Спосіб очистки білкових розчинів від домішки патогенної форми пріонового білка

Спосіб очистки білкових розчинів від домішки патогенної форми прюнового білка, який відрізняється тим, що відокремлення прюнового білка забезпечується афінно-хроматографічною сорбцією на нерозчинному носи з іммобілізованими лігандами аналогами арпнільних залишків в поліпептидному ланцюзі подвійного комплексу прюнового білка з штучно доданим білком-екстрагентом, що містить ВІДМІННІ ВІД лізинзв'язуючих ділянок та розміщені в окремих структурних доменах ділянки зв'язування лігандів структурних аналогів арпнільних залишків у поліпептидному ланцюзі, а як білки-екстрагенти пропонуються плазміноген, ХІМІЧНО ЧИ генетично шактивований по гідролітичному центру плазмін, фрагменти плазміну, що містять як лізин-, так і арпнілзв'язуючі ділянки Винахід відноситься до бютехнологм, медицини та фармацевтичної промисловості і може бути використаний для очистки білкових препаратів від домішки патогенної форми прюнового білка Відомо, ЩО ймовірна присутність патогенної форми прюнового білка (РгР с) та пов'язана з цим можливість інфікування повільними вірусними хворобами спричинила до заборони або істотних обмежень щодо використання цілої низки медикаментозних білкових препаратів з тваринної та донорної сировини [1,2] Мала величина мінімальної інфіційної дози (порядку 105 молекул [3]) та її здатність до акумуляції в інфікованому організмі практично виключають можливість ефективного розпізнавання носія прюнової інфекції як в призначеній для отримання медикаментозних препаратів тваринній та донорнм сировині, так і в кінцевому продукті Тому задача гарантованого позбавлення призначених до медицинських цілей білкових препаратів від можливої домішки PrPSc відноситься до найактуальніших в сучасній бютехнологм Рішення цієї задачі ускладнюється високою конформаційною стабільністю інфіційного агенту, що значно перевершує стабільність більшості відомих білків та виключає можливість селективної денатурації PrP Sc в суміші з отримуваним білковим продуктом онового білка здатна до ефективного комплексоутворення з так званими лізин-зв'язуючими ділянками (ЛЗД) - структурними групами, що ефективно зв'язують дипольні лігандні пари типу лізил-карбоксил чи арпніл-карбоксил [4-6] ЛЗД відіграють ключову роль у міжмолекулярних взаємодіях системи фібринолізу [7] а також використовуються для виділення окремих білків цієї системи методами афінної хроматографії [8] Комплементарні ЛЗД білкові структури, що складаються з розміщених в певній конформації лігандних диполних пар є досить рідкими та присутні лише в обмеженій КІЛЬКОСТІ білків Тому штучне додання ЛЗД-вмістних білків з подальшим їх вилученням може бути ефективно використане для селективного вилучення з білкових препаратів домішки патогенної форми прюнового білку Необхідною умовою подібної очистки є збереження протягом очистної процедури здатності ЛЗД до комплексоутворення з патогенною формою прюнового білку Один з можливих ПІДХОДІВ до виконання подібної умови полягає в утилізації асоціативних властивостей так званих бензамідин- чи арпніл-зв'язуючих ділянок (АЗД), що також знаходяться в окремих від ЛЗД та автономних доменах молекул окремих ЛЗД-вмістних білків, зокрема плазміногену, плазміну та його фрагментів [9,10] В той же час відомо, що патогенна форма прі В якості прототипу вибрано йонобмінний спо 00 ю 00 47858 сіб відокремлення домішок патогенної форми пріонового білка, що полягає у фракційному розділенні пріон-вміщуючого білкового розчину на групу йонобмінних сорбентів з подальшим відокремленням цільового продукту [11] Недолік способу-прототипу полягає у відсутності принципової гарантії відокремлення мінорної домішки PrP Sc за умови малої розмірності мінімальної інфіційної дози та здатності організму до акумуляції прюнового білка, тобто у незабезпеченості гарантованого відокремлення інфіційного носія в умовах промислового виробництва До недоліків способу-пототипу також відноситься складність та багатостадійність йонобмінних процедур, що істотно ускладнюють технологію отримання кінцевого продукту В якості аналогу вибрано афінно-хроматографічний спосіб отримання оь-антиплазміну, здатного до ефективного комплексоутворення з ЛЗДвміщуючими білками (плазміногеном, плазміном, важким ланцюгом плазміну та фрагментом плазміну К1-3 [12] Спосіб-аналог полягає у афіннохроматографічній очистці плазми крові від ЛЗДвміщуючих білків з подальшим виділенням (Х2-антиплазміну на афінному сорбенті, що містить іммобілізований ЛЗД-вміщуючий білок - плазміноген людини Варіантом способу-аналогу є спосіб виділення сі2-антиплазміну на іммобілізованому на нерозчинному агарозному носи фрагменті плазміну К1 -3 [13] В обох варіантах способу-аналогу утилізовано здатність ЛЗД-вмістних білків до ефективного комплексоутворення з адекватним за специфічністю структурним угрупуванням на поверхні молекули (Х2-анти плазміну Недолік аналогу полягає у залежності ЛЗДвміщуючого афінного сорбенту від конформаціиної СТІЙКОСТІ іммобілізованого білку - плазміногену [12] чи фрагменту К1-3 [ІЗ] 3 практики відомо, що отримання зазначених сорбентів та їх підтримка у дієспроможному стані є вельми складною задачею, чим, зокрема, пояснюється придатність прототипа та аналога до застосування тільки в лабораторних цілях 3 наведеного також витікає практична непридатність застосування іммобілізованих ЛЗД-вміщуючих білків для гарантованого технологічного відокремлення від білкових розчинів від можливої домішки прюнового білку Відмічені недоліки прототипу та аналогу подолані у способі, що заявляється, завдяки застосуванню білка-екстрагенту - розчинної добавки ЛЗДвмістних білків, що поряд з лізин-зв'язуючими ділянками містять зв'язуючі ділянки принципово відмінної лігандної специфічності До подібного типу білків можуть бути віднесені плазміноген, ХІМІЧНО чи генетично шактивований плазмін та фрагменти плазміну, що разом з лізин-зв'язуючими ділянками містять так звані арпніл-зв'язуючі ділянки, здатні до ефективного комплексоутворення з їм мобілізованим и на нерозчинних носіях лігандами-аналогами арпнільних залишків у поліпептидному ланцюзі - бензамідином та со-гуанідильованими похідними аліфатичних вуглеводнів [10, 14] ВІДМІННІСТЬ у лігандній специфічності ЛЗД та АЗД, а також селективне розміщення цих ділянок у високоавтоно мних структурних доменах молекули забезпечує ефективне вилучення білка-екстрагента та зв'язаної ним домішки патогенної форми прюнового білка на нерозчиному афінному сорбенті з іммобілізованими лігандами - структурними аналогами арпнільних залишків у поліпептидному ланцюзі Гарантований характер вилучення носія прюнової інфекції забезпечується величезним молекулярним надлишком білка-екстрагента по відношенню до мінорних кількостей прюнової домішки, так і афінного сорбенту по відношенню до білка-екстрагента Істотною перевагою запропонованого способу є можливість контролю за його ефективністю за допомогою маркерних кількостей радіоактивне мічених білків, здатних до комплексоутворення з ЛЗД, зокрема - фрагментів фібрину Спосіб виконується згідно наведених прикладів Приклад 1 Отримання гуанідинооктил-вміщуючого сорбенту Гуанідування комерційних препаратів со-аміновміщуючнх похідних агарози проводили за допомогою сульфату метилізосечовини [16] До охолодженої до 4°С суспензії 15мл гелю в 50мл насиченого розчину ІЧагССз при перемішуванні додавали 2 5г сульфату метилізосечовини Отриману суспензію перемішували протягом ночі при 4°С, після чого гель послідовно відмивали 0 1 М розчином Na2CO3, 0 1 М розчином NaHCO3, 0 5 М розчином NaCI та 0 05 М натрій-фосфатним буфером, рН 7 4 Зберігали у тому ж буфері Приклад 2 Афінно-хроматографічне зв'язування плазміногену гуанідино-октил-агарозою Дослідження отриманого гелю щодо здатності афінно сорбувати плазміноген проводили колонковою хроматографією аналогічно [10] На відміну від вихідної со-амінооктил-агарози, ефективна сорбція плазміногену не руйнувалася ні 0 5 М розчином NaCI у 0 05 М натрій-фосфатному буфері, рН 7 4, ні 0 2 М розчином 6-аміногексановоі кислоти Наявність цих розчинів не впливало на здатність сорбенту до зв'язування плазміногену Натомість, 0 1 М розчин аргініну у 0 05 М натрій-фосфатному буфері, рН 7 4, призводив до повної десорбції зв'язаного плазміногену та запобігав його сорбції Наведений приклад свідчить про зв'язування плазміногену з со-гуанідинооктил-вміщуючим сорбентом за допомогою ВІДМІННИХ ВІД ЛЗД арпніл-зв'язуючих ділянок Приклад 3 Порівняння сорбційної здатності оогуанідинооктил-агарози з сорбційними властивостями пара-амінобензамідин-агарози ("Sigma", США) Порівняння сорбційної здатності со-гуанідинооктил- та пара-амшо-бензамідин-вміщуючих сорбентів проводилася за допомогою J 1 2 5 -мічених препаратів плазміногену за утриманням мітки на афінній колонці [17] за допомогою радіометру Beckmann Gamma 5500 (США) Йодований до 4 5МБк на мг білку плазміноген додавали до неміченого у розрахованих кількостях Встановлено, що в обох випадках специфічна сорбція є приблизно рівною та сягає 12 - 17мг білка на мл гелю Сорбенти однаково ефективно утримують плазміногензв'язану радіоактивну мітку та є нечутливими до десорбційної дії 0 5 М розчину NaCI у 0 05 М на 47858 трій-фосфатному буфері, рН 7 4 та 0 2 М розчину 6-амшогексановоі кислоти Натомість, 0 1 М розчин аргініну чи 0 1 М розчин бензамідину у 0 05 М натрій-фосфашому буфері, рН 7 4, призводив до повної десорбції плазміноген-зв'язаної мітки Приклад 4 Десорбція прюнового білка з розчину овальбуміну за допомогою афінного зв'язування плазміногену на со-гуанідинооктил-агарозі Штучну контамінацію патогенною формою прюнового білку розчину ЮОмг овальбуміну ("Sigma", США) у 50мл 0 05 М натрій-фосфатному буфері, рН 7 4, проводили додаванням 15 - 20мг гомогенат}/ головного мозку бика з вираженою формою спонпформної енцефалопатм (BioRad Life Science Labs, США) До отриманого розчину додавали 5мг плазміногену людини та за повільного перемішування проводили інкубацію протягом години при 12°С Отриманий білковий розчин піддавали мікрофільтрацм для відокремлення нерозчинних часJl ітература 1 Prusmer S Priori disease and BSE crisis // Science -1997 -278 - P 245-251 2 Lederraan L/ Transmissible spongiform encephalopanes // Genetic Engineering News -1999 ApnllS -P9-55 3 Chesebro В BSE and pnons Uncertainties about the agent//Science - 2 January 1998 -279 P 42-43 4 Fischer M , Roecki С , Panzek P Et al Binding of disease-associated pnon protein to plasmmogen // Nature -23 November 2000 -408 - P 479-483 5 Okamoto S , Oshiba S , Mihara H , Okamoto W Synthetic inhibitors of fibrmolysis in vitro and in vivo mode of action // Ann NY Acad Sci - 1968 -146, N3-P 414-429 6 Wmn E , Hu S , Hochschwender S , Laursen R Studies on the lysme-binding sites of human plasmmogen the effect of hgand structure on the binding of lysme analogs to plasmmogen // Eur J Biochem -1980 -104, N 4 - P 579-586 7 Wman В , Wallen P The specific interaction of plasmmogen and fibrin A physiological role of the lysme-binding sites in human plasmmogen // Thromb Res -1977 -10, N 2 - P 213-222 8 Deutsch D , Mertz E Plasmmogen purification from human plasma by affinity chromatography // Science -1970 -N3962 -P 1095-1096 9 Holleman W , Anders W , Weiss L The relationship between the lysme and p-ammobenzamidme ток та пропускали через афінну колонку з 8мл согуанідинооктил-агарози, отриманої згідно Прикладу 1 Визначення прюнового титру білкового розчину до та після проходження через афінну колонку провадили іммуноферментним методом з застосуванням набору BioRad, США [15] Згідно отриманих даних, зазначена процедура призводила до зменшення прюнового титру з величин порядку ЗО - 50 LDso до рівня, що знаходився нижче нижньої межі чутливості методу, тобто щонайменше в 4000 разів Наведені приклади свідчать, що запропонований спосіб забезпечує ефективне зв'язування плазміногену поза ЛЗД, що лишаються вільними для зв'язування можливої домішки патогенної форми прюнового білка та гарантує ефективну очистку білкових розчинів від домішки патогенної форми прюнового білка binding sites of human plasmmogen // Thromb Res 1975 -7, N5-683-693 10 Verevka S , Kudmov S , Grmenko T Argmylbmdmg sites of human plasmmogen // Thromb Res 1986 - 4 1 , N 5 -P 689-698 11 Uren E, Kleimg M, Thomas P, Goss N Partitmg of PrPSc in the Chromatographie process of plasma derived proteins // Plasma product Biotechnology Meeting -2001 -May 14-17 - P 55 12 Wiman B, Collen D Purification and characteristics of human antiplasmm, the fast-acting plasmm inhibitor//Eur J Biochem -1977 - 78, N 1 P 19-26 13 Wiman В Affinity Chromatographie purification of human a2-antiplasmm // Biochem Journ -1980 -191, N 1 - P 229-232 14 Веревка С В Изучение лигандной специфичности лизин- и аргинил-связывающих участков плазминогена человека // Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук -Киев -1988 15 Moynagh J , Schimmel H Tests for BSE evaluated//Nature -8 July 1999 -400 -P 105-111 16 Roche J-, Morque M, Baret R Sur la guamdation des proteins // Bull Soc Chem Biol 1954 -36, N 1 -P 85-94 17 Me Conahey P , Dixon F Radioiodivation of protein by the use chloramme T method//Meth Enzymol - 1980 - 70 - P 210-213 ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044) 456 - 20 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71