Спосіб прогнозування виживаності хворих на серозний рак яєчника за допомогою маркера проліферації кі-67

Спосіб прогнозування виживаності хворих на серозний рак яєчника за допомогою маркера проліферації Кі-67, що передбачає дослідження суспензії клітин, забарвлених пропідіум йодидом, для визначення перебігу захворювання, який відрізняється тим, що проводять імуногістохімічне дослідження зразків пухлинної тканини з використанням біомолекулярного маркера проліферації Кі67, визначають індекс мітки (ІМ, %), отримане значення індексу мітки порівнюють з пороговим значенням і, якщо воно менше порогового, роблять висновок про статистично вірогідний 5-річний прогноз виживаності хворих на серозний рак яєчника, які не проходили неад'ювантної поліхіміотерапії. (19) (21) u200913464 (22) 24.12.2009 (24) 25.03.2010 (46) 25.03.2010, Бюл.№ 6, 2010 р. (72) БУЧИНСЬКА ЛЮБОВ ГЕОРГІЇВНА, ЮРЧЕНКО НАТАЛІЯ ПЕТРІВНА, ГРІНКЕВИЧ ВАЛЕНТИНА МИКОЛАЇВНА, ГЛУЩЕНКО НАДІЯ МИКОЛАЇВНА, РОМАНЕНКО ОЛЕКСАНДР ВІКТОРОВИЧ (73) НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ О.О. БОГОМОЛЬЦЯ, ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ, ОНКОЛОГІЇ І РАДІОБІОЛОГІЇ ІМ. Р.Є. КАВЕЦЬКОГО НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК УКРАЇНИ 3 в клітині не є постійною та змінюється при переході з однієї фази мітотичного циклу в іншу, що дозволяє припустити його належність до білківрегуляторів клітинного циклу [6]. Виявлено зв'язок між значеннями експресії Кі67 та ступенем гістологічного диференціювання пухлин ендометрія, сечового міхура, легень, нервової системи. Кі-67 є незалежним прогностичним показником появи рецидивів та тривалості життя хворих на рак молочної залози та рак простати [7, 8]. Так, відомий спосіб діагностики раку яєчника за допомогою проточної цитометрії передбачає дослідження клітин в різних фазах клітинного циклу і виявляє ступінь агресивності пухлин [9]. Недоліком цього способу є те, що він потребує отримання значної кількості (15-20 тисяч) клітин пухлинної тканини у вигляді спеціально підготовленої суспензії. Об'єктивним показником, що характеризує проліферативну активність пухлинних клітин, є експресія біомолекулярного маркеру Кі-67. При цьому для виявлення рівня експресії Кі-67 достатньо дослідити зразок пухлинної тканини, що містить близько 1000 клітин. Способом, що заявляється, вирішується задача прогнозування виживаності хворих на серозний рак яєчника, які не отримали неоад'ювантну поліхіміотерапію, шляхом імуногістохімічного дослідження їх пухлинної тканини, завдяки використанню маркеру проліферації Кі-67, і таким чином усувається недолік прототипу щодо необхідності занадто великої кількості пухлинних клітин, що обмежує використання відомого способу. Поставлена задача досягається тим, що у відомому способі, який передбачає дослідження суспензії клітин, забарвлених пропідіум йодидом для визначення перебігу захворювання, згідно корисної моделі проводять імуногістохімічне дослідження зразків пухлинної тканини яєчника з використанням бімолекулярного маркеру проліферації Кі-67, визначають індекс мітки (ІМ, %), отримане значення індексу мітки порівнюють з пороговим значенням і якщо воно менше порогового, роблять висновок про статистично вірогідний 5-річний прогноз виживаності хворих на серозний рак яєчника, які не проходили неад'ювантної полі хіміотерапії. Спосіб здійснюють наступним чином. Імуногістохімічне виявлення біомаркерів проводять на депарафінованих зрізах пухлинної тканини, отриманих після операції у хворих, які не отримували неоад'ювантної поліхіміотерапії. Для видалення парафіну із зрізів скельця занурюють у орто-ксилол на 20хв. з наступною обробкою 96° етанолом протягом 20хв. і промивають у двох порціях дистильованої води по 3хв. Для демаскування антигену зрізи інкубують у цитратному буфері рН 6,0 (10,0мл 0,1М розчину лимонної кислоти і 40,0мл 0,1М розчину цитрату натрію, доведеного до об'єму 500,0мл дистильованою водою) в мікрохвильовій печі потужністю 700Вт протягом 10хв. Наступні етапи імуногістохімічної реакції такі: охолоджують препарати при кімнатній t° до +25°С, 48766 4 промивають у двох порціях дистильованої води по 2хв. Проводять блокування ендогенної пероксидази 3,0% розчином перекису водню протягом 10хв. при кімнатній t°, промивають у двох порціях дистильованої води по 2хв. і у трьох порціях фосфатного буферу (PBS) рН 7,4 (суміш солей: NaCl - 8,0г, KСl - 0,2г, KН2РО4 - 0,2г і Na2HPO4 - 1,15г, яку доводять дистильованою водою до об'єму 1,0л.) по 5хв. Надлишок буферу обережно, не доторкаючись до зрізу і не допускаючи висихання останнього, забирають з двох боків клаптиками фільтрувального паперу і розташовують у вологій камері, де виконуються всі наступні процедури. Блокування неспецифічних білків (для запобігання неспецифічного забарвлення) здійснюють шляхом інкубації зрізів у присутності 1,0% розчину сироватки бичачого альбуміну на PBS протягом 30 хв. при кімнатній t°. Інкубацію з первинним моноклональним антитілом (МКАТ) Кі-67 МІВ-1 ("DakoCytomation", Данія) проводять протягом 18 годин в холодильнику при t+4°C. Для візуалізації білка застосовують систему En Vision, яку наносять і залишають на зрізі при кімнатній t° протягом 30хв. Забарвлення білка здійснюють за допомогою хромогену - 3діамінобензидину тетрахлориду (ДАБ), продукт реакції якого має коричневий колір. Ядра клітин дофарбовують гематоксиліном Маєра, який виготовляють шляхом змішування 5,0мл 2,0% розчину гематоксиліну на 96% етанолі і 100,0мл 5,0% розчину алюмо-кальцієвих квасців. Для перевірки специфічності взаємодії антитіл і, таким чином, отримання реальних результатів, кожного разу при проведенні імуногістохімічних досліджень ставлять контрольні реакції. У якості позитивного контролю використовують препарати зі зрізами тканин, де було встановлено гіперекспресію даного маркеру. Негативним контролем біли зрізи пухлинної тканини яєчника на які не наносили МКАТ. Результати імуногістохімічної реакції оцінюють напівкількісним методом, шляхом підрахунку кількості позитивно забарвлених ядер до загальної кількості проаналізованих клітин - індекс мітки (ІМ, %). У кожному випадку аналізують по 1000 пухлинних клітин. Отримане значення ІМ Кі-67 у пухлині хворої порівнюють з пороговим рівнем (медианою), що дорівнює 24%. Якщо отримане значення індексу мітки Кі-67 менше за порогове значення 24%, робиться висновок про статистично вірогідну 5-річну виживаність хворої на серозний рак яєчника. Таким чином, запропонований спосіб дає можливість зробити більш точний статистично вірогідний прогноз виживаності хворих на серозний рак яєчника після хірургічного втручання та може широко застосовуватися в клінічній практиці. Література: 1. Винокуров В.Л., Юркова Л.Е., Загольская В.Н. Степень дифференцировки и клиническое течение рака яичников // Вопросы онкологии. 1985. - 31, №3. - С.55-62. 2. Карселадзе А.И. Некоторые проблемы клинической морфологии эпителиальных опухолей яичников // Практическая онкология. - 2000. - № 4. - С.14-18. 5 48766 3. Бохман Я.В. Руководство по гинекологии. СПб.: ООО Издательство Фолиант, 2002. - 542с. 4. Божок А.А., Семиглазов В.Ф., Семиглазов В.В., Арзуманов А.С., Клетцель А.Е. Прогностические и предсказательные факторы при раке молочной железы // Вопросы онкологии. - 2005. - 51, №4 - С.434-443. 5. Пожарисский К.М., Леенман Е.Е. Прогностическое и предсказательное значение иммуногистохимических маркеров при онкологических заболеваниях // Матер. III съезда онкологов и радиологов СНГ: Минск, 25-28 мая, 2004г. - Минск: ОДО Тонпик, 2004. - Ч.1. - С.113-116 6. Шацева Т.А., Мухина М.С. Антиген Кі-67 в оценке опухолевой пролиферации. Его структура Комп’ютерна верстка А. Рябко 6 и функции // Вопросы онкологии. - 2004. - 50, №2. С.157-164. 7. Корнеев И.А. Прогностическое значение индекса пролиферации Ki-67 в переходноклеточном раке почечной лоханки и мочеточника // Вопросы онкологии. - 2005. - Т.51, №2. - С.211-215. 8. Лукашина М.И., Глухова Е.И., Жукова Л.Г. и др. Экспрессия HER2/NEU, КІ-67 и плоидность при раке молочной железы // Арх. патол. - 2003. - №5. - С.21-25. 9. И.В. Паниченко, В.Н. Богатырев, К.И. Жорданиа, В.В. Кузнецов, О.А. Анурова "Прогностическое значение параметров ДНК-проточной цитофлюорометрии при раке яичников" // Рос.онколог.журнал. - 2007. - №3. - С.25-28. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601