Спосіб прогнозування виживаності хворих на рак яєчника, які не проходили неад’ювантну поліхіміотерапію після оперативного втручання

Спосіб прогнозування виживаності хворих на рак яєчника, які не проходили неад'ювантної полі 3 ливостей пухлинного росту взагалі і рака яєчника, зокрема, не втрачають своєї актуальності, незважаючи на велику кількість робіт, присвячених цим питанням. Сучасні дослідження свідчать про наявність тісного взаємозв'язку між кровопостачанням пухлини, ступенем розвитку кровоносних судин у пухлині та здатністю до рецидивування та метастазування. Відкриття та вивчення факторів ангіогенезу, синтез препаратів - інгібіторів ангіогенезу дає можливість прогнозувати перебіг захворювання та обґрунтувати ефективність антиангіогенної терапії [6, 7]. На даний час відомо багато факторів, що приймають участь у регуляції пухлинного неоангіогенезу. До ангіогенних стимуляторів відносяться представники родини ростових факторів VEGF та їх рецептори, PD-ECGF та ТР, Anq 1 і Anq 2 , родина ephrin, а також ангіогенні інгібітори: тромбоспондін 1, ендостатин, ангіостатин, інгібітор VEGF та ін. [8, 9]. Так, відомий спосіб діагностики раку яєчника що передбачає проведення гістологічного дослідження, забарвлених гематоксиліном та еозином для встановлення патогістологічного діагнозу пухлинних тканин (1). Недоліком цього способу є те, що він не дозволяє отримати достовірні дані про наявність заново створених молодих судин, які утворюються навколо пухлини і живлять її. Об'єктивним показником, що характеризує ангіогенез пухлини є щільність мікросудин (ЩМС), яка може бути визначена безпосередньо за експресією такого маркеру, як CD34 [10]. Слід зазначити, що CD34 не експресується ендотеліоцитами великих артерій та вен, що дає можливість його використання саме як маркера новоутворених кровоносних судин [11]. Задача, яка вирішується способом, що заявляється - прогнозування виживаності хворих на серозний рак яєчника шляхом імуно-гістологічного дослідження їх пухлинних тканин, використовуючи маркер ангіогенезу CD34. Технічний результат - більш точний статистично вірогідний прогноз виживаності хворих на серозний рак яєчника після хірургічного втручання. Поставлена задача досягається тим, що у відомому способі, який передбачає гістологічне дослідження препаратів, забарвлених гематоксиліном та еозином для встановлення патогістологічного діагнозу, проводиться імуногістологічне дослідження для визначення щільності мікросудин (ЩМС) та порівняння отриманих величин з визначеним пороговим значенням, на основі якого робиться висновок про статистично вірогідну виживаність хворих. Відмінною особливістю способу, що заявляється, є можливість використання маркера CD34, який не експресується ендотеліоцитами великих артерій та вен і дозволяє визначити щільність мікросудин, яка є об'єктивним показником, що характеризує ангіогенез пухлини. Спосіб здійснюють наступним чином. Імуногістохімічне виявлення біомаркерів проводять на паралельних депарафінованих зрізах пухлинної тканини, отриманих після операції у 47985 4 хворих, які не проходили неад'ювантної поліхіміотерапії. Для видалення парафіну із зрізів скельця занурюють у орто-ксилол на 20хв. з наступною обробкою 96° етанолом протягом 20хв. і промивають у двох порціях дистильованої води по 3хв. і цитратному буфері pH6,0, який виготовляють із 10,0мл 0,1М розчину лимонної кислоти і 40,0мл 0,1М розчину цитрату натрію, доведеного до об'єму 500,0мл дистильованою водою. Демаскування антигенів проводять шляхом обробки зрізів у цитратному буфері pH6,0 в мікрохвильовій печі потужністю 700Вт протягом 10хв. Наступні етапи імуногістохімічної реакції такі: охолоджують препарати при кімнатній t° до +25°С, промивають у двох порціях дистильованої води по 2хв. Проводять блокування ендогенної пероксидази 3,0% розчином перекису водню протягом 10хв. при кімнатній t°, промивають у двох порціях дистильованої води по 2хв. і у трьох порціях фосфатного буферу (PBS) pH7,4 (суміш солей: NaCl - 8,0г, КСІ - 0,2г, КН2РО4 - 0,2г і Na2HPO4 - 1,15г, яку доводять дистильованою водою до об'єму 1,0л.) по 5хв. Надлишок буферу обережно, не доторкаючись до зрізу і не допускаючи висихання останнього, забирають з двох боків клаптиками фільтрувального паперу і розташовують у вологій камері, де виконуються всі наступні процедури. Блокування неспецифічних білків (для запобігання неспецифічного забарвлення) здійснюють шляхом інкубації зрізів у присутності 1,0% розчину сироватки бичачого альбуміну на PBS протягом 30хв. при кімнатній t°. Інкубацію з первинними МКАТ проводять протягом 18 годин при t+4°C в холодильнику. Для візуалізації білка застосовують систему En Vision, яку наносять і залишаютьна зрізі при кімнатній t° протягом 30хв. Забарвлення білка здійснюють за допомогою хромогену - 3-діамінобензидину тетрахлориду (ДАБ), продукт реакції якого має коричневий колір. Ядра клітин дофарбовують гематоксиліном Маєра, який виготовляють шляхом змішування 5,0мл 2,0% розчину гематоксиліну на 96% етанолі і 100,0мл 5,0% розчину алюмокальцієвих квасців. Для перевірки специфічності взаємодії антитіл і, таким чином, отримання реальних результатів, кожного разу при проведенні імуногісточімічних досліджень ставлять контрольні реакції. У якості позитивного контролю використовують препарати із зрізами тканин, де було встановлено гіперекспресію даного маркеру. Оцінку щільності судин у пухлинах яєчника проводять методом прямого підрахунку кількості судин в 10 полях зору світлового мікроскопа на середньому збільшенні (х160). Розмір одного поля зору обмежується вимірювальною квадратною сіткою із стороною 0,79мм. Наступне визначення 2 числа мікросудин на 1мм вираховується за формулою: ЩМС n / 0,625 мм 2 Отримане значення величини ЩМС порівнюють з пороговим значенням 59,0судин/мм2 [12]. Якщо отримане значення ЩМС менше за порогове 2 значення 59,0судин/мм , робить висновок про статистично вірогідну 5-річну виживаність хворого на 5 47985 серозний рак яєчника після хірургічного видалення пухлини. Таким чином, запропонований спосіб дає можливість зробити більш точний статистично вірогідний прогноз виживаності хворих на серозний РЯ після хірургічного втручання та може широко застосовуватися в клінічній практиці. Джерела інформації: 1. Урманчеева А.Ф., Мешкова И.Е. Вопросы эпидемиологии и диагностики рака яичников // Практ. онкол. - 2000. - №4.-С.7-13. 2. Bamberger E.S., Perrett С.W. Angiogenesis in epithelian ovarian cancer // J. Clin. Pathol.: Мої. Pathol. - 2002. - 55. -P.348-359. 3. Винокуров В.Л., Юркова Л.Е., Загольская В.Н. Степень дифференцировки и клиническое течение рака яичников // Вопросы онкологии. 1985. - 31, №3. - С.55-62. 4. Карселадзе А.И. Некоторые проблемы клинической морфологии эпителиальных опухолей яичников // Практическая онкология. - 2000. - №4. С.14-18. 5. Копнин Б.П. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию базовых механизмов канцерогенеза // Биохимия. 2000. - 65, №1. -С.5-33. 6. Новик А.А., Камилова Т.А., Цыган В.Н. Новая парадигма и новые мишени терапии рака // Вопросы онкологии. - 2003. - 49, №6. - С.695- 704. Комп’ютерна верстка А. Рябко 6 7. Byrne A.T., Ross L., Holash J. et al. Vascular endothelial growth factor-trap decreases tumor burden inhibits ascites, and causes dramatic vascular remodeling in an ovarian cancer model // Clin. Cancer Res. - 2003. - 9. - P.5721-5728. 8. Barton D.P.J., Cai A., Wendt K. et al. Angiogenic protein expression in advanced epithelial ovarian cancer // Clin. Cancer Res. - 1997. - 3. P.1579-1586. 9. Manenti L., Paganoni P., Floriani I. et al. Expression levels of vascular endothelial growth factor, matrix metalloproteinases 2 and 9 and tissue inhibitor of metalloproteinases 1 and 2 in the plasma of patients with ovarian carcinoma // Eur. J. Cancer. 2003. - №39. - P.1948-1956. 10. Бахидзе Е.В., Малек А.В. Значение методов исследований генома для диагностики и терапии рака яичника // Вопросы онкологии. - 2005. 51, №1. - С.50-55. 11. Берштейн Л.М. Современная эндокринология гормонозависимых опухолей // Вопросы онкологии. - 2002. - 48, №4.-С.496-504. 12. Бучинська Л.Г., Грінкевич В.М., Юрченко Н.П., Воробйова Л.І. Експресія р53, VEGF та CD34 у пухлинній тканині та виживаність хворих на серозний рак яєчника // Онкология - 2009. - 11, №2. С.109-112. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601