Спосіб виготовлення вірусвакцини проти міксоматозу кроликів

1 Спосіб виготовлення вірусвакцини проти міксоматозу кроликів, який полягає у тому, що спочатку вирощують матриксний вірус на первинно-трипсинізованій культурі клітин нирок кроленят в живильному середовищі з наступним зараженням клітини штамом вірусу міксоми В-82, заморожуванням-відтаванням отриманого матриксного вірусу, яким надалі заражають уже виробничий об'єм культури клітин нирок кроленят, вирощеної також у живильному середовищі на первиннотрипсинізованій тканині нирок кроленят, до одержання вірусних зборів з наступним їх висушуванням у середовищі висушування, і люфілізацією готової вірусвакцини, який відрізняється тим, що в живильне середовище на стадії вирощування культури кліток нирок кроленят, як при приготуванні матриксного вірусу, так і при одержанні виробничого об'єму вірусвакцини додають вітаміни та амінокислоти 2 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що як вітаміни використовують тіамін хлорид, фолієву кислоту, нікотинамід, пантотенат кальцію, піродоксин пдрохлориду, холінхлорид, інозит, рибофлавін 3 Спосіб за пп 1, 2, який відрізняється тим, що КІЛЬКІСТЬ кожного вітаміну, що вводять, відносно живильного середовища знаходиться в співвідношенні 0,01 1 4 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що як амінокислоти використовують глютамін, цистин 5 Спосіб за пп 1, 4, який відрізняється тим, що КІЛЬКІСТЬ глютаміну, яку вводять, стосовно живильного середовища знаходиться в співвідношенні 0,03 1, а КІЛЬКІСТЬ цистину, яку вводять, стосовно живильного середовища знаходиться в співвідношенні 0,004 1 Винахід відноситься до ветеринарної вірусологи, зокрема до способу виготовлення вірусвакцини проти міксоматозу кроликів і може бути використаний на підприємствах біологічної промисловості Найбільш близьким до способу, що заявляється, і який обраний як прототип є спосіб виготовлення вірусвакцини проти міксоматозу кроликів (див Інструкцію з виготовлення і контролю вакцини проти міксоматозу кроликів сухою живою культурою зі штаму В-82 з розчинником, затверджену Головним управлінням ветеринарії Держагропрому СРСР 1987р ), ВІДПОВІДНО до якого на первинно трипсинізованій тканині нирок кроленят, вирощують культуру клітин кроленят в живильному середовищі з наступним зараженням и штамом вірусу міксоми В-82, отримують матріксний вірус, заморожу ють-відтаю ють, і надалі заражають їм вже виробничий об'єм культури клітин кроленят, вирощеної в живильному середовищі з попередньо трипсинізованої тканини нирок кроленят до отримання вірусних зборів, до яких додають середовище висушування з наступною люфілізацією готової вакцини На практиці при використанні зазначеного способу виготовлення вірусвакцини відзначається недостатній ріст культури клітин при зараженні їх як штамом вірусу міксоми В-82, так і матріксним вірусом Пояснюється це низькою біологічною активністю самої культури, що приводить до зниження врожайності культури клітин і вимагає значних термінів для формування моношару, а в цілому негативно виявляється на активності отриманого вірусу В основу винаходу поставлене завдання удосконалення способу виготовлення вірусвакцини, у якому за рахунок додаткової обробки вітамінами і амінокислотами культури клітин кроленят на стадії и вирощування, як для готування матриксного вірусу, так і при одержанні виробничого об'єму віру ю ю 55121 свакцини забезпечується збільшення життєздатності і врожайності культури клітин, зменшується терміни формування її моношару При цьому підвищується інфекційна активність отриманого вірусу, а саме його титр, скорочуються терміни виготовлення вакцини, що позитивно впливає на продуктивність цього способу Поставлене завдання вирішується тим, що у відомому способі виготовлення вірусвакцини проти міксоматозу кроликів, який полягає у тому, що спочатку вирощують матриксний вірус на первинно-трипсинізованій культурі клітин кроленят в живильному середовищі з наступним зараженням культури клітини штамом вірусу міксоми В-82, заморожуванням-відтаюванням отриманого матриксного вірусу, яким надалі заражають уже виробничий об'єм культури клітин кроленят, вирощеної також у живильному середовищі на первиннотрипсинізованій тканині нирок кроленят до одержання вірусних зборів, до яких додають середовище висушування з наступною люфілізацією готової вірусвакцини, ВІДПОВІДНО ДО винаходу, у живильне середовище на стадіях вирощування культури клітин кроленят, як при готуванні матриксного вірусу, так і при отриманні виробничого об'єму вірусвакцини додають вітаміни і амінокислоти Крім того, як вітаміни використовують тіамін хлорид, фолієву кислоту, нікотинамід, пантотенат кальцію, піродоксин пдрохлориду, холінхлорид, інозит, рибофлавін, причому КІЛЬКІСТЬ КОЖНОГО вітаміну, що вводиться, стосовно живильного середовища знаходиться в межах 0,01 1 Як амінокислоти використовують L-глютамш, цистін, при цьому КІЛЬКІСТЬ L-глютамша, що вводиться, стосовно живильного середовища знаходиться в межах 0,03 1, а КІЛЬКІСТЬ цистіна - у співвідношенні 0,004 1 Причинно-наслідковий зв'язок всіх ознак винаходу, що заявляється, з результатами, що досягаються, виражається в наступному Додавання заявлених вітамінів і амінокислот у запропонованих співвідношеннях у живильне середовище на стадії вирощування культури клітин, як при одержанні матриксного вірусу, так і при отриманні виробничого об'єму вірусвакцини за рахунок властивостей природних біологічно активних речовин у комплексі вітамінів і амінокислот, дозволяє збільшити життєздатність самої культури, збільшуючи, таким чином, врожай клітин При цьому знижуються також терміни формування моношару культури клітки до 4 днів, підвищується інфекційна активність отриманої вірусвакцини, про що свідчить збільшений до 10 7 0 ИДбо/сн3 титр вірусу Спосіб, що заявляється, здійснюється таким чином Спочатку вирощують матриксний вірус, для чого витягають нирки кроленят 2 - 3 добового віку, подрібнюють їх на фрагменти і промивають розчином Хенкса до повного просвітління рідини Потім проводять трипсинізацію тканин нирок кроленят теплим або холодним способом до повного виснаження тканини До отриманої суспензії додають сироватку великої рогатої худоби (ВРХ) для інактивації трипсину Визначають концентрацію і життєздатність клітин Звісь клітин фільтру ють через стерильний тришаровий марлевий мішечок Після ЧОГО ДО отриманої суспензії додають живильне середовище у вигляді 0,5% розчину гемопдролізата на розчині Хенкса з антибіотиками, до якої також додають вітаміни тіамін хлорид, фолієву кислоту, нікотинамід, пантотенат кальцію, піродоксин пдрохлориду, холінхлорид, інозит, рибофлавін у КІЛЬКОСТІ кожного вітаміну до живильного середовища у співвідношенні 0,01 1 і амінокислоти L-глютамш у співвідношенні до живильного середовища 0,031 і цистін у співвідношенні 0,004 1, вирощують культуру в підготовлених матрацах Роблять контроль за формуванням моношару культури клітин Потім вирощену таким чином культуру клітин кроленят заражають вірусом штаму, для чого використовують сухий виробничий штам В-82 вірусу міксоми При зараженні вірус адсорбується на культурі, процес ведуть протягом 3-х годин при температурі (33 ± 0,5)°С Після додають підтримуюче середовище і витримують заражену культуру клітин протягом 3 - 4 доби при температурі (33 ± 0,5)°С, при цьому щодня протягом цієї доби проводять мікроскопію інфікованої культури клітин на предмет утворення груп округлених клітин з поступовим поширенням округлих клітин по всьому клітинному моношару (цитопатична дія - ЦПД) Матраци з матриксним вірусом заморожують при температурі мінус (20 - 40)°С і відтаюють при температурі (20 - 25)°С Перевіряють інфекційну активність отриманого матриксного вірусу шляхом титрування, який дорівнює 10 5 0 - 10 Г о ИДйо/ом3 Потім отриманим матриксним вірусом заражають виробничий об'єм культури клітин кроленят, котрі, як і для одержання матриксного вірусу вирощують у живильному середовищі, куди також додають вітамінну суміш і амінокислоти аналогічного складу, як і при одержанні матриксного вірусу і у такому же співвідношенні Роблять також контроль щодо інтенсивності розмноження вірусу в культурі клітин і інфекційної активності отриманого вірусного збору Потім ДО вірусного збору зі змістом вірусу в титрі 10 7 0 ИДбо/сн3 додають середовище висушування, що містить 10% лактози, 8% пептону, 1% желатина на фосфатно-буферному розчині з рН 7,2-7,4 Після додавання середовища висушування суспензію, яка містить вірус, розливають у стерильні флакони, наприклад, по 2,5 - 5см3 по ТУ У 04763746-016-98 з наступною люфілізацією готової вакцини, яку проводять у низькотемпературних апаратах при температурі мінус (45 - 60)°С и витримують при цій же температурі протягом 8 - 1 0 годин Приклад конкретного виконання способу Спочатку вирощують матриксний вірус, для чого з 10 кроленят 2 - 3 добового віку витягають нирки і за допомогою леза подрібнюють їх на фрагменти 2 - Змм3, промивають розчином Хенкса до повного просвітління рідини і одержують 25 грам здрібненої тканини Потім проводять трипсинізацію теплим мето 55121 дом при температурі (33 ± 0,5)°С Для цього заливають 25 грамів тканини нирок кроликів 250мм теплого трипсину Процес трипсинізацм проводять протягом 2 годин до повного виснаження тканини Перший злив роблять після 5 хвилин витримування і видаляють його Другий - через 40 хвилин, третій - через 20 - ЗО хвилин Трипсинізацію проводять до повного виснаження тканини Отриману клітинну суспензію в КІЛЬКОСТІ ЗООмл поміщають у матрац і додають сироватку великої рогатої худоби в КІЛЬКОСТІ бмл для інактивації трипсину Визначають концентрацію і життєздатність клітин у камері Горяєва Звісь КЛІТИН фільтрують через стерильний тришаровий марлевий мішечок Посівна концентрація первинно-трипсинізованої культури кліток нирки кролика 800 - 900 тис у см 3 Потім проводять посів клітин нирок кроленят в матраци з попередньо підготовленою сумішшю живильного середовища у вигляді 0,5% розчину гемопдролізата в розчині Хенкса з антибіотиками, куди також додають вітаміни з розрахунку тіаміну хлориду - 0,01 г/л, фолієву кислоту - 0,01 г/л, нікотинаміду - 0,01 г/л, пантотената кальцію - 0,01 г/л, піродоксина пдрохлориду - 0,01 г/л, холінхлорида 0,01 г/л, інозиту - 0,01 г/л, рибофлавіну - 0,01 г/л і амінокислоти з розрахунку L-глютамшу - Зг/л, цистіна - 0,004г/л У кожен матрац заливають 200мл живильного середовища На четверту добу, після мікроскопування відбирають матраци з цілком сформованим моношаром Отримують 8 матраців, з яких 7 матраців з культурою клітин нирок кроленят заражають штамом В-82 вірусу міксоми, а один матрац залишають для контролю культур клітин Зараження культури клітин нирок кроленят проводять з розрахунку 0,05 - 0,50 ИД50 вірусу на клітину Адсорбцію вірусу проводять протягом З годин при температурі (33 ± 0,5)°С Після додають підтримуюче середовище у вигляді 0,5% гемопдролізата в КІЛЬКОСТІ 200мл на 1 матрац Заражену культуру клітин витримують 4 доби при температурі (33 ± 0,5)°С Кожний день протягом цього часу проводять мікроскопію інфікованої і контрольної культури клітин до появи ясно виражених груп округлених клітин з наступним поширенням округлих клітин по всьому клітинному шару (ЦПД) Контрольний матрац не повинний мати неспецифічної дегенерації кліток, а заражені - бактеріальних проростів і ЦВІЛІ Матраци з зараженою культурою з вираженим ЦПД заморожують при температурі мінус 40°С и відтаюють при температурі 25°С для визначення на біологічну активність Визначають інфекційну активність отриманої матриксної розплодки на кроликах шляхом титрування препарату внутрішкіряним зараженням Титр вірусу 10?0ИД5о/см3 Отриману сировину - матриксний вірус у КІЛЬКОСТІ 1400мл перевіряють на бактеріальну чистоту і інфекційну активність Надалі матриксним вірусом заражають уже виробничий об'єм культури клітин кроленят Для чого роблять усі ті ж дії, що і при одержанні матриксного вірусу тільки для отримання сировини тканини беруть 75 голів кроленят, отримують 187 грамів здрібнених нирок кроленят, заливають 1800мл теплого трипсину і одержують 2200мл клітинної суспензії, для інактивації трипсину додають 110мл сироватки ВРХ Також здійснюють контроль концентрації та життєздатності клітин У попередньо підготовлене живильне середовище у виді 0,5% розчину гемопдролізата в розчині Хенкса з антибіотиками також додають вищезгадані вітаміни та амінокислоти у такому ж співвідношенні до живильного середовища як і при отриманні матриксного вірусу На 4 добу отримують 60 матраців з моношаром клітин кроленят, які заражають матриксним вірусом міксоми Після адсорбції вірусу на 4 добу одержують 12л вірусвакцини, додають середовище висушування в співвідношенні 1 1, тобто 12л, що складається з 10% лактози, 8% пептону, 1% желатіни на фосфатнобуференному розчині, з рН - 7,2 - 7,4 Фасовку вакцини роблять у флакони по 2,5мл (25 доз у 1 флаконі) і відправляють їх на люфілізацію у вакуум-сушильному апараті Вірусвакцина проти міксоматозу, що отримана за даним способом, активна, нешкідлива для кроликів Застосовують дану вакцину внутрим'язево в об'ємі 1см3 Імунітет формується на 9 добу після вакцинації і продовжується не менш 9 МІСЯЦІВ МОЛОДНЯК ревакцинується через 3 МІСЯЦІ Вірусвакцина стабільно зберігає свої імунобюлопчні властивості в процесі збереження протягом 12 МІСЯЦІВ при температурі 4°С Таким чином, виготовлена по запропонованому способу вірусовакцина дозволяє забезпечити захист кролів від хвороби міксоматоза Спосіб, що заявляється, простий у виконанні, доступний, що робить його промислово застосовним Підписано до друку 03 04 2003 р Тираж 39 прим ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)236-47-24