Спосіб визначення in vitro чутливості до харчових алергенів

Корисна модель стосується медицини, а саме способів виявлення зміненої чутливості організму до чужорідних речовин, що містяться у харчових продуктах. Важливість швидкого та вчасного діагностування підвищеної чутливості до певних харчових продуктів зумовлюється необхідністю захисту імунної системи організму, яка додатково потерпає від напруження при отриманні з їжею або утворенні внаслідок її вживання шкідливих для організму речовин та сполук. Відомий спосіб [патент Росії №2260802, опубл.20.09.2005] визначення впливу на організм харчового продукту, згідно з яким у пробі крові пацієнта визначається тіол-дисульфідне співвідношення (ТДС), після чого до проби крові вводиться одинична доза антигену певного харчового продукту, потім через 30хв, 1год та 3год після введення повторно додають збільшену у 2,4,8 разів відповідно дозу антигену та визначають ТДС з інтервалами у 30хв, 1год, 3год, 24год, після чого будують графік залежності рівня ТДС від періоду інкубації та вираховують значення площі під кривою графіку. Недоліком відомого способу є багатостадійність та довготривалість процедур дослідження та встановлення результатів тесту, а також додаткові вимоги до зберігання вихідних матеріалів для дослідження. Завданням корисної моделі є розробка прискореного та спрощеного способу визначення чутливості організму пацієнтів, зокрема дітей, до харчових алергенів. Поставлене завдання вирішується тим, що у способі визначення in vitro чутливості до харчових алергенів, що включає введення харчового антигену до проби крові, згідно з корисною моделлю змінена чутливість організму пацієнта внаслідок дії харчового антигену визначається через специфічну метаболічну відповідь лейкоцитів, при цьому непереносимість харчового антигену виявляють через відхилення від норми показників цілісності та морфології лейкоцитів внаслідок дії харчового антигену. Пропонований спосіб характеризується високою специфічністю, що робить його результати високо достовірними. Для проведення досліджень проби крові при введенні харчового алергену використовують венозну кров. Реакції лейкоцитів на харчовий антиген спостерігаються за допомогою мікроскопу, що спрощує технологію дослідження. Корисна модель здійснюється наступним чином. Для дослідження у пацієнтів при кімнатній температурі беруть венозну кров у кількості 3-5мл (залежно від кількості алергенів), гепаринізують, змішують у пробірці з 3,8 g/1 цитрата натрію. Набрана кров може підлягати як моментальному аналізу, так і використовуватись для відкладеного дослідження протягом 72 годин. При необхідності зберігання пробірка з кров'ю повинна зберігатися у холодильній камері при температурі 1-10°С. Для проведення дослідження необхідно виділити з крові лейкоцити. Виділення лейкоцитів може відбуватись наступним чином: 1) кров із 3,8g/1 цитрата натрію, відстоюється у холодильній камері при температурі від 1 до 10°С до того часу, поки не відбудеться відділення плазми, але не більше 72 годин. 2) кров, з 3,8g/1 цитрата натрию у конусній пробірці для відділення плазми розташовується у центрифугу на 5-20 хвилин при швидкості обертання 1000-2000об\хв. При цьому тривалість обробки проби крові та швидкість обертання центрифуги залежать від: 1) показника скипання крові, у випадку якщо аналіз повинен бути моментальним і кров не було розміщено у холодильну камеру на тривалий період. 2) якості відділення плазми у випадку, якщо кров знаходилася в холодильній камері, але не більше 72 годин. У такому випадку, якщо розділення плазми в холодильній камері відбулося якісно, вона не потребує додаткової обробки у центрифузі. Після відділення плазми з пробірки добувають лейкоцити, які вводять до іншої пробірки, що містить 2,5мл води, та плавно перемішують. Даний метод допускає змішування лейкоцитів з плазмою тієї ж проби крові, з якої були добуті лейкоцити, в об'ємі 1-2,5мл. Лейкоцитарну пробу інкубують з харчовим антигеном у концентрації 5000PNU/1мл. При цьому аналіз крові не повинен перевищувати 60 хвилин від відділення плазми крові до закінчення останнього аналізу з виявлення харчового алергену. В якості контрольних засобів в сироватці крові визначається рівень специфічних антитіл класу в множинному алергосорбентному тестуванні. Роль харчових алергенів виконують повні антигени та не повні - гаптени. Неповні антигени викликають алергію наступними шляхами: - з'єднуючись з макромолекулами організму, індукують вироблення антитіл, специфічність реагування яких пов'язано з гаптеном, а не його носієм; - формуючи антигенні комплекси з молекулами організму. При цьому продуковані антитіла реагують тільки з комплексом, а не з його компонентами. Реакції лейкоцитів на харчовий антиген спостерігаються за допомогою мікроскопу. Антиген є компонентом клітини або сорбований на ній, а антитіло потрапляє до тканин організму. Алергічна реакція виникає в результаті прямої руйнівної дії антитіл на клітини тканин, активації комплементу, активації субпопуляції В-кілерів, активації фагоцитозу. Провокуючим фактором є комплекс антиген-антитіло. Спостерігається розпад лейкоцитів і вивільнення лізосомальних факторів, що вказують на запалення, зміна активності холінестерази та підвищення вивільнення ацетилхолину, зміна вмісту електролітів. Спостерігається також підвищення концентрації іонів калію та кальцію, що призводить до зміни чутливості тканин. Нижче указуються реакції прямої ушкоджувальної дії антитіл на клітки: Нормальна реакція: Лейкоцити зберегли свій розмір і форму І ступінь алергічної реакції - 50% лейкоцитів змінили свою форму або деформувалась в процесі культивації антигену. II ступінь алергічної реакції - 70-80% лейкоцитів змінили свою форму або деформувалась в процесі культивації антигену. III ступінь алергічної реакції - 80% і більше лейкоцитів змінили свою форму або деформувалась в процесі культивації антигену. Реакція не менш специфічна по відношенню до антигена, ніж реакція з імуноглобулінами. Пропоновану корисну модель може бути здійснено на стандартному устаткуванні із застосуванням відомих технологій.