Спосіб визначення псевдодефіциту арилсульфатази а

Спосіб визначення псевдодефіциту арилсу льфатази А, який включає визначення активності арилсульфатази А в гомогенаті лейкоцитів шляхом інкубації зразків лейкоцитів при температурі 37°С протягом 1 години, який відрізняється тим, що додатково здійснюють інкубацію зразків лейкоцитів при 0 - 4°С протягом 1 6 - 2 0 годин і отримані результати порівнюють з областю нормальних значень активності арилсульфатази А Винахід відноситься до медицини, а зокрема діагностики спадкової патологи, і може використовуватись при медико-генетичному консультуванні сімей, обтяжених по метахроматичній лейкодистрофм - спадковій хворобі, що обумовлена мутацією в гені арилсульфатази А і, як наслідок, зниженням активності цього ферменту В результаті цього нерозщеплений субстрат накопичується в лізосомах тканин і призводить до розвитку важких неврологічних порушень Але виявилось, що ІНОДІ зниження активності арилсульфатази А спостерігається у здорових осіб - псевдодефіцит арилсульфатази А Доведено, що цей стан обумовлений наявністю двох мутацій в гені арилсульфатази А, які впливають на активність цього ферменту при и визначенні in vitro, в той час як in vivo не спостерігається жодних ознак захворювання Таким чином, якщо не виключити наявність псевдодефіциту, можна особу зі зниженою активністю арилсульфатази А та неврологічною симптоматикою іншого генезу помилково діагностувати як метахроматичну лейкодистрофію сті арилсульфатази А в гомогенаті лейкоцитів за стандартним методом Baum et al [2] Для цього з З - 5мл венозної гепаринізованої крові виділяють лейкоцити за стандартною методикою [3] До 0,2мл гомогенату лейкоцитів додають 0,2мл субстратної суміші такого складу ЮмМ пнітрокатехолсульфат у ацетатному буфері рН 5,0, що містить 10% хлорида натрію та 0,5мМ пірофосфата натрію Зразки інкубують при 37°С на протязі 1 години Реакцію зупиняють додаванням 2,5н гідроксиду натрію КІЛЬКІСТЬ звільненого субстрату оцінюють визначенням оптичної ЩІЛЬНОСТІ зразків при 515нм Калібрування проводять з використанням стандартних розчинів п-нітрокатехолу Результати висловлюють у нмоль/год/мг білку КІЛЬКІСТЬ білку в гомогенаті лейкоцитів визначають за стандартним методом Крістіана та Варбурга [4] Отримані показники порівнюють з областю нормальних значень активності арилсульфатази А, що визначається дослідним шляхом Відомий спосіб визначення псевдодефіциту арилсульфатази А за допомогою молекулярногенетичних технологій [1] Для цього виділяють ДНК, напрацьовують фрагменти гену арилсульфатази А за допомогою полімеразної ланцюгової реакції та аналізують наявність мутацій в цих фрагментах Використання молекулярно-генетичних методів ускладнене в зв'язку з великою вартістю аналізу, а також ймовірності нової, досі неописаної мутації в цьому гені Відомий спосіб визначення зниження активно При визначенні активності арилсульфатази А в гомогенаті лейкоцитів за стандартним методом Baum et al спостерігається значне перекривання областей нормальних значень активності АСА та значень при псевдодефіциті арилсульфатази А На фіг 1 представлена діаграма розподілу значень активності арилсульфатази А в різних групах обстежених ос і б (обстежено 59 здорових донорів, 12 хворих на метахроматичну лейкодистрофію та 14 осіб з псевдодефіцитом арилсульфатази А) Наявність зони перекривання областей активності арилсульфатази А у хворих на метахроматичну лейкодистрофію та у осіб з псевдодефіцитом арилсульфатази А значно ускладнює інтерпретацію 5 ю 54174 показників, що потрапляють в цю зону Задачею заявляемого винаходу є підвищення достовірності визначення псевдодефіциту арилсульфатази А біохімічним методом Поставлена задача досягається тим, що, додатково здійснюють інкубацію зразків лейкоцитів при 0 - 4°С на протязі 1 6 - 2 0 годин і отримані показники порівнюють з областю нормальних значень активності арилсульфатази А, отриманих в цих же умовах Спосіб здійснюється наступним чином Лейкоцити отримують з гепаринізованої крові за стандартною методикою згідно прототипу В якості субстрату використовують ЮмМ пнітрокатехолсульфат у ацетатному буфері рН5,0, що містить 10% хлорида натрію та 0,5мМ пірофосфата натрію Реакційну суміш готують, змішуючи 0,2мл гомогенату лейкоцитів та 0,2мл субстрату Інкубацію зразків проводять при 37°С на протязі 1 години та при 0 - 4°С на протязі 16-20 годин Після інкубації реакцію зупиняють додаванням 0,1 мл 2,5н NaOH КІЛЬКІСТЬ звільненого субстрату визначають шляхом вимірювання оптичної ЩІЛЬНОСТІ розчину при 515нм Результати висловлюють у нмоль/год/мг білку для зразків, що шкубували при 37°С, та у нмоль/18год/мг білку для зразків, що шкубували при 0 - 4°С КІЛЬКІСТЬ білку в гомогенаті лейкоцитів визначають за стандартним методом Крістіана та Варбурга Отримані показники порівнюють з областю нормальних значень активності арилсульфатази А На фіг 2 представлена діаграма розподілу значень активності арилсульфатази А в різних групах обстежених ос і б (обстежено 21 здоровий донор, 12 хворих на метахроматичну лейкодистрофію та 14 осіб з псевдодефіцитом арилсульфатази А), отримані заявляємим способом 3 діаграми видно, що області різних груп не перекриваються Це дозволяє з великою достовірністю ідентифікувати осіб з псевдодефіцитом арилсульфатази А Приклад Пацієнтка Ш , бміс , історія хвороби №15645 Направлена на медико-генетичне консультування з попереднім діагнозом лейкодистрофія зі стійким судомним синдромом, резистентним до антиконвульсантів При клінічному огляді відмічено стан дитини тяжкий, судомний синдром, відмічаються напади апноє на фоні поперхування їжою та водою, ГІПОТОНІЯ, плаваючі рухи очей, за предметами не стежить, сухожильні рефлекси не викликаються, наявні пірамідні знаки При визначенні активності арилсульфатази А у пацієнтки та у батьків(облігатних гетерозигот) отримані наступні результати Інкубація зразків при 37°С Пацієнтка Ш - 24нмоль/год/мг білку Мати - 31 нмоль/год/мг білку Батько - 50нмоль/год/мг білку При порівнянні результатів з областю нормальних значень видно, що активність арилсульфатази А пацієнтки Ш при інкубації зразків при 37°С знаходиться в зоні патологічних значень, тобто не виключено наявність МЛД у пацієнтки Активність ферменту у батьків також знаходилась в зоні, яку можна інтерпретувати як гетерозиготні носи, так і псевдодефіцит арилсульфатази А Для перевірки наявності псевдодефіциту в цій родині було проведено визначення активності арилсульфатази А згідно запропонованому нами способу Інкубація зразків при 0 - 4°С Пацієнтка Ш - 260нмоль/18год/мг білку Мати - 262нмоль/18год/мг білку Батько - 214нмоль/18год/мг білку Таким чином, активність арилсульфатази А і у пацієнта, і у батьків знаходиться в області нормальних значень Наявність псевдодефіциту арилсульфатази А у всіх трьох членів родини підтверджено молекулярно-генетичними методами Таким чином, впровадження способу визначення псевдо дефіциту арилсульфатази А у 15 випадках на базі кафедри медичної генетики, клінічної імунологи та алергології КМАПО їм П Л Шупика та лабораторії медичної генетики УДСЛ "ОХМАТДИТ" дозволило зробити слідуючи висновки 1 завдяки заявляемому способу значно підвищено достовірність ідентифікації псевдодефіциту арилсульфатази А, 2 впровадження способу визначення псевдодефіциту арилсульфатази А дозволить значно покращити медико-генетичне консультування сімей, обтяжених по цій патологи, перспективне консультування подружніх пар з випадками непідтвердженого біохімічно діагнозу метахроматичної лейкодистрофп в родоводі, при родинному шлюбі та ш Література 1 Coulter-Mackie MB, Applegarth DA, Toone J, Vallance H, DNA-based diagnosis of arylsulfatase A deficiencies as a supplement to enzyme assay a case in point, Clm Biochem 1997, vol 30, 1 57 - 61 2 Baum H, Dodgson KS, Spenser B, The assay of arylsulfatases A and В in human urine Clm Chim Acta, 1959, 4 453-455 3 Цветкова И В , Бахарев В А , Кази 3 , Осипова Г Н , Розенфельд Е Л , Розовский И С "Выявление недостаточности арилсульфатазы А при метахро мати чес кой лейкодистрофии и пренатальний диагноз заболевания" Вопр мед химии, 1980, вып 4, стр 4 6 4 - 4 6 4 4 Досон Р , Эллиот Д , Эллиот У , Джонс К , Справочник биохимика, Москва, Мир, 1991, 543с 54174 активність АСА при 37 С -мпд -ІЩ -норма ФІГ.1 активність АСА при 0-4 С М / і зкіивнісіь АСА, нкояьАод/чг Фіг.2 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)236-47-24