Спосіб отримання трансферфакторного препарату для імунотерапії онкологічних хворих

Спосіб отримання трансферфаісгорного препарату для імунотерапії онкологічних хворих, що включає використання діалізованого екстракту лейкоцитів донорів, який відрізняється тим, що джерело фактора переносу - лейкоцити, одержані з ексудату післяопераційної хірургічної рани онкологічних хворих Винахід відноситься до галузі медицини, зокрема до онкології Фактор переносу (ФП) являє собою низькомолекулярну речовину, здатну переносити клітинноопосередковану імунну реакцію на антиген, так звану пперчутливість сповільненого типу (ГСТ), від імунного донора до неімунного реципієнта Феномен такого переносу був відкритий ДВІЧІ спочатку Л Дейтчем у лабораторії І І Мечнікова [1], а потім Г Лоуренсом [2] Вважається, що джерелом ФП є Т-лімфоцит Проте невиключно, що окрім Т-лімфоцитів його можуть продукувати всі, чи принаймні більшість імунокомпетентних клітин Спроби встановити які ж саме клітини продукують цей ендогенний фактор призвили до вивчення діалізованих екстрактів з різних імунокомпетентних клітин, об'єднаних під назвою діалізовані екстракти лейкоцитів (ДЕЛ) З'ясувалося, що ДЕЛ мають властивості притаманні ФП Особливо цікаві ефекти викликають ендогенні речовини отримані з суміші лейкоцитів Насьогодні відомо, що трансферфакторні білки (ТФ-білки) являють собою невеликі поліпептиди з молекулярною вагою від 3,5 кД до 12 кД [3], які зданті афінно зв'язуватися з молекулами антигену [4] Здатність тварин продукувати ФП регулюється генетичне, але перенесення ГСТ за допомогою ФП генетично не обмежено [5] КЛІНІЧНІ дослідження показали, що ФП може бути ефективним засобом імунотерапії хворих з широким спектром імунопатології, включно рецидивуючі та дисемшовані шфекцм[6,7], ЗЛОЯКІСНІ новоутворення [8] Імунофармаколопчні препарати ТФ-білків, що виробляються за кордоном під комерційними назвами lmreg-1 та ISS (США), Transfer Faktor (Німеччина), RCTF-I (Японія), HEBERTRANS (Куба) Аффінолейкш (Росія) отримують на основі донорської крові, лейкоцитарної маси, залишкових продуктів виробництва лейкоцитарного інтерферону та лімфоідної тканини Слід визначити, що насьогодні відсутні загальноприйнятий методндартизацм препаратів ТФ-білків за імуноспецифічною активністю Звичайно застосовують умовні одиниці, які відповідають клітинному еквіваленту вихідної сировини Частіше за 1 одиницю приймають активність препарату, отриманого з 5x108 лейкоцитів, яку можливо виділити з стандартної упаковки донорської крові 0,4л У переважній КІЛЬКОСТІ робіт, що вивчали ефективність ФП в імунотерапії онкологічних хворих були застосовані препарати ТФ-білків, отримані з лейкомаси донорів [8,9,10] чи лейкоцитів осіб, які перебували у контакті з хворими [11] Однак, ці препарати ТФ-білків володіли високою фармакологічною активністю, яка, на відміну від пухлиноспецифічної активності, може бути небажаною та непрогнозованою при проведені імунотерапії онкологічним хворим У деяких випадках вдається ВІДДІЛИТИ пухлиноспецифічні ТФ-білки безпосередньо з крові онкологічних хворих [12] Однак, цей ПІДХІД обмежений неможливістю отримання великої КІЛЬКОСТІ лейкоцитів з крові онкологічних хворих для подальшого виділення достатньої активності ФП, що необхідна для проведення імунотерапії Прототипом винаходу може вважатися одне з перших КЛІНІЧНИХ досліджень, яке продемонстру ю ю ю 00 48555 вало можливість переносу клітинноопосередкованої імунної реакції на пухлинні клітини за допомогою ФП [Levin A S , Byers V S , Fudenberg H H , Wybran T, Tohnstan Т О , Hackett A T Osteogemc sarcoma , immimologic parameters before and during immunotherapy with tumor specific transfer factor // J Clmlnv- 1975- V 55 - P 48 497] Ці автори виділяли ФП з крові хворих на остеогенну саркому, лімфоцити яких виявляли цитотоксичність проти аутолопчних пухлинних клітин, і вводили його іншим хворим з цією патологією Лімфоцити хворих, яким вводили ФП набували цитотоксичностіпо відношенню до аутолопчних пухлинних клітин у тесті in vitro Це є дуже важливим аргументом, який свідчить про індукцію специфічної протипухлинної клітино-опосередкованої імунної реакції у рецепієнтів ФП Однак, суттєвого покращення КЛІНІЧНОГО ефекту у порівнянні з комбінованим лікуванням автори не спостерігали 5,0мл ІЗОТОНІЧНОГО розчину хлориду натрію піддавали п'ятиразовому замороженню - відтаненню при -20°С/+37° С, ВІДПОВІДНО В'язкість екстрактів клітин зменшували за допомогою інкубації з ДНК азою, активованою юноми магнію на протязі ЗОхв при 37°С, після чого всі зрачки центрифугували при 5000д 20хв і ультрафільтрували Ультрафільтрацію проводили на конічних фільтрах "Centnflo25" з номінальною ВІДСІЧКОЮ молекулярною вагою 25кД ("Amicon", Голландія) за допомогою центрифугування протягом 15хв при 400д Після ультрафільтрації в кожній з фракцій визначали вміст загального білку за матодом Lown і співавт Для їх стандартизації Отриману низькомолекулярну фракцію стерилізували за допомогою мікрофільтрацм через мембрану з діаметром пор 0,22мкм ("Milhpor", США), розфасовували в стерильні ампули і зберігали при -20°С, для подальшого тестування Позитивним у прототипі є отримання специфічного ФП з лейкоцитів онкологічних хворих Недоліком прототипу є те, що отримати велику КІЛЬКІСТЬ лейкоцитів з крові онкологічних хворих (а це 109/л-1011/л) для виділення необхідної активності ФП, достатньої для проведення імунотерапії не завжди можливо В основу винаходу покладено задачу створити спосіб для отримання пухлиноспецифічного ФП шляхом його виділення з нетрадиційного джерела - лейкоцитів екссудату хірургічної рани (ЕХР), який може бути використаний в імунотерапії онкологічних хворих Дана задача вирішується розробкою технології отримання ДЕЛ з ЕХР, який збирали у стерільні ємкості на 1-у і 2-у доби після операції За звичай при торакотомм вдається отримати від 200,0мл до 450,0мл ексудату у 1-шу добу і до 150,0мл у 2-гу Після заповнення ємності ЕХР центрифугують при 200д протягом 15хв , надосад видаляють, осаджені клітини ресуспендують в охолодженому (4°С) гемолітичному буфері з експонуванням 8хв для звільнення від еритроцитів Лейкоцити, що залишилися, ДВІЧІ відмивають ІЗОТОНІЧНИМ розчином хлориду натрію центрифугуванням при 200д протягом Юхв Отриманий осад клітин ресуспендують у тому ж розчині КІЛЬКІСТЬ лейкоцитів підраховуть у гемоцитометрі і ЩІЛЬНІСТЬ клітин доводять до концентрації 1 х 108кл/мл При такій схемі отримання лейкоцитів з ЕХР вдається виділити від 1,8 х 10 9 до 8,0 х 10 10 життєздатних клітин Прикладами реалізації заявленого винаходу можуть вважатись результати отримання ФП з клітин ЕХР хворих на рак стравоходу Хворий С 69 років (історія хвороби АІ-0429) знаходився у січні-березні 2001 року у відділенні пухлин органів грудної порожнини Інституту онкологи АМН України з приводу раку стравоходу (T3N1MO) При патопстолопчному обстеженні підтверджено плоскоклітинний рак Було проведено передопераційне опромінення за розробленою методикою 26 02 2001 р хворому було виконано операцію Льюіса У плевральну порожнину було встановлено дренаж, що приєднувався до 3-хампульної системи, яка призначена для створення негативного тиску у прооперованій плевральній порожнині та для збирання ЕХР У ємність для накопичення ЕХР було введено одразу після операції 0,5мл розчину гепарину Через добу після операції було отримано - 250,0мл ЕХР, з якого виділено - 1,74 х 109 лейкоцитів На градієнті ЩІЛЬНОСТІ фікол-верографіну отримано 8 x 1 0 мононуклеарів, з яких Т-лімфоцити склали - 37% (2,96x10 клітин) Вивчення клітинного складу ЕХР проводили за допомогою мікроскопіювання цитологічних мазків, пофарбованих за Романовським, та в тесті Ерозеткоутворення, після виділення мононуклеарів з ЕХР на градієнті ЩІЛЬНОСТІ фікол-верографину (d=l,077 /см3) У наших дослідженнях біля 90% клітин ЕХР були представлені поліморфноядерними нейтрофілами і 10% - лімфоцитами На градієнті ЩІЛЬНОСТІ вдається виділити від 3,5 х 107 до 3,6 х 108 мононуклеарів, з яких Т-лімфоцити склали 13,43% , що в перерахунку на КІЛЬКІСТЬ мононуклеарів складає від 0,94 х 10 до 7,7 х 107 Т-клітин Як видно, клітинний склад ЕХР мало чим відрізняється від аналогічного у периферійній крові Подальше отримання ДЕЛ проводили таким чином Стандартну КІЛЬКІСТЬ КЛІТИН (5 х 108кл) в Хворий Б 52 роки (історія хвороби АІ-1236) знаходився у лютому-квітні 2001 року у відділенні пухлин органів грудної порожнини Інституту онкологи АМН України з приводу раку стравоходу (T3N1MO) При патопстолопчному обстеженні підтверджено плоскоклітинний рак Було проведено передопераційне опромінення за розробленою методикою 18 04 2001 р хворому виконано операцію Льюіса Під час операції у плевральну порожнину було встановлено дренаж, для збирання ЕХР, як наведено вище Через добу після операції було отримано - 400,0мл ЕХР, з якого виділено 1,8 х 10 лейкоцитів На градієнті ЩІЛЬНОСТІ фіколверографіну отримано - 1,5 х 108 мононуклеарів, з яких Т-лімфоцити склали - 41% (6,15 х 107 клітин) Хворий Ф 47 років (історія хвороби АІ-1841) знаходився у березні-травні 2001 року у відділенні пухлин органів грудної порожнини Інституту онкологи АМН України з приводу раку стравоходу (T3N1MO) При патопстолопчному обстеженні підтверджено плоскоклітинний рак Було проведено передопераційне опромінення за розробленою методикою 18 04 2001р хворому 48555 було виконано операцію Льюіса Під час операції у плевральну порожнину було встановлено дренаж, для збирання ЕХР, як наведено вище Через добу після операції було отримано - 400,0мл 9 ЕХР, з якого виділено - 6,6 х 10 лейкоцитів На градієнті ЩІЛЬНОСТІ фікол-верографіну отримано 7 3,5 х 10 мононуклеарів, з яких Т-лімфоцити 6 склали - 27% (9,45 х 10 клітин) Таким чином, у описаному способі, донором лейкоцитів є сам організм пухлиноносія, а джерелом ФП безпосередньо лейкоцити, які отримують після оперативного втручання з ЕХР На першу і другу доби після операції вдається виділити достатню КІЛЬКІСТЬ життєздатних лейкоцитів, склад яких мало чим відрізняється від такого у периферічній крові Використання лейкоцитів з ЕХР значно розширює можливості отримання пухлиноспецифічного ФП (аутолопчного, чи алогенного), які можуть бути використані в адоптивній імунотерапії онкологічних хворих Джерела інформації 1 Мечников И И / / Академ собрн соч - М 1953-Т8-253с 2 Lawrence H S The transfer in humans of delayed skin sensitivity to streptococcal M substance and to tuderculm with disrupted leucocytes // J C I m l n v - 1 9 5 5 - V 3 4 - P 219-232 3 Lawrence H S , Borkowsky W TransferFactor - current sfatus and future prospects // Biotherapy-1996-N9-P 1 -5 4 Dwyer J M Transfer factor in the age of molecular biology A review // Biotherapy - 1996 - N9 P 7-11 5 Kirkpatnck С H Transfer factor // J Allergy Clm I m m u n o l - 1 9 8 8 - V 81 - N5 - P 8 0 3 - 8 1 3 6 Viza D AIDS and transfer factor Myths, certainties and realities // Biotherapy - 1 9 9 6 - N9 - P 17 -26 7 Мац A H , Перепечкина Н П , Райхер И И и соавт Аффинолейкин - биофармацевтический препарат для инструктивной противоинфекционной иммунотерапии при недостаточности клеточного иммунитета //Ж Микробиол - М -1998 - N2 С 78-83 8 Pilotti V , Mastronlli M , Pizza G , De Vinci С etal Transfer factor as an adjuvant to non-small cell lung cancer (NSCLC) therapy//Biotherapy - 1996N9-P 117-121 9 Fujisawa T , Yamaguchi Y , Kimura H , Anta M , Baba M , Shiba M Adjuvant immunotherapy of primary resected lung cancer with transfer factor // Cancer -1984 - V 54 - P 663 - 669 10 Whyte R J , Schork M A , Sloan H , Ornnger M В , Kirsh M M Adjuvant theatment using transfer factor for bronchogenic carcinoma long-term followup // Ann Thorac -1992 - V 53 - N3 - P 391 - 396 11 Levin A S , Byers V S , Fudenberg H H , Wybran J , Johnston J О , Hackett A J Osteogemc carcoma immunologic parameters before and during immunotherapy with tumour specific transfer factor // JCImlnv1975-V 55,- P 487 497 (прототип) 12 Pizza G , Viza D , Boucheix С , Corrado F Effect of in vitro produced transfer factor on the immune response of cancer patients // Eur J Cancer1 9 7 7 - V 1 3 - N 9 - P 917-923 ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71