Спосіб прогнозування перебігу захворювання у хворих на рак шлунка

Спосіб прогнозування перебігу захворювання у хворих на рак шлунка, що включає визначення рівней активності желатинази А, який відрізняється тим, що дослідний матеріал отримують неінвазивним методом і в ньому визначають співвідношення активних і латентних форм желатиназ А та В, і при показниках співвідношення, нижчих за 0,2 для желатинази А та 0,5 для желатинази В, прогнозують сприятливий перебіг захворювання, а при вищих за 0,2 для желатинази А та 0,5 для желатинази В - несприятливий. (19) (21) u200906894 (22) 01.07.2009 (24) 11.01.2010 (46) 11.01.2010, Бюл.№ 1, 2010 р. (72) ГАНУСЕВИЧ ІРИНА ІВАНІВНА, ОЛІЙНИЧЕНКО ГЕНАДІЙ ПЕТРОВИЧ, ОСИНСЬКИЙ СЕРГІЙ ПЕТРОВИЧ (73) ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ, ОНКОЛОГІЇ ТА РАДІОБІОЛОГІЇ ІМ. Р.Є. КАВЕЦЬКОГО НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК УКРАЇНИ 3 Після стандартного внутрішньовенного забору кров хворого витримували при температурі +4 С впродовж 1 години, центрифугували при температурі +4 С та 3000об/хв. впродовж 20хв. та відбирали надосад. Отриману сироватку крові зберігали в рідкому азоті при температурі -180 С не більше, ніж 1 місяць. Для приготування зразка до 10мкл швидкорозмороженої сироватки крові додавали 10мкл 1 розчину додецилсульфату натрія. Концентрації активних та латентних форм желатиназ А і В в отриманому зразку визначали методом зимографії в 12 ПААГ з додецилсульфатом натрія і 0,1 желатину в якості субстрату [7]. 20мкл зразка сироватки крові вносили в лунки геля та проводили електрофорез при температурі +4 С, в напрузі електричного поля 150V, протягом 4 годин. Після розділення досліджуваних білків гель відмивали в 2,5 розчині тритону -100, потім інкубували в буфері з додаванням хлориду кальція (рН=7,5) впродовж 18 годин при температурі +37 С, фіксували та забарвлювали 0,25 Кумассі діамантовим синім. Після відмивання гелю у розчині оцтової кислоти з метанолом протеолітична активність желатиназ візуалізувалась у вигляді знебарвлених смужок на синьому тлі, а їхня локалізація відповідала молекулярній масі латентної та активної форм кожного із ферментів, які визначалися за стандартами молекулярних мас. Оцінку протеолітичної активності проводили шляхом виміру площі зони лізису та визначали концентрації ферментів, використовуючи стандартний набір матриксних металопротеїназ. Співвідношення концентрацій активних і латентних форм ММП-2 (ММП-2/проММП-2) та ММП-9 (ММП-9/проММП-9) вказує на рівень активації цих ферментів. Для всіх обстежених хворих встановлено, що межа розподілу між умовно високим та низьким рівнями активації дорівнює 0,2 для ММП-2 та 0,5 для ММП-9, і пацієнти з низькою активацією желатиназ мають кращі показники виживаності, ніж пацієнти з високою активацією. Таким чином, у хворих, в сироватці крові яких ММП-2/проММП 0,2 і ММП-9/проММП-9 0,5, активація ферментів вважається високою, що є основою для прогнозування у них несприятливого перебігу захворювання. У хворих, в сироватці крові яких співвідношення концентрацій активних і латентних форм ММП2 (ММП-2/проММП-2) 0,2 та ММП-9 (ММП9/проММП-9) 0,5, активація наведених ферментів вважається низькою, що є основою для прогнозування у них сприятливого перебігу захворювання. Критеріями ефективності використаного способу є покращання раннього виявлення рецидивів та/або метастазів пухлини, корекція схем лікування, що призводить до підвищення ефективності терапії та подовження життя хворих на рак шлунка. За розробленою методикою обстежено 102 хворих на рак шлунка. З них у 68 хворих виявлено високі рівні активації желатиназ та встановлено негативний прогноз перебігу захворювання, у 34 низькі рівні активації желатиназ та позитивний прогноз перебігу захворювання. 46852 4 Прикладами реалізації заявленого способу можуть вважатися наведені витяги з історій хвороби двох хворих. І. Хвора К., 1927 року народження (Історія хвороби № 17078, АК № 16192/05, ПГЗ № 38641-50/05 - аденокарцинома шлунка, Т3N1М0, G3, стадія ІІІА). Виконана операція - дистальна субтотальна резекція шлунка за Більрот-ІІ у модифікації Гофмейстера-Фінстерера. На десяту добу після операції із вени пацієнтки було отримано зразок крові, який витримували при температурі +4 С впродовж 1 години, центрифугували при температурі +4 С та 3000об/хв. впродовж 20хв. та відбирали надосад. Отриману сироватку крові зберігали в рідкому азоті при температурі -180 С до проведення вимірів (2 тижні). Безпосередньо перед вимірюванням до 10мкл швидко розмороженої сироватки крові додавали 10мкл 1 розчину додецилсульфату натрія. Концентрації активних та латентних форм желатиназ А і В у зразку визначали методом зимографії в 12 ПААГ з додецилсульфатом натрія і 0,1 желатину в якості субстрату. 20мкл зразку вносили в лунки геля та проводили електрофорез при температурі +4 С, в напрузі електричного поля 150'V, протягом 4 годин. Після розділення досліджуваних білків проби гель відмивали в 2,5 % розчині тритону -100, потім інкубували в буфері з додаванням хлориду кальція (рН=7,5) впродовж 18 годин при температурі +37 С, фіксували та забарвлювали 0,25 Кумассі діамантовим синім. Після відмивання гелю у розчині оцтової кислоти з метанолом протеолітична активність желатиназ візуалізувалась у вигляді знебарвлених смужок на синьому тлі, а їхня локалізація відповідала молекулярній масі латентної та активної форм кожного із ферментів, які визначалися за стандартами молекулярних мас. Оцінку протеолітичної активності проводили шляхом виміру площі зони лізису та визначали концентрацію ферментів, використовуючи стандартний набір матриксних металопротеїназ. Вираховували співвідношення концентрацій активних і латентних форм ММП-2 та ММП-9, яке відповідає рівню активації цих ферментів. Співвідношення ММП-2/проММП-2 дорівнювало 0,72 , тобто більше, ніж 0,2, і співвідношення ММП-9/проММП-9 дорівнювало 0,8, тобто більше, ніж 0,5, що вказувало на високу активацію обох желатиназ і значний рівень деструкції позаклітинного матриксу. За цих умов прогноз перебігу захворювання є несприятливим. Тривалість життя хворої становила 30 тижнів. II. Хворий 3., 1964 року народження (Історія хвороби № 18394, АК № 16876/05, ПГЗ № 4125355/05- слизопродукуюча карцинома шлунка, Т4М1М0, G3, стадія ІІІВ). Виконана операція - комбінована гастректомія за Гіляровичем. На восьму добу після операції із вени пацієнтки було отримано зразок крові, який витримували при температурі +4 С впродовж 1 години, центрифугували при температурі +4 С та 3000об/хв. впродовж 20хв. та відбирали надосад. Отриману сироватку крові зберігали в рідкому азоті при тем 5 46852 пературі -180 С до проведення вимірів (2 тижні). Безпосередньо перед вимірюванням до 10мкл швидкорозмороженої сироватки крові додавали 10мкл 1 розчину додецилсульфату натрія. Концентрації активних та латентних форм желатиназ А і В желатиназ у зразку визначали методом зимографії в 12 ПААГ з додецилсульфатом натрія і 0,1 желатину в якості субстрату. 20мкл зразку вносили в лунки геля та проводили електрофорез при температурі +4 С, в напрузі електричного поля 150V, протягом 4 годин. Після розділення досліджуваних білків проби гель відмивали в 2,5 розчині тритону -100, потім інкубували в буфері з додаванням хлориду кальція (рН=7,5) впродовж 18 годин при температурі +37 С, фіксували та забарвлювали 0,25 Кумассі діамантовим синім. Після відмивання гелю у розчині оцтової кислоти з метанолом протеолітична активність желатиназ візуалізувалась у вигляді знебарвлених смужок на синьому тлі, а їхня локалізація відповідала молекулярній масі кожного із ферментів, які визначалися за стандартами молекулярних мас. Оцінку протеолітичної активності проводили шляхом виміру площі зони лізису та визначали концентрацію ферментів, використовуючи стандартний набір матриксних металопротеїназ. Вираховували співвідношення концентрацій активних і латентних форм ММП-2 та ММП-9, яке відповідає рівню активації цих ферментів. Співвідношення ММП-2/проММП-2 дорівнювало 0,1, тобто менше, ніж 0,2, і співвідношення ММП-9/проММП-9 дорівнювало 0,3, тобто менше, ніж 0,5, що вказувало на Комп’ютерна верстка А. Крижанівський 6 низьку активацію обох желатиназ і незначний рівень деструкції позаклітинного матриксу. За цих умов прогноз перебігу захворювання є сприятливим. Тривалість життя хворого становила 92 тижня. Джерела інформації: 1. Macdonald J.S., Cervantes A. New horizons for gastric cancer: commentary // Eur. J. Cancer Suppl. - 2006. - Vol. 4, № 10. - P. 1-2. 2. Gastric cancer /V. Catalano, R. Labianca, G. Beretta et al. // Crit. Rev. Oncol. Hematol. - 2005. Vol. 54. - P. 209-241. 3. Matrix metalloproteinase-2 is a consistent prognostic factor in gastric cancer / F. Kubben , C. Sier , W. Duijn et al. // Br J Cancer - 2006. - Vol. 94. P 1035- 1040 (прототип) 4. Fingleton B. Matrix metalloproteinases: roles in cancer and metastasis // Front Biosci- 2006.- Vol. 11.P. 479-491. 5. Serum matrix metalloproteinase-2 in patients with malignant melanoma / U. Wollina, U-C. Hipler, B. Knoll et al. // J Cancer Clin Oncol -2001. -Vol.127.P.631-635. 6. High Serum Levels of Matrix Metalloproteinase-9 and Matrix Metalloproteinase-1 Are Associated with Rapid Progression in Patients with Metastatic Melanoma / J.Nikkola, P.Vihinen, MS.Vuoristo et al. // Clin Cancer Res-2005.-Vol. 11(14).-P. 5158-5166. 7. Inhibition of invasion and metastasis in cells transfected with an inhibitor of metalloproteinases / YA. De Clerk , N. Perez, H. Shimada et al. // Cancer research. - 1992. - Vol. 52. - P. 701-708. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601