Вантажний вагон

Даний винахід стосується бактеріальної культури, одержаної з кишкового тракту ссавців, вільних від патогенних мікроорганізмів. Він також стосується субкультур таких культур та способів використання таких субкультур для захисту худоби від утворення колоній ентеропатогенних бактерій.

Ентеропатогенні мікроорганізми, такі як Salmonella і Escherichia coli 0157.H7, зумовлюють недопустимо високу захворюваність і смертність у людей і можуть зменшувати приріст поголів'я худоби. Як правило, шлунково-кишкові патогенні мікроорганізми потрапляють до людини з кишковими інфекціями, що заносяться з м'ясом, яке вона споживає. На симпозіумі на тему «Відслідкування шляхів хвороботворних мікроорганізмів харчового походження від ферми до столу: Дані потребують оцінки контрольних груп», який проводився у січні 1995 року, було поставлене питання «Яке значення мають захворювання харчового походження?» (Tracking Foodbome Pathogens from Farm to Table: Data Needs to Evaluate Control Groups, Washington, DC, 3-29, 1995). Відзначалося, що у Сполучених Штатах щороку мають місце від 6,5 до 33 мільйонів випадків харчових отруєнь, в результаті яких гине до 9000 осіб. Служба Економічних Досліджень USDA оцінює щорічні медичні затрати та збитки від зниження приросту поголів'я худоби у випадку семи патогенних мікроорганізмів харчового походження на суму від 5,6 до 9,4 мільярдів доларів США. За оцінкою Меннінга щороку в США мають місце понад 5 мільйонів випадків отруєння м'ясом тварин та домашніх птахів, і значний відсоток таких випадків припадає на інфекції Salmonella і Campylobacter (J. Am. Vet. Med. Assoc, Volume 192, 494-497, 1988). За оцінками Робертса витрати у кожному випадку сальмонельозу становлять 700 доларів США (Amer. J. Agr. Econ., Volume 71, 468-474, 1989). Виходячи з оцінок захворювань харчового походження в інших країнах, важко заперечити, що у всьому світі кількість річних випадків діарей харчового походження, спричинених сальмонелами, ймовірно перевищує 100 мільярдів, а пов'язані з ними витрати перевищують 25 мільярдів доларів. Ці патогенні бактерії також є причиною болю, страждань і смерті. Крім того, ентеропатогенні бактерії також можуть призводити до значних економічних збитків внаслідок зараження поголів'я худоби.

Методики конкурентного виключення (KB) застосовують для послаблення утворення колоній ентеропатогенних бактерій у домашніх птахів. Nurmi та ін. (Nature, Volume 241, 210-211 1973) виявили, що препарати, виготовлені на основі сировини, одержаної з дорослих здорових курей, надавали захисту малим курчатам, мікрофлора яких ще не встановилася проти утворення колоній сальмонел. Введення курчатам довільних препаратів конкурентного виключення пришвидшує формування кишкової флори пташенят, котрі щойно вилупились з яйця, і забезпечує субстрат для природного процесу передачі мікрофлори від дорослої курки до її потомства.

Snoeyenbos та ін. (патент США № 4, 335, 107, червень, 1982) розробили методику мікрофлори конкурентного виключення для запобігання утворення колоній сальмонел (Salmonella) шляхом ліофілізації посліду і анаеробного культивування цього препарату. Mikola та ін. (патент США № 4, 657, 762, квітень, 1987) використовували фекальний вміст кишечнику та сліпої кишки в якості джерела мікрофлори конкурентного викдючення з метою запобігання утворення колоній сальмонел. Для лікування таким типом культури середовище повинне було бути анаеробним, а pH фактор збалансований.

Stern та ін. (патент США № 5, 451, 400, 19 вересня 1995 року) описують композицію конкурентного виключення, одержану із слизової оболонки, призначену для захисту домашніх птахів від утворення колоній Salmonella і Campylobacter, яку одержують зіскрібанням шару муцину із попередньо промитої сліпої кишки і зскрібки, які зберігають у вільному від кисню середовищі, культивують в анаеробних умовах.

Nisbet та ін. (патент США № 5, 478, 557; 26 грудня 1996 року) описують пробіотик, який може бути одержаний від ряду домашніх тварин, зокрема від курей, а також коней, свиней та биків; цей список не обмежується цими тваринами. Як описано у Nisbet та ін., певний стабільний пробіотик переважно одержують неперервним вирощуванням періодичної культури, одержаної безпосередньо із посліду, вмісту сліпої і/або товстої кишки дорослої тварин-мішені. Також описується, що значну кількість пробіотика можна одержати або з неперервної, або з періодичної культури, причому періодичну культуру продовжують до досягнення концентрації оцтової кислоти, яка перевищує або дорівнює приблизно 20ммоль, концентрації пропіонової кислоти, яка перевищує або дорівнює приблизно 10ммоль, і концентрації суміші масляної та ізомасляної кислот, яка перевищує або дорівнює 15ммоль.

Asplund та ін. (Journal of Applied Bacteriology, Volume 81, 217-223, 1996) описують модель кишки свині in vitro та її використання для виявлення інгібування Yersinia enterocolitica 0 : 3 мікрофлорою клубової та сліпої кишки свині. Сліпі кишки та очищені частини тонкої кишки збирають, витримують в анаеробних умовах, і їх вміст збирають, групують і культивують. Доведено, що інокуляти сліпої та клубової кишки пригнічують ріст культивованої У. enterocolitica, причому флора сліпої кишки деякою мірою більш ефективна порівняно з флорою клубової кишки. Дія in vivo не відзначалась.

Вперше даним винаходом запропонована композиція і спосіб ослаблення in vivo і/або запобігання утворення колоній ентеропатогенних бактерій у ссавців, зокрема у худоби.

Відповідно, задачею даного винаходу є одержання субкультури із слизової оболонки тварини для боротьби з утворенням колоній ентеропатогенних бактерій у тварин.

Ще однією задачею цього винаходу є створення способу лікування тварин з метою боротьби з утворенням колоній ентеропатогенних бактерій у тварин з використанням препарату, одержаного з культури слизової оболонки.

Додаткові задачі та переваги винаходу будуть зрозумілі із наведеного далі опису.

Протягом останніх дванадцяти років все більше значення надається вивченню черевних інфекцій у людей. Взаємозв'язок між зараженням худоби та інфекційними захворюваннями у людей також знайшов достатнє підтвердження в документах. У процесі одержання і переробки м'яса тварин, таких як худоба, фекальний матеріал, що містить патогенні мікроорганізми, може потрапляти на м'ясо і воно зберігає ці мікроорганізми, потрапляючи на кухню. Свині разом з домашніми птахами, великою рогатою худобою та морськими продуктами є основними носіями сальмонел (Bean et al, J, Food Protect., Volume 53, 804-817, 1990; Lammerding et al, J. Food Protect., Volume 51, 47-52, 1988). Інфекція потрапляє до місцевих тварин через заражену їжу, від хронічних носіїв, які потрапляють у популяцію, інфікованих гризунів або від зараженого персоналу ферм (Heard, Vet. Rec, Volume 85, 482-484, 1969; Williams et al, J. Hyg. Camb., Volume 66, 281-293, 1968, Wilcock et al, Diseases in Swine, Leman et al, eds., Iowa State University Press, Ames IA, 570-583, 1992; Duhamel et al, Proc. 12th Int. Symp. New and Emerging Infect. Dis., San Diego, CA, 381, 1992). У випадку свиней основним джерелом зараження на бійні є свиня-носій інфекції. Вважається, що інфекція передається у безпосередньому контакті тварин або через взаємодію з зараженим фізичним середовищем (Newell et al, J. Am. Vet. Med. Assoc, Volume 158, 89-98, 1971). Ці інфіковані тварини, у свою чергу, заражують приміщення, обладнання і персонал, що призводить до зараження кінцевого продукту (Williams et al, Am. J. Pub. Health, Volume 60, 926-929, 1970; Newel et al, див. вище; Morgan et al, , Epidemiol. Infect, Volume 98, 323-330, 1987). Первинним носієм, тим не менше, залишається свиня-носій. На даний момент на заваді спроб виявлення та знищення популяції-носія інфекції ставала відсутність інформації відносно епідеміології та патогенезу сальмонельозу у худоби. Так як види сальмонел широко розповсюджені в середовищі та є стійкими до нього, було складно знищувати та контролювати ці мікроорганізми. Існує значна кількість інформації щодо вірулентності сальмонел відносно патогенезу у випадку людини. Проте, існує дуже мало інформації стосовно тваринних джерел цього інфекційного агента. Розуміння інфекційного процесу у тварин, які вживаються в їжу, набуло пріоритетного значення, так як контроль і вилучення тварини-носія запобігатиме зоонозному перенесенню захворювання. Боротьба із захворюваннями харчового походження найкраще може здійснюватися за рахунок виявлення та знищення популяції-носія. Хоча тварина може стати носієм у будь-який період свого життя, вперше вона може зазнати дії патогенних мікроорганізмів при народженні. Було винайдено застосування культури із слизової оболонки для контролю за утворенням колоній патогенних мікроорганізмів у тварин, які вживаються в їжу. Термін «контроль» означає ослаблення або запобігання утворення колоній ентеропатогенних бактерій. Під тваринами, які вживаються в їжу, маються на увазі будь-які тварини, що споживаються людиною.

Унікальну бактеріальну культуру одержують із зскрібків з кишкового тракту тварини, вільної від патогенних мікроорганізмів. Тварини можуть бути різного віку, найбільш бажано для захисту новонароджених та старших тварин використовувати молодих тварин. Цю первинну культуру субкультивують і після цього уводять молодим тваринам. Спосіб згідно з винаходом може бути застосований до будь-якої тварини як домашньої, так і дикої, і зокрема до худоби, яку вирощують для споживання людиною і яка може бути носієм патогенних мікроорганізмів-мішеней. Під худобою мають на увазі велику рогату худобу, телят, молодих овець, свиней, баранів, ягнят, буйволів, кіз, кролів, морських тварин і подібних. Препарат на основі субкультури конкурентного виключення із слизової оболонки худоби (LMCES) бажано вводити двічі протягом перших 24 годин post partum. Проте, препарат може вводитися у будь-який час протягом життя тварини на постійній основі або, наприклад, в окремі періоди життя тварини. Під терміном «постійна основа» мають на увазі те, що постійне джерело LMCES вводиться тварині через питну воду, корм, з допомогою харчування через зонд або з допомогою аерозолів. Для забезпечення постійної основи LMCES може вводитися у воду та корм щодня, щомісяця і т. п. Під поняттям «в окремі періоди життя тварини» мають на увазі введення культури LMCE в критичні контрольні моменти, які мають місце при народженні, відлученні від грудей, захворюванні, введенні антибіотиків, перегріві, зневодненні, застуді; при транспортуванні, зокрема при перевезенні до інших приміщень в процесі вирощування і перед транспортуванням на бійню і т. п.

Патогенні мікроорганізми-мішені включають всі людські ентеропатогенні бактерії, які здатні утворювати колонії у тварин, особливо у худоби, яку вирощують для споживання людиною. Вжитим тут терміном «людські ентеропатогенні бактерії» позначають бактерії, які здатні утворювати колонії, або відомо, що вони утворюють колонії у травному тракті людини або розповсюджують у ньому токсини і здатні зумовлювати кишкові захворювання у людському організмі-носії. Приклади людських ентеропатогенних бактерій включають, але не обмежуються ними, різновиди сальмонел, різновиди Campylobacterі Escherichia coli.

LMCES може поєднуватися з іншими культурами або лікарськими засобами, ефективними для боротьби з сальмонелами у тварин, такими як, наприклад, Lactobacillus, фруктоолігосахариди і дріжджі. Інші традиційні або відомі курси лікувань, зокрема для інгібування ентеропатогенних мікроорганізмів тварин можуть поєднуватися з препаратами LMCES, які не діють на активність цих препаратів.

Згідно зі способами даного винаходу тваринам уводять композиції, що містять субкультури конкурентного виключення із слизової оболонки худоби(LMCES). Під «введенням» у даному випадку мають на увазі будь-який придатний спосіб орального введення композицій тваринам, відомий у галузі техніки, такий як, наприклад, годування через зонд, через корм, розпилювання або нанесення пасти на материнські соски або штучні соски, через молоко і т. п. LMCES також може вводитися через анальний отвір. Препарат може застосовуватися у будь-якій відомій в цій галузі формі, такій як, наприклад, рідина, паста, желатинова капсула або аерозоль .для введення. Препарати LMCES вводять тваринам у будь-якому віці, включно з новонародженими тваринами, у кількостях, ефективних принаймні для ослаблення людських ентеропатогенних бактерій, виявлених у кишках тварин. Вжитий тут термін «ослаблення бактерій» або «принаймні ослаблення людських ентеропатогенних бактерій» означає зменшення кількості бактерій порівняно з кількістю, яка могла б бути передбачена у випадку тварини, яка не одержувала препаратів згідно із способами даного винаходу. Для таких зіставлень може використовуватись будь-який точний метод вимірювання, розрахунку і порівняння бактерій, присутніх у кишковому тракті тварин, відомих фахівцям у цій галузі. Вжиті тут терміни «у кількостях, ефективних», «ефективна кількість» або «кількість, ефективна» означають кількість введеного препарату LMCES, при якій ефект від введення виявляється принаймні у зменшенні кількості людських ентеропатогенних бактерій, виявлених у тварин різного віку. Кількість препарату буде змінюватися залежно від розмірів тварини, яка підлягає лікуванню, та способу лікування. У випадку малих тварин, включно з малими новонародженими тваринами, через зонд може вводитися 4-8 мл другого або наступного пасажу 48-годинної субкультури культури LMCES, причому перевага надається дозі 5 мл. У випадку великих тварин, включно з великими новонародженими тваринами, другий пасаж 48-годинної субкультури або наступний пасаж LMCES може не розводитися або до 10 разів розводитися до рідкої суспензії для орального введення, в якій розчинником може бути, наприклад, молоко, вода і под. Також можуть використовуватися додаткові пасажі субкультури, але вони будуть менш ефективні. Розведені і нерозведені препарати LMCES можуть вводитися безпосередньо. У випадку новонароджених тварин препарат LMCES вводять приблизно протягом 2-48 годин від народження, більш бажано протягом 2-6 годин від народження, після чого вводять другу дозу приблизно через 18-24 години. Найбільша перевага надається такій схемі застосування лікарського засобу: першу дозу вводять протягом приблизно 6 годин від народження, а наступну дозу - приблизно через 24 години після народження. Загалом першу дозу лікарського засобу вводять приблизно за 2-48 годин перед відлученням від грудей, перевезенням або транспортування до інших приміщень, перевага надається проміжку часу, який становить 2-6 годин. У цих випадках існує потреба в одному введенні лікарського засобу, але через 18-24 години після першої дози може вводитися друга доза лікарського засобу. Варіанти у схемах застосування лікарського препарату відображають комерційну сільськогосподарську практику. Додаткові дози можуть вводитися при відлученні від грудей, перед переміщенням в межах складського господарства або перед транспортуванням на бійню. Щоденне введення мало б місце у випадку введення засобу з кормом або водою.

Препарат LMCES одержують шляхом асептичного видалення "нижньої" кишки включно з сліпою кишкою тварини та їх розміщення у стерильному контейнері. Вжитим тут терміном "нижня" кишка позначається ділянка від виходу зі шлунка до сліпої кишки включно ,з нею. В процесі вирощування культур цей контейнер зберігають в анаеробному середовищі. Кишку по всій вибраній довжині можна вивертати будь-якими відомими у цій галузі засобами. Вміст кишки видаляють з допомогою промивання, яке здійснюють разом із зіскрібанням. Промивання здійснюють з допомогою відповідного анаеробного середовища. На стадії промивання можна використовувати будь-яке середовище, ефективне у використанні із зазначеною метою, включно з водою. Перевага надається анаеробному середовищу, причому особлива перевага надається попередньо відновленому, Eh збалансованому анаеробному середовищу. Поверхневе зіскрібання здійснюють з допомогою засобів з тупими краями, наприклад з допомогою скальпеля з затупленим лезом. Після зіскрібання порожнину промивають, після чого знову здійснюють зіскрібання з допомогою засобів з гострими краями, наприклад з допомогою скальпеля з гострим лезом або з допомогою іншого придатного інструмента. Загострені засоби та порожнину промивають середовищем описаним вище способом з метою одержання епітеліальних клітин і автохтонної мікрофлори, і продукти промивання збирають у стерильну ємність. Вирізана тканина також може бути одразу внесена в живильне середовище для вирощування культури без здійснення зіскрібання. На початку цієї процедури бажано зберігати тканину при зниженому тиску, тобто в потоці азоту. Продукти промивання або зрізи разом зі зв'язаними епітеліальними клітинами і мікрофлорою суспендують, і вміст інокулюють в стерильне анаеробне середовище для культури. Вжите тут поняття "мікрофлора" також охоплює автохтонних бактерій. Культуру інкубують в анаеробних умовах при температурі приблизно 35-40°С протягом приблизно 48 годин, переносять у свіже анаеробне середовище і повторно інкубують приблизно протягом додаткових 48 годин. В результаті другого інкубування одержують другий 48-годинний пасаж субкультури, який є найкращим вживаним препаратом LMCES. Також, як описувалося вище, можуть застосовуватися інші пасажі субкультури. Після цього культуру аналізують на наявність людських ентеропатогенних мікроорганізмів з використанням будь-яких придатних відомих методик виділення. Культури, вільні від патогенних мікроорганізмів, осушені заморожуванням або заморожені з використанням відомих методик заморожування культивованих клітин, вводять одразу. Слід провести серологічні аналізи крові тварин-донорів на рівень антитіл до відповідних патогенних мікроорганізмів тварини-хазяїна, включно з людиною. Слід використовувати культури тільки від тих тварин, у випадку яких не має місця явище сероконверсії.

Наведені нижче приклади більш детально ілюструють винахід, не обмежуючи при цьому об'єм правової охорони, визначений формулою винаходу.

ПРИКЛАД 1

ОДЕРЖАННЯ КУЛЬТУР КОНКУРЕНТНОГО ВИКЛЮЧЕННЯ ІЗ СЛИЗОВОЇ

ОБОЛОНКИ БИКІВ

Кишки дорослого здорового бика одержують на місцевій бійні і протягом однієї години доставляють у пластикових пакетах в стерильному анаеробному середовищі до лабораторії. Культуру слизової оболонки одержують із нижнього кишкового тракту. Перед видаленням ділянки кишки, призначеної для використання, її перев'язують ниткою з метою уникнення витікання кишкового вмісту в оточуюче середовище. В стерильних умовах видаляють ділянку завдовжки приблизно від 4 до 5 дюймів і кладуть у стерильний контейнер. Після цього контейнер ставлять у посудину, на яку постійно подають сильні струмені газоподібного азоту, вільного від кисню. Всі операції здійснюють нижче країв посудини для того, щоб середовище, в кому перебуває вирощувана культура, було анаеробним. Кишкову тканину по всій довжині обережно вивертають на стерильний скляний стержень так, щоб не торкатися її внутрішньої поверхні. Одразу ж після цього вміст видаляють промиванням і зіскрібанням. Промивання здійснюють введенням через шприц попередньо відновленого бульйону із серця і мозку (PR-BHIB). Придатними для використання на стадії промивання є будь-яке інше придатне анаеробне середовище. Зіскрібання здійснюють тупим краєм леза стерильного скальпеля. Порожнину промивають, зіскрібають і знову промивають. На цьому етапі епітелій сліпої кишки обережно зіскрібають переважно гострим краєм скальпеля. Проте, тканину можна вирізати одразу ж в живильне середовище для вирощування культури. Після зіскрібання вивернутої кишки, скальпель і стінки порожнини знову промивають з допомогою PR-BHIB. Цей кінцевий продукт промивання збирають - у стерильну посудину. Продукт промивання разом зі зв'язаними епітеліальнимим і бактеріальними клітинами відсмоктують з допомогою стерильного шприца і голки і використовують для інокулювання в пробірку з PR-BHIB через гумову перегородку. Ці пробірки інкубують при температурі 35°С протягом 48 годин, переносять і повторно інкубують протягом додаткових 48 годин. Культуру досліджують на присутність у ній досліджуваних людських ентеропатогенних мікроорганізмів, таких як різновиди Salmonella, Ε. coll і Campylobacter. Якщо культура є вільною як від людських, так і від тваринних патогенних мікроорганізмів і вважається безпечною, вона є готовою для застосування або зберігання з метою подальшого використання.

ПРИКЛАД 2

АНАЛІЗ ЕФЕКТИВНОСТІ БИЧАЧИХ LMCES

Бичачі композиції LMCES, описані у Прикладі 1, приблизно двічі вводять новонародженим телятам протягом приблизно перших 24 годин життя. Культуру вводять орально з допомогою пляшки і соски. Кожне із телят, що підлягає введенню препарату, щоразу одержує приблизно 500 мл LMCES, нерозведеної або до 10 разів розведеної у молоці. Після введення препарату телят годують, як звичайно. Приблизно через 24 години після введення кожному теляті через зонд уводять приблизно 108 клітин Е. соlі 0157:Н7, стійкої до налідиксової кислоти. Після контрольного зараження телят вирощують в ізольованих приміщеннях протягом приблизно семи днів для того, щоб будь-які чужорідні клітини Е. соlі 0157:Н7 очистили кишковий тракт. Після цього телят забивають, сліпі кишки асептично видаляють і кладуть в стерильні пластикові пакети. Після цього сліпі кишки досліджують на присутність і рівень Е. соlі 0157:Н7. Середнє число навантаження патогенними мікроорганізмами (log number) на грам сліпої кишки для всієї групи називається фактором утворення колоній (CF). Співвідношення факторів CF (контрольна група, якій не вводять препарат/CF (Група введення препарату)) називають фактором захисту (PF). Шляхом порівняння PF однієї культури конкурентного виключення із слизової оболонки з PF іншої культури одержують відносну величину ступеня захисту для культури.

ПРИКЛАД 3

ОДЕРЖАННЯ КУЛЬТУР КОНКУРЕНТОГО ВИКЛЮЧЕННЯ ІЗ СЛИЗОВОЇ ОБОЛОНКИ СВИНЕЙ

Здоровому молодому кабану, віком у проміжку від 1-6 місяців до повної зрілості, вводять суміш транквілізаторів прийнятими у цій галузі способами. Використовували суміш 8 мг/кг Кетасету (Ketaset), 6мг/кг Телазолу (Telazol) і 4мг/кг Ромпуну (Rompun). Після цього кабана забивають кровопусканням. Сліпу кишку асептично видаляють і кладуть у стерильну чашку Петрі. Після цього чашку Петрі ставлять у посудину, на яку постійно подають сильні струмені газоподібного азоту, вільного від кисню. Всі операції мають здійснюватися нижче країв посудини для того, щоб середовище, в якому перебуває вирощувана культура, було анаеробним. Кишкову тканину по всій довжині обережно вивертають на стерильне знаряддя так, щоб не торкатися внутрішньої поверхні. Одразу ж після цього вміст видаляють промиванням і зіскрібанням. Промивання здійснюють введенням через шприц попередньо відновленого бульйону. Зіскрібання здійснюють тупим краєм леза стерильного інструменту. Порожнину промивають, зіскрібають і знову промивають. На цьому етапі епітелій сліпої кишки обережно зіскрібають гострим краєм скальпеля або її можна обережно розрізати на малі зрізи (приблизно 5см). Після зіскрібання вивернутої сліпої кишки скальпель і стінки порожнини знову промивають з допомогою PR-BHIB. Цей кінцевий продукт промивання або зрізи сліпої кишки збирають у стерильну посудину. Продукт промивання разом зі зв'язаними бактеріальними клітинами відсмоктують з допомогою стерильного шприца і голки і використовують для інокулювання в пробірку з PR-BHIB через гумову перегородку. Ці пробірки інкубують при температурі приблизно 35°С приблизно протягом 48 годин, переносять і повторно інкубують ще приблизно протягом 48 годин. Культуру досліджують на присутність у ній досліджуваних людських ентеропатогенних мікроорганізмів, таких як різновиди Salmonella, Ε. coli і Camplyobacter. Якщо культура є вільною від патогенних мікроорганізмів і вважається безпечною, вона є готовою для застосування або зберігання.

ПРИКЛАД 4

АНАЛІЗ ЕФЕКТИВНОСТІ КУЛЬТУРИ КОНКУРЕНТНОГО ВИКЛЮЧЕННЯ ІЗ СЛИЗОВОЇ ОБОЛОНКИ СВИНЕЙ (LMCES)

Свиноматок, дати опоросу яких були відомі, тримали в клітках в ізольованих загонах. За день до відомої дати опоросу через кожні чотири години кожну із свиноматок перевіряли з метою підтвердження, що перша культура LMCES була введена своєчасно. Після опоросу поросятам давали змогу смоктати свиноматку для забезпечення одержання ними молозива, і кожному поросяті через зонд вводили приблизно 5мл LMCES у проміжку часу від приблизно 2 до 6 годин після народження. Другу дозу, яка становила приблизно 5мл, водили приблизно на 24 годину. Приблизно через 48 годин після народження (через 24 години після останнього ведення LMCES) здійснювали контрольне зараження поросятам введенням приблизно 103 CFU S. choleraesuis шляхом інтраназальної інстиляції. Після введення препарату поросят годували як звичайно. Протягом приблизно 7 днів після контрольного зараження вимірювали ректальну температуру у кожного поросяти і брали ректальні мазки та культивували сальмонел. Приблизно на сьомий день після контрольного зараження всіх поросят забивали і робили розтин. Для кількісного бактеріологічного аналізу збирали тканини, які включали тканини піднебіннєвої мигдалини (ton), мандибулярного лімфатичного вузла (min), легені, плечового лімфатичного вузла (bin), печінкиг селезінки (spl), середньої клубової кишки, з'єднання клубової і товстої кишки (icj), лімфатичних вузлів клубової і товстої кишки, сліпої кишки (сес), вмісту сліпої кишки (сс), ободової кишки (сої), лімфатичних вузлів ободової кишки і стінок шлунка (sw). З метою визначення рівня сальмонел у тканинах також проводили кількісний бактеріологічний аналіз вмісту сліпої кишки та з'єднання клубової та товстої кишки.

З метою встановлення впливу, який могли б мати на поросят свиноматки, також збирали і культивували фекалії свиноматок до опоросу, протягом 48 годин після опоросу та приблизно на сьомий день після контрольного зараження поросят (у випадку свиноматок не було здійснено жодного безпосереднього котрольного зараження S. choleraesuis). Поросятам із контрольної групи не вводили LMCES, але через 48 годин після народження було здійснене контрольне зараження. Тканини збирали і обробляли описаним вище способом.

У ході експерименту клінічні ознаки не були очевидними у всіх поросят. Виділення сальмонел із ректальних мазків було різним. Проте, у поросят, яким вводили LMCES, приблизно 41% тканин були позитивними, тоді як у поросят з контрольної групи позитивними виявились 63% тканин (Таблиця 1, Підсумок для Експериментів 1 і 2). У поросят, народжених від негативних свиноматок (Експеримент 1 - свиноматки 1, 2, 3 і Експеримент 2 - свиноматка 2) позитивними були 39% [120/310] тканин, тоді як у поросят, народжених від свиноматки із контрольної групи (Експеримент 1 - негативна свиноматка із контрольної групи) позитивними були 78% тканин [47/60]. На противагу поросятам, яким не вводили препарат, у поросят, яким була введена культура конкурентного виключення, спостерігалось зменшення кількості сальмонел. Порівняно з контрольною групою у поросят, яким була введена LMCES, спостерігали приблизно від 2 до 5 зменшення log числа для сальмонел у вмісті сліпої кишки (сс) або з'єднанні клубової і товстої кишки (icj) (сальмонел відповідно виділяли -з icj і сс поросят, народжених від свиноматок 2 і 1) (Таблиця 2, Експерименти 1 і 2). В Експерименті 1 всі свиноматки були вільні від патогенних мікроорганізмів. Спочатку всі свиноматки виділяли одну серологічну групу, що припинилось перед опоросом. При опоросі свиноматка 1 і свиноматка із контрольної групи виділяли серологічну групу В. В Експерименті 2 поросята, народжені від свиноматок 1 і 2, виділяли лише В тип сальмонел, а не введених при контрольному зараженні S. choleraesuis. Поросятам із контрольної групи, які використовувались в Експериментах 1 і 2, зовсім не вводили LMCES, a здійснювали їх контрольне зараження. Як видно, не має місця не лише зменшення кількості мікроорганізмів, з допомогою яких здійснювали контрольне зараження, а й ослаблення утворення колоній нативних мікроорганізмів. Хоча таке ослаблення і спостерігається у поросят з колоніями сальмонел, відмінних від одержаних при контрольному зараженні, ступінь захисту знижується, зважаючи на те, що у випадку поросят-сисунків, може бути передбачене більш раннє введення препарату.

Наведений нижче детальний опис носить ілюстративний характер. Такі деталі служать лише із вказаною метою, відповідно фахівець в даній галузі може здійснити модифікації, не виходячи за рамки об'єму даного винаходу.

ТАБЛИЦЯ 1

Частота і Рівні сальмонел у поросят, яким вводили LMCES або не вводили LMCES (Ctrl)

ПІДСУМОК

Log10/g

Мазки

% POS

Тканини

% POS

СС

ICJ

СЕ

57/281

20.3

157/380

41.3

3.19

3.13

Ctrl

72/114

63.2

95/150

63.3

5.09

5.45

ТАБЛИЦЯ 2

Частота і рівні сальмонел через 2 дні після контрольного зараження поросят, яким вводили LMCE або не вводили LMCE (Ctrl)

Експ. 1

Свиноматка / кільк. поросят

Пасаж No.

NO.POS. Мазки

NO.POS. Тканини

%POS. Тканини

log 10 СС

log 10 ICJ

1-/1/2/2

0

36/40

90

3.86

3.65

2-/1/2/2

1

21/60

35

2.51

3.35

3-/12

4/5

2

43/120

36

1.5

0

Сумарно

Ns

100/220

45

3.16

3.14

Контр. група

С/6

0

47/60

79

5.39

5.74

Всі свиноматки негативні

Тканини

ton

bin

легеня

печінка

spl

col

icj

cec

cc

sw

1(4)

3

4

4

3

4

4

4

3

4

3

2(6)

0

3

3

3

3

0

4

2

2

1

3(12)

2

12

9

7

6

0

3

1

3

0

с (6)

4

4

5

5

5

5

5

5

5

4

Експеримент 2:

Всі сальмонели

Свиноматка/

No. Pos.

No. Pos.

%Pos.

log 10

log 10

Кільк. поросят

Пасаж No.

Мазки

Тканини

Тканини

СС

ICJ

1+/7

4/4

50/56*

37/70

53

2.32

1.38

2-/9

6/7

4/49*

20/90

22

-0-

-0-

Сумарно

па

57/160

36

2.02

1.08

С+/9

72/72*

48/90

53

3.33

4.23

* виділення тільки В

ТАБЛИЦЯ 2 (продовження)

Тканини

ton

bin

легеня

печінка

spl

col

icj

cec

cc

sw

1(7)

2

6

6

5

4

4

4

2

4

0

2(9)

1

5

3

2

3

1

1

2

2

0

с

2

3

3

3

2

6

9

9

9

2

Тільки С1:

Свиноматка/

No. Pos.

No. Pos.

% Pos.

log 10

log 10

Кільк. поросят

Пасаж No.

Мазки

Тканини

Тканини

CC

ICJ

1+/7

4/4

na

19/70

27

-0-

-0-

2-/9

6/7

na

18/90

20

-0-

-0-

Сумарно

na

37/160

23

-0-

-0-

С+/9

na

16/98

18

2.98

4.23

Тканини

ton

bin

легеня

печінка

spl

col

icj

cec

cc

sw

1(7)

1

5

5

4

4

0

0

0

0

0

2(9)

1

5

3

2

3

1

1

1

1

0

С

1

3

3

2

2

1

1

1

1

1