Спосіб ідентифікації клітин купфера люмінесцентним методом із використанням наночастинок напівмагнітного напівпровідника

Спосіб ідентифікації клітин Купфера люмінесцентним методом шляхом реєстрації люмінесцен 3 зрізи тканини, після чого реєструють люмінесцентний сигнал адсорбованого біосенсора при опроміненні в діапазоні 400-440нм із селективним виявленням клітин Купфера. Спільними ознаками прототипу та способу, що заявляється, є візуаліза-ція досліджуваних структур люмінесцентним методом. Корисна модель відрізняється від прототипу тим, що джерелом 45028 4 люмінесцентного сигналу є на-ночастинки напівмагнітного напівпровідника Cdi.xMnxS, які наділені функціональними перевагами, спрощується методика обробки зрізів, зменшуються фінансові затрати. Порівняння способу, що заявляється, та способу-прототипу, подано у таблиці. Таблиця Спосіб ідентифікації клітин Куп- Спосіб ідентифікації клітин Купфера фера (прототип) (спосіб, що заявляється) Два типи антитіл та люмінесценСенсорний матеріал Один тип наносенсора тна мітка Нанесення сенсорного матеріала багатоступеневе одноступеневе Тип джерела люмінесцентного сигТрьохкомпонентна напівпровідникоОрганічна молекула налу ва наночастинка Характеристики люмінесцентого сигналу а) спектр збудження вузький широкий б) фотостабільність слабка значна в) можливість регулювати емісійвідсутня складом, розмірами наночастинок ним спектром Ознака Теоретичне підґрунтя для використання способу. Неорганічні наночастинки є важливими складовими для утворення різноманітних функціональних надструктур. Розміри їх можуть складати від одиниць до сотень нанометрів. Вони наділені багатьма специфічними оптичними й електронними властивостями, які залежать від їх розмірів, форми, складу та мають передбачуваний характер [В.А.Олейников, А.В.Суханова, И.Р.Набиев Флуоресцентные полупроводниковые нанокристаллы в биологии и медицине / ж. Российские нанотехнологии.- Т. 2, №1-2.- 2007.- С.160-173; Aihua Fu, Weiwei Gu, Carolyn Larabell and A Paul Alivisatos Semiconductor nanocrystals for biological imaging / Current Opinion in Neurobiology. - 2005. -V.15.p.568-575]. Розміри субклітинних структур співрозмірні з розмірами наночастинок, що спонукає до використання їх як нанозондів, які дозволяють проводити дослідження на клітинному рівні. Одним із чутливих методів дослідження біологічних об'єктів є флюо-ресцентний аналіз. [Alexander P. Demchenko Introduction to Fluorescence Sensing / Springer. 2009.-586р.]. Дослідження показали, що напівпровідникові квантові точки мають значні переваги над стандартними фарбуючими речовинами: збуджуються широким спектром довжин хвиль, що дозволяє при одному джерелі збудження отримувати різні спектри випромінювання; наділені значною фотостабільністю; їх спектри випромінювання, які регулюються розміром і складом наночастинок, є вузькими та симетричними; мають мінімальну інтерференцію від натуральних автофлюоресцентних частинок [Robert E.Bailey, Andrew M.Smith, Shuming Nie_Quantum dots in biology and medicine / Physica E.- 2004. - V.25.- p.1-12; Alivisatos P. The use of nanocrystals in biological detection / Nature Biotechnology .-2004.-V.22.-p.47-52]. Використання напівпровідникових наночастинок у візуалізації біологічних об'єктів має обмеження, що пов'язано з отриманням біосумісних нанок-ристалів. Зокрема, різка зміна умов часто призводить до деградації та дезактивації чутливих біологічних компонентів, і обмінні реакції на поверхні наночасток часто утруднюють формування стабільних біокон'югатів, змінюють хімічний та фізичний стан поверхневих атомів наночастинки, що в багатьох випадках зменшує квантовий вихід люмінесценції наночастинок, а також призводить до перетворень, які сприяють їх агрегації та осадженню [Eugenii Katz and Itamar Willner Integrated Nanoparticle-Biomolecule Hybrid Systems: Synthesis, Properties, and Applications Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 6042 -6108; Christof M. Niemeyer Nanoparticles, Proteins, and Nucleic Acids: Biotechnology Meets Materials Science / Angew. Chem. Int. Ed. 2001, 40, 4128 - 4158]. Спосіб, що заявляється, здійснюється наступним чином. Метод обробки тканин перед нанесенням біосенсорів полягає у наступному. Застосований спосіб обробки тканини, який мінімально змінює її хімічні та структурні властивості, зокрема, дозволяє зберегти придатними для виявлення більшість антигенів [Эллиниди В.Н., Аникеева Н.В., Максимова Н.А. Практическая иммуногистоцитохимия (методические рекомендации). -СПб. - 2002. - 38с] і сульфгідрильних груп білкових молекул з можливістю їх тривалої консервації у парафінових блоках. Основні принципи зазначеного способу обробки тканини полягають у: 1) фіксації тканини у забуференому (рН=7,0) фосфатним буфером за Ліллі 10%-му розчині формаліну впродовж 22 годин (триваліший час обро 5 45028 бки у формаліні призводить до артефактів структури більшості антигенів), 2) прискореному зневодненні у висхідній батареї спиртів, 3) просочуванні у парафіні притемпературі 58°С (вищі значення температури можуть викликати небажані зміни структури антигенів). Гістологічні зрізи 5мкм завтовшки отримували за допомогою санного мікротому МС-2. Нанесення біосенсорів на гістологічний зріз проводять наступним чином. Гістологічний зріз повністю покривають колоїдом із наночастинок. Тривалість експозиції в межах 5-10хв. Після експозиції гістологічний зріз промивають дистильованою водою, просушують. Фотолюмінесцентні дослідження оброблених гістологічних зрізів виконують з використанням мікроскопа ЛЮМАМ-Р-8, цифрової фотокамери Olympus C740UZ, люмінесцентного об'єктиву Л40х. Приклад практичного використання способу. З використанням способу, який заявляється як корисна модель, було проведено дослідження гістологічних препаратів печінки померлих плодів та померлих новонароджених. Зелене світіння повністю відповідало локалізації та формі клітинам Комп’ютерна верстка О. Рябко 6 печінки, які за морфологічними ознаками ідентифіковані як гепатоцити і еритроцити. Спектральний діапазон зображення знаходився в області зеленого кольору (біля 500нм). Спостерігалося також яскраве червоне світіння об'єктів. З урахуванням їх локалізації (стінка синусоїдів), розмірів, кількості у одиниці площі зрізу, поліморфізму контурів дані об'єкти відповідають клітинам Купфера (зірчастим ретикулоендотеліоцитам) та їх відросткам. Для усунення суб'єктивності в оцінці кольору забарвлення здійснено спектральний комп'ютерний аналіз ділянок зображення у системи RGB. Ідентифікацію клітин Купфера здійснювали з урахуванням сучасних уявлень про будову печінки [Серов В.В., Лапиш К. Морфологическая диагностика заболеваний печени / АМН СССР.М.Медицина, 1989, 336с]. Для порівняння використовували гістологічні зрізи печінки досліджені методиками вибраними в якості аналога і прототипу. Технічний результат: використання способу, що заявляється, дозволяє здійснити морфологічну оцінку стану печінки по кількості та розташуванні клітин Купфера. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601