Спосіб прогнозу продукції інтерлейкіна-2 та експресії рецепторів до інтерлейкіна-2, що асоційовані з нla-антигенами у хворих на хронічну ниркову недостатність

Спосіб прогнозу продукції інтерлейкша-2 та експресії рецепторів до інтерлейкша-2, що асоці йовані з HLA-антигенами у хворих на хронічну ниркову недостатність, який включає визначення HLA-антигенів на мононуклеарах периферичної крові, який відрізняється тим, що визначають HLA-DR2-aHTnreH у фенотипі хворих на хронічну ниркову недостатність, присутність якого свідчить про високий рівень продукції інтерлейкша-2 та експресії рецепторів до інтерлейкша-2, що є ознакою підвищеного ризику розвитку гострої реакції відторгнення алотрансплантованої нирки Винахід відноситься до медицини, а саме до клінічної імунологи, і може бути використаний для лабораторного прогнозу рівня продукції штерлейкіна-2 (ІЛ-2) та експресії рецепторів до штерлейкіна-2 у хворих на хронічну ниркову недостатність, які є потенційними реципієнтами трансплантата алогенної нирки Незважаючи на те, що наукові досягнення в галузі генетики імунної ВІДПОВІДІ вже мають відображення у практиці, насамперед при інфекційних хворобах, дослідження цього питання знаходяться у фазі розробки Розуміння під таким кутом зору взаємозв'язку між HLA-фенотипом суб'єкта і схильністю до синтезу імунокомпетентними клітинами цитокинів має не тільки теоретичне значення, але може бути практично доцільним, оскільки є підставою для прогнозу перебігу КЛІНІЧНОГО процесу та призначення терапевтичних препаратів За останні роки отримані данні про те, що ІЛ-2, який продукується Т-хелперами 1 типу, належить головна роль в клітинних імунних реакціях на алотрансплантований орган, насамперед при гострій реакції відторгнення алогенної нирки Відомо, що ІЛ-2 контролює процеси проліферації, диференціації та функціональну активність Т-, В- та ПКклітин, а порушення експресії рецепторів до ІЛ-2 призводять до дефектів їх функціонування Ступінь пстосумісності між донором та реципієнтом під час алотрансплантації нирки визначається на підставі тканинного типування та виявлення HLA фенотипів донора та реципієнта На сьогодні у більшості країн типування засновано на ідентифікації антигенів сублокусів HLA-A, -В, -С та DR Це свідчить проте, що не ТІЛЬКІ виживання трансплантатів, але й виживання реципієнтів залежить від сумісності за HLA-антигеном між реципієнтом та донором [1] Такі теоретичні аспекти можуть скласти основу для прогнозу рівня продукції інтерлейкша-2 та експреси рецепторів до інтерлейкша-2 мононуклеарами периферійної крові на підставі визначення антигенів системи HLA у хворих на хронічну ниркову недостатність Відомий спосіб визначення взаємозв'язку між параметрами імунного статусу та HLA-фенотипів у здорових донорів бурятської та російської національності [2], який взято за прототип, де встановлений зв'язок високого рівня продукції ІЛ-2 з В7 у HLA-фенотипі здорових осіб російської національності Недоліком способу є те, що відсутні дані про існування асоційованого зв'язку HLA-антигенів з рівнем експресії рецепторів до ІЛ-2, та не відомо, чи існує така залежність у хворих на хронічну ниркову недостатність В основу винаходу поставлена задача удосконалення способу прогнозу продукції інтерлейкша-2 та експресії рецепторів до інтерлейкша-2, що асоційовані з HLA-антигенами у хворих на хронічну ниркову недостатність, які є потенційними реципі (О ю 56474 єнтами алогенної нирки, шляхом виявлення конкретних антигенів HLA-системи, що дозволить прогнозувати високий ризик негативних ускладнень у післяопераційному періоді, насамперед, високий ризик гострої реакції відторгнення трансплантату алогенної нирки Поставлена задача вирішується тим, що спосіб прогнозу продукції ін-терлейкшу-2 та експресії рецепторів до штерлейкіна-2, що асоційовані з HLA-антигенами у хворих на хронічну ниркову недостатність, який включає визначення HLAантигенів на мононуклеарах периферійної крові, згідно з винаходом визначають HLA-DR2-aHTnreH у фенотипі хворих на хронічну ниркову недостатність, присутність якого свідчить про високий рівень продукції інтерлейкша-2 та експресії рецепторів до інтерлейкша-2, що є ознакою підвищеного ризику розвитку гострої реакції відторгнення алотрансплантованої нирки Спосіб прогнозу продукції інтерлейкшу-2 та експресії рецепторів до інтерлейкшу-2, що асоційовані з HLA-антигенами у хворих на хронічну ниркову недостатність виконують таким чином Периферійну кров хворого, стабілізовану гепарином, розводять фізіологічним розчином у співвідношенні 1 2 В центрифужні пробірки вносять 2 - Змл розчину суміші поліглюкіну з верографіном і на нього пастерівською піпеткою нашаровують 1 - 2мл розведеної крові Пробірки з кров'ю центрифугують при 1500зв/хв 25 - ЗОхв Кільце клітин, яке створюється на кордоні двох середовищ, збирають піпеткою та переносять в суху пробірку, в яку додають 1 - 2мл фізіологічного розчину та центрифугують при 1500зв/хв Юхв Цю процедуру повторюють ДВІЧІ Клітини ПІСЛЯ відмивання доводять фізіологічним розчином до концентрації 1000-2000 в мм3 Комплемент отримують із суміші сироваток крові 5 - 7 кроликів таким чином з сонної артерії тварин у центрифужні пробірки забирають 20 40мл крові Після створювання згустку сироватку ВІДДІЛЯЮТЬ та відділені зразки центрифугують при 3000 - 5000зв/хв 20хв Отримані сироватки змішують та розливають по 0,4 - 0,8мл в поліетиленові пробірки та зберігають при t -20°C Хід реакції анті-НІ_А-сироватки до HLAантигенів локусів -А, -В, -С, -DR розкапують у лунки планшетів Терасаки під вазелінове масло та витримують при t -20°C Перед визначенням HLAантигенів, планшети Терасаки з сироватками залишають в умовах кімнатної температури В кожну лунку камери під вазелинове масло та сироватку вводять 0,001мл суспензії лімфоцитів Реагенти змішують покачуванням камери 2 - Зхвилини, потім камери залишають в термостаті при t 37°C на 60 хвилин Після ЦЬОГО В кожну лунку вносять по 0,005мл комплементу, змішують покачуванням камери протягом 2 - Зхв та знову шкубують в термостаті при 137°С 60 хвилин 3 лунок камери тонкою піпеткою або легким струсом камери видаляють вазелинове масло та вносять в кожну лунку по 0,001мл розчину тріпанової синьки Камери інкубують в термостаті при t 37°C протягом 5хв, струшуванням видаляють краску та проводять підрахування результатів за допомогою мікроскопи (збільшення 9x10, 10x15) Антигени локусу HLA-DR визначають у пролонгованому тесті комплемент залежної лімфоцитотоксичності з попереднім збагаченням взвесі мононуклеарів В-лімфоцитами на колонках з нейлонової вати Результати реакції облічують шляхом підрахунку відсотку "мертвих" (профарбованих) лімфоцитів в кожній лунці 0 -15% "мертвих" - негативний результат, 16 - 20% "мертвих" - слабо позитивний результат (+), 21 - 50% "мертвих" - позитивний результат 51 - 75% "мертвих" - виражений позитивний ++++ 76 -100% "мертвих" - різко позитивний ( ) HLA-фенотип визначають на основі результатів мікроскопи змісту лунок з позитивною реакцією з сироватками Практичне застосування способу, що пропонується, проведене при обстеженні 43 хворих на хронічну ниркову недостатність, які знаходились на лікуванні у ВІДДІЛІ трансплантації нирки Інституту урології та нефрології АМН України - Інститут урології АМНУ Наводимо приклади взаємозв'язку рівня продукції ІЛ-2 з HLA-фенотипом Приклад 1 Розподіл хворих на хронічну ниркову недостатність по групах в залежності від рівня продукції ІЛ-2 1 група - хворі, у яких рівень продукції ІЛ-2 був вищий за норму (п = 14), 2 група - хворі, у яких рівень продукції ІЛ-2 менший за норму (п = 20) Середні значення продукції ІЛ-2 в 1 та 2 групах , абсолютна (п) та відносна (%) КІЛЬКІСТЬ хворих з антигенами А2, DR2, DR7 в фенотипі, наведені у таблиці 1 Частота присутності інших HLAантигенів була малою і для подальшого аналізу не використовувалась При застосуванні запропонованого способу індивідуальний аналіз частоти присутності HLA-антигенів у фенотипах показав, що у хворих 1 групи, де ІЛ-2 продукуюча здібність лімфоцитів периферійної крові була вище за норму, найбільш часто виявлялися антигени пстосуМ І С Н О С Т І D R 2 ( 8 H 3 % L A A 2 ( 5 0 % ) , H L A D R 7 ( 5 0 % ) , H L A ) Таблиця 1 Частота HLA-антигенів у хворих на хронічну ниркову недостатність в залежності від рівня продукції ІЛ-2 ІЛ-2 (Од Акт) 1 гр 19,4±1,3 HLAп (%) антиген (+АГ) (+АГ) А2 DR2 DR7 7 12 6 50* 83* 50* ІЛ-2 (Од Акт) 2гр 4,2±1,2 п (%) (-АГ) (-АГ) 5 4 5 25 20 25 Примітка, 1) * різниця достовірна (Р < 0,05) в порівнянні даних присутності одного АГ у хворих 1 та 2 групп 2) п (+АГ) та п (-АГ) - абсолютна (п) та віднос 56474 з частотою А2 - 50%, DR7 - 45%, DR 2 - 83% У присутністю та відсутністю даного HLA-антигену фенотипі хворих 4 групи, що мали низьку КІЛЬКІСТЬ ІЛ-2Р-позитивних клітин, HLA -А2, -DR2 та -DRTАналіз даних, що отримані в групі хворих з ниантигени були присутні з меншою частотою, тобто зькою продукцією ІЛ-2 мононуклеарами перифеантиген HLA-DR2 був присутній у хворих на хронірійної крові свідчить, що HLA-DR2 антиген також чну ниркову недостатність з високим рівнем ексбув присутній у виборці, але у меншої КІЛЬКОСТІ преси рецепторів до ІЛ-2 частіше інших хворих Відрізнялась також частота присутності в фенотипі хворих - HLA-A2 антигенів (25%) та DR7Порівняння даних взаємозв'язку антигенів сисантигенів (25%) теми HLA з показниками експресії та продукції ІЛ-2 показало, що високий рівень параметрів, які доПриклад 2 Розподіл хворих на хронічну нирсліджуються, маркірується антигенами HLA-A2, кову недостатність по групах в залежності від рівDR7, -DR2 ня експресії ІЛ-2Р 3 група - хворі, у яких рівень експресії ІЛ-2Р Приклад 3 Хворі на хронічну ниркову недостабув вищим за норму (п = 20), тність (10 осіб), у яких одночасно на рівні високої продукції ІЛ-2 визначали високий зміст ІЛ-2Р4 група - хворі, у яких рівень експресії ІЛ-2Р позитивних клітин В цієї групі при застосуванні меншим за норму (п = 10) запропонованого способу виявили у 9 з 10 хворих Середні значення експресії рецепторів до ІЛ-2 в HLA-фенотипі присутний антиген HLA-DR2, тобу хворих третьої та четвертої груп, абсолютна (п) то у 90% хворих та відносна (%) КІЛЬКІСТЬ хворих в цих групах з антигенами А2, DR2, DR7 в фенотипі, наведено у Таким чином, отримані результати дозволили таблиці 2 визначити генетичну схильність частини хворих на хронічну ниркову недостатність до високих показАналіз отриманих даних при застосуванні заників ІЛ-2-залежноі ланки імунітету Значною міпропонованого способу показав, що в групі хворих, рою ця залежність пов'язана з HLA-DR-2 антигеде напередодні алотрансплантації КІЛЬКІСТЬ ІЛ-2Рном, тому що він визначався у 90% хворих з позитивних клітин була вищою за норму, у феновисоким рівнем продукції та експресії ІЛ-2 клітинатипі хворих на хронічну ниркову недостатність ми периферійної крові та у 83% хворих з високим HLA-антигени зустрічались з частотою А2 - 50%, рівнем одного з показників, які досліджували DR7 - 45%, DR 2 - 83% У фенотипі хворих 4 групи, що мали низьку КІЛЬКІСТЬ ІЛ-2Р-ПОЗИТИВНИХ КЛІТИН, На підставі вищесказаного можно зробити такі HLA -А2, -DR2 та -DRy-антигени були присутні з висновки меншою частотою, тобто антиген HLA-DR2 був - встановлено зв'язок між особливостями проприємній у хворих на хронічну ниркову недостатдукції та експресії ІЛ-2 та HLA-фенотипом, що свіність з високим рівнем експресії рецепторів до ІЛ-2 дчить про присутність HLA-генетичного контролю частіше інших імунного статусу у хворих на хронічну ниркову недостатність Таблиця 2 - присутність у фенотипі хворих на хронічну ниркову недостатність одночасно HLA-DR2 та HLA-A2 антигенів асоційовано з високим рівнем Частота HLA-антигенів у хворих на хронічну нирпродукції та експресії ІЛ-2, що є ознакою підвищекову недостатність в залежності від рівня ного ризику розвитку гострої реакції відторгнення ІЛ-2Р+ клітин алотрансплантованої нирки Запропонований спосіб дозволяє без додаткових витрат використовуІЛ-2Р+ ІЛ-2Р+ HLAп п (%) (%) вати імуногенетичну (HLA-фенотип) характеристи(%) антиген (+АГ) (+АГ) (%) (-АГ) (-АГ) ку пацієнта для прогнозу рівня продукції та 3 гр 4гр експресії ІЛ-2 А2 10 50* 1 10 Джерела інформації, прийняті до уваги при 21,3±2,7 DR2 4,14±0,9 18 83* 4 40 експертизі DR7 9 45 4 40 1 Возианов А Ф , Бутенко А К , Зак К П Цитокины Биологическое и противоопухолевое свойПримітка 1) * різниця достовірна (Р < 0,05) в ства -Киев Наукова думка, 1998 -312с порівнянні даних 3 та 4 групп 2) п (+АГ) та п (-АГ) 2 Алексеев Л П , Яздовский В В , Хаитов Р М абсолютна (п) та відносна (%) КІЛЬКІСТЬ хворих 1 та Межэтнические различия в генетическом контроле 2 груп ВІДПОВІДНО з присутністю та відсутністю даиммунного статуса человека // Рос физиол журн ного HLA-антигена им И М Сеченова - 2000 - Т 86, №3 В 3 групі хворих, де напередодні алотрансС 280-284 плантації КІЛЬКІСТЬ ІЛ-2Р-ПОЗИТИВНИХ клітин була вищою за норму, у фенотипі хворих на хронічну ниркову недостатність HLA-антигени зустрічались на (%) КІЛЬКІСТЬ хворих 1 та 2 груп ВІДПОВІДНО З Підписано до друку 05 06 2003 р Тираж 39 прим ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)236-47-24