Спосіб двоступінчатої глутаральдегідної кон’югації ентеротоксинів escherichia coli

Спосіб двоступінчатої глутаральдегідної кон'югації ентеротоксинів Е.соlі, що включає: культи 3 59232 ST в кінцевому продукті у 2,5 разу, за рахунок уникнення утворення ковалентних зв'язків між молекулами ST-ST під дією глутаральдегіду, суттєво скоротити робочий час, занятий відповідними операціями; мінімізувати число процедур, підвищити специфічність за рахунок нативних ентеротоксинів, зменшити трудомісткість і використання коштовного обладнання і реактивів, що дає можливість рекомендувати його для створення імунізуючих і діагностичних препаратів проти токсигенних Е.соlі, що відповідає критерію "новизна". Спосіб виконується таким чином. Штами Е.соlі, які синтезують ST і LTентеротоксини, висівають окремо на Синтетичне поживне середовище і інкубують при 37 °С протягом 4-х годин, центрифугують при 6000-8000 об/хв. протягом 30-40 хвилин при 4 °С і отримують безклітинні супернатанти, які ліофілізують без передчасної їх очистки; 100 мг LT-ентеротоксину Е.соlі розчинюють у 2,0 мл 0,1 М фосфатного буфера з рН 6,8, який містить 12,5 г/л глутаральдегіду, через 18-20 годин інкубації при кімнатній температурі суміш наносять на хроматографічну колонку 0,9x60 см з сефадексом G-25, урівноважену 0,15 М розчином хлориду натрію; фракції, які містять активований LT (екстинція при 403 нм) об'єднують і концентрують в 5 разів ПЕГ з молекулярною масою 35000-40000 D, до цього розчину додають 4060 мг ST, розчиненого в 10 мл 0,15 М хлориду натрію і 1,0 мл карбонат-бікарбонатного буфера; через 20-24 години інкубації при 4°С додають 1,0 мл 0,2 М розчину лізину і на 1-3 години ставлять на діаліз проти фосфатно-сольового буфера; кон'югат центрифугують 10-30 хвилин при 10003000 об/хв. і зберігають при 4 °С. 4 Приклад 1. Визначали оптимальне співвідношення LT:ST, при якому досягалося максимальне зв'язування ST у кон'югат, (фіг.1). Приклад 2. Імуногенні властивості кон'югату ентеротоксинів Е.соlі, перевіряли на білих безпородних мишах масою 14-16 г. Мишей прищеплювали підшкірно, двічі, в дозі 0,3 мл (перша ін'єкція) і 0,5 мл (друга ін'єкція) з інтервалом між введеннями 7 днів. На 21 добу після другого введення препарату визначали напругу імунітету шляхом інтраперитоніального зараження мишей 2Dlm токсинів і 2LD культур гомологічних і гетерологічних штамів. Кон'югат вважали імуногенним, коли виживало більше 50 % тварин (табл.1.). Приклад 3. Порівнювали спосіб двоступінчатої глутаральдегідної кон'югації з прототипом по таких показниках, як швидкість реакції і вміст ST в кінцевому продукті. Кількість (%) ST у кінцевому кон'югаті визначали по різниці концентрацій білка до і після діалізу (табл.2). Основними перевагами способу двоступінчатої глутаральдегідної кон'югації ST і LT ентеротоксинів Е.соlі є: прискорення одержання препарату у 2,7 разу, збільшення вмісту ST в кінцевому кон'югаті у 2,5 разу, підвищення специфічності за рахунок використання нативних ентеротоксинів, суттєве скорочення робочого часу, зайнятого відповідними операціями, спрощення і мінімізація числа процедур, позбавлення трудомісткості. Спосіб не потребує коштовного і малодоступного обладнання і реактивів, і може бути рекомендований для створення імунізуючих препаратів проти токсигенних Е.соlі, а також для конструювання діагностичних систем на їх основі. Таблиця 1 Кількість (%) виживших імунізованих кон'югатом ентеротоксинів білих безпородних мишей, масою 14-16 г, після зараження їх 2Dlm ST-ентеротоксину и 2LD культур гомологічних і гетерологічних штамів Е.соlі. Імунізуючий препарат Кон'югат ентеротоксинів Кількість (%) виживших імунізованих мишей після зараження (X ± s, n = 5) 2Dlm ентеротоксинів 2 LD культури гомологіч. гетерологіч. штамів Е.соlі гомологіч. гетерологіч. штамів Е. соlі 93,6 ± 0,07 84,0 ± 0,07 90,6 ± 0,06 80,0 ± 0,04 Таблиця 2 Тривалість приготування (год.) і вміст ST-ентеротоксину Е.соlі в кінцевому кон'югаті (%). Спосіб одержання кон'югату Двоступінчатий глутаральдегідний Одноступінчатий глутаральдегідний (прототип) ST-ентеротоксин в кінцевому кон'югаті (%) 98,25 ±2,36 Тривалість приготування кон'югату (год.) ~26 39,25 ± 0,95 ~70 5 Комп’ютерна верстка А. Крижанівський 59232 6 Підписне Тираж 24 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601