Середовище для дозрівання in vitro ооцитів корів та овець

Середовище для дозрівання in vitro ооцитів корів та овець, що містить хлористий натрій, хлористий калій, гідрокарбонат натрію, фосфорнокислий натрій, хлористий кальцій, фенол червоний, хепес, гентаміцин, естральну сироватку, фолікулостимулюючий гормон (ФСГ), лютеотропний гормон (ЛГ), піруват натрію і гепарин, яке відрізняється тим, що до складу середовища додатково введені преднізолон і лізин при такому співвідношенні компонентів Винахід відноситься до галузі репродуктивної біотехнологм, зокрема, ядерного дозрівання ооцитів до стадії метафази II, а саме до середовищ для дозрівання ооцитів корів і овець in vitro і може бути використаний в бютехнолопчних центрах, в господарствах з різними формами власності і в приватному секторі Відоме і використовується в галузі репродуктивної біотехнологм середовище для дозрівання ооцитів in vitro (1) 100мл середовища містить наступні інгредієнти NaCI 0,8г КСІ 0,02г СаСІ2 0,02г МдСІ2 6Н2О 0,1г NaH2PO4 H2O 0,006г Глюкоза 0,1г NaHCO3 0,1г Недоліком існуючого середовища для дозрівання in vitro ооцитів є відсутність біологічноактивних речовин, що забезпечують інтенсифікацію процесів ядерного дозрівання в ооцитах Найбільш близьким по суті до середовища, що заявляється, є середовище (2) NaCI 1,305-1,450г NaCI КСІ СаСІ2 МдСІ2 6Н2О NaH2PO4 NaHCO3 фенол червоний хепес гентаміцин естральна сироватка ФСГ ЛГ Na-піруват гепарин преднізолон лізин вода тридистильована 1,305-1,450г 0,0513-0,057г 0,065 - 0,072 г 0,069 - 0,077г 0,007 - 0,008г 0,470 - 0,522г 0,0018-0,002г 0,535 - 0,595г 3,6 - 4,0мкг/л 45 - 50г 4,5 - 5,0мкг/мл 4,5 - 5,0мкг/мл 7,2-8,0мг 4,41-4,90мкг/мл 0,20 - 0,60мкг/мл 18,0-20,0мкг/мл до 250мл 0,0513-0,057г КСІ 0,065 - 0,072г СаСІ2 0,069 - 0,077г МдСІ2 6Н2О 0,007 - 0,008г NaH2PO4 0,470 - 0,522г NaHCO3 Фенол червоний 0,0018-0,002г Hepes 0,535 - 0,595г Гентаміцин 3,6 - 4,0мкг/л Естральна виворотка 45 - 50г ФСГ 4,5 - 5,0мкг/мл ЛГ 4,5 - 5,0мкг/мл Na-піруват 7,2-8,0мг Гепарин 4,41 - 4,90мкг/мл Вода три дистильована до 250мл Дане середовище забезпечує 70% ядерного дозрівання ооцитів in vitro до стадії метафази II Недоліком цього складу середовища є відсутність в ньому речовин, що забезпечують інтенсифікацію процесів ядерного дозрівання в ооцитах Заявлене нами середовище усуває недоліки прототипу і забезпечує полиндукторну дію на проліферативні процеси в ооцитах за рахунок наявності в заявленому середовищі додаткових бюлопчно-активних речовин, що проявляється в 85%-ому ядерному дозріванні ооцитів in vitro до стадії ме ю 52177 MgCb 6H2O, СаСЬ, фенол червоний Hepes, гентаміцин, естральна сиворотка, ФСГ, ЛГ, Na-піруват, гепарин Однак, наявність зазначених, спільних з прототипом ознак, недостатня для одержання технічного результату, який забезпечує заявлене середовище Технічних рішень, які б за сукупністю ознак повністю співпадали із заявленим середовищем - не виявлено Це дозволяє зробити висновок про ВІДПОВІДНІСТЬ заявленого технічного рішення критерію винаходу "новизна" В патентній і науково-технічній інформації не знайдено технічних рішень, в яких були б описані ВІДОМОСТІ про ознаки, що відрізняють заявлений винахід від прототипу і забезпечують досягнення технічного результату, - введення в середовище препаратів лізину і преднізолону при такому співвідношенні компонентів NaCI 1,305-1,450г КСІ 0,0513-0,057г СаСІ2 0,065 - 0,072г МдСІ2 6Н2О 0,069-0,077г NaH2PO4 0,007 - 0,008г NaHCO3 0,470 - 0,522г Фенол червоний 0,0018 - 0,002г Hepes 0,535 - 0,595г Лізин 18,0 - 20,0МКГ/МЛ Гентаміцин 3,6 - 4,0мкг/л Водатридистильована до 250мл Естральна виворотка 45 - 50г Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю ФСГ 4,5 - 5,0мкг/мл ознак винаходу, який заявляється і технічним реЛГ 4,5 - 5,0мкг/мл зультатом, якого можна досягнути є наступним Na-піруват 7,2 - 8,0мг без преднізалону неможливо Гепарин 4,41 - 4,90мкг/мл підтримувати на належному рівні водноПреднізолон 0,20 - 0,60мкг/мл сольовий баланс оолеми ооцита, оскільки предніЛізин 18,0 - 20,0МКГ/МЛ золон виступає як сіль-затримуючий фактор і як Водатридистильована до 250мл фактор інтенсифікації проліферативних процесів в Отже, заявлене технічне рішення не витікає клітинах кумулюсу, явним чином з рівня техніки, що дозволяє зробити висновок про його ВІДПОВІДНІСТЬ критерію винаходу активізувати ДНК-залежну РНК-полімеразу та "винахідницький рівень" підвищити інтенсивність синтезу пстонових білків ядерного апарату ооцитів Заявлене технічне рішення належить до галузі без лізину неможливо репродуктивної біотехнологм тварин, зокрема до ядерного дозрівання in vitro ооцитів до стадії местворити оптимальну концентрацію екзогеннотафази II Воно може бути застосоване як середого лізину у середовищі для дозрівання in vitro оовище для дозрівання in vitro ооцитів у бютехнолоцитів, пчних центрах, в господарствах з різними підсилити ініціацію ядерного дозрівання, за формами власності, приватному секторі і тому рахунок додаткового вмісту лізину в середовищі, відповідає критерію винаходу "промислова придапідсилити дію поліпептидних факторів росту тність" клітин кумулюсу, нормалізувати синтез пстонових білків, які заТаким чином, заявлене технічне рішення є нобезпечують мейотичне дозрівання ооцитів до мевим, промислово - придатним, має винахідницький тафвази II рівень, тобто відповідає всім умовам патентноспроможності винаходу згідно із ст 7 розділу II "ЗаЗапропоноване середовище дозволяє забезкону України про охорону прав на винаходи і корипечити ядерне дозрівання ооцитів до стадії метасну моделі" №1771 -111, 2002р фази II, підтримувати на оптимальному рівні водно-сольовий баланс оолеми та інтенсифікацію Середовище готують шляхом поступового проліферативних процесів в клітинах кумулюсу, розчинення вищезгаданих інгредієнтів в тридистиоптимальну концентрацію сумарного лізину в ляті з доведенням об'єму до 250мл культуральному середовищі, підвищити ініціацію Ефективність заявленого середовища і його ядерного дозрівання ооцитів, підсилювати дію попереваги перед прототипом підтверджені приклаліпептидних факторів росту клітин кумулюсу дами конкретного виконання Середовище виготовляється в умовах стерильного боксу лабораторії При проведенні патентно-інформаційного поклітинної інженери УААН (м Львів) і застосовувашуку заявником і авторами винаходу знайдено лось в дослідному господарстві "Гряда" технічне рішення, яке містить найбільшу КІЛЬКІСТЬ ознак, спільних із заявленим середовищем наявПриклад 1 3 мінімальним значенням інгредієність в середовищі NaCI, KCI, NaHCO3, NaH2PO4, нтів тафази II, в створенню оптимального збалансованого мікросередовища аналогічного умовам in vivo В основу винаходу поставлено завдання розробити ефеїсгивний склад середовища для дозрівання in vitro ооцитів спрямованого на ефективну індукцію ядерного дозрівання in vitro ооцитів до стадії метафази II Технічний результат досягають шляхом додаткового внесення до складу середовища преднізолону і лізину при такому співвідношенні інгредієнтів NaCI 1,305-1,450г КСІ 0,0513-0,057г СаСІ2 0,065 - 0,072г МдСІ2 6Н2О 0,069-0,077г NaH2PO4 0,007 - 0,008г NaHCO3 0,470 - 0,522г Фенол червоний 0,0018 - 0,002г Hepes 0,535 - 0,595г Гентаміцин 3,6 - 4,0мкг/л Естральна виворотка 45 - 50г ФСГ 4,5 - 5,0мкг/мл ЛГ 4,5 - 5,0мкг/мл Na-піруват 7,2 - 8,0мг Гепарин 4,41 - 4,90мкг/мл Преднізолон 0,20 - 0,60мкг/мл 52177 NaCI KCI CaCI2 MgCI2 6H2O NaH2PO4 NaHCO3 1,305г 0,051г 0,065 г 0,069г 0,007г 0,470г Фенол червоний 0,0018г Hepes 0,535г Рентам і цин 3,6мкг/л Естральна виворотка 45г ФСГ 4,5мкг/мл ЛГ 4,5мкг/мл Na-піруват 7,2мг Гепарин 4,41мкг/мл Преднізолон 0,20мкг/мл Лізин 18,0мкг/мл Вода три дистильована до 250мл Приклад 2 3 середнім значенням інгредієнтів NaCI 1,378г KCI 0,054г 0,068 г СаСІ2 0,073г MgCI2 6Н2О 0,008г NaH2PO4 0,496г NaHCO3 Фенол червоний 0,0019г Hepes 0,565г Рентам і цин 3,8мкг/л Естральна виворотка 47,5г ФСГ 4,75мкг/мл ЛГ 4,75мкг/мл Na-піруват 7,6мг Гепарин 4,66мкг/мл Преднізолон 0,40мкг/мл Лізин 19,0мкг/мл Вода тридистильована до 250мл Приклад 3 3 максимальнимі значенням інгрі ДІЄНТІВ NaCI KCI СаСІ2 MgCI2 6Н2О NaH2PO4 NaHCO3 Фенол червоний Hepes Гентаміцин Естральна виворотка ФСГ ЛГ Na-піруват Гепарин Преднізолон Лізин 1,450г 0,057г 0,072г 0,077г 0,008г 0,522г 0,002г 0,595г 4,0мкг/л 50г 5,0мкг/мл 5,0мкг/мл 8,0мг 4,90мкг/мл 0,60мкг/мл 20.0мкг/мл Вода тридистильована до 250мл Результати спостережень за дозріванням ооцитів в умовах заявленого середовища із мінімальним, середнім і максимальним значенням інгредієнтів свідчать про те, що найбільш ефективним виявився склад середовища із середнім значенням інгредієнтів Відсоток ядерного дозрівання ооцитів до стадії метафази II в умовах середовища із середнім значенням складу інгредієнтів становив 85% проти 84% - в середовищі із мінімальним і 84,3% із максимальним значенням складових середовища Одержані ооцити вміщували в стерильні чашки Петрі, дозрівали до метафази на протязі 24 годин у вищезгаданих середовищах при температурі 38,5°С з 5% СО2 Рівень ядерного дозрівання оцінювали по наявності полярного тільця та гомогенності ооплазми ооцитів Ефективність дозрівання ооцитів в контрольному середовищі становила 40%, в середовищі прототипа - 70%, в запропонованому середовищі - 85% Рівень ефективності дослідних груп з ооцитами великої рогатої худоби не відрізнявся від рівня ефективності застосування вищезгаданих середовищ при роботі з ооцитами овець Заявлене середовище для дозрівання in vitro ооцитів успішно застосовувалось в дослідному господарстві "Гряда" і в лабораторії клітинної інженери Інституту біологи тварин Ефективність застосування рекомендованого середовища (%) КІЛЬКІСТЬ ООЦИТІВ Нове Протовміщених в се- Контрольсередотип редовище вище ВРХ 210 320 430 овець 60 90 110 % ядерного дозрівання ООЦИТІВ до стадії метафази II 40 70 85 Джерела інформації 1 Справочник биохимика Р Досон, Д Єллиот, У Єллиот, К Джонс Издательство "Мир", с 374 2 Ergebmsse von In-vitro - Befruchtungsversuchen mit Rmderoozyten unter Berucksichtigung ihreer Entwicklungsfahigkeit nach Transfer auf Empfangertiere Inaugural-dissertation zur Erlangung des Grades emes Doctor Medicmae Vetermanae Vorgelegt von Uwe R Waldmann, Hannover 1991, s 35-38 ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71