти, що синтезуються штамом. Молочна кислота при зброджуванні вуглеводів, чинники мікробного антагонізму. Антагоністична активність штаму. Для визначення антагоністичної активності штаму було застосовано метод його вирощування на агарових платівцях. Штам рискою засівали на поверхню агару і через добу перпендикулярно до нього на відстані не більше 1-2мм стрічками засівались штами, що випробовувались. Склад агару для випробування антагоністичної дії відповідав складові середовища МПА. Результати наведені в таблиці 1. Специфічна активність в кишечнику (рівень адгезїї штаму до поверхні слизової оболонки (рівень гістадгезії) експериментальних тварин). Рівень адгезії (гістадгезії) клітин кишкових мікробів, зокрема ентерококів Enterococcus faecium HM-5, характеризує їх колонізаційну активність. Рівень адгезії' визначали на свіжоекстірпованих кишечниках мишей за методом В. П. Жалко-Титаренко, В.М. Бондаренко, А.В. Григор'єва, Л.Г. Кулчинського. Метод складається з 9 окремих стадій: - готування мікробної суспензії; - передопераційної підготовки тварини; - евтаназія; - препарування кишечнику, його канюлізація; - введення мікробної суспензії; - витримування при зниженій температурі; - відмивання; - триптична дезінтеграція; - посів. Таблиця 1 Антагоністична активність штаму Enterococcus faecium HM-5 Таблиця 1 Назва виду і штаму Е. соїі 026 F У41 Е. coliOnrstoken" Е. coli Aberdin S. sonnet 17 ( req. N 100033) S. flexneri 2a (reg N 100035) K. pneumoniae ATCC 13885 S. typhi 562 (свіжовиділений) P. mirabilis F 458 P. vulqaris U 8 P. vulqaris F 295 A S. aureusATCC6538 Відстань пригнічення, у мм 4-5 5-6 5-7 4-5 3-4 5-6 3-4 4-5 6-7 5-7 6-8 Результати розраховували за формулою В. Жалко-Титаренко: г m a x _ m V " 1-а ' де: C m a x - рівень гістадгезії в кількостях КУО на мм 2 поверхні слизової, m - концентрація мікробів в дезінтеграті, V - об'єм дезінтеграту, І - довжина екстірпованого відрізка кишки, а - ширина екстірпованого відрізка кишки. Гістадгезійна активність штаму залежить від концентрації Enterococcus faecium HM-5 в порожнині кишки - К, за співвідношенням: Cmax-U-K де: U - коефіцієнт гістадгезії, що обчислюється за результатами досліду за формулою: к Специфічна, колонізаційна (гістадгезійна) активність штаму наведена в таблиці 2. Таблиця 2 Гістадгезійна активність штаму Enterococcus faecium HM-5 Концентрація бактерій штаму Середнє значення коефіцієнту Рівень гістадгезії, в КУО на кв.см слизової вмлн/мл гістадгезії U 420±20 0,1 1,0 5440+270 0,31±0,15 10,0 22900±1200 100,0 243000±12000 Для визначення конкурентноздатності штаму за сайти адгезії в кишечнику обчислено показник конкуренції порівняно з вірулентними шигелами Флекснера, що мають U = 0,03 : показник конкуренції: Цштаму) = 0,31 ІДшигель) 0,03 Це означає, що штам перевищує пстадгезивну потужність збудника дизентерії у 10 разів. Репродуктивна активність. Штам досягає максимальної' концентрації при репродукції' у флаконах з середовищем МПА на другу добу вирощування. Довгострокове зберігання штаму. Для довгострокового зберігання штаму необхідно його ліофілізувати за стандартною технологією, що використовується для випуску сухих бактерійних препаратів. Тимчасове продовжене зберігання протягом тижня, до місяця включно припустимо у пробірках з середовищем МПА або МРС під шаром вазелінової олії в рефрижераторі з температурою не нижче +5°С. Для ліофілізації беруть культуру штаму, вирощену в середовищі при 37 39°С протягом 2-х діб. До взятого об'єму культури додають свіжовиготовлене середовище висушування в кількості 33%. Середовище висушування складається з трьох рівних частин по 50мл: знежи 2493 реного молока-«обрату»; розчину 31,5г сахарози у дистильованій воді; розчину 4,5г желатини у дистильованій воді (желатину для набухання витримують у теплій воді 1-2 години). Компоненти нарізно стерилізують в автоклаві 30хв. при 110°С, змішують в теплому стані і додають до культури при 37-39°С. Режим висушування: заморожування під вакуумом до -45°С, ступінчасте підвищення температури по 5°С на годину до +22 - +24°С, досушування протягом 12 год. Спосіб, умови та склад середовища для культивування штаму Штам культивують в середовищах за відомими стандартними рецептурами. Основою культивування є ряд пробірок з відповідним середовищем по 9 мл, що попередньо бажано регенерувати. Колонія штаму вноситься в першу пробірку ряду, ретельно перемішується. Матеріал з першої пробірки далі переноситься в наступні по Імл (серійні десятикратні розведення). Температура культивування 38±0,5°С. Для одержання штаму з наданих Депозитарієм флаконів, культура оживлюється регідратуванням шляхом додавання 5 мл фізіологічного розчину хлориду натрію або поживного середовища. Після цього матеріал серійно розводять по 1 мл в рядах з 9 пробірками по 9мл, середовища в кожній і термостатують з щоденною перевіркою протягом 4 днів. Генетичні особливості штаму. Штам генетичне однорідний. Штам чутливий до деяких антибіотиків: гентаміцину, тетрацикліну, ампіциліну, карбеніциліну, рифампіцину, цефазоліну, мономіцину, канаміцину. Штам резистентний до нітроксоліну, налідиксової кислоти, цефтріаксону, левоміцетину, оксациліну, еритроміцину, поліміксину, тетрацикліну, лінкоміцину, ванкоміцину. Відомості про патогенність. Щоб підтвердити відсутність патогенної дії Enterococcus faecium НМ-5 на теплокровні лабораторні тварини для досліджень брали максимальні дози клітин. Перевірку патогенних властивостей штаму виконано з використанням безпородних білих мишей вагою 20±2 г шляхом введення суспензій клітин внутрішньочеревинно в ін'єкціях. Нагляд за тваринами, які були протягом 15 діб адаптовані до умов утриман 8 ня, проводили щоденно протягом 15-20 днів після ін'єкцій. Визначали вірулентність суспензії активних клітин, отриманих при культивуванні штаму в аеробних умовах протягом 24 годин на агаризованому живильному середовищі (МРС) при температурі 37±1°С. Суспензію готували на стерильному фізіологічному розчині, концентрацію клітин визначали за допомогою оптичного стандарту мутності та контролювали титруванням. Суспензію клітин вводили внутрішньочеревинно в ін'єкціях. Через 15-20 діб після зараження проводили мікроскопічні дослідження зразків тканин внутрішніх органів тварин за допомогою фарбування препаратів матеріалу та висівів на живильний агар. В період спостереження після вводу суспензії живих клітин бактерій (внутрішньочеревинно) всі тварини були активними, добре поїдали корм, фізіологічні відправлення у них не порушувались, поведінкові реакції були звичайними, змін з боку хутряного покрову не помічено. Клінічних ознак токсикозу не відмічено. Була відсутня достовірна різниця в масі тіла та температурі дослідних і контрольних тварин, а також в загальному стані та поведінці. Мікробіологічні дослідження внутрішніх органів дослідних тварин через 19 діб після початку дослідупоказали, внутрішньочеревне введення суспензії живих клітин культури не приводило до інвазії бактерій у внутрішні органи тварин та не спричиняло їх захворювання. Результати наведено у таблиці 3. Отримані результати свідчать про авірулентність Enterococcus faecium НМ-5 для досліджених теплокровних тварин. Не відмічено випадків захворювання чи загибелі мишей, які б перевищували контрольний рівень при введенні суспензії клітин бактерій (5,0 млрд. клітин/мишу) внутрішньочеревинно. Всі миші і контрольні в тому числі, які залишились живими після закінчення терміну спостережень, були вбиті. Провели їх розтин і дослідження внутрішніх органів. Відсутність інфекційної патології і ознак ураження дослідних тварин було підтверджено при макроскопічному вивченні внутрішніх органів. Таблиця З Результати дослідження вірулентності штаму Enterococcus faecium НМ-5 Кількість Дослід: Матеріал для ввемишей, дення штук Доза мл млрд. клітин Кількість мишей Вижило Загинуло Курс введення, діб Захворіло штук штук штук Суспензія активних 24ГОДИННИХ КЛІТИН 10 0,5 5,0 1 0 0 10 Контроль:Фізіологічний розчин 10 0,5 0 1 0 0 10 Результати розтину показали: - серце звичайної форми і розміру; - легені в об'ємі не збільшені, долі легко відокремлюються одне від одного, поверхні гладенькі, спайок не відмічено; - шлунок, петлі тонкого і товстого кишечнику зовні є звичайними, на розрізі малюнок слизової незмінений; - печінка темно-червоного кольору, нормальної консистенції, середнього кровонаповнення, не збільшена, поверхня гладенька; - нирки звичайних розмірів і форми, поверхні гладенькі, на розрізі чіткий малюнок коркової і мозкової речовини; 2493 10 - селезінка не збільшена, консистенція туга, на бактерійний препарат містив 1 108 КУО/r непаторозрізі пульпа помірно повнокровна і темного когенних бактерій Enterococcus faecium HM-5. льору. Приклад 2. Таким чином, отримані результати показують, Виготовлення двохкомпонентного бактерійнощо штам Enterococcus faecium HM-5 належить до го препарату. Одержану за прикладом 1 біомасу групи непатогенних авірулентних мікроорганізмів у непатогенних бактерій Enterococcus faecium HM-5 відповідності з такими нормативними документазмішували у співвідношенні 1:1 з біомасою штаму ми: непатогенних бактерій Eschenchia coil HM-2, що Методические указания по гигиенической оцедепонований у Депозитарії Інституту мікробіології і нке микробных средств защиты растений от насевірусологи НАН України під номером 1 MB B-7049, комых и болезней на основе неспорообразующих дата надходження 27 червня 2002 року. Одержану микроорганизмов. Киев, 1982. суміш мікроорганізмів суспендували у стерильноМетодические указания по экспериментальму водному розчині захисного середовища, що ному обоснованию ПДК микроорганизмовмістить 5% сухого знежиреного молока, 8% сахапродуцентов и содержащих их готовых форм прерози, 4,5% натрію лимоннокислого. Одержану тапаратов в объектах производственной и окружаким чином суспензію заморожували в морозильній ющей среды М , 1991. шафі при температурі мінус (35±5)°С і висушували в сублімаційній сушарці. Далі наведено приклади використання штаму, Приклад 3. що заявляється. Приклад 1. Виготовлення біологічно активної добавки. ЛіВиготовлення бактерійного препарату. Для наофілізовану суміш непатогенних бактерій копичення біомаси мікроорганізмів виготовляли Enterococcus faecium HM-5 та Eschenchia coli HMсередовище культивування, основою якого є від2, що була одержана за прикладом 2 змішували із новлене знежирене молоко, білки якого гідролізостеаратом кальцію, цукром молочним і порошком вані протосубтиліном, з додаванням лактози, лилистя та стебел Silybum marianum у такому співмоннокислого натрію, сірчанокислого заліза та відношенні, % мас: стимуляторів росту. У підготовлене поживне серелюфілізована суміш мікроорганізмів довище вносили посівний матеріал. Посівна доза Enterococcus faecium HM-5 і Escherichia Enterococcus faecium HM-5 у ферментер становиcoli HM-2 10,0, ла 7%. Інокулят бактерій Enterococcus faecium HMстеарат кальцію 1,0, 5 готували на стерилізованому знежиреному моцукор молочний 20,0, лоці з посівною дозою 1% при температурі порошок листя та стебел Silybum 37±1°С протягом 16 годин. Накопичену біомасу marianum 69,0. мікроорганізмів відокремлювали від культуральноВиготовлена біологічно активна добавка - сіго середовища на центрифузі, суспендували у рувато-зелений порошок, з характерним приємним стерильному водному розчині захисного середосмаком і запахом. За мікробіологічними показнивища, що містить 5% сухого знежиреного молока, ками біологічно активна добавка відповідає таким 8% сахарози, 4,5% натрію лимоннокислого. Одервимогам: загальна кількість життєздатних мікрооржану таким чином суспензію заморожували в моганізмів становить 1-Ю6 КУО/г. розильній шафі при температурі мінус (35±5)°С і висушували в сублімаційній сушарці. Одержаний Комп'ютерна верстка Н. Лисенко Підписне Тираж 38 прим. Міністерство освгти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м. Київ, МСП, 04655, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул. Сім'ї Хохловпх, 15, м. Київ, 04119