Спосіб визначення наявності алергенів тарганів у приміщенні

Спосіб визначення наявності алергенів тарганів у приміщенні, який включає приготування екстракту пилу приміщення шляхом додавання до сухої навіски фосфатного буфера (рН 7,4) з подальшим центрифугуванням впродовж 30 хвилин при 13000г та діалізуванням отриманого супе 3 генів за допомогою специфічних моноклональних антитіл). Більш того, таким чином можна визначити у пилу тільки 2 з відомого спектру атопенів рудого таргана - Bla g 1 та Bla g 2, рівень яких не завжди корелює з загальним рівнем алергенів тарганів. Методів визначення в пилу алергенів чорного таргана взагалі не існує, оскільки немає моноклональних антитіл, не розроблено методик. На кінець існуючі методи є затратними, потребують спеціального дорогого обладнання, часу (в середньому результат отримують через 2-3 дні) та не можуть використовуватись рутинно. Для виготовлення стандартних алергенів зазвичай використовують тіла живих особин, але в природних умовах людина контактує не тільки з живими тарганами, але й з фрасом (мертві особини, фекалії, лінькові шкурки), який, як показали дослідження, також є джерелом алергенів. Подальші вивчення фрасу виявили, що в його склад входять 2 стабільні ензими: ендо- та екзохітиназа (ферментний комплекс, який приймає участь у гідролізі молекул хітину, молекулярна вага 25 та 85кДа, відповідно), рівень яких корелює як з рівнем алергенів у екстракті живих тіл, так і з компонентами фрасу. Як показали дослідження (Chang F. N.Duong P. Т., 2006), рівень хітиназ, поодинці, і разом має пропорційне відношення до загального рівня алергенів у домашньому пилу та у фрасі, що робить хітинази ідеальним маркером рівня алергенів тарганів у пилу. Більш того, доведено, що рівень цих ферментів у домашньому пилу прямо корелює з рівнем основних алергенів тарганів та не має валідного зв'язку з рівнем атопенів кліщів. Це дозволяє використовувати якісне та кількісне визначення рівня екзо- та ендохітиназ для моніторингу ступеня інфестації тарганів та наявності їх антигенів у пилу приміщень (Chang F. N.Duong P. Т., 2006). Найбільш близьким за технічною сутністю та результатом, що досягається, є спосіб, який полягає у визначенні хітиназ у домашньому пилу за допомогою приготування екстракту з навіски домашнього пилу та електрофорезу отриманого супернатанту у поліакриламідному гелі, що виконують наступним чином: навіску пилу гомогенізують у фосфатнму буфері (рН 7,4) з наступним центрифугуванням 13000 . протягом 30 хвилин, після чого отриманий супернатант діалізують протягом 8 годин спочатку проти фосфатного буферу, потім проти деіонізованої води, після чого отриманий екстракт розділяють у поліакриламідному гелі за допомогою електрофорезу у присутності SDS при постійній напрузі 200V, при кімнатній температурі, після додають 2,5% Triton X-100 та витримують впродовж 30 хвилин, після чого гель обробляють флюорогенним субстратом 0,25 мМ (для екзохітинази використовують 4MU-(NAG), для ендохітинази - 4MU-(NAG)3) та проводять флюорометрію, порівнюють результати з контролем (екстракт з тіл та фрасу тарганів) (Chang, Frank N., Duong, Phu Т. US Patent 7033777 -Method for detecting cockroach allergens and determining total allergen level / US Patent Issued on April 25, 2006, Application No. 10392239 filed on 03/19/2003). 51743 4 Спільними суттєвими ознаками найближчого аналогу і корисної моделі, що заявляється, є такі: - Приготування навіски пилу з приміщення. - Приготування екстракту пилу шляхом додавання до сухої навіски фосфатного буферу (рН 7,4) з подальшим центрифугуванням впродовж 30 хвилин при 13000g. - Діалізування отриманого супернатанту проти фосфатного буферу (рН 7,4) для вилучення домішок з низькою молекулярною масою. - Проведення ренатурації отриманих протеїнів за допомогою Тритон-Х 100. - Проведення розгонки білкових молекул. - Визначення екзо- (85кДа) та ендохітинази (25кДа) за молекулярною масою. - Використання контролю (екстракт з тіл та фрасу тарганів). Цей спосіб є недостатньо ефективним: оскільки потребує більшої затрати часу (біля 20 годин, з них 8 годин лише для діалізу), використання енергоресурсів (електричний струм з постійною напругою для проведення електрофорезу, флюорометрії), додаткового лабораторного устаткування (флюорометру для флюорометричної зимографії, або ручного джерела ультрафіолету - флюорометру Тернера), дорогих, нестабільних матеріалів (хроматофорів). В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалення способу визначення наявності алергенів тарганів у приміщенні шляхом використання хроматографії на пластинці "Силуфол", що забезпечить біль швидке та менш затратне визначення наявності алергенів тарганів у пилу приміщень, а також вчасну діагностику та підвищення ефективності контролю над алергічними захворюваннями при наявності алергії до тарганів. Поставлена задача вирішується тим, що у способі, який включає приготування екстракту пилу приміщення шляхом додавання до сухої навіски фосфатного буферу (рН 7,4) з подальшим центрифугуванням впродовж 30 хвилин при 13000г та діалізуванням отриманого супернатанту проти фосфатного буферу (рН 7,4), денатурування його за допомогою Тритон-Х 100, проведення розділення білкових молекул, та виведення висновку про наявність екзо- та ендохітиназ (після попереднього фарбування) за результатами розділення та у порівнянні з контролем, новим є те, що обробку отриманого супернатанту екстракту пилу приміщення неіонним детергентом Тритон-Х 100 для вилучення домішок проводять до розгонки білків, розгонку білкових молекул проводять у системі пропанол: гідрооксид амонію (7:3) на пластинці "Сілуфол", фарбування отриманих білкових фракцій проводять 1% розчином алоксану в ДМФА з наступним нагріванням при 100°С у сушильній шафі (у R+0,09). Відповідність червоного забарвлення з таким контролю вважають позитивною реакцією або наявністю екзо- та ендохітинази у досліджуваному зразку. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю ознак, що заявляються, та технічним результатом полягає у такому. Виявлення білкових молекул з масою 25 та 85кДа у дериваті пилу з приміщень проводиться за 5 51743 допомогою доступних невитратних методик, приладдя для яких є у більшості лабораторій. Наявність екзо- та ендохітинази у пилу приміщень свідчить про наявність алергенів тарганів, що дозволить визначити наявність контакту з алергенами тарганів та причину сенситизації. Таким чином, сукупність вищезазначених переваг забезпечує підвищення ефективності контролю над алергією. Спосіб здійснюється таким чином. Навіску пилу (0,5-2г) вносять в 4мл фосфатного буферу (рН 7,4) та екстрагують 12 годин при температурі 20°С. Далі інкубаційну суміш переносять у центрифужні пробирки та центрифугують 30 хвилин при 13000г. Відібраний супернатант діалізують 4 години проти фосфатного буферу (рН 7,4) для вилучення домішок з низькою молекулярною масою. Після діалізу відбирають 1-2мл отриманої рідини та додають до неї 0,1мл розчину Тритон-Х 100 (його ж додають і у стандартну пробу). В якості контролю використовують екстракт з тіл та фрасу рудого та чорного тарганів, приготований таким самим способом, як і екстракт пилу. На лінію старту пластинки "Сілуфол" наносять 0,1-0,04мл рідини, що досліджується та контрольну пробу того ж об'єму. Хроматограму розміщують у систему пропанол:гідрооксид аммонию (7:3). Після проходження розчинника 10см пластину висушують та проявляють 1% розчином алоксану у ДМФА з наступним нагріванням при 100°С у сушильній шафі (у R+0,09). Далі проводять якісний аналіз по наявності забарвлення досліджуваного зразка у порівнянні з контролем. Приклад. Під нашим спостереженням знаходився хворий Н., 1997 року народження з діагнозом «Бронхіальна астма, середньоважкий персистуючий перебіг, частково контрольована. Алергічний персис Комп’ютерна верстка Н. Лиcенко 6 персистуючий риніт». Під час опитування матері було виявлено, що після початку відвідування дитячого садку, де є таргани, у дитини астма стала менш контрольованою, а симптоми риніту стали з'являтися взимку, чого раніше не було. Вдома тарганів не було, але протягом останнього року мати дитини бачила 1 особину таргана в кухні. В дитячому садку після проведення мір елімінації тарганів стало менше. Проведення шкірного алерготестування з алергенами рудого та чорного тарганів показало наявність гіперчутливості до алергенів чорного та рудого тарганів. Рівень IgE як загального, так і специфічного антитарганного в крові виявився підвищеним. За результатами проведених діагностичних заходів у дитини діагностовано алергію на рудого та чорного таргана. З метою виявлення наявності алергенів тарганів у домашньому пилу мати зібрала пилососом домашній пил. Навіску пилу (0,5-2г) внесли в 4 мл фосфатного буферу (рН 7,4) та екстрагували 12 годин при температурі 20°С. Далі інкубаційну суміш перенесли у центрифужні пробирки та центрифугували 30 хвилин при 13000г. Відібраний супернатант діалізували 4 години проти фосфатного буферу (рН 7,4) для вилучення домішок з низькою молекулярною масою. Після діалізу відбирали 12мл отриманої рідини та додали до неї 0,1мл розчину Тритон-Х 100. На лінію старту пластинки "Сілуфол" нанесли 0,1-0,04мл рідини, що досліджується та контрольну пробу того ж об'єму. Хроматограму розмістили у систему пропанол:гідрооксид аммонию (7:3). Після проходження розчинника 10см пластину висушили та проявили 1% розчином алоксану у ДМФА з наступним нагріванням при 100°С у сушильній шафі (у R+0,09). Далі провели якісний аналіз по наявності забарвлення досліджуваного зразка у порівнянні з контролем. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601