Спосіб одержання препарату для діагностики хламідійної інфекції

Спосіб одержання препарату для діагностики хламідійної інфекції, що полягає у культивуванні хламідій С psittaci у бюсубстраті і наступному готуванні діагностичного препарату, який відрізняється тим, що для культивування хламідій використовують первинно трипсинізовану культуру клітин фібробластів ембріонів курей, заражену ex tempore у завись цих клітин, а відбір культурального інфекційного матеріалу та готування діагностичного препарату здійснюють через 36-42 години від моменту зараження клітин Винахід належить до медицини, а саме до мікробіологи, може знайти застосування в інших споріднених галузях медицини і ветеринарії при виготовленні препаратів для діагностики хламідійних інфекцій людини та тварини, а також при проведенні епідеміологічних і епізоотологічних досліджень Реакція непрямої імунофлуоресценцм (РНІФ) з використанням хламідійного слайда-антигену для виявлення антитіл і імуноглобулінів різних класів у сироватках крові, секретах, СЛІЗНІЙ рідині, молозиві й інших біологічних матеріалах, є одним з високоспецифічних і чутливих методів діагностики хламідюзів зоонозного й антропонозного походження ВІДОМІ способи одержання біомаси хламідій з метою готування діагностичних систем на основі використання різних бюсубстратів для культивування збудника, таких, наприклад, як суспензії гомогенізованої тканини жовткових МІШКІВ, або очищені елементарні тільця збудника, які одержують із суспензій жовткових МІШКІВ курячих ембріонів, заражених різними штамами хламідій, адаптованих до курячого ембріона [1 -4] У способі [1] 7-8-денні курячі ембріони заражають у порожнину жовткового мішка лабораторними штамами С trachomatis Після загибелі ембріонів через 5-12 діб, їх розтинають, з додержанням стерильності витягають жовткові мішки, з яких при максимальному накопиченні збудника готують суспензії, центрифугують їх у певному режимі, шактивують і потім використовують як хламідійний матеріал, середній шар, де знаходяться елементарні і ретикулярні тільця Недоліком способу є неспецифічне СВІТІННЯ тла при люмінесцентній мікроскопи слайд ів-антигенів, приготовлених з такого матеріалу, через присутність ЛІПІДІВ та інших домішок Для одержання очищених елементарних тілець хламідій необхідно мати спеціальне устаткування, дефіцитні реактиви Відомий аналогічний спосіб Горовиц Э С і Тимашевой О А [4], з тією різницею, що зараження здійснюють штамом С psitacci у порожнину жовткового мішка, а для інактивації збудника в суспензію додають 0,1 азиду натрію і 0,15% формаліну У якості хламідієвмісного матеріалу використовують середній шар, що містить елементарні і ретикулярні тільця збудника Для постановки РНІФ специфічний і контрольний антигени наносять на ретельно оброблені предметні стекла, підсушують на повітрі, фіксують протягом 20 хвилин охолодженим (+4°С) ацетоном і використовують приготовлені слайди-антигени для реакції Цей спосіб був обраний прототипом Зазначений спосіб характеризується низкою недоліків для готування антигену використовується вельми вартісна харчова сировина - курячі ембріони, термін готування антигену тривалий - не менше восьми діб (включає процес розмноження збудника, інактивацію інфекційного матеріалу), процес готування антигену містить операції, що обумовлюють багаторазовий контакт з інфекційним матеріалом (зараження, розтин курячих ембріонів, готування, гомогенізація суміші, центрифугування, інактивація), наявність домішок жовтка в антигенному матеріалі зумовлює неспецифічне СВІТІННЯ тла при люмінесцентній мікроскопи препарату ю о> о> ю 59959 В основу винаходу поставлена задача спрощення виготовлення діагностичного препарату (хламідієвмісного слайда-антигену) шляхом використання такого бюсубстрату для культивування хламідій, який не вимагає багатоетапного процесу готування антигену, що дозволить значно скоротити строки та знизити витрати на готування діагностичного препарату, покращити його якість, підвищити безпеку способу Поставлена задача досягається тим, що як цільовий продукт хламідієвмісного матеріалу, використовують первинно трипсинізовану ЛІНІЮ культур клітин фібробластів ембріонів курей (ФЕК), заражену ex tempore в завись зазначеної культури ФЕК, а відбір культурального інфекційного матеріалу і діагностичний препарат готують через 36-42 години від моменту зараження клітин Розроблений спосіб здійснюється наступним чином Первинно трипсинізовані клітини ФЕК готують узвичаєним способом [5] і культивують у живильному середовищі 199 чи середовищі Ігла, додаючи 10% сироватки великої рогатої худоби (ВРХ) і 2мкг/мл гентаміцину Як заражаючий матеріал можна використовувати різні штами хламідій виду С psittaci, але найбільш прийнятним варіантом є використання штаму, адаптованого до культури клітин ФЕК Як такий штам був використаний штам К (С psittaci), що депонований і зберігається у державній колекції вірусів інституту вірусологи їм Д І Іванівського АМН РФ (депонент № 683) Авторами штаму є д м н Малікова M B , к м н Федоров А І , к м н Нехороших З М Штам К (С psittaci), що був адаптований до культури клітин ФЕК, має коротший цикл розвитку, накопичується в цьому бюсубстраті у високому інфекційному титрі (7-8 Ід LDso/ооз при титруванні на білих мишах), характеризується значною біологічною активністю - репродуктивною антигенною, алергенною Заражаючим матеріалом була пасажна культуральна рідина, збирана з моношару культури клітин ФЕК, інфікованого штамом К (С psittaci) 6080% клітин культури при морфологічному контролі містили включення хламідій у вигляді зрілих елементарних тілець, що становило 8-9 Ід ЛД50/003 мл при титруванні на білих мишах Високого ступеня накопичення збудника в інфікованих клітках можна досягти при зараженні їх двома способами а) на сформований моношар одно-дводобової культури, розлитої у пеніцилінові флакони із покривними скельцями, по 2 мл суспензії (1,5-2,0 х 105 клітин у 1 мл середовища), б) безпосередньо у завись клітин, приготовленої ex tempore, розлитої аналогічно до наведеного у пункті "а" Перший спосіб використовується для ізоляції збудника, ідентифікації та вивчення його біологічних властивостей, одержання діагностичних і імунобюлопчних препаратів Зараження у завись ex tempore є переважнішим, тому що дозволяє скоротити декілька етапів при виготовленні діагностичного препарату, дає можливість у коротший термін одержати матеріал з високим інфекційним титром При зараженні у завись клітин, до 2мл суспензії ФЕК, розлитих у пеніцилінові флакони з покривними скельцями, додають по 0,2мл культуральної рідини, що містить хламідм в інфекційному титрі (89 Ід ЛД5О/о оз) Паралельно для цитоморфолопчного контролю накопичення збудника, в обох випадках, тим же інфекційним матеріалом, у тій же дозі заражають культуру ФЕК у пеніцилінових флаконах з покривними скельцями Контролем до дослідного зразка були незаражені клітини ФЕК, приготовлені аналогічним чином Флакони з інфікованими клітинами і контрольним матеріалом шкубують при +36°С Через 36-42 години після зараження покривні скельця, з утвореним на них моношаром клітин, виймають з флаконів, препарати фіксують ацетоном, офарблюють акридином оранжевим Після цього, за допомогою люмінесцентної мікроскопи здійснюють цитоморфолопчний контроль накопичення збудника Нашими дослідженнями встановлено достатність терміну у 36-42 години для одержання 60-80% інфікованих клітин з цитоплазматичними включеннями, що складаються зі зрілих елементарних тілець хламідій Заражені клітини механічно (струшуванням) відокремлюють від стінок флакона, ретельно гомогенізують пастерівською піпеткою їхню завись у культуральній рідини Зберігають цей хламідієвмісний матеріал у флаконі при температурі не вище -20°С протягом декількох МІСЯЦІВ Для готування слайду-антигену інфекційний матеріал спочатку розморожують, завись клітин гомогенізують і тонко відтягнутою пастерівською піпеткою наносять краплі, діаметром 2-3 мм, на знежирене предметне скло Слайд-антиген підсушують на повітрі, фіксують в охолодженому ацетоні протягом 20 хвилин Одночасно з фіксацією відбувається інактивація збудника ацетоном Частину слайдів-антигенів, після підсушування, використовують для постановки РНІФ, ІНШІ зберігають при температурі не вище -20°С протягом багатьох МІСЯЦІВ Для постановки РНІФ використовують приготовлені слайди-антигени, досліджувані сироватки чи інший біологічний матеріал від хворих і ВІДПОВІДНІ антивидові сироватки або імуноглобуліни Використання культури ФЕК як бюсубстрату для приготування діагностичного препарату (слайда-антигену), у порівнянні з прототипом, дозволяє спростити спосіб, в 6-9,5 разів скоротити строки готування препаратів (табл), за рахунок виключення декількох етапів (зараження курячих ембріонів, їх розтин, приготування суспензій жовткових МІШКІВ, центрифугування, контроль на стерильність, інактивація) Окрім того, заявлений спосіб дозволяє заощадити дорогу харчову сировину курячі ембріони Використання культурального матеріалу С psittaci штаму К, адаптованого до культури клітин ФЕК, з коротшим циклом розвитку, дозволяє швидше накопичувати інфекційний матеріал, до того ж, використання культури клітин ФЕК істотно поліпшує якість препаратів через усунення неспецифічного СВІТІННЯ фону Підвищується вірогідність одержуваних результатів, тому що хламідійний антиген виявляється не тільки поза 59959 клітинно (елементарні і ретикулярні тільця хламідій), але й у цитоплазмі інфікованих клітин у ви 6 гляді специфічно світного антигену Таблиця Тривалість готування діагностичного препарату (порівняльний аналіз із прототипом) №пп Винахід, що заявляється 1 2 3 Готування культури клітин Зараження культури клітин у завись Культивування Цитоморфолопчний контроль накопичення хламідіи Готування зависі Готування слайда-антигену - нанесення матеріалу - фіксація + інактивація (одночасно) Усього 4 5 6 7 8 9 10 Тривалість годин Діб 2 1 36-42 1 1 0,3 =2 доби Приклад 1 ВІДПОВІДНО ДО узвичаєної методики Голубева Д Б та співавт [5], одержували первинно трипсинізовану культуру клітин ФЕК Отримані клітини ех tempore заражали у завись пасажним культуральним матеріалом штаму К (С psitacci) Для цього до 2мл зависі ФЕК, розлитої у пеніцилінові флакони з покривними скельцями додавали 0,2 мл хламідієвмісної культуральної рідини Паралельно готували матеріал для цитоморфолопчного контролю накопичення збудника в культурі клітин ФЕК, використовуючи таку саму дозу зараження, той самий інфекційний матеріал та техніку приготування Контролем слугувала зазначена вище культура клітин, але без внесення заражаючого матеріалу Флакони із зараженими і контрольними клітинами шкубували в термостаті при температурі +36°С Через 36 годин після зараження покривні скельця з інфікованим моношаром клітин виймали, фіксували охолодженим ацетоном, офарблювали акридином оранжевим Цитоморфолопчний контроль накопичення збудника з використанням люмінесцентної мікроскопи виявив, що 60% клітин містили цитоплазматичні включення, забарвлені у жовтозелений колір (зрілі елементарні тільця хламідіи) Виготовляли хламідійний діагностичний препарат (слайд-антиген) Заражені клітини відокремлювали від стінок флакона струшуванням, їх завись в культуральній рідині ретельно гомогенізували, і наносили тонкою пастерівською піпеткою краплі розміром 2-Змм на знежирені Комп'ютерна верстка Т Чепелсва Прототип [4] Зараження курячих ембріонів Культивування Розтин та витягування жовткового мішка Контроль на стерильність Готування суспензій Контроль на стерильність Центрифугування Інактивація (азід+формалш) Готування слайда-антигену - нанесення матеріалу - фіксація Усього Тривалість годин Діб 2 5-Ю 2 2 2 2-3 2-3 3 0,3 12,3-19,3 доби предметні стекла Стекла підсушували на повітрі та фіксували 20 хв в охолодженому ацетоні Частину виготовлених слайдів-антигенів використовували для постановки РНІФ Інші, що залишилися невикористаними, зберігали при температурі не вище -20°С Приклад 2 Техніку одержання культури клітин ФЕК, зараження їх в завись, приготування та мікроскопію слайд-антигену виконували аналогічно прикладу 1 Флакони з зараженими і контрольними клітинами переглядали через 42 години після інкубування в термостаті (t=+36°C) При цитоморфолопчному контролі було виявлено накопичення збудника - 80% клітин містили цитоплазматичні включення зі зрілих елементарних тілець хламідіи Джерела інформації 1 Шаткин А И , Мавров И И Урогенитальные хламидиозы -Киев Здоров'я-1991 2 Автсв СССР №1711898 Способ получения хламидийного антигена для реакции непрямой иммунофлуоресценции 3 Автсв СССР №1641883 Способ получения биомассы хламидий 4 Горовиц Э С , Тимашева О А Применение иммунофлуоресцентной реакции для микроагглютинации для внутривидовой дифференциации иммунного ответа при некоторых хламидиозах // ЖМЭИ-1985, №5 -С 55-57 5 Голубев Д Б , Саминина А А , Медведева Н М Руководство по применению клеточных культур в вирусологии Л-д Медицина, 1976 Підписано до друку 06 10 2003 Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна