Спосіб прогнозування агресивності перебігу міхурового заносу

Спосіб прогнозування агресивності перебігу міхурового заносу, що включає цитогенетичне дослідження тканини видаленого міхурового заносу, який відрізняється тим, що у випадку визначення S-phase в межах від 26,14% до 47,02% хворі підлягають спеціальному лікуванню навіть при низьких та негативних рівнях хорюнічного гонадотропіну Винахід відноситься до галузі медицини, а саме до клінічної онкологи, і може використовуватися в лікуванні хворих на міхуровий занос Міхуровий занос (МЗ) - це доброякісна патологічна зміна росту та диференціювання трофобласту, що у 80-90% випадків не потребує спеціального лікування Пильна увага онкопнеколопв до цієї патології обумовлена тим, що міхуровий занос може метастазувати в 1-6% випадків і майже в 1000 разів у порівнянні з фізіологічними родами підвищує ризик розвитку надзвичайно злоякісної пухлини - хорюкарциноми Маркером трофобластичних пухлин (ТП), до яких належить і МЗ, є хорюнічний гонадотропін глікопротешовий гормон, що продукується нормальною плацентою та ТП У випадку спонтанної ремісії при повному МЗ нормалізація рівня ХГ відбувається приблизно на 78 день, при частковому МЗ - на 63 день після евакуації МЗ (1) Однак Товариство Гінекологічних Онкологів та FIGO рекомендують лікарю самостійно визначати в кожній конкретній ситуації рівень плато ХГ, що вказує на необхідність спеціального лікування після евакуації МЗ (2) Цей факт, а також випадки постміхурових ТП з негативними та слідовими рівнями ХГ, обумовлюють необхідність пошуку додаткових диференціально-діагностичних критеріїв агресивності перебігу міхурового заносу 81(1)-P 67-70) В залежності від КІЛЬКОСТІ ДНК в клітинах пухлини прогнозується біологічна поведінка повного МЗ Позитивними характеристиками прототипу є - визначення ПЛОІДНОСТІ клітин МЗ, - використання в якості джерела матеріалу парафінових блоків евакуйованого повного МЗ, проведення морфологічних та ДНКцитометричних паралелей тканини евакуйованого повного МЗ До недоліків прототипу можна віднести - аналіз ПЛОІДНОСТІ пухлинної тканини тільки у хворих на повний МЗ, - відсутність аналізу розподілу клітин за фазами мітотичного циклу (КІЛЬКІСТЬ КЛІТИН проліферуючого пулу), - відсутність аналізу гормональної активності пухлини (за рівнем хорюнічного гонадотропіну) в залежності від КІЛЬКОСТІ ДНК В клітинах пухлини В основі винаходу поставлена задача розробити спосіб прогнозування агресивності перебігу міхурового заносу, шляхом визначення S-phase тканини евакуйованого МЗ, що забезпечить диференціювання хворих, які потребують спеціального лікування навіть при низьких та негативних рівнях хорюнічного гонадотропіну Поставлена задача вирішується наступним чином Вміст ДНК В клітинах пухлини оцінювали проточно-цитометричним методом після їх фарбування флюорохромом (пропідіум йодид), який селективно зв'язується з нуклеїновою кислотою в ядрі клітини В якості джерела матеріалу використовували парафінові блоки евакуйованого МЗ Прототипом поданої заявки є робота, в якій автори пропонують визначати агресивність перебігу повного МЗ за ДНК статусом клітин тканини евакуйованого МЗ (Fukunaga М Flow cytometnc and climcopathologic study of complete hydatidiform moles with special reference to the significance of cytometnc aneuploidy // Gynecol Oncol - 2001, ю 59299 Ступінь анеуплоідності та аналіз розподілу клітин за фазами мітотичного циклу визначали, виділяючи для аналізу окремі КЛІТИННІ ядра за допомогою спеціальних параметрів приладу Суть методу клітини в G2+M фазі клітинного циклу містять подвійну КІЛЬКІСТЬ ДНК і, отже, флюорохрому, у порівнянні з клітинами в фазі Go Клітини в S-фазі та анеуплоідні пухлинні клітини повинні містити більшу КІЛЬКІСТЬ ДНК, що і фіксується приладом Чим більший вміст ДНК в КЛІТИНІ, ТИМ СИЛЬНІШИЙ імпульс і тим далі відсувається запис гістограми на осі абсцис На осі ординат реєструється число імпульсів на канал чим вища крива в будь-якій точці, тим більше клітин із ВІДПОВІДНИМ вмістом ДНК зосереджено в даному каналі Фарбування клітин здійснювали за допомогою флюорохромного барвника пропідія йодид (РІ) Клітини у КІЛЬКОСТІ 10 на пробу після однократного відмивання в 5мл PBS при 200д протягом Юхв ресуспендували в 1мл ГІПОТОНІЧНОГО лізуючого буфера (0,1% цитрат натрію, 0,1% Triton X-100, 5 (j.g/ml PI Всі реагенти фірми "Sigma Chemical Co", USA) Після обережного струшування, клітини шкубували при 22-25°С протягом ЗО хв в темряві Пухлинні клітини додатково обробляли 250мкг на 1мл фарбуючого буфера Ribonuclease A ("Sigma Chemical Co", USA), шкубуючи проби протягом 10 хв при 37°С (4) Усі цитометричні аналізи здійснені на приладі FACScan ("Becton Dickinson", USA), що обладнаний аргоновим лазером з довжиною хвилі 488нм, з використанням програми CellQuest для Мас для отримання та аналізу даних Для вимірювання флюоресценцм РІ використовували вузькополосний фільтр 585/42нм Для оцінки дольового вмісту клітин в основних фазах мітотичного циклу (G1/0, S, G2+M) та анеуПЛОІДНОСТІ пухлинних клітин гістограми розподілу клітин за вмістом ДНК обробляли за допомогою спеціалізованої математичної програми Mod Fit LT 2 0 (BDIS, USA) для комп'ютерів Мас В тканині евакуйованого МЗ визначали наступні показники - розподіл пухлинних клітин за фазами клітинного циклу, - процент диплоідних та анеуплоідних клітин в пробі, - індекс ПЛОІДНОСТІ ДНК (ІДНК) (характеризує співвідношення інтенсивності флюоресценцм піка анеуплоідних клітин, тобто номер його каналу, до диплоідних) Прикладами конкретного виконання способу можуть бути витяги із двох історій хвороб Приклад І Хвора І Н , і х №4541 від 1107 2001 року ПГЗ №996/2001 від ЗО 05 01 р міхуровий занос 14 05 01 р - евакуація міхурового заносу (12 тижнів - за розмірами матки та за строком вагітності) Спостерігалася 2 МІСЯЦІ Протягом всього періоду спостереження ХГ у сироватці крові 0 mlU/ml, 11 07 2001 року в ургентному порядку у зв'язку з кровотечею госпіталізована у відділення онкопнекологм ІОАМНУ для лікування Вміст ДНК В клітинах пухлини оцінювали проточно-цитометричним методом після їх фарбування флюорохромом (пропідіум йодид), який селективно зв'язується з нуклеїновою кислотою в ядрі клітини В якості джерела матеріалу використовували парафінові блоки евакуйованого МЗ Ступінь анеуплоідності та аналіз розподілу клітин за фазами мітотичного циклу визначали, виділяючи для аналізу окремі КЛІТИННІ ядра за допомогою спеціальних параметрів приладу Фарбування клітин здійснювали за допомогою флюорохромного барвника пропідія йодид (РІ) Клітини у КІЛЬКОСТІ 10 на пробу після однократного відмивання в 5мл PBS при 200д протягом Юхв ресуспендували в 1мл ГІПОТОНІЧНОГО лізуючого буфера (0,1% цитрат натрію, 0,1% Triton X-100, 5 (j.g/ml PI Всі реагенти фірми "Sigma Chemical Co", USA) Після обережного струшування, клітини шкубували при 22-25°С протягом ЗОхв в темряві Пухлинні клітини додатково обробляли 250мкг на 1мл фарбуючого буфера Ribonuclease A ("Sigma Chemical Co", USA), шкубуючи проби протягом Юхв при 37°С (4) Усі цитометричні аналізи здійснені на приладі FACScan ("Becton Dickinson, USA), що обладнаний аргоновим лазером з довжиною хвилі 488нм, з використанням програми CellQuest для Мас для отримання та аналізу даних Для вимірювання флюоресценцм РІ використовували вузькополосний фільтр 585/42нм Для оцінки дольового вмісту клітин в основних фазах мітотичного циклу (G1/0, S, G2+M) та анеуПЛОІДНОСТІ пухлинних клітин гістограми розподілу клітин за вмістом ДНК обробляли за допомогою спеціалізованої математичної програми Mod Fit LT 2 0 (BDIS, USA) для комп'ютерів Мас В тканині евакуйованого МЗ визначали наступні показники - розподіл пухлинних клітин за фазами клітинного циклу, - процент диплоідних та анеуплоідних клітин в пробі, - індекс ПЛОІДНОСТІ ДНК (ІДНК) (характеризує співвідношення інтенсивності флюоресценцм піка анеуплоідних клітин, тобто номер його каналу, до диплоідних) S-phase тканини евакуйованого міхурового заносу-47,02% Приклад II Хвора Д Л , і х №6857 від 18102001 року ПГЗ № 1984/01 від 161001р міхуровий занос з вогнищевою проліферацією хоріального епітелію та елементів цитотрофобласта 24 08 01 р евакуація міхурового заносу (8 тижнів - за розмірами матки та за строком вагітності) Спостерігалася 2 МІСЯЦІ Рівень ХГ у сироватці крові 43,16 mlU/ml На момент госпіталізації у відділення онкопнекологм ІОАМНУ в мюметрм визначалися 2 пухлинні вузли розмірами 4,4x2,7см та 2,2x3,1см кожний Вміст ДНК В клітинах пухлини оцінювали проточно-цитометричним методом після їх фарбування флюорохромом (пропідіум йодид), який селективно зв'язується з нуклеїновою кислотою в ядрі 59299 клітини В якості джерела матеріалу використовували парафінові блоки евакуйованого МЗ Ступінь анеуплоідності та аналіз розподілу клітин за фазами мітотичного циклу визначали, виділяючи для аналізу окремі КЛІТИННІ ядра за допомогою спеціальних параметрів приладу Фарбування клітин здійснювали за допомогою флюорохромного барвника пропідія йодид (РІ) Клітини у КІЛЬКОСТІ 10 на пробу після однократного відмивання в 5мл PBS при 200д протягом Юхв ресуспендували в 1мл ГІПОТОНІЧНОГО лізуючого бу фера (0,1% цитрат натрію, 0,1% Triton X-100, 5 (j.g/ml PI Всі реагенти фірми "Sigma Chemical Co", USA) Після обережного струшування, клітини шкубували при 22-25°С протягом ЗОхв в темряві Пухлинні клітини додатково обробляли 250мкг на 1мл фарбуючого буфера Ribonuclease A ("Sigma Chemical Co", USA), шкубуючи проби протягом Юхв при 37°С (4) Усі цитометричні аналізи здійснені на приладі FACScan ("Becton Dickinson, USA), що обладнаний аргоновим лазером з довжиною хвилі 488нм, з використанням програми CellQuest для Мас для отримання та аналізу даних Для вимірювання флюоресценцм РІ використовували вузькополосний фільтр 585/42нм Для оцінки дольового вмісту клітин в основних фазах мітотичного циклу (GI/0, S, G2+M) та анеуплоїдності пухлинних клітин гістограми розподілу клітин за вмістом ДНК обробляли за допомогою спеціалізованої математичної програми Mod Fit LT 2 0 (BDIS, USA) для комп'ютерів Мас В тканині евакуйованого МЗ визначали наступні показники Комп'ютерна верстка Л Ціхановська - розподіл пухлинних клітин за фазами клітинного циклу, - процент диплоідних та анеуплоідних клітин в пробі, - індекс ПЛОІДНОСТІ ДНК (ІДНК) (характеризує співвідношення інтенсивності флюоресценцм піка анеуплоідних клітин, тобто номер його каналу, до диплоідних) S-phase тканини евакуйованого міхурового заносу-38,6% Таким чином, використання даного способу визначення агресивності перебігу різних форм міхурового заносу на основі цитогенетичного дослідження тканини видаленого міхурового заносу забезпечить диференціювання хворих, що підлягають спеціальному лікуванню навіть при низьких та негативних рівнях хорюнічного гонадотропшу Джерела інформації 1 Paradis F J , Browne P , Fisher R A et al A clinical histopathological and flow cytometnc study of 149 complete moles and 107 non-molar hydropic abortions // HistopathoL -1996, 28(2) - P 101 -110 2 Kohom E I The new FIGO 2000 staging and risk factor scoring system for gestational trophoblastic disease Description and critical assessment // Int J Gynecol Cancer -2001,11 -P1Z-11 3 Fukunaga M Flow cytometnc and clmicopathologic study of complete hydatidiform moles with special reference to the significance of cytometnc aneuploidy//Gynecol Oncol-2001, 81(1) - P 67-70 (прототип) 4 Pradier О , Rave-Frank M , Lehmann J et al Effects of docetaxel in combination with radiation on human head and neck cancer cells (ZMK-1) and cervical squamous cell carcinoma cells (CASKI) // Int J Cancer - 2001, 91 (6) - P 840-845 Підписано до друку 05 09 2003 Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна