Інгібітор проліферації стовбурових клітин,фармацевтична композиція (варіанти) та спосіб їх використання (варіанти)

1 Фармацевтическая композиция, содержащая в основном (а) по меньшей мере один полипептид, выбранный из группы, включающей а цепь гемоглобина, р-цепь гемоглобина, у-цепь гемоглобина, 5-цепь гемоглобина, s-цепь гемоглобина и ^-цепь гемоглобина, и (Ь) фармацевтически приемлемый носитель 2 Фармацевтическая композиция по п 1 , содержащая а -цепь гемоглобина и фармацевтически приемлемый носитель 3 Фармацевтическая композиция по п 1 , содержащая р-цепь гемоглобина и фармацевтически приемлемый носитель 4 Фармацевтическая композиция по п 2, дополнительно содержащая р-цепь гемоглобина 5 Фармацевтическая композиция по п 1 или 4, отличающаяся тем, что она содержит не менее двух из упомянутых полипептидов, которые, необязательно, находятся в форме димера 6 Фармацевтическая композиция по п 5, в которой указанные пептиды выбирают из группы, включающей а-цепь гемоглобина-р-цепь гемоглобина, а-цепь гемоглобина-у-цепи гемоглобина, а цепь гемоглобина-5-цепь гемоглобина и 5-цепь гемоглобина-5-цепи гемоглобина 7 Фармацевтическая композиция по любому из пп 1 - 6 в виде единичной дозированной формы 8 Фармацевтическая композиция по п 7, содержащая от 0,1мг до 6г одного или двух соединений, выбранных из группы, включающей а - р - у 5 - s - и '%- цепи гемоглобина 9 Изолированный пептид, выбранный из группы, включающей пептиды, имеющие последовательность Фен-Про-Гис-Фен-Асп-Лей-Сер-Гис-Гли-Сер-АлаГлн-Вал, Цис-Фен-Про-Гис-Фен-Асп-Лей-Сер-Гис-Гли-СерАла-Глн-Вал-Цис (где два остатка Цис образуют дисульфидную связь), Асп-Ала-Лей-Тре-Асн-Ала-Вал-Ала-Гис-Вал-АспАсп-Мет-Про-Асн-Ала-Лей-Сер-Ала, Лей-Вал-Вал-Тир-Про-Трп-Тре-Глн-Арг-Фен, Лей-Вал-Вал-Тир-Про-Трп-Тре-Глн-Арг, Лей-Вал-Вал-Тир-Про-Трп-Тре-Глн, Лей-Вал-Вал-Тир-Про-Трп-Тре, Лей-Вал-Вал-Тир-Про-Трп, Лей-Вал-Вал-Тир-Про, Вал-Вал-Тир-Про-Трп-Тре-Глн, Тир-Про-Трп-Тре-Глн-Арг-Фен, Тир-Про-Трп-Тре-Глн-Арг, Тир-Про-Трп-Тре-Глн, и Тир-Про-Трп-Тре 10 Изолированный пептид по п 9, имеющий последовательность Фен-Про-Гис-Фен-Асп-Лей-СерГис-Гли-Сер-Ала-Глн-Вал 11 Изолированный пептид по п 9, отличающийся тем, что он является циклическим пептидом, имеющим последовательность Цис-Фен-Про-ГисФен-Асп-Лей-Сер-Гис-Гли-Сер-Ала-Глн-Вал-Цис, где два остатка Цис образуют дисульфидную связь 12 Изолированный пептид по п 9, имеющий последовательность Асп-Ала-Лей-Тре-Асн-Ала-ВалАла-Гис-Вал-Асп-Асп-Мет-Про-Асн-Ала-Лей-СерАла 13 Фармацевтическая композиция, содержащая (а) композицию по любому из пп 1 - 6 и (Ь) по меньшей мере одно ингибирующее соединение, выбранное из группы, включающей МІР-1 а , О а> го ю 54379 TGFp, T N F a , INF a , INF p, INFy, пентапептид пироГлу-Глу-Асп-Цис-Лиз, тетрапептид N-АцетилСер-Асп-Лиз-Про и трипептид глутатион (Гли-ЦисуГлу) 14 Фармацевтическая композиция, содержащая (а) композицию по любому из пп 1 - 6 и (Ь) по меньшей мере одно стимулирующее соединение, выбранное из группы, включающей ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-9, ИЛ-11, ИЛ-13, ИЛ-14, ИЛ-15, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, эритропоэтин, тромбопоэтин, фактор стволовых клеток и лиганд flk2/flt3 15 Способ ингибирования пролиферации стволовых клеток, включающий приведение гемопоэтических клеток в контакт с ингибирующим пролиферацию стволовых клеток количеством композиции по любому из пп 1 - 6 16 Композиция, содержащая по меньшей мере один изолированный пептид по п 9 и носитель 17 Способ ингибирования пролиферации стволовых клеток, включающий приведение гемопоэтических клеток в контакт с ингибирующим пролиферацию стволовых клеток количеством композиции по п 16 18 Способ ингибирования пролиферации стволовых клеток, включающий приведение гемопоэтических клеток в контакт с ингибирующим пролиферацию стволовых клеток количеством композиции по п 13 19 Способ ингибирования пролиферации стволовых клеток, включающий приведение гемопоэтических клеток в контакт с ингибирующим пролиферацию стволовых клеток количеством композиции по п 14 20 Способ стимулирования роста В-клеток, включающий приведение гемопоэтических клеток в контакт со стимулирующим рост количеством композиции по любому из пп 1 - 6 21 Способ стимулирования роста В-клеток, включающий приведение гемопоэтических клеток в контакт со стимулирующим рост количеством композиции по п 16 22 Способ лечения рака у млекопитающего, страдающего от него, согласно которому a) проводят радио- либо химиотерапию, и b) вводят ингибирующее пролиферацию стволовых клеток количество композиции по любому из пп 1 -6 23 Способ по п 22, отличающийся тем, что стадии а и b повторяют один или большее количество раз 24 Способ по п 22, отличающийся тем, что стадию а осуществляют после стадии b 25 Способ по п 22,отличающийся тем, что стадию b осуществляют не ранее чем за 24 часа перед стадией а или не позже чем через 24 часа после стадии а 26 Способ лечения рака у млекопитающего, страдающего от него, согласно которому a) проводят радио- либо химиотерапию, и b) вводят ингибирующее пролиферацию стволовых клеток количество композиции по п 16 27 Способ лечения рака у млекопитающего, включающий а) удаление у упомянутого млекопитающего гемопоэтических клеток, b) обработку упомянутых гемопоэтических клеток композицией по любому из пп 1 - 6 ex vivo, c) обработку упомянутых гемопоэтических клеток со стадии b с помощью химиотерапии либо излучения, d) проведение миелоаблативной терапии упомянутого млекопитающего, и e) пересадку упомянутому млекопитающему гемопоэтических клеток со стадии с 28 Способ по п 27, отличающийся тем, что упомянутым раком является лейкоз 29 Способ лечения рака у млекопитающего, включающий a) удаление у упомянутого млекопитающего гемопоэтических клеток, b) обработку упомянутых гемопоэтических клеток композицией по п 16 ex vivo, c) обработку упомянутых гемопоэтических клеток со стадии b с помощью химиотерапии либо излучения, d) проведение миелоаблативной терапии упомянутого млекопитающего, и e) пересадку упомянутому млекопитающему гемопоэтических клеток со стадии с 30 Способ ингибирования деления стволовых клеток у млекопитающего, подверженного воздействию вещества, которое повреждает либо уничтожает стволовые клетки, включающий введение ингибирующего пролиферацию стволовых клеток количества композиции по любому из пп 1 - 6 31 Способ по п 30, в котором упомянутым веществом является противовирусное средство 32 Способ ингибирования деления стволовых клеток у млекопитающего, подверженного воздействию вещества, которое повреждает либо уничтожает стволовые клетки, включающий введение ингибирующего пролиферацию стволовых клеток количества композиции по п 16 33 Способ сохранения гемопоэтических стволовых клеток млекопитающих ex vivo, включающий приведение гемопоэтических клеток в контакт с ингибирующим пролиферацию стволовых клеток количеством композиции по любому из пп 1 - 6 34 Способ по п 33, отличающийся тем, что упомянутые гемопоэтические клетки выбраны из группы, включающей костномозговые клетки, клетки периферической крови, клетки активированной периферической крови и клетки пуповинной крови 35 Способ поддержания гемопоэтических стволовых клеток млекопитающих ex vivo, включающий приведение гемопоэтических клеток в контакт с ингибирующим пролиферацию стволовых клеток количеством композиции по п 16 36 Способ лечения миелопролиферативного или аутоиммунного заболевания либо гиперпролиферации эпителиальных стволовых клеток у млекопитающего, страдающего от них, включающий введение ослабляющего гиперпролиферацию количества композиции по любому из пп 1 - 6 37 Способ по п 36, отличающийся тем, что указанным миелопролиферативным заболеванием является миелодиспластический синдром 38 Способ лечения миелопролиферативного или аутоиммунного заболевания либо гиперпролиферации эпителиальных стволовых клеток у млекопитающего, страдающего от них, включающий 54379 введение ослабляющего гиперпролиферацию количества композиции по п 16 39 Способ дифференцированной защиты нормальных, но не раковых, стволовых клеток млекопитающего от воздействия химиотерапии либо облучения, включающий введение защищающего стволовые клетки количества композиции по любому из пп 1 - 6 40 Способ по п 39, отличающийся тем, что упомянутую композицию вводят после индуцирования пролиферации упомянутых нормальных стволовых клеток посредством воздействия цитотоксичного лекарственного препарата или излучения 41 Способ дифференцированной защиты нормальных, но не раковых, стволовых клеток млекопитающего от воздействия химиотерапии либо облучения, включающий введение защищающего стволовые клетки количества композиции по п 16 42 Способ вакцинации млекопитающего, включающий введение композиции по любому из пп 1 6 в качестве адъюванта до, во время либо после введения вакцины 43 Способ вакцинации млекопитающего, включающий введение композиции по п 16 в качестве адъюванта до, во время либо после введения вакцины 44 Композиция, содержащая изолированный ингибитор пролиферации стволовых клеток, в основном не содержащий белковых веществ, полученный в соответствии со способом, включающим следующие стадии a) выделение костного мозга и удаление из экстракта макрочастиц, b) нагревание упомянутого экстракта и удаление осадка, c) осаждение упомянутого экстракта с помощью кислоты и сбор осадка, и d) выделение упомянутого ингибитора с помощью хроматографии с обращенной фазой, причем упомянутый ингибитор представляет собой по меньшей мере один пептид, выбранный из группы, включающей а-цепь гемоглобина, р-цепь гемоглобина, s-цепь гемоглобина и ^-цепь гемоглобина 45 Композиция по п 44, отличающаяся тем, что указанный ингибитор пролиферации стволовых клеток очищен до явной однородности 46 Способ лечения млекопитающего, страдающего от иммунодепрессии, вызванной гиперпролиферацией стволовых клеток, включающий введение упомянутому млекопитающему реверсирующего гиперпролиферацию количества композиции по любому из пп 1 - 6 47 Способ лечения млекопитающего, страдающего от иммунодепрессии, вызванной гиперпролиферацией стволовых клеток, включающий введение упомянутому млекопитающему реверсирующего гиперпролиферацию количества композиции по п 16 48 Способ проведения генотерапии у млекопитающего, включающий a) удаление у упомянутого млекопитающего гемопоэтических клеток, b) трансфицирование упомянутых гемопоэтических клеток с помощью некоторого предопределенного гена, c) приведение упомянутых трансфицированных гемопоэтических клеток ex vivo в контакт с композицией по любому из пп 1 - 6, d) пересадку упомянутому млекопитающему гемопоэтических клеток со стадии с 49 Способ по п 48, дополнительно после стадии (а) включающий обработку упомянутых гемопоэтических клеток по меньшей мере одним стимулирующим цитокином для индуцирования пролиферации стволовых клеток 50 Способ по п 49, дополнительно после стадии (d) включающий лечение млекопитающего in vivo с помощью композиции по любому из пп 1 - 6 51 Способ проведения генотерапии у млекопитающего, включающий a) удаление у упомянутого млекопитающего гемопоэтических клеток, b) трансфицирование упомянутых гемопоэтических клеток с помощью некоторого предопределенного гена, c) приведение упомянутых трансфицированных гемопоэтических клеток ex vivo в контакт с композицией по п 16, d) пересадку упомянутому млекопитающему гемопоэтических клеток со стадии с 52 Способ размножения стволовых клеток ex vivo, включающий приведение гемопоэтических клеток в контакт с композицией по любому из пп 1 - 6 и хотя бы одним стимулирующим цитокином 53 Способ по п 52, отличающийся тем, что упомянутые гемопоэтические клетки являются клетками, выбранными из группы, включающей костномозговые клетки, клетки пупочного канатика, клетки периферической крови и клетки активированной периферической крови 54 Способ размножения стволовых клеток ex vivo, включающий приведение гемопоэтических клеток в контакт с композицией по п 16 и хотя бы одним стимулирующим цитокином Настоящее изобретение относится к использованию ингибиторов пролиферации стволовых клеток для регулирования их митотической активности при лечении людей либо животных от аутоиммунных болезней, старения, рака, миелодисплазии, предлейкоза, лейкоза, псориаза и других заболеваний, включающих состояние ги перпролиферации Настоящее изобретение относится также к способу лечения людей либо животных, которым назначены либо были введены химиотерапевтические препараты или другие препараты, повреждающие цитирующие стволовые клетки, либо лучевая терапия И, наконец, настоящее изобретение относятся к усовершен 54379 ствованию способов сохранения или размножения стволовых клеток для ауто- и, аллотрансплантации либо для переноса генов Большинство клеток на терминальной стадии дифференцировки в возобновляющихся системах являются короткоживущими и должны постоянно заменяться в течение всего срока жизни Например, клетки крови берут начало в самообновляющейся популяции мультипотентных гемопоэтических стволовых клеток Гемопоэтические стволовые клетки являются субпопуляцией гемопоэтических клеток Гемопоэтические клетки могут быть получены, например, из костного мозга, крови пупочного канатика либо периферической крови (как неактивированной, так и активированной с помощью такого фактора, как G-CSF (гранул оцитарный колониестимулирующий фактор)), Гемопоэтические клетки включают популяцию стволовых клеток, клетки-предшественники, дифференцированные клетки, А-клетки, клетки стромы и другие, способствующие созданию среды, необходимой для продуцирования зрелых клеток крови Поскольку гемопоэтические стволовые клетки необходимы для развития всех зрелых клеток гемопоэтической и иммунной систем, их выживание является необходимым условием полного функционального восстановления системы защиты у людей, подвергающихся химиотерапии либо воздействию других препаратов (факторов) Продуцирование гемопоэтических клеток регулируется рядом факторов, стимулирующих их рост и дифференциацию Некоторые из этих факторов, например, эритропоэтин и G-CSF в настоящее время используются в клинической практике Одной частью сети управления, которая, однако, экстенсивному исследованию не подвергалась, является механизм обратной связи, образующий отрицательную ветвь процесса регулирования (Ивз (Eaves) и др , Blood 78 110117, 1991) Исследования, ранее проведенные Лордом (Lord) и сотр , показали существование растворимого белкового фактора в экстрактах нормального костного мозга мышей и свиней, обладавшего способностью обратимого ингибирования митотической активности гемопоэтических стволовых клеток (HSC) (Лорд и др , Вг J Haem 34 441-446, 1976) ЭТОТ ингибирующий фактор (молекулярная масса 50 - ЮОкилоДальтон) был назван ингибитором стволовых клеток (SCI) Работа по выделению этого фактора из первоисточников не была завершена вследствие трудностей, присущих постановке реакции in vivo, требующей большого количества облученных мышей Пытаясь преодолеть эти проблемы, Прагнелл (Pragnell) и сотр разработали реакцию in vitro для гемопоэтических стволовых клеток (CFU-A) и отобрали клеточные линии, подходящие для получения ингибитора стволовых клеток (см Грехем (Graham) и др , Nature 344 442-444, 1990) Ранее проведенные исследования позволили идентифицировать макрофаги, как возможный источник SCI (Лорд и др , Blood Cells 6 581-593, 1980) С этой целью была отобрана линия клеток 8 макрофагов мышей J774 2 (Грехем и др , Nature 344 442-444, 1990) Для очистки Грехем и др использовали кондиционированную среду этой линии клеток, был выделен ингибирующий пептид, оказавшийся идентичным ранее описанному цитокину-макрофагальному медиатору аллергического воспаления 1-а (М1Р-1а) Таким образом, М1Р-1а был выделен из линии клеток, а не из первичного материала В то время, как Грехем и др установили, что антитела к М1Р-1а нейтрализовали активность неочищенного экстракта костного мозга, другие исследователи показали, что важную роль играют и другие ингибирующие факторы Например, Грехем и др (J Exp Med 178 925-32, 1993) предположили, что основным ингибитором гемопоэтических стволовых клеток является не MIP-1a, a TGFp (фактор роста Тклеток) Далее, Ивз и др (PNAS 90 12015-19, 1993) предположили, что как М1Р-1а, так и TGFp присутствуют в нормальном костном мозге в субоптимальных количествах и что для ингибирования требуется синергизм двух этих факторов Другие исследователи описали дополнительные факторы ингибирования стволовых клеток Фриндел (Frmdel) и сотрудники из костного мозга плода КРС и экстрактов печени выделили тетрапептид, обладавший ингибирующей активностью по отношению к стволовым клеткам (Ленфант (Lenfant) и др, PNAS 86 779-782, 1989), Пуковиц (Paukovits) и др (Cancer Res , 50 328-332, 1990) идентифицировали пентапептид, который, в виде мономера, является ингибитором, а в виде димера - стимулятором цитирования стволовых клеток Сообщали также о ингибирующих свойствах других факторов в различных системах in vitro (см Райт (Wright) и Прагнелл, Bailher's Chmical Haematology, т 5, стр 723-39, 1992 (Bailhere Tmddall, Pans)) В авторском свидетельстве СССР №1561261 А1 (Цырлова (Tsyrlova) и др) раскрыт процесс очистки ингибитора пролиферации стволовых клеток До настоящего времени ни один из этих факторов не был рекомендован для применения в клинической практике Существует, однако, необходимость в эффективных ингибиторах стволовых клеток Основной опасностью, связанной с химиотерапией либо лучевой терапией, является уничтожение нормально пролиферирующих клеток, что может привести к угнетению костного мозга либо оказаться токсичным для желудочнокишечного тракта Эффективный ингибитор стволовых клеток обеспечил бы защиту этих клеток и позволил оптимизировать вышеупомянутые лечебные схемы Вероятнее всего, что, в такой же степени, как необходимы различные стимулирующие цитокины (те такие цитокины, как ИЛ-1 (интерлейкин-1), ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-9, ИЛ-11, ИЛ-13, ИЛ-14, ИЛ-15, G-CSF, GM-CSF (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор), эритропоэтин, тромбопоэтин, фактор роста стволовых клеток, лиганд flk2/flt3 и т д , которые стимулируют циклирование гемопоэтических клеток) в зависимости от клинической ситуации, для удовлетворения различных клинических потребностей 54379 необходимы будут и различные ингибирующие факторы Гемоглобин является весьма упорядоченным белком-тетрамером, молекулярная масса которого составляет около 64000 Дальтон Он состоит из двух а- и двух р-цепей Каждая цепь связывает одну молекулу гема (ферропротопорфирин IX), железосодержащую простетическую группу, а- и р-цепи позвоночных произошли, вероятно, от одного предкового гена, который, в последующем, дуплицировался и дивергировал, две цепи сохраняют значительное сходство последовательности как между собой, так и у различных позвоночных (см фиг16А) У людей кластер ацепи на 16 хромосоме содержит два а-гена (ои и аг), которые кодируют идентичные полипептиды, а также гены, кодирующие другие а-подобные цепи 4. & и несколько нетранскрибированных псевдогенов (см фиг 16В - кДНК и аминокислотная последовательность а-цепи человека) Кластер р-цепи на 11 хромосоме состоит из одного гена р-цепи и нескольких р-подобных генов 5, s, G-y и А-у, а также из, как минимум, двух неэкспрессированных псевдогенов (см фиг 16С - кДНК и аминокислотная последовательность р-цепи человека) Экспрессия этих генов изменяется в процессе развития В гемопоэзе человека, который был подвергнут экстенсивному изучению, эритробласты плода последовательно синтезируют тетрамеры двух ^-цепей и двух s-цепей (Гувер I), двух а-цепей и двух s-цепей (Гувер II) либо двух '%цепей и двух у-цепей (НЬ Портланд) В ходе дальнейшего эмбриогенеза преобладающая форма состоит из фетального гемоглобина (HbF), который включает две а-цепи и две у-цепи Синтез зрелого гемоглобина (2а- и 2р-цепи) начинается в течение фетального периода развития, в момент рождения около 50% гемоглобина представлено зрелой формой и переход завершается, приблизительно, к шестимесячному возрасту Преобладающая часть гемоглобина у взрослых (около 97%) представлена разновидностью с двумя а- и двумя р-цепями (НЬА) с небольшими поддающимися обнаружению количествами HbF и 5-цепью (НЬАг) Гем экстенсивно изучался в отношении его воздействия на гемопоэз (см обзорные статьи С Caeca (S Sassa), Seminars Hemat, 25 312-20, 1988 и Н Абрахам (Abraham) и др , Int J Cell Cloning 9 185-210, 1991) Гем необходим для созревания эритробластов, in vitro гемин (хлорферропротопорфирин IX - т є гем с дополнительным ионом хлора) усиливает пролиферацию CFU-GEMM (колониеобразующая единица гранулоцитов-эритроцитов-макрофаговмегакариоцитов - КОЕ-ГЭММ), BFU-E (эритроидная бурстобразующая единица - БОЕэ) и CFU-E (эритроидная колониеобразующая единица КОЕэ) Подобным же образом гемин повышает объем клеточного содержимого в культурах клеток костного мозга 1 Химиотерапия и лучевая терапия рака В результате продуктивных исследований стимуляторов роста в клиническую практику вве 10 ден ряд этих факторов (эритропоэтин, G-CSF, GM-CSF и т д ) Эти факторы снизили заболеваемость и смертность, связанные с химио- и радиотерапией Дальнейшую клиническую пользу для пациентов, подвергающихся химио- либо радиотерапии, могла бы принести альтернативная стратегия блокирования вступления стволовых клеток в стадию митотической активности, что защитило бы их от токсических побочных действий II Трансплантация костного мозга Трансплантация костного мозга (ВМТ) является эффективным способом лечения различных гематологических, аутоиммунных и злокачественных заболеваний, к числу современных терапевтических средств отнесены гемопоэтические клетки, полученные из крови пупочного канатика либо из периферической крови (как неактивированной, так и активированной с помощью такого фактора, KaKG-CSF), а также из костного мозга В настоящее время для размножения стволовых клеток крови до объемов популяции, пригодной для пересадки, прибегают к манипулированию гемопоэтическими клетками ex vivo Для оптимизации этой методики необходимо (1) достаточное количество стволовых клеток, способных поддерживать длительный процесс восстановления гемопоэза, (2) истощение Т-лимфоцитов, вызывающих реакцию "трансплантат против хозяина" и (3) отсутствие остаточных раковых клеток Эта методика может быть оптимизирована посредством включения ингибитора(-ов) стволовых клеток для размножения ex vivo Эффективность десенсибилизации гемопоэтических клеток в результате удаления остаточных раковых клеток с помощью цитотоксических препаратов ограничена вследствие токсичности этих соединений для нормальных гемопоэтических клеток и, особенно, для стволовых клеток Необходима эффективная защита нормальных клеток в процессе десенсибилизации, защита может быть обеспечена посредством изъятия стволовых клеток из процесса цитирования с помощью эффективного ингибитора III Сбор периферических стволовых клеток Стволовые клетки периферической крови (PBSC) обладают рядом потенциальных преимуществ перед костным мозгом для аутологической пересадки У пациентов, лишенных подходящих участков сбора клеток костного мозга вследствие наличия опухолей либо предшествующей радиотерапии, может производиться сбор PBSC Использование стволовых клеток крови исключает необходимость выполнения общего анестезирования и хирургической операции у больных, плохо их переносящих Методика афереза, осуществляемая для сбора клеток крови, эффективна и общедоступна в большинстве крупных медицинских центров Основными ограничениями данной методики являются как низкая частота встречаемости стволовых клеток в периферической крови при гомеостазе, так и их высокая митотическая активность после активации с помощью препаратов либо факторов роста (например, циклофосфамида, G-CSF, фактора роста стволовых клеток) Эффективный ингиби 54379 12 11 тор стволовых клеток был бы полезен для их отделяется от обоих высокоэффективной жидковозврата в состояние покоя, предотвращая тем стной хроматографией с обращенной фазой (см самым их утрату вследствие дифференциации Пример 12), IV Лечение гиперпролиферативных рас(e) Биологическая активность сохраняется стройств после нагревания в течение одного часа при 37°С, 55°С либо 75°С в водном растворе и Ряд заболеваний характеризуется состоянием гиперпролиферации, при котором хаотически (f) Биологическая активность сохраняется делящиеся стволовые клетки способствуют возпри осаждении 1% соляной кислотой в ацетоне никновению переизбытка клеток на терминальНастоящее изобретение, далее, характериной стадии дифференцировки Подобные забозуется и отличается от других возможных ингилевания включают, но не ограничиваются, биторов стволовых клеток (например, М1Р-1а, псориаз, при котором наблюдается перепроизTGFp и различных олигопептидов) способностью водство эпидермальных клеток, и предраковое обеспечения ингибирования в реакциях in vitro состояние желудочно-кишечного тракта, которое после непродолжительной преинкубации (см характеризуется появлением полипов в кишечниПример 5) ке Ингибитор стволовых клеток был бы полезен Настоящее изобретение включает также при лечении подобных состояний фармацевтические составы, содержащие ИНV Перенос генов ПРОЛ, для лечения ряда расстройств В настоящее время в клинической практике Настоящее изобретение предоставляет спонаходит применение перенос генетической инсоб лечения человека, который должен быть формации в гемопоэтические клетки Гемопоэтиподвергнут воздействию фактора, обладающего ческие клетки являются подходящей мишенью способностью убивать либо повреждать стволодля генотерапии благодаря простоте доступа, вые клетки, посредством введения упомянутому обширному опыту манипулирования и обработки человеку эффективного количества состава, инэтой ткани ex vivo и благодаря способности клегибирующего стволовые клетки Стволовыми ток крови просачиваться сквозь ткани Далее, клетками, защищаемыми этим способом, могут корректирование некоторых генетических дефекбыть гемопоэтические стволовые клетки, обычно тов человека оказывается возможным благодаря присутствующие и делящиеся в костном мозгу В вставке функционального гена в стволовые клетальтернативном варианте, стволовыми клетками ки крови гемопоэтической системы человека могут быть эпителиальные клетки, находящиеся, например, в кишечнике либо в волосистой части Существует несколько ограничений для кожи головы или на других участках тела, или же вставки генов в гемопоэтические клетки человека половые клетки, находящиеся в репродуктивных с помощью ретровирусных векторов либо физиорганах Способ, соответствующий настоящему ческих способов переноса генов (1) Низкая часизобретению, может быть, желательно, испольтота встречаемости стволовых клеток в гемопозован на людях, хотя этим способом предусматэтических тканях обусловила необходимость ривается также и лечение животных Термины разработки высокоэффективных способов пере"субъект" либо "пациент", используемые в данноса генов, и (2) быстрее цитирующие стволоном описании, относятся к животному, например, вые клетки оказались более восприимчивыми к млекопитающему, включая человека векторной инфекции, однако повышение частоты инфицирования путем стимуляции пролифераВ другом аспекте изобретение предоставляции стволовых клеток факторами роста оказывает способ защиты и восстановления гемопоэтиет отрицательное воздействие на долгосрочную ческой, иммунной либо других систем стволовых экспрессию генов, поскольку клетки, содержащие клеток пациента, проходящего курс химиотератрансгены, вынуждены необратимо дифференпии, который включает введение пациенту эфцироваться и теряют способность к самовосстафективного количества ИНПРОЛ'а новлению Острота этих проблем может быть В следующем аспекте настоящее изобретеослаблена применением ингибитора стволовых ние предоставляет способ дополнительного леклеток для предотвращения дифференциации и чения любого ракового заболевания, включая потери способности к самовосстановлению характеризующиеся наличием твердых опухолей, Настоящее изобретение относится к полипосредством введения раковому больному эфпептидам, которые являются ингибиторами профективного количества ИНПРОЛ'а для защиты лиферации стволовых клеток ("ИНПРОЛ" стволовых клеток костного мозга, желудочно(INPROL)), и их применению кишечного тракта или других органов от токсического воздействия химио- либо радиотерапии Настоящее изобретение включает ингибитор пролиферации стволовых клеток, характеризуюВ следующем аспекте настоящее изобретещийся следующими свойствами ние предоставляет способ лечение лейкоза, (a) Удельная активность (ICso) менее или включающий обработку гемопоэтических клеток, равна 20нг/мл в реакции с колониеобразующими содержащих в своей среде пролиферативные единицами селезенок мышей (CFU-S - КОЕ-С) лейкозные клетки, эффективным количеством (см Пример 4), ИНПРОЛ'а для ингибирования пролиферации нормальных стволовых клеток, и обработку кост(b) Молекулярная масса больше 10 000 и ного мозга цитотоксическим средством для уничменьше 100 000 Дальтон (ультрафильтрация), тожения лейкозных клеток Действенность этого (c) Активность чувствительна к грипсинизаспособа может быть усилена последующей обции, работкой костного мозга другими средствами, (d) Гидрофобнее, чем М1Р-1а либо TGFp и 54379 14 13 стимулирующими его пролиферацию, например, ловых клеток колониестимулирующими фаісгорами (КСФ) В Настоящее изобретение предоставляет такодном из вариантов осуществления настоящего же изобретения этот способ реализуется in vivo В Способ лечения людей либо животных, в соальтернативном варианте, этот способ пригоден ответствии с которым упомянутый ингибитор также для десенсибилизации и размножения гепролиферации стволовых клеток вводится после мопоэтических клеток для пересадки ex vivo того, как пролиферация стволовых клеток была вызвана воздействием цитотоксического препаВ следующем аспекте, способ включает лерата либо облучением Стволовые клетки нахочение субъекта, имеющего расстройство, выдятся обычно в состоянии покоя, однако их митозванное пролифериующими стволовыми клеткатическая активность стимулируется химиотерами Такие расстройства, как псориаз, миелодиспией Вследствие этого они становятся более плазия, некоторые аутоиммунные болезни, имвосприимчивыми к повторному введению химиомуно-депрессивные состояния при старении летерапевтических препаратов, данный способ чатся посредством введения субъекту эффекобеспечивает их защиту от подобной обработки тивного количества ИНПРОЛ'а для частичного ингибирования пролиферации соответствующих Настоящее изобретение предоставляет такстволовых клеток же Настоящее изобретение предоставляет споСпособ лечения людей или животных, в сособ обратимой защиты стволовых клеток от поответствии с которым упомянутый ингибитор вреждения цитотоксическим средством, способпролиферации стволовых клеток вводится как ным убить либо повредить стволовые клетки адъювант до или во время вакцинации с целью Способ включает введение субъекту, подлежаусиления иммунной реакции щему воздействию подобного средства, эффекНастоящее изобретение предоставляет тактивного количества ИНПРОЛ'а же способ лечения людей либо животных, принимающих цитотоксические препараты, либо Настоящее изобретение также предоставляподвергающихся лучевой терапии, включающий ет ингибитор пролиферации стволовых клеток, введение эффективного количества ингибитора выделенный из свиного либо другого костного пролиферации стволовых клеток для защиты мозга следующим способом (см Пример 12) стволовых клеток от повреждения (a) Экстрагирование костного мозга и удаление макрочастиц посредством фильтрации, Изобретение включает также фармацевтический состав, содержащий гемоглобин и фарма(b) Тепловая обработка при 56°С в течение цевтически приемлемый носитель 40 минут с последующим охлаждением на ледяной бане, Изобретение включает также фармацевтический состав, содержащий (а) полипептид, вы(c) Удаление осадка центрифугированием бранный из группы, состоящей из а-цепи гемопри 10 000об/мин в течение 3 минут при 4°С, глобина, р-цепи гемоглобина, у-цепи гемоглоби(d) Кислотное осаждение посредством дона, 5-цепи гемоглобина, s-цепи гемоглобина и '%бавления супернатанта к 10 объемам перемешицепи гемоглобина и (Ь) фармацевтически приемваемого ледяного ацетона, содержащего 1(об)% лемый носитель Подобные фармацевтические концентрированной соляной кислоты и инкубиросоставы могут состоять из одного полипептида, вание при 4°С в течение 16 часов, выбранного из упомянутой группы, смеси поли(e) Выделение осадка центрифугированием пептидов, выбранных из упомянутой группы либо при 20 000об/мин в течение 30 минут при 4°С и полипептидов из указанной группы в виде димепромывка ледяным ацетоном с последующим ров или полимеров с/без гема высушиванием, (f) Выделение высокоэффективной жидкостИзобретение включает также пептиды, ной хроматографией с обращенной фазой и конимеющие следующие последовательности троль активности посредством ингибирования Фен-Про-Гис-Фен-Асп-Лей-Сер-Гис-Гли-Сер-Алаобразования колоний клетками костного мозга, Глн-Вал, предварительно обработанными 5-фторурациЦис-Фен-Про-Гис-Фен-Асп-Лей-Сер-Гис-Гли-Серлом и инкубированными в присутствии мышиного Ала-Глн-Вал-Цис ИЛ-3, а также абсорбцией на 280нм и электрогде два цистеиновых остатка образуют дифорезом в полиакриламидном геле в присутстсульфидную связь вии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) Цис-Фен-Про-Гис-Фен-Асп-Лей-Сер-Гис-Гли-СерНастоящее изобретение предоставляет такАла-Глн-Вал-Цис же где два цистеиновых остатка соединяются Способ очистки ингибитора пролиферации углеродным мостиком, и стволовых клеток, по существу, свободного от Асп-Ала-Лей-Тре-Асн-Ала-Вал-Ала-Гис-Вал-Аспдругих белковых материалов, включающий предАсп-Мет-Про-Асн-Ала-Лей-Сер-Ала шествующие этапы, а также подробнее описанИзобретение также включает последованый далее тельности ДНК, кодирующие вышеупомянутые Настоящее изобретение предоставляет такпептиды, векторы, содержащие указанные поже следовательности ДНК и клетки-хозяева, содерСпособ лечения людей либо животных, в сожащие указанные векторы Эти пептиды могут ответствии с которым ингибитор пролиферации быть синтезированы с помощью стандартных стволовых клеток нейтрализует иммуносупресхимических способов (например, твердофазный сию, обусловленную гиперпролиферацией ствометод синтеза) либо с помощью рекомбинантных 54379 16 15 способов (например, системы слияния наподоТир-Про-Лиз-Гли-г\ІН2, бие использующих глутатион-З-трансферазу Тир-Про-Лей-Гли-г\ІН2 и (ДБ Смит) (D В Smith) и К С Джонсон (К S Про-Лей-Гли-г\ІН2 Johnson), Gene 67 31-40, 1988), тиоредоксин (Ла Изобретение включает также способ провеВелли (La Value) и др , Biotechnology 11 187-193, дения генотерапии млекопитающего, включаю1993) либо убиквитин (Батт (Butt) и др , PNAS 86 щий 2540-4, 1989, патент США 5 391 490)) a) удаление гемопоэтических клеток из упоНаряду с этим, изобретение включает способ мянутого млекопитающего, ингибирования пролиферации стволовых клеток, b) факультативную обработку указанных гевключающий введение гемопоэтических клеток в мопоэтических клеток ex vivo, как минимум, одконтакт с соединением, способным связывать ним стимулирующим цитокином для того, чтобы опиатные рецепторы, в предпочтительном варивызвать пролиферацию стволовых клеток, анте, подкласс ц, опиатных рецепторов Из гемоc) трансфекцию указанных гемопоэтических глобина были выделены пептиды (названные клеток предопределенным геном, "геморфинами"), проявляющие опиатоподобную d) введение указанных трансфектированных активность (например, Брант (Brante) и др , Eur гемопоэтических клеток ex vivo в контакт с ИНJ Pharm , 125 309-10, 1986, Девис (Davis) и др , ПРОЛ'ом, Peptides 10 747-51, 1989, Карелин (Karelin) и др, e) пересадку млекопитающему гемопоэтичеBioch Biophys Res Comm, 202 410-5, 1994, Жао ских клеток этапа d, (Zhao) и др, Ann N Y Acad Sci 750 452-8, f) факультативную обработку указанного 1995) Каждая из этих статей включена в намлекопитающего in vivo ИНПРОЛ'ом стоящее описание в качестве ссылки Изобретение включает также способ размножения стволовых клеток ex vivo, включающий Изобретение также включает способ ингибиобработку указанных гемопоэтических клеток рования пролиферации стволовых клеток, вклюИНТРОЛ'ом и, как минимум, одним стимулируючающий введение гемопоэтических клеток в конщим цитокином ИНПРОЛ вводится в контакт с такт с пептидом, выбранным из группы гемопоэтическими клетками до, во время и/или геморфинпептидов, имеющих последовательпосле контакта со стимулирующим цитокином ность Изобретение включает также фармацевтичеЛей-Вал-Вал-Тир-Про-Трп-Тре-Глн-Арг-Фен, ский состав, включающий (а) ИНПРОЛ и (Ь) как Лей-Вал-Вал-Тир-Про-Трп-Тре-Глн-Арг, минимум, одно ингибирующее соединение, выЛей-Вал-Вал-Тир-Про-Трп-Тре-Глн, бранное из группы, состоящей из MIP-1a, TGFp, Лей-Вал-Вал-Тир-Про-Трп-Тре, TNFa, INFa, INPp, INFy, пентапептида пироГлуЛей-Вал-Вал-Тир-Про-Трп, Глу-Асп-Цис-Лиз, тетрапептида N-ацетил-СерЛей-Вал-Вал-Тир-Про, Асп-Лиз-Про и трипептида глутатион (Гли-ЦисВал-Вал-Тир-Про-Трп-Тре-Глн, уГлу) Тир-Про-Трп-Тре-Глн-Арг-Фен, Тир-Про-Трп-Тре-Глн-Арг, Изобретение включает также фармацевтичеТир-Про-Трп-Тре-Глн, и ский состав, включающий (а) ИНПРОЛ и (Ь) как Тир-Про-Трп-Тре минимум, одно стимулирующее соединение, выВышеупомянутые пептиды имеют последобранное из группы, включающей ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛвательность, сходную с другими опиатоподоб3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-9, ИЛ-11, ИЛ-13, ными пептидами, например, с пептидами из сеИЛ-14, ИЛ-15, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, эритромейства Тир-MIF-I (см обзорную статью Рида поэтин, тромбопоэтин, фактор роста стволовых (Reed) и др , Neurosci, Biobehav Rev 18 519-25, клеток и лиганд flk2/flk3 1994), казеин-производными, казоморфинами Настоящим изобретением описывается инги(Брантл и др , Hoppe-Seyler's Z Physiol Chem битор стволовых клеток (ИНПРОЛ), отличаю360 1211-16, 1979, Лукас (Loukas) и др , Biochem щийся от известных в данной области, например, 22 4567-4573, 1983, Фиат (Fiat) и Джоль (Jolles), MIP-1a, TGFp, тетрапептида Фриндела и др лиМої Cell Biochem 87 5-30, 1989), пептидами, бо пентапептида Пуковица и др (ср, Райт и полученными из цитохрома в, именуемыми циПрагнелл 1992 (цитированное сочинение)) Мотохрофинами (Брантл и др , Eur J Pharm III 293лекулярная масса естественного ИНПРОЛ'а пре4, 1985), а также с пептидами, полученными из вышает 10 000 Дальтон (ультрафильтрация), что комбинаторных библиотек, отобранных для связи отличает его как от тетрапептида, так и от пентас опиатными рецепторами (см обзорную статью пептида Он отличается большей гидрофобноДули (Dooley) и др , Peptide Research 8 124-137, стью, чем MIP-1a или TGFp в хроматографиче1995) Каждая из этих статей включена в наских системах с обращенной фазой, что отличает стоящее описание в качестве ссылки его от указанных цитокинов Далее, способ его действия отличается от способа действия любоИзобретение включает также способ ингибиго ранее описанного ингибитора тем, что он акрования пролиферации стволовых клеток, вклютивен в реакции in vitro, будучи использованным чающий введение гемопоэтических клеток в конлишь в течение преинкубационного периода такт с пептидом, выбранным из группы, включаю(Пример 5) Далее, естественный ИНПРОЛ актищей пептиды, родственные Тир-MIF-I, казоморвен в реакции, измеряющей "клетки с высоким фины и цитохрофины В частности, включены пролиферативным потенциалом" (HPP-PFC), в то пептиды Тир-MIF-I, имеющие последовательновремя как у MIP-1a подобная активность отсутстсти вует (Пример 6) Тир-Про-Три-Гли-г\1Н2, 54379 18 17 На фиг 1 - 4 представлены фракции продукта Данные нормализованы к контрольным величипосле каждого этапа очистки (ДСН-ПАГЭ) нам Фиг 1 - полоса 1 - химотрипсиноген, полоса Фиг15А - хроматограмма ОФ-ВЖХ С4 2 - овальбумин, полоса 3 - бычий сывороточный элюирование очищенным оИНПРОЛ'ом с 53% альбумин, полоса 4 - фракции