Спосіб оцінки функціонального стану слизової оболонки шлунка

Спосіб оцінки функціонального стану слизової оболонки шлунка, що включає біопсію слизової оболонки гастродуоденальної зони, виготовлення із матеріалу зрізів, обробку зрізів антитілами до імунокомпетентних клітин, візуалізацію реакції антиген - антитіло та оцінку КІЛЬКОСТІ І ЯКОСТІ ЦИХ КЛІТИН, який відрізняється тим, що бюптат ретельно відмивають від шару слизового секрету у фізіологічному розчині дворазово, а як первинні антитіла використовують CD4, CD8, CD11 Спосіб оцінки функціонального стану слизової оболонки порожнини рота Пат 2001096503 Украина.МПК 7 А61 СІ 7/00/ Кайдашев І П ,Т-каченко П І, Куроедова В Д , Карасюнок О О, Шинкевич В І, Баштовенко О А (Украйна), №41428 Заявл 24 09 2001 Опубл 10 06 2002 -Зс ] Для його здійснення отримують бюптат слизової оболонки порожнини рота, з матеріалу виготовляють крюстатні зрізи і фіксують в льодяному ацетоні За допомогою антитіл до фенотипових антигенів імуноцитів, визначають або ідентифікують клітини, використовуючи імунопстохімічний аналіз Визначають CD3+, CD4+, CD8+, CD20+, CD16+, CD14+ HLA-DR+ клітини, які присутні в слизовій оболонці порожнини рота Метод включає три реакції, сутність яких полягає у взаємодії клітинних антигенів із специфічними антитілами та проявку цієї реакції Для методу використовують другий шар антитіл, мічених біотином В результаті третьої реакції взаємодіють біотин із стрептавідин-пероксидазою Візуалізація проводиться з використанням діамінобензидину солянокислого Кінцевим продуктом ГІСТОХІМІЧНОЇ реакції є нерозчинний пігмент коричневого кольору, що випадає в МІСЦІ знаходження антигену Позитивно забарвлені клітини підраховують, характеризують їх локалізацію Недоліками даного способу є 1 Неможливість використання методу імунопСТОХІМІЧНОГО аналізу для виявлення імуноцитів слизової оболонки шлунка в зв'язку з наявністю секрету на и поверхні 00 ю 58992 2 Недостатня інформативність щодо характеристики імуноцитів слизової оболонки шлунка, зумовлена наступними обставинами Як відомо з літературних даних, внутріепітеліальні лімфоцити слизової оболонки шлунка представлені CD4+ клітинами, СО8+Т-лімфоцитами-кіллерами, а також CD11 + антиген презентуючими клітинами, що визначає значну роль саме цих клітин в роботі імунологічного апарату [Дранник Г Н Клиническая иммунология и аллергология -Одесса «АстроПринт»-1999 -603 с , Хаитов Р М Физиология иммунной системы Российский физиологический журнал им Сеченова-2000-Т 86, №3 -С 252-267], а їх виявлення є дуже важливим В основу винаходу поставлено задачу створити спосіб оцінки функціонального стану слизової оболонки шлунка, який виявляє імуноцити, представлені у слизовій оболонці гастродуоденальної зони шлунку Поставлену задачу вирішують шляхом створення способу дослідження функціонального стану слизової оболонки шлунка, що включає біопсію слизової оболонки гастродуоденальної зони, виготовлення із матеріалу зрізів, обробку зрізів первинними моноклональними антитілами до імунокомпетентних клітин, візуалізацію реакції антигенантитіло, та оцінку КІЛЬКОСТІ І ЯКОСТІ ЦИХ КЛІТИН, який, згідно винаходу, відрізняється тим, що бюптат ретельно відмивають від шару слизового секрету у фізіологічному розчині дворазове, а в якості первинних антитіл використовують CD4, CD8, CD11 Спосіб оцінки здійснюється наступним шляхом 1 Матеріал для дослідження одержують під час проведення фіброгастро-дуоденоскопм хворому, шляхом взяття бюптату слизової оболонки гастродуоденальної зони (може бути використаний також післяопераційний матеріал) 2 Бюптати ретельно та обережно відмивають від шару слизового секрету у двох змінах охолодженого фізіологічного розчину Терміново, з метою уникнення руйнування клітинних антигенів, матеріал біопсії заморожують зануренням в рідкий азот 3 Отримують крюстатні зрізи товщиною 5-7 мкм, та фіксують їх в охолодженому ацетоні 4 Зрізи обробляють первинними моноклональними антитілами CD4, CD8, CD11 5 Наступним етапом виявляють первинні моноклональні антитіла або візуалізують реакцію атиген-антитіло за допомогою хромотропа 6 Проводять дозабарвлення зрізів гематоксиліном для визначення локалізації позитивних клітин відносно епітелію та власної пластинки слизової оболонки шлунку, а також для виявлення особливостей чи змін гістологічної будови слизової оболонки, з огляду на важливість стану мікрооточення імуноцитів 7 Оцінюють КІЛЬКІСТЬ, ЯКІСТЬ та місце знаходження CD4+, CD8+, CD11 + клітин, локалізацію відносно шарів епітелюцитів та солокалізацію, особливості будови, ІНШІ характеристики Приклад використання 1 Досліджували бюптат слизової оболонки шлунка при виразковій хворобі дванадцятипалої кишки у стадії загострення, за допомогою непрямого біотин - екстравідин - пероксидазного методу [Дж Полак, С Ван Порден, Введение в иммуноцитохимию Современные методы и проблемы // Перевод с англ Глуховой М А , под ред Хрущова Н Г-М «Мир»-1987-74с ] В якості первинних антитіл використовували моноклональні мишачі антитіла Друга реакція полягала у зв'язуванні первинних моноклональних антитіл антитілами міченими біотином Екстравідін використовувався у якості третього шару і виявляв бютинильовану мітку Візуалізація реакції проводилася за допомогою діамінобензидину солянокислого Приклад використання 2 Проведено дослідження післяопераційного бюптату слизової оболонки шлунка, з приводу виразкової хвороби шлунка, непрямим імуноферментним методом [Дж Полак, С Ван Норден Введение в иммуноцитохимию Современные методы и проблемы /У Перевод с англ Глуховой М А , под ред Хрущова Н Г -М «Мир»-1987-74с ] В якості первинних моноклональних антитіл використовували CD4, CD8, CD11 моноклональні мишачі антитіла Другим шаром служили антитіла кози до IgG миші, мічені пероксидазою хріна (anti IgG-HRP) Візуалізацію проводили за допомогою З-амшо-9-етилкарбазола (Sigma, USA) Продукт реакції мав червоне забарвлення Було виявлено характерні зміни імунологічного апарату слизової оболонки шлунку Приклад використання З Проведено дослідження бюптату слизової оболонки шлунка здорового індивідуума за допомогою прямого імунофлуоресцентного методу В якості первинних моноклональних антитіл використовували CD4, CD8, CD11 моноклональні антитіла, мічені флуорецешізотюцианатом (ФІТЦ) Забарвлений зріз оцінювали під мікроскопом з ультрафіолетовою оптикою, при цьому в місцях зв'язування антитіл спостерігали зелену флуоресценцію Приклад використання 4 Досліджували бюптат слизової оболонки антрального відділу шлунка при виразковій хворобі дванадцятипалої кишки у стадії ремісії за допомогою непрямого імунофлуоресцентного методу В якості первинних моноклональних антитіл використовували CD4, CD8, CD11 мишачі моноклональні антитіла Другий шар антитіл був представлений антитілами кози до первинних специфічних антитіл і мічений ФІТЦ Забарвлений зріз оцінювали під мікроскопом з ультрафіолетовою оптикою, при цьому в місцях зв'язування антитіл спостерігали зелену флуоресценцію Представлені результати досліджень, проведених запропонованим методом, дозволяють зробити висновок про високу інформативність аналізу функціонального стану слизової оболонки гастродуоденальної зони, який дозволяє оцінити роль імунних механізмів у патогенезі захворювань слизової оболонки шлунка та дванадцятипалої кишки 58992 Комп'ютерна верстка М Клюкш Підписано до друку 05 09 2003 Тираж 39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна