Спосіб одержання гранульованих препаратів бульбочкових бактерій

УКРАЇНА (19) U А « , Л 7715 и (13) А (5D6 А 61 К 35/74 ОПИС ДО ПАТЕНТУ ДЕРЖАВНЕ ПАТЕНТНЕ ВІДОМСТВО НА ВИНАХІД без проведення експертизи по суті на підставі Постанови Верховної Ради України N* 3769-ХІІ від 23.ХІІ. 1993 р. Публікується в редакції заявника (54) СПОСІБ ОДЕРЖАННЯ ГРАНУЛЬОВАНИХ БАКТЕРІАЛЬНИХ ПРЕПАРАТІВ 1 (21)95083971 (22) 30.08.95 (24) 20.05.97 (46)31.10.97. Бюл. № 5 (47) 20.05.97 (72)Курдиш Іван Кирилович, СІчкар Вячеслав Іванович, Титова Людмила Вячеславівна (73) Інститут мікробіології І вірусології їм. Д.К.Заболотного НАН України (UA) (57) 1. Способ получения гранулированных бактериальных препаратов, включающий выращивание культуры микроорганизмов, смешивание их суспензии с наполнителем и гранулирование полученной массы, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что в качестве наполнителя используют глинистые минералы, преимущественно монтмориллонит, которые вносят в культуральную жидкость в массовом соотношении 1,2-2,0:1,0. 2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что глинистые минералы вносят в два приема, пр ел 17715 их смешивания с защитными средами. Известен способ получения бактериальных препаратов путем распылительного высушивания (авт. св. СССР № 161990, кл. С 12 N 1/02, опубл. 30.12.90), отличающийся 5 тем, что с целью увеличения количества жизнеспособных клеток, микроорганизмы перед высушиванием их суспензии сначала смешивают с глинистым минералом палыгорскитом, а затем с сухим молоком. Однако Ю применение сухого молока в качестве защитной среды, а также энергоемкого распылительного высушивания значительно удорожает процесс получения бакпрепаратов. 15 Предложен способ защиты и консервирования микроорганизмов глинистыми минералами, предусматривающий смешивание водных суспензий микроорганизмов и глин и последующее удаление избытка влаги 20 до получения состава, в котором клетки покрыты слоем глины (заявка Франции № 2394606, кл. С 12 К 1/08; А 01 15/00, опубл. 17.07.87). Недостатком данного способа является необходимость многократного отмывания 25 клеток микроорганизмов перед их смешиванием с глинистыми минералами. Описан способ получения бактериального препарата, в котором для его приготовления суспензию микроорганизмов 30 смешивают с прокаленным глинистым минералом, а затем полученную смесь высушивают под вакуумом (заявка Франции № 2592892, кл. С 12 N 1/20, опубл. 17.07.87). Такой подход обеспечивает высокий выход жиз- 35 неспособных клеток в сыпучем препарате. Однако вакуумное высушивание препарата значительно удлиняет время его получения и увеличивает стоимость готового продукта. 40 Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ приготовления препаратов клубеньковых бактерий, основанный на смешивании суспензии этих микроорганизмов с химически 45 инертным пористым материалом при соотношении 0,5-1,0 и последующем высушивании на воздухе в асептических условиях в течение 2-Ю дней (патент ЕПВ № 0203708, 1986). Однако порошковидный препарат 50 жизнеспособных бактерий не всегда удобен в применении, а длительный срок его высушивания значительно усложняет технологию получения биопрепарата. В основу изобретения поставлена зада- 55 ча создания гранулированного бактериального препарата, в котором в качестве наполнителя используют стерильные глинистые минералы, чем обеспечивается возможность гранулирования композита, содержащего клетки микроорганизмов и за счет их взаимодействия с данными материалами достигается сохранение жизнеспособности бактерий в удобном для применения готовом препарате низкой стоимости. Поставленная задача решается тем, что в процессе получения гранулированных бактериальных препаратов, включающем выращивание культуры микроорганизмов, смешивание ее суспензии с наполнителем и гранулирование полученной массы, согласно изобретению в культуральную жидкость, содержащую клубеньковые бактерии, вносят стерильные глинистые минералы, которые задают в два приема в конечном массовом отношении к суспензии микроорганизмов 1,2-2,0:1,0. На первом этапе глинистые минералы вносят в пределах 0,1-2,0% от массы суспензии; основную часть глины задают через 15-20 мин после внесения первой порции. Полученную массу перемешивают и гранулируют известным методом. Для удаления влаги с поверхности полученных частиц и их подсушивания гранулы приводят в контакт со стерильными порошковидными высушенными глинистыми минералами. Затем препарат подсушивают на воздухе в течение часа и расфасовывают. Сущность предполагаемого изобретения иллюстрируется следующими примерами. П р и м е р 1. Культуру бактерий Bradyrhlzobium japonicum штамм 634 выращивали в среде с гороховым отваром (100 г гороха на 1 л) следующего состава (в г/л): КНРО4 - 0,5; К2НРО4 3Н2О - 0,5; (NH/O2SO4 - 0,5; MgSO4 7НгО - 0,2; СаСОз - 0,1; дрожжевой экстракт - 1,0; маннит - 10,0, рН среды 6,3-6,5. Для этого в 3 колбы Эрленмеера, объемом 0,7 л вносили по 50 мл среды вышеприведенного состава, инокулированной данными микроорганизмами, полученными при смыве их газона со скошенной агаризованной среды в микробиологических пробирках. Культуру микроорганизмов выращивали при 28-30°С в течение трех суток. В 4 50 мл суспензии бактерий вносили 7,5 г порошковидного стерильного глинистого минерала монтмориллонита. Смесь медленно взбалтывали в течение 15 мин для улучшения контакта бактерий с частицами глинистого минерала. После этого в смесь вносили 202,5 г порошковидного стерильного монтмориллонита до получения густой массы. Полученную смесь перемешивали, гранулировали известным методом, постоянно припудривая поверхность гранул сухим стерильным глинистым минералом для отбора влаги с 17715 поверхности гранул. Гранулы досушивали на воздухе в течение часа, отсеивали от порошковидных частиц и стерильно расфасовывали. Получено 345 г гранулированного препарата влажностью 27,6% (часть подго- 5 товленной массы терялась в емкости для смешивания и грануляторе). Численность жизнеспособных бактерий в образцах определяли методом десятикратных разведений с последующим высевом Ю 0,1 мл образца соответствующего разведения на поверхность агаризованной среды вышеприведенного состава в чашках Петри и учетом количества выросших колоний после 10-12 суток культивирования при темпе- 15 ратуре 28-30°С. Для приготовления десятикратных разведений из образцов гранулированного препарата 10 г этого препарата вносили в 90 мл стерильной водопроводной воды и реактивировали пу- 20 тем встряхивания на качалке в течение двух часов. Численность жизнеспособных клубеньковых бактерий в 1 мл исходной суспензии составляла 1,71 109. В 150 мл суспензии со- 25 держалось 2,56 10 11 жизнеспособных клеток, а их титр в 1 г гранулированного препарата составлял 0,52 109 клеток. Их количество в 345 г препарата достигало 1,79 1011. Таким образом, выход жизнеспо- 30 собных клеток в гранулированном препарате с монтмориллонитом составил 69,9%. П р и м е р 2. Бактерии Bradyrhizobium Japonicum 634 выращивали в условиях, описанных в примере 1, В 5 колб вносили по 150 35 мл суспензии, полученной при выращивании этих микроорганизмов. В разные колбы с этой суспензией добавляли стерильный порошковидный глинистый материал палыгорскит в количестве 0,15; 7,5; 15,0; 30,0 г. В 40 один из вариантов глинистый минерал не вносили. Для улучшения контакта бактерий с частицами минерала содержимое колб медленно перемешивали в течение 15 мин. После этого во все колбы вносили новые 45 порции данного минерала до его конечного содержания 225 г (таблица). Смесь тщательно перемешивали, гранулировали известным методом, постоянно припудривая поверхность полученных гранул сухим сте- 50 рильным порошком палыгорскита для отбора влаги с поверхности гранул. Их досушивали на воздухе в течение часа, отсеивали от порошковидных частиц и расфасовывали. 55 Численность жизнеспособных бактерий в суспензии микроорганизмов и препаратах определяли по методу, описанному в примере 1. Количество жизнеспособных бактерий в исходной суспензии составило 1,71 109 кл/мл. Следовательно, в 150 мл суспензии содержалось 2,56 10 11 клеток. Численность жизнеспособных бактерий в различных образцах препарата приведена в таблице. Полученные результаты свидетельствуют о том, что при однократном внесении палыгорскита в суспензию микроорганизмов выход жизнеспособных клеток в гранулированном препарате составлял лишь около 10% от их численности в исходной суспензии Если же глинистые минералы вносили в два приема (таблица), что улучшало взаимодействие клеток с частицами минерала, выход жизнеспособных бактерий существенно возрастал. При внесении на первом этапе 5% палыгорскита выход жизнеспособных бактерий в готовом препарате достигал максимальных значений и составлял 41,8%. Таким образом, внесение глинистого минерала в суспензию микроорганизмов два приема; на первом этапе в пределах 0,1-20%, а на втором - до получения гранулируемой массы, способствует контактному взаимодей твию бактерий с частицами минерала, предохраняет клетки от действия неблагоприятных факторов окружающей среды и повышает выход жизнеспособных микроорганизмов. П р и м е р З . Бактерии Bradyrhizobium japonicum 634 выращивали в условиях, описанных в примере 1. В 150 мл полученной суспензии вносили 7,5 г стерильного порошковидного палыгорскита. Смесь медленно перемешивали в течение 15 мин для улучшения контакта микроорганизмов с частицами глинистого минерала. Затем туда вносили 172,5 г данного минерала. Смесь тщательно перемешивали, гранулировали известным методом, постоянно припудривая поверхность гранул сухим стерильным порошковидным палыгорскитом для отбора влаги с поверхности этих гранул. Их досушивали на воздухе в течение одного часа, отсеивали от порошковидных частиц и расфасовывали. Получено 271 г гранулированного препарата. Численность жизнеспособных клеток в исходной суспензии и готовом препарате определяли по методу, описанному в примере 1. В исходной суспензии количество жизнеспособных бактерий составляло 2.5.109 кл/мл. Следовательно, в 150 мл суспензии содержалось 3,75Ю жизнеспособных клеток. В гранулированном препарате титр жизнеспособных бактерий составлял 0,39 109 кл/г. В 271 г препарата их содержание достигало 1,0610 кл/r. Выход жизнеспособных бактерий в гранулированном препарате с палыгорскитом составил 28,3 %. 17715 8 Полученный результат свидетельствует Таким образом, использование глио том, что применение глинистого минерала нистых минералов палыгорскита и, осопалыгорскита в весовом соотношении к сусбенно, монтмориллонита позволяет получить гранулированный препарат пензии бактерий 1,2-1,0 позволяет получить гранулированный препарат клубеньковых бак- 5 Bradyrhizobium japonicum с высоким содержанием в нем жизнеспособных бактетерий с выходом жизнеспособных бактерий в рий. нем 28,3% от их содержания в суспензии, Зависимость качества препарата Bradyrhizobium japonicum от количества глинистого минерала палыгорскита, вносимого в суспензию бактерий на первом и втором этапе подготовки материала к гранулированию Характеристика препарата Количество палыгорскита (г), вносимого в суспензию бактерий на первом (числитель) и втором (знаменатель) этапе подготовки материала 0 225Я Численность жизнеспособных бактерий, кл/г Масса полученного препарата, г Общая численность бактерий в препарате Выход жизнеспособных бактерий в препарате, % 7,5 0,9 * 10 8 10,2 11 0,30 109 0,29 109 300 297 1,07-Ю11 0,90 10 11 0,86 10 11 41,8 35,2 33,6 2Ї75 9 302 295 0,26 10 0,19 10 30,0 79О0 298 225Л 15,0 0,36 109 0,15 0,57 • 10 11 22,3 П р и м е ч а н и я : 1. Объем используемой суспензии - 150 мл; 2. Титр жизнеспособных бактерий в исходной суспензии - 1,71*109; 3. Часть массы, подлежащей гранулированию, остается на используемом оборудовании. Упорядник Замовлення 4247 Техред Н.Румянцева Коректор М. Керецмэн Тираж Підписне Державне патентне відомство України, 254655, ГСП, КиГв-53, Львівська пл., 8 Відкрите акціонерне товариство "Патент", м. Ужюрод в, і і л* ірій $ 101 УКРАЇНА (19, UA (11)17715 аз) С 2 (51) 6 C12N1/20, C05F11/08 МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ ОПИС ДЕРЖАВНИЙ ДЕПАРТАМЕНТ ІНТЕЛЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ ДО ПАТЕНТУ НА ВИНАХІД (54) СПОСІБ ОДЕРЖАННЯ ГРАНУЛЬОВАНИХ ПРЕПАРАТІВ БУЛЬБОЧКОВИХ БАКТЕРІЙ (21)95083971 (22) 30.08.1995 (24) 16.10.2000 (46) 16.10.2000, Бюл. № 5-1, 2000 р. (72) Курдиш Іван Кирилович, Січкар Вячеслав Іванович, Титова Людмила Вячеславівна (73) Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України (56) ЕР 0 203 708, Int. СІ.5: C12N 1/04, A01N 63/00, А01С 1/06, C05F 11/08, Date of publication of application 12.06.1986 (57) 1. Способ получения гранулированных препаратов клубеньковых бактерий, включающий выращивание культуры микроорганизмов, смешивание их суспензии с наполнителем, в качестве которого используют глинистые минералы, и гранулирова ние полученной массы, отличающийся тем, что глинистый минерал вносят в культуральную жидкость в массовом соотношении 1,2-2:1,0 в два приёма, причём на первом этапе их задают в пределах 0,1-2,0% от массы суспензии микроорганизмов, а затем основное количество минерала, после чего полученный композит гранулируют, при этом гранулы приводят в контакт с порошком высушенного стерильного глинистого минерала, затем их подсушивают в течение часа на воздухе, отделяют от пылевидных частиц известным способом и стерильно расфасовывают. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве глинистого минерала используют монтмориллонит. см О to Изобретение относится к биотехнологии, а именно, к производству бактериальных препаратов. Сыпучие бактериальные препараты обладают рядом преимуществ перед суспензиями микроорганизмов и другими формами готового продукта. Они заключаются в удобстве хранения сыпучих препаратов, транспортирования, а также их использования. Широко распространенным способом получения сыпучих бактериальных препаратов является их изготовление на основе торфа (А. с. СССР №540852, МКИ С 05 F 11/08, опубл. 30.12.1976). Однако, учитывая различия в происхождении торфов, степени их метаморфизма и свойствах, применение данных субстратов для приготовления бактериальных препаратов зачастую не позволяет получать эффективные препараты. К тому же, очень часто возникают значительные сложности со стерилизацией торфа, поскольку термическая обработка может приводить к непрогнозируемому ухудшению его качества, а радиационная стерилизация данного материала является дорогостоящей и труднодоступной. Достаточно распространенным способом получения сыпучих бактериальных препаратов является распылительное высушивание микробных суспензий после их смешивания с защитными средами. Известен способ получения бактериальных препаратов путём распылительного высушивания (А.с. СССР № 1616990, МКИ C12N 1/02, опубл. 30.12.90), отличающийся тем, что с целью увеличения количества жизнеспособных клеток, микроорганизмы перед высушиванием их суспензии сначала смешивают с глинистым минералом палыгорскитом, а затем с сухим молоком. Однако применение сухого молока в качестве защитной среды, а также энергоёмкого распылительного высушивания значительно удорожает процесс получения бакпрепаратов. Предложен способ защиты и консервирования микроорганизмов глинистыми минералами, предусматривающий смешивание водных суспензий микроорганизмов и глин и последующее удаление избытка влаги до получения состава, , в котором клетки покрыты слоем глины (Заявка Франции №2394606, МКИ С12К 1/08, А01 15/00, опубл. 17.07.87). Недостатком данного способа является необходимость многократного отмывания клеток микроорганизмов перед их смешиванием с глинистыми минералами. Описан способ получения бактериального препарата, в котором для его приготовления суспензию микроорганизмов смешивают с прокаленным глинистым минералом, а затем полученную смесь высушивают под вакуумом ( Заявка Франции №2592892, МКИ С12 №1/20, опубл. 17.07.87 ). Такой подход обеспечивает высокий выход жизнеспособных клеток в сыпучем препарате. Однако, вакуумное высушивание препарата значительно ю 17715 удлиняет время его получения и увеличивает стоимость готового продукта. Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ приготовления препаратов клубеньковых бактерий, основанный на смешивании суспензии этих микроорганизмов с химически инертным пористым материалом при соотношении 0,5-1,0 и последующем высушивании на воздухе в ассептических условиях в течении 2-Ю дней (Пат.ЕПВ №0203708.1986). Однако порошковидный препарат жизнеспособных бактерий не всегда удобен в применении, а длительный срок его высушивания значительно усложняет технологию получения препарата. В основу изобретения поставлена задача создания гранулированного бактериального препарата, в котором в качестве наполнителя используют стерильные глинистые материалы, чем обеспечивается возможность гранулирования композита, содержащего клетки микроорганизмов и за счет их взаимодействия с данными материалами достигается сохранение жизнеспособности бактерий в удобном для применения готовом препарате низкой стоимости. Поставленная задача решается тем, что в процессе получения гранулированных бактериальных препаратов, включающем выращивание культуры микроорганизмов, смешивание её суспензии с наполнителем и гранулирование полученной массы, согласно изобретению, в культурную жидкость, содержащую клубеньковые бактерии, вносят стерильные глинистые материалы, которые задают в два приёма в конечном массовом отношении к суспензии микроорганизмов 1,22,0.1,0. На первом этапе глинистые материалы вносят в пределах 0,1-2,0% от массы суспензии; основную часть глины задают через 15-20 мин. После внесения первой порции. Полученную массу перемешивают и гранулируют известным методом. Для удаления влаги с поверхности полученных частиц и их подсушивания гранулы приводят в контакт со стерильными порошковидными высушеными глинистыми материалами. Затем препарат подсушивают на воздухе в течении часа и расфасовывают. Сущность изобретения иллюстрируется следующими примерами. ПРИМЕР! Культуру бактерий Bradyrhizobium japonicum штамм 634 выращивали в среде с гороховым отваром (100 г гороха на 1 л) следующего состава (в г/л):КН2 PO4-0,5;K2HPO4*3H2O-0,5;(NH4)2SO40,5;MgSO4*7 Н2О-0,2;СаСОз-0,1; дрожжевой экстракт - 1,0; маннит - 10,0; рН среды 6,3-6,5. Для этого в 3 колбы Эрленмеера, объемом 0,7 л вносили по 50 мл среды вышеприведенного состава, инокулированной данными микроорганизмами, полученными при смыве их газона со скошенной агаризованной среды в микробиологических пробирках. Культуру микроорганизмов выращивали при 28-30° С в течении трёх суток. В 150 мл суспензии бактерий вносили 7,5 г порошковидного стерильного глинистого минерала монтмориллонита. Смесь медленно взбалтывали в течении 15 мин. Для улучшения контакта бактерий с частицами глинистого материала. После этого в смесь вносили 202,5 г порошковидного стерильного монтмо риллонита до получения густой массы. Полученную смесь перемешивали, гранулировали известным методом, постоянно припудривая поверхность гранул сухим стерильным глинистым материалом для отбора влаги с поверхности гранул. Гранулы досушивали на воздухе в течении часа, отсеивали от порошковидных частиц и стерильно расфасовывали. Получено 345 г гранулированного препарата влажностью 27,6% (часть подготовленной массы терялась в емкости для смешивания и грануляторе). Численность жизнеспособных бактерий в образцах определяли методом десятикратных разведений с последующим высевом 0,1 мл образца соответствующего разведения на поверхность агаризованной среды вышеприведенного состава в чашках Петри и учётом количества выросших колоний после 10 суток культивирования при температуре 28-30° С. Для приготовления десятикратных разведений из образцив гранулированного препарата 10 г этого препарата вносили в 90 мл стерильной водопроводной воды и реактивировали путем встряхивания на качалке в течении двух часов. Численность жизнеспособных клубеньковых бактерий в 1 мл исходной суспензии составляла 1,71*109. В 150 мл суспензии содержалось 2,56* 10 11 жизнеспособных клеток, а их титр в 1 г гранулированного препарата составлял 0,52*109 клеток. Их количество в 345 г препарата достигало 1,79*1011. Таким образом, выход жизнеспособных клеток в гранулированном препарате с монтмориллонитом составил 69,9%. ПРИМЕР 2. Бактерии Bradyrhizobium japonicum 634 выращивали в условиях, описанных в примере 1. В 5 колб вносили по 150 мл суспензии, полученной при выращивании этих микроорганизмов. В разные колбы с этой суспензией добавляли стерильный порошковидный глинистый минерал палыгорскит в количестве 0,15;7,5;15,0;30,0 г. В один из вариантов глинистый материал не вносили. Для улучшения контакта бактерий с частицами минерала содержимое колб медленно перемешивали в течении 15 мин. После этого во все колбы вносили новые порции данного минерала до его конечного содержания 225 г (табл.). Смесь тщательно перемешивали, гранулировали известным методом, постоянно припудривая поверхность полученных гранул сухим стерильным порошком палыгорскита для отбора влаги с поверхности гранул. Их досушивали на воздухе в течении часа, отсеивали от порошковидных частиц и расфасовывали. Численность жизнеспособных бактерий в суспензии микроорганизмов и препаратах определяли по методу, описанному в примере 1. Количество жизнеспособных бактерий в исходной суспензии составило 1,71*109 кл/мл. Следовательно, в 150 мл суспензии содержалось 2,56* 10 11 клеток. Численность жизнеспособных бактерий в различных образцах препарата приведена в таблице. Полученные результаты свидетельствуют о том, что при однократном внесениипалыгорскита в суспензию микроорганизмов выход жизнеспособных клеток в гранулированном преперате составлял лишь около 10% от их численности в исходной суспензии. Если же глинистые материалы вносили в два 17715 приёма (табл.), что улучшало взаимодействие клеток с частицами минерала, выход жизнеспособных бактерий существенно возрастал. При внесении на первом этапе 5% палыгорскита выход жизнеспособных бактерий в готовом препарате достигал максимальных значений и составлял 41,8%. Таким образом, внесение глинистого минерала в суспензию микроорганизмов в два приёма: на первом этапе в пределах 0,1-20%, а на втором до получения гранулированной массы, способствует контактному взаимодействию бактерий с частицами минерала, предохраняет клетки от действия неблагоприятных факторов окружающей среды и повышает выход жизнеспособных микроорганизмов. ПРИМЕР 3. Бактерии Bradyrhizobium japonicum 634 выращивали в условиях, описанных в примере 1. В 150 мл полученной суспензии вносили 7,5 г стерильного порошковидного палыгорскита. Смесь медленно перемешивали в течении 15 мин. для улучшения контакта микроорганизмов с частицами глинистого минерала. Затем туда вносили 172,5 г данного минерала. Смесь тщательно перемешивали, гранулировали известным методом, постоянно припудривая поверхность гранул сухим стерильным порошковидным палыгорскитом для отбора влаги с поверхности этих гранул. Их подсушивали на воздухе в течении одного часа, отсеивали от порошковидных частиц и расфасовывали. Получено 271 г гранулированного препарата. Численность жизнеспособных клеток в исходной суспензии и готовом препарате определяли по методу, описаному в примере 1. В исходной суспензии количество жизнеспособных бактерий составляло 2,5* 109 кл/мл. Следовательно, в 150 мл суспензии содержалось 3,75*1011 жизнеспособных клеток. В гранулированном препарате титр жизнеспособных бактерий составлял 0,39*109 кл/г. В 271 г препарата их содержание достигало 1,06*1011 кл/г. Выход жизнеспособных бактерий в гранулированном препарате с палыгорскитом составил 28,3%. Полученный результат свидетельствует о том, что применение глинистого материала палыгорскита в весовом соотношении к суспензии бактерий 1,2:1,0 позволяет получить гранулированный препарат клубеньковых бактерий с выходом жизнеспособных бактерий в нём 28,3% от их содержания в суспензии. Таким образом, использование глинистых минералов палыгорскита и, особенно, монтмориллонита позволяет получить гранулированный препарат Bradyrhizobium japonicum с высоким содержанием в нём жизнеспособных бактерий. Таблица Зависимость качества препарата Bradyrhizobium japonicum от количества глинистого минерала палыгорскита, вносимого в суспензию бактерий на первом и втором этапе подготовки материала к гранулированию Характеристика препарата Количество палыгорскита (г), вносимого в суспензию бактерий на первом (числитель) и втором (знаменатель) этапе подготовки материала 0 /225,0 0,15/225,0 7,5/217,5 15,0/210,0 30,0/190,0 0,9*108 0,19*109 0,36*109 0,30*109 0,29*109 Масса полученного препарата.г 295 302 298 300 297 Общая численность бактерий в препарате 0,26*1011 0,57*1011 1,07*1011 0,90*1011 0,86*1011 10,2 22,3 41,8 35,2 33,6 Численность жизнеспособных препаратов.кл/г Выход жизнеспособных бактерий в препарате,% 17715 Примечания: 1. Объем использованной суспензии -150 мл; 2. Титр жизнеспособных бактерий в исходной су9 спензии -1,71*10 ; 3. Часть массы, подлежащей гранулированию, оотается на используемом оборудовании. ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Бульв. Лесі Українки, 26, Київ, 01133, Україна (044) 254-42-30, 295-61-97 Підписано до друку /э.#3- 2001 p. Формат 60x84 1/8. Обсяг #*/5~обл.-вид.арк. Тираж 50 прим. Зам._ УкрІНТЕІ Вул. Горького, 180, Київ, 03680 МСП, Україна (044) 268-25-22 УКРАЇНА (19>UA (11)17715 (із) С2 (51) 6C12N1/20,C05F11/08 МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ ОПИС ДЕРЖАВНИЙ ДЕПАРТАМЕНТ ІНТЕЛЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ ДО ПАТЕНТУ НА ВИНАХІД (54) СПОСІБ ОДЕРЖАННЯ ГРАНУЛЬОВАНИХ ПРЕПАРАТІВ БУЛЬБОЧКОВИХ БАКТЕРІЙ (21)95083971 (22) 30.08.1995 (24) 16.10.2000 (46) 16.10.2000, Бюл. № 5-1, 2000 р. (72) Курдиш Іван Кирилович, Січкар Вячеслав Іванович, Титова Людмила Вячеславівна (73) Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України (56) ЕР 0 203 708, Int. СІ.5: C12N 1/04, A01N 63/00, А01С 1/06, C05F 11/08, Date of publication of application 12.06.1986 (57) 1. Способ получения гранулированных препаратов клубеньковых бактерий, включающий выращивание культуры микроорганизмов, смешивание их суспензии с наполнителем, в качестве которого используют глинистые минералы, и гранулирова ние полученной массы, отличающийся тем, что глинистый минерал вносят в культуральную жидкость в массовом соотношении 1,2-2:1,0 в два приёма, причём на первом этапе их задают в пределах 0,1-2,0% от массы суспензии микроорганизмов, а затем основное количество минерала, после чего полученный композит гранулируют, при этом гранулы приводят в контакт с порошком высушенного стерильного глинистого минерала, затем их подсушивают в течение часа на воздухе, отделяют от пылевидных частиц известным способом и стерильно расфасовывают. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве глинистого минерала используют монтмориллонит. Изобретение относится к биотехнологии, а именно, к производству бактериальных препаратов. Сыпучие бактериальные препараты обладают рядом преимуществ перед суспензиями микроорганизмов и другими формами готового продукта. Они заключаются в удобстве хранения сыпучих препаратов, транспортирования, а также их использования. Широко распространенным способом получения сыпучих бактериальных препаратов является их изготовление на основе торфа (А. с СССР №540852, МКИ С 05 F 11/08, опубл 30.12.1976). Однако, учитывая различия в происхождении торфов, степени их метаморфизма и свойствах, применение данных субстратов для приготовления бактериальных препаратов зачастую не позволяет получать эффективные препараты. К тому же, очень часто возникают значительные сложности со стерилизацией торфа, поскольку термическая обработка может приводить к непрогнозируемому ухудшению его качества, а радиационная стерилизация данного материала является дорогостоящей и труднодоступной. Достаточно распространенным способом получения сыпучих бактериальных препаратов является распылительное высушивание микробных суспензий после их смешивания с защитными средами. Известен способ получения бактериальных препаратов путём распылительного высушивания (А.с. СССР № 1616990, МКИ C12N 1/02, опубл. 30.12.90), отличающийся тем, что с целью увеличения количества жизнеспособных клеток, микроорганизмы перед высушиванием их суспензии сначала смешивают с глинистым минералом палыгорскитом, а затем с сухим молоком. Однако применение сухого молока в качестве защитной среды, а также энергоёмкого распылительного высушивания значительно удорожает процесс получения бакпрепаратов. Предложен способ защиты и консервирования микроорганизмов глинистыми минералами, предусматривающий смешивание водных суспензий микроорганизмов и глин и последующее удаление избытка влаги до получения состава, , в котором клетки покрыты слоем глины (Заявка Франции №2394606, МКИ С12К 1/08, А01 15/00, опубл. 17.07.87). Недостатком данного способа является необходимость многократного отмывания клеток микроорганизмов перед их смешиванием с глинистыми минералами. Описан способ получения бактериального препарата, в котором для его приготовления суспензию микроорганизмов смешивают с прокаленным глинистым минералом, а затем полученную смесь высушивают под вакуумом ( Заявка Франции №2592892, МКИ С12 №1/20, опубл. 17.07.87 ). Такой подход обеспечивает высокий выход жизнеспособных клеток в сыпучем препарате. Однако, вакуумное высушивание препарата значительно см О ю 17715 удлиняет время его получения и увеличивает стоимость готового продукта. Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ приготовления препаратов клубеньковых бактерий, основанный на смешивании суспензии этих микроорганизмов с химически инертным пористым материалом при соотношении 0,5-1,0 и последующем высушивании на воздухе в ассептических условиях в течении 2-Ю дней (Пат.ЕПВ №0203708.1986). Однако порошковидный препарат жизнеспособных бактерий не всегда удобен в применении, а длительный срок его высушивания значительно усложняет технологию получения препарата. В основу изобретения поставлена задача создания гранулированного бактериального препарата, в котором в качестве наполнителя используют стерильные глинистые материалы, чем обеспечивается возможность гранулирования композита, содержащего клетки микроорганизмов и за счет их взаимодействия с данными материалами достигается сохранение жизнеспособности бактерий в удобном для применения готовом препарате низкой стоимости. Поставленная задача решается тем, что в процессе получения гранулированных бактериальных препаратов, включающем выращивание культуры микроорганизмов, смешивание её суспензии с наполнителем и гранулирование полученной массы, согласно изобретению, в культурную жидкость, содержащую клубеньковые бактерии, вносят стерильные тинистые материалы, которые задают в два приёма в конечном массовом отношении к суспензии микроорганизмов 1,22,0:1,0. На первом этапе глинистые материалы вносят в пределах 0,1-2,0% от массы суспензии; основную часть глины задают через 15-20 мин. После внесения первой порции. Полученную массу перемешивают и гранулируют известным методом. Для удаления влаги с поверхности полученных частиц и их подсушивания гранулы приводят в контакт со стерильными порошковидными высушеными глинистыми материалами. Затем препарат подсушивают на воздухе в течении часа и расфасовывают. Сущность изобретения иллюстрируется следующими примерами. ПРИМЕР 1. Культуру бактерий Bradyrhizobium japonicum штамм 634 выращивали в среде с гороховым отваром (100 г гороха на 1 л) следующего состава (в г/л):КН2 PO4-0,5;K2HPO4*3H2O-0,5;(NH4)2SO40,5;MgSO4*7 H2O-0,2;CaCO3-0,1; дрожжевой экстракт - 1,0; маннит - 10,0; рН среды 6,3-6,5. Для этого в 3 колбы Эрленмеера, объемом 0,7 л вносили по 50 мл среды вышеприведенного состава, инокулированной данными микроорганизмами, полученными при смыве их газона со скошенной агаризованной среды в микробиологических пробирках. Культуру микроорганизмов выращивали при 28-30° С в течении трёх суток. В 150 мл суспензии бактерий вносили 7,5 г порошковидного стерильного глинистого минерала монтмориллонита. Смесь медленно взбалтывали в течении 15 мин. Для улучшения контакта бактерий с частицами глинистого материала. После этого в смесь вносили 202,5 г порошковидного стерильного монтмо риллонита до получения густой массы. Полученную смесь перемешивали, гранулировали известным методом, постоянно припудривая поверхность гранул сухим стерильным глинистым материалом для отбора влаги с поверхности гранул. Гранулы досушивали на воздухе в течении часа, отсеивали от порошковидных частиц и стерильно расфасовывали. Получено 345 г гранулированного препарата влажностью 27,6% (часть подготовленной массы терялась в емкости для смешивания и грануляторе). Численность жизнеспособных бактерий в образцах определяли методом десятикратных разведений с последующим высевом 0,1 мл образца соответствующего разведения на поверхность агаризованной среды вышеприведенного состава в чашках Петри и учётом количества выросших колоний после 10 суток культивирования при температуре 28-30° С. Для приготовления десятикратных разведений из образцив гранулированного препарата 10 г этого препарата вносили в 90 мл стерильной водопроводной воды и реактивировали путем встряхивания на качалке в течении двух часов. Численность жизнеспособных клубеньковых бактерий в 1 мл исходной суспензии составляла 1,71*109. В 150 мл суспензии содержалось 2,56* 10 11 жизнеспособных клеток, а их титр в 1 г гранулированного препарата составлял 0,52*1О9 клеток. Их количество в 345 г препарата достигало 1,79*1011. Таким образом, выход жизнеспособных клеток в гранулированном препарате с монтмориллонитом составил 69,9%. ПРИМЕР 2. Бактерии Bradyrhizobium japonicum 634 выращивали в условиях, описанных в примере 1. В 5 колб вносили по 150 мл суспензии, полученной при выращивании этих микроорганизмов. В разные колбы с этой суспензией добавляли стерильный порошковидный глинистый минерал палыгорскит в количестве 0,15;7,5;15,0;30,0 г. В один из вариантов глинистый материал не вносили. Для улучшения контакта бактерий с частицами минерала содержимое колб медленно перемешивали в течении 15 мин. После этого во все колбы вносили новые порции данного минерала до его конечного содержания 225 г (табл.). Смесь тщательно перемешивали, гранулировали известным методом, постоянно припудривая поверхность полученных гранул сухим стерильным порошком палыгорскита для отбора влаги с поверхности гранул. Их досушивали на воздухе в течении часа, отсеивали от порошковидных частиц и расфасовывали. Численность жизнеспособных бактерий в суспензии микроорганизмов и препаратах определяли по методу, описанному в примере 1. Количество жизнеспособных бактерий в исходной суспензии составило 1,71*109 кл/мл. Следовательно, в 150 мл суспензии содержалось 2,56*1011 клеток. Численность жизнеспособных бактерий в различных образцах препарата приведена в таблице. Полученные результаты свидетельствуют о том, что при однократном внесениипалыгорскита в суспензию микроорганизмов выход жизнеспособных клеток в гранулированном преперате составлял лишь около 10% от их численности в исходной суспензии. Если же глинистые материалы вносили в два 17715 приёма (табл.), что улучшало взаимодействие клеток с частицами минерала, выход жизнеспособных бактерий существенно возрастал. При внесении на первом этапе 5% палыгорскита выход жизнеспособных бактерий в готовом препарате достигал максимальных значений и составлял 41,8%. Таким образом, внесение глинистого минерала в суспензию микроорганизмов в два приёма: на первом этапе в пределах 0,1-20%, а на втором до получения гранулированной массы, способствует контактному взаимодействию бактерий с частицами минерала, предохраняет клетки от действия неблагоприятных факторов окружающей среды и повышает выход жизнеспособных микроорганизмов. ПРИМЕР 3. Бактерии Bradyrhizobium japonicum 634 выращивали в условиях, описанных в примере 1. В 150 мл полученной суспензии вносили 7,5 г стерильного порошковидного палыгорскита. Смесь медленно перемешивали в течении 15 мин. для улучшения контакта микроорганизмов с частицами глинистого минерала. Затем туда вносили 172,5 г данного минерала. Смесь тщательно перемешивали, гранулировали известным методом, постоянно припудривая поверхность гранул сухим стерильным порошковидным палыгорскитом для отбора влаги с поверхности этих гранул. Их подсушивали на воздухе в течении одного часа, отсеивали от порошковидных частиц и расфасовывали. Получено 271 г гранулированного препарата. Численность жизнеспособных клеток в исходной суспензии и готовом препарате определяли по методу, описаному в примере 1. В исходной суспензии количество жизнеспособных бактерий составляло 2,5*109 кл/мл. Следовательно, в 150 мл суспензии содержалось 3,75*1011 жизнеспособных клеток. В гранулированном препарате титр жизнеспособных бактерий составлял 0,39*109 кл/г. В 271 г препарата их содержание достигало 1,06*1011 кл/г. Выход жизнеспособных бактерий в гранулированном препарате с палыгорскитом составил 28,3%. Полученный результат свидетельствует о том, что применение глинистого материала палыгорскита в весовом соотношении к суспензии бактерий 1,2:1,0 позволяетполучить гранулированный препарат клубеньковых бактерий с выходом жизнеспособных бактерий в нём 28,3% от их содержания в суспензии. Таким образом, использование глинистых минералов палыгорскита и, особенно, монтмориллонита позволяет получить гранулированный препарат Bradyrhizobium japonicum с высоким содержанием в нём жизнеспособных бактерий. Таблица Зависимость качества препарата Bradyrhizobium japonicum от количества глинистого минерала палыгорскита, вносимого в суспензию бактерий на первом и втором этапе подготовки материала к гранулированию Характеристика препарата Количество палыгорскита (г), вносимого в суспензию бактерий на первом (числитель) и втором (знаменатель) этапе подготовки материала 0 /225,0 0,15/225,0 7,5/217,5 15,0/210,0 30,0/190,0 0,9* 10 8 0,19*10® 0,36*109 0,30*109 0,29*109 Масса полученного препарата,г 295 302 298 300 297 Общая численность бактерий в препарате 0,26*1011 0,57*1011 1,07*1011 0,90* 10 11 0,86*1011 10,2 22,3 41,8 35,2 33,6 Численность жизнеспособных препаратов,кл/г Выход жизнеспособных бактерий в препарате,% 17715 Примечания. 1. Объем использованной суспензии -150 мл; 2. Титр жизнеспособных бактерий в исходной су9 спензии - 1,71*10 ; 3. Часть массы, подлежащей гранулированию, остается на используемом оборудовании. ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Бульв. Лесі Українки, 26, Київ, 01133, Україна (044) 254-42-30, 295-61-97 Підписано до друку /S-03- 2001 р Формат 60x84 1/8. Обсяг О, */Э~обл.-вид.арк. Тираж 50 прим. Зам. /£ УкрІНТЕІ Вул. Горького, 180, Київ, 03680 МСП, Україна (044) 268-25-22