Спосіб визначення чутливості хворих на поширений рак шлунка до поліхіміотерапії

Спосіб визначення чутливості хворих на поширений рак шлунка до поліхіміотерапії, що передбачає імуногістологічне дослідження біопсійного матеріалу, який відрізняється тим, що одночасно визначають наявність експресії маркерів bcl-1, p-53, VEGF та рівень молекулярного маркера 8-oxodGu в добовій сечі методом фільтрації та спектрофотометрії і при відсутності експресії в тканинах пухлини проапоптичного білка р-53, антиапоптичного білка bcl-1, активній експресії фактора неоваскуляризації VEGF, швидкості екскреції 8-oxodGu, яка не перевищує фізіологічний рівень, визначають чутливість хворих на поширений рак шлунка до поліхіміотерапії. Корисна модель, що заявляється, належить до медицини, а саме до онкології, і може бути використана з метою прогнозування ефективності неоадьювантної полі хіміотерапії (ПХТ) у хворих на поширені форми раку шлунка. Як відомо, активація проапоптотичного білка р53 призводить до генетичних порушень та блокування клітинного циклу, зупиняючи його у фазі G1. При виникненні мутацій у гені р53 кодований ним білок втрачає здатність нормально виконувати свої функції, що призводить до неконтрольованого росту пухлин (1). Білок bcl-2 походить із родини регуляторів апоптозу, він володіє сильною антиапоптотичною дією, оскільки має здатність зв'язувати принаймні п'ять інших білків цієї родини, які виконують проапоптотичні функції. Запуск цього механізму призводить до порушення формування мітохондріальних пор та блокує вихід з мітохондрій цитохрому та APAF-1, які активують каспазу-9 і ініціюють апоптоз. Така активність bcl-2 зумовлює виживання пухлинних клітин при застосуванні протипухлинних препаратів, дія яких спрямована на активацію апоптозу (2). Розвиток нової судинної сітки відбувається під впливом ангіогенного фактору росту VEGF-A, останній декретується клітинами пухлини та його роль в неоангіогенезі є доведеною. На даний момент сімейство VEGF нараховує 6 факторів росту. Фактори росту сімейства VEGF взаємодіють із своїми рецепторами VEGFR ініціюючи міграцію, проліферацію та диференціювання клітин ендотелію (3). Білки р-53 та bcl-2 підвищують хіміорезистентність пухлинної клітини шляхом захисту її від апоптозу, індукованого такими протипухлинними препаратами як інгібітори топоізомерази, антиметаболіти та інші (4, 5). Концентрація ендотеліального фактора росту судин (VEGF) корелює із ступенем судинного забезпечення пухлини, що безпосередньо впливає на ефективність доставки хіміопрепарату до клітин пухлини[i]. 8-oxodGu (8оксодезоксигуанозин) - маркер швидкості пошкодження ДНК, він свідчить про рівень пошкодження (19) UA (11) 51093 (13) U (21) u201003150 (22) 19.03.2010 (24) 25.06.2010 (46) 25.06.2010, Бюл.№ 12, 2010 р. (72) ЩЕПОТІН ІГОР БОРИСОВИЧ, ЛУКАШЕНКО АНДРІЙ ВОЛОДИМИРОВИЧ, МЕЛЬНИК МИКОЛА МИКОЛАЙОВИЧ, БУРЛАКА АНТОН АНАТОЛІЙОВИЧ, ПРИЙМАК ВІКТОР ВАСИЛЬОВИЧ, ВАСИЛЬЄВ ОЛЕГ ВАЛЕНТИНОВИЧ, РОЗУМІЙ ДМИТРО ОЛЕКСАНДРОВИЧ, ЖУКОВ ЮРІЙ ОЛЕКСАНДРОВИЧ (73) НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ О.О. БОГОМОЛЬЦЯ, НАЦІОНАЛЬНИЙ ІНСТИТУТ РАКУ 3 ДНК, ступінь індукованої нестабільності функціонування геному та деградації міжклітинного матриксу (6-8). Найбільш близьким по суті до способу, що заявляється, та прийнятим за прототип є спосіб визначення чутливості пухлин до поліхіміотерапії, який потребує використання імуногістохімічного методу визначення глутатіон s-трансферази в біоптаті тканини пухлини шлунка (2). Однак недоліком цього способу є його низька достовірність через використання підходу оцінки детоксикації радикальних форм кисню, зокрема перекису водню, тільки однією ферментною системою. Крім того, при застосуванні даного способу можливе визначення чутливості пухлини лише до препаратів платини, тоді як схема ECF поліхіміотерапії згідно стандартів України включає (епірубіцин 40мг/м2 в 1-й день, цисплатин 40мг/м2 в 2-й день, 5-ФУ 425мг/м2 1-4 дні), що робить дану методику малоінформативною та обмежує можливість визначення чутливості до поліхіміотерапії пухлини раку шлунка. Застосування цього способу потребує використання імуногістохімічного методу визначення глутатіон s-трансферази в тканині пухлини шлунка. Задача, яку вирішує спосіб, що заявляється, полягає у застосуванні індивідуалізованого підходу при лікуванні пацієнтів з діагнозом раку шлунка за рахунок додаткового лабораторного обстеження. Технічний результат - покращення результатів лікування. Поставлена задача досягається тим, що у відомому способі, що передбачає імуногістологічне дослідження біопсійного матеріалу, згідно корисної моделі, одночасно визначають наявність експресії маркерів bcl-1, р-53, VEGF та рівень молекулярного маркера 8-oxodGu в добовій сечі методом фільтрації та спектрофотометрії і при відсутності експресії в тканинах пухлини проапоптичного білка р53, антиапоптичного білка bcl-1, активній експресії фактора неоваскуляризації VEGF, швидкості екскреції 8-oxodGu, яка не перевищує фізіологічний рівень, визначають чутливість хворих на поширений рак шлунка до поліхіміотерапії. Суть способу полягає в тому, що після стандартних методів обстеження та гістологічного підтвердження діагнозу, проводилось імуногістохімічне дослідження біопсійного матеріалу на наявність експресії маркерів bcl-1, р-53, VEGF. Так, використовуючи матеріал біопсії хворих на рак шлунку (гістопрепарати гематоксилін-еозин), визначали антигенний та рецепторний статусу пухлин хворих на рак шлунка із застосуванням імуногістохімічного дослідження за стандартною методикою. Як первинні антитіла були застосовані моноклональні антитіла (мкАТ): Monoclonal Mouse Antibody to Human p53 Protein Clone DO-7, ready-to-use, Dako), Monoclonal Mouse Antibody to Human BCL Oncoprotein Clone 124, ready-to-use, Dako), полік 51093 4 лональне антитіло Flt-1/VEGFRl (Clon Ab-1, readyto-use, Lab Vision). Для виявлення антигенних детермінант зрізи обробляли в Target Retrieval Solution (Dako) впродовж 30 хвилин при 96°С. Для візуалізації реакції антиген-антитіло була застосована візуалізаційна система Dual link EnVision (Dako), хромоген АЕС+Substrate-Chromogen (ready-to-use, Dako). Після постановки імуногістохімічної реакції зрізи дофарбовувались гематоксиліном Мейєра і заключались в середовище Faramount Agueous Medium. Спосіб здійснюється наступним чином: Згідно із імуногістохімічним фенотипом та рівнем окисноіндукованих точкових мутацій, пацієнти розподілені на 3 групи: І. Група високої чутливості до хіміотерапії (ВIЧ) - відсутність експресії в тканинах пухлини проапоптичного білка р-53, антиапоптичного білка bcl-1, активній експресії фактору неоваскуляризації VEGF, швидкості екскреції 8-oxodGu, яка не перевищує фізіологічний рівень; II. Група низької чутливості до хіміотерапії (НЧ) - відсутність експресії р-53, bcl-1, VEGF, підвищений рівень екскреції 8-oxodGu (до 7,0нМоль/доба·кг маси тіла); III. Група із відсутністю чутливості до хіміотерапії (ВІЧ) - наявність експресії р-53, bcl-1, відсутність фактору VEGF та високий рівень екскреції 8oxodGu (>7,0нМоль/доба·кг маси тіла). Суть способу підтверджується прикладом конкретного виконання. Пацієнт Л. 54р. поступив у відділення із діагнозом - рак нижньої третини шлунка T3NxM0 стадія II. Ускладнення - субкомпенсований стеноз вихідного відділу шлунка. Було проведено визначення імуногістохімічного фенотипу, серологічних маркерів оксигенації та рівня окисного пошкодження ДНК. Пацієнт був віднесений до групи ВиЧ. В неоад'юватному режимі було проведено 2 курси поліхіміотерапії за схемою FLEP. Була виконана комп'ютерна томографія до та після ПХТ, відмічалось зменшення інфільтративних змін в стінці шлунка. Була виконана ФЕГДС (після проведеного лікування відбулась часткова регресія пухлини), при повторному взятті біопсії та гістологічному дослідженні спостерігався терапевтичний патоморфоз (виражені дистофічні та некробіотичні зміни пухлини, клітини пухлини із дистрофічними змінами розташовані в сполучній тканині із міксоматозом.) Надалі була виконана дистальна субтотальна резекція шлунка із лімфаденектомією в об'ємі D2a. Пацієнт виписаний у задовільному стані на 7 добу після операції. Клінічна апробація даного методу проведена на базі відділення пухлин органів черевної порожнини та заочеревинного простору Національного інституту раку у період 2008-2009pp. проведено лікування, з використанням даного підходу 22 хворим на рак шлунка (Табл.). 5 51093 6 Таблиця Оцінка ефективності проведеної неоадьювантної ПХТ у пацієнтів із високою, низькою чутливістю та відсутністю чутливості. Оцінка проводилась за результатами ФЕГДС Регресія пухлини/групи Повна Часткова Стабілізація пухлинного процесу Прогресування Всього Група ВиЧ 3 Група НЧ 1 Група ВіЧ 4 4 1 8 2 7 4 4 Спосіб може бути застосований у всіх спеціалізованих онкологічних закладах, як тест на проведення прогностичної ефективності неоадьювантної ПХТ у хворих на поширену форму раку шлунка. Джерела інформації: 1. Symonds Н., Krall L., Remington L., SaenzRobles M., Lowe S., Jacks Т., Van Dyke T. p53dependent apoptosis suppresses tumor growth and progression in vivo. Cell. 1994 Aug26; 78(4):703-ll. 2. Gurova K.V., Kwek S.S., Koman I.E., Komarov A.P., Kandel E., Nikiforov M.A., Gudkov A.V. Apoptosis inhibitor as a suppressor of tumor progression: expression of Bcl-2 eliminates selective advantages for p53-deficient cells in the tumor. Cancer Biol Ther. 2002 Jan-Feb; 1(1):39-44. 3. Dvorak HF. Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor: A critical cytokine in tumor angiogenesis and a potential target for diagnosis and therapy. J Clin Oncol. 2002; 20:4368-4380. 4. Reed, J.C, Kitada, S., Takayama, S., and Miyashita. T. Regulation of ehemoresistanee by the bel-2 oneoprotein in non-Hodgkin's lymphoma and Комп’ютерна верстка А. Рябко lymphocytic leukemia cell lines. Ann. Oneol., 5 (Suppl. J): 61-65, 1994. 5. Lotem, J., and Saehs, L. Regulation by bel-2, c-rnye, and p53 of susceptibility to induction apoptosis by heat shock and cancer chemotherapy compounds in differentiation-competent and defective myeloid leukemia cells. Cell Growth Differ., 4: 41-47, 1993. 6. Connoly, D.Т., Heuvelman, D.M., Nelson, R., Olander, J.V., Eppley, B.L., Delfino, J.J., Siegel, N.R., and Feder, J. Tumor vascular permeability factor stimulates endothelial cell growth and angiogenesis. J. Clin. Invest., 84: 1470-1478, 1989. 7. Lawrence J. Mamett. Oxyradicals and DNA damage. Carcinogenesis, Vol.21, No. 3,361-370, March 2000. 8. Toshiro Okuyama, M.D., Yoshihiko Maehara, M.D., Kazuya Endo, M.D., Hideo Baba, M.D., Yosuke Adachi, M.D., Michihiko Kuwano, M.D., Keizo Sugimachi, M.D. Expression of glutathione stransferasepi and sensitivity of human gastric cancer cells to cisplatin. Cancer Cytopathology СA: A Cancer Journal for Clinicians Volume 74 Issue 4, Pages 1230-1236. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601