Спосіб прогнозування виживаності хворих на серозний рак яєчника за допомогою визначення прогестерон-естрогенового статусу пухлин

Спосіб прогнозування виживаності хворих на серозний рак яєчника за допомогою визначення 3 В останнє десятиріччя завдяки розробці новітніх імуногістохімічних технологій стало можливим визначення білкових продуктів генів за допомогою специфічних моноклональних антитіл. Цей метод дає можливість оцінити експресію біомолекулярних маркерів у пухлинній тканині і визначити морфологічні структури, що їх експресують [4]. Так, відомий спосіб визначення рецепторного статусу при раку яєчника за допомогою біохімічного радіолігандного методу передбачає дослідження пухлини і встановлення концентрації в ній гормональних рецепторів [7]. Недоліком цього способу є те, що він потребує отримання зразків пухлинної тканини, які підлягають подальшій деструкції та не дозволяє визначити істинну концентрацію рецепторів саме в клітинах пухлини. Об'єктивним показником, що характеризує прогестерон-естрогеновий статус пухлин, є експресія рецепторів прогестерону та естрогенів, що визначається за допомогою імуногістохімічного методу, який дозволяє використовувати для дослідження архівні зразки та дає можливість визначити істинну концентрацію рецепторів саме в пухлинній тканині з чутливістю, що значно переважає біохімічний метод. Способом, що заявляється, вирішується задача прогнозування виживаності хворих на серозний рак яєчника, які не отримували неоад'ювантної поліхіміотерапії, шляхом імуногістохімічного дослідження їх пухлинної тканини завдяки використанню біомолекулярних маркерів до рецепторів прогестерону та естрогенів. Поставлена задача досягається тим, що у відомому способі, шляхом дослідження гормонального статусу, згідно корисної моделі, проводять імуногістохімічне дослідження зразків пухлинної тканини яєчника за допомогою моноклональних антитіл (РЕ, клон 1D5 та РП, клон PgR636 ("DakoCytomation", Данія) до рецепторів прогестерона і естрогенів, визначають кількість позитивно забарвлених клітин (індекс мітки, ІМ, %) для кожного з маркерів, порівнюють індекс мітки з відповідними пороговими величинами та визначають статистичну вірогідність 5-річного прогнозу виживаності хворих на серозний рак яєчника. Спосіб здійснюють наступним чином. Імуногістохімічне виявлення біомаркерів проводять на депарафінованих зрізах пухлинної тканини, отриманих після операції у хворих, які не отримували неоад'ювантної поліхіміотерапії. Для видалення парафіну із зрізів скельця занурюють у орто-ксилол на 20хв. з наступною обробкою 96° етанолом протягом 20хв. і промивають у двох порціях дистильованої води по 3хв. Для демаскування антигену зрізи інкубують у цитратному буфері рН 6,0 (10,0мл 0,1М розчину лимонної кислоти і 40,0мл 0,1М розчину цитрату натрію, доведеного до об'єму 500,0мл дистильованою водою) в мікрохвильовій печі потужністю 700Вт протягом 10хв. Наступні етапи імуногістохімічної реакції такі: охолоджують препарати при кімнатній t° до +25°С, промивають у двох порціях дистильованої води по 2хв. Проводять блокування ендогенної пероксида 48765 4 зи 3,0% розчином перекису водню протягом 10хв. при кімнатній t°, промивають у двох порціях дистильованої води по 2хв. і у трьох порціях фосфатного буферу (PBS) рН 7,4 (суміш солей: NaCl - 8,0г, КСl - 0,2г, KН2РО4 - 0,2г і Na2HPО4 - 1,15г, яку доводять дистильованою водою до об'єму 1,0л.) по 5хв. Надлишок буферу обережно, не доторкаючись до зрізу і не допускаючи висихання останнього, забирають з двох боків клаптиками фільтрувального паперу і розташовують у вологій камері, де виконуються всі наступні процедури. Блокування неспецифічних білків (для запобігання неспецифічного забарвлення) здійснюють шляхом інкубації зрізів у присутності 1,0% розчину сироватки бичачого альбуміну на PBS протягом 30хв. при кімнатній t°. Інкубацію з первинними моноклональними антитілами (МКАТ) до білків РЕ, клон 1D5 та РП, клон PgR636 ("DakoCytomation", Данія) проводять протягом 18 годин при t+4°C в холодильнику. Для візуалізації білка застосовують систему EnVision ("DakoCytomation", Данія), яку наносять і залишають на зрізі при кімнатній t° протягом 30хв. Забарвлення білка здійснюють за допомогою хромогену - 3-діамінобензидину тетрахлориду (ДАБ), продукт реакції якого має коричневий колір. Ядра клітин дофарбовують гематоксиліном Маєра ("DakoCytomation", Данія). Для перевірки специфічності взаємодії антитіл і, таким чином, отримання реальних результатів, кожного разу при проведенні імуногістохімічних досліджень ставлять контрольні реакції. У якості позитивного контролю використовують препарати зі зрізами тканин, де було встановлено гіперекспресію даного маркеру. Негативним контролем були зрізи без обробки первинними МКАТ. Результати імуногістохімічної реакції оцінюють напівкількісним методом, шляхом підрахунку відсотка позитивно забарвлених ядер до загальної кількості проаналізованих клітин - індекс мітки (ІМ, %). У кожному випадку аналізують по 1000 пухлинних клітин. Отримане значення ІМ експресії рецепторів прогестерона та естрогенів у пухлині хворої порівнюють з пороговим рівнем (медіаною), що дорівнює 37% для рецепторів прогестерону та 29% для рецепторів естрогенів. Якщо обидва отриманих значення індексу мітки більші за відповідні порогові значення, робиться висновок про статистично вірогідну 5-річну виживаність хворої на серозний рак яєчника та про вірогідну доцільність гормонотерапії. Таким чином, запропонований спосіб дає можливість зробити більш точний статистично вірогідний прогноз виживаності хворих на серозний рак яєчника після хірургічного втручання та може широко застосовуватися в клінічній практиці. Література 1. Урманчеева А.Ф., Мешкова И.Е. Вопросы эпидемиологии и диагностики рака яичников // Практ. онкол. - 2000. - №4. - С. 7-13. 2. Chu S., Mamerrs P., Burger H. et al. Estrogen Receptor Isoform Gene Expression in Ovarian stromal and epithelial tumors // J. Clin. Endocrinology. - 2006. - 85, №3. - С 1200-1205. 5 48765 3. Smyth J F, Gourley Ch, Walker G. et al. Antiestrogen Therapy Is Active in Selected Ovarian Cancer Cases: The Use of Letrozole in Estrogen Receptor-Positive Patients. Clin Cancer Res. - 2007. №13. - С 3617-3622. 4. Пожарисский KM, Леенман ЕЕ. Значение иммуногистохимических методик для определения характера лечения и прогноза опухолевых заболеваний // Архив патол. - 2000. - №5. - С. 11-17. 5. Beenken SW, Bland KI. Biomarkers for breast cancer // Minerva Chir. - 2002. - 57. – С.437-438. Комп’ютерна верстка М. Ломалова 6 6. Shupnik Margaret A. Estrogen receptor- : why may it influence clinical outcome in estrogen receptorpositive breast cancer? // Breast Cancer Res. 2007. - 9, №3. - P. 107-108. 7. Божок А.А., Семиглазов В.Ф., Семиглазов В.В., Арзуманов А.С., Клетцель А.Е. Прогностические и предсказательные факторы при раке молочной железы // Вопросы онкологии. - 2005. - 51. №4 - С. 434-443. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601