Спосіб ідентифікації сортів рису

Спосіб ідентифікації сортів рису, що включає ПЛР-аналіз ДНК, виділеної із зразків рослин генетичного матеріалу, із використанням SSRмаркерів, для подальшого його використання в ідентифікації та реєстрації сортів рису у вигляді формули, що відображає певний алельний склад добраних мікросателітних локусів. (19) (21) u201009619 (22) 02.08.2010 (24) 11.07.2011 (46) 11.07.2011, Бюл.№ 13, 2011 р. (72) СИВОЛАП ЮРІЙ МИХАЙЛОВИЧ, ГАЛАЄВ ОЛЕКСІЙ ВОЛОДИМИРОВИЧ, ДУДЧЕНКО ВОЛОДИМИР ВІКТОРОВИЧ (73) ПІВДЕННИЙ БІОТЕХНОЛОГІЧНИЙ ЦЕНТР В РОСЛИННИЦТВІ НААНУ 3 60990 - можливість проводити ідентифікацію сорта з будь-яких органів рослин у різні фази онтогенезу (зерно, лист, стебло, корінь); - спосіб підготовки зразків до аналізу (виділення ДНК); - показник, по якому ідентифікують генотипи (алельний склад 12 мікросателітних локусів). Спосіб забезпечує високу точність та унікальність ідентифікації сортів, не потребує наявності коштовного обладнання та реактивів. Спосіб здійснюється таким чином. 1. Виділення ДНК. 1 см-сегмент паростка (чи будь-якого органу рослини, листя, коріння) чи зерно в 1,5 мл-пробірці типу "епендорф" (далі епендорф) гомогенізувати скляним товкачем та залити лізуючим буфером (100 mM Na3EDTA, 100 mМ Трис-НСl рН 8,5 при 25°С, 100 mM NaCl, 1,0% SDS, 0,1% тритон Х-100, 100 мкг/мл протеінази К) до повної мацерації тканин. Лізат інкубувати 30 хв. при 55°С. Додати рівний об'єм (0,6 мл) суміші хлороформ-iзоаміловий спирт (24:1 за об'ємом), перемішати до утворення білої емульсії. Отриману суміш центрифугувати 5 хв. при 14000 об./хв на мікрофузі "Eppendorf 5415", водну фазу перенести в новий епендорф. До водної фази додати 0,5 об'єму (0,3 мл) ізопропілового спирту, перемішати і осадити ДНК центрифугуванням при 14000 об./хв протягом 4 хв. на мікрофузі "Eppendorf 5415". Надосадну рідину злити, осад промити двічі 1 мл 70% етанола - центрифугувати при 14000 об./хв протягом 2 хв. на мікрофузі "Eppendorf 5415", надосадну рідину злити. Підсушити осад при кімнатній температурі 15-20 хв. і розчинити в 100 мкл ТЕбуферу (10 mМ Трис-НСl рН 7,4; 1 mМ Na3EDTA рН 8,0). 4 2. Проведення полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). ПЛР проводити у 0,5 мкл - епендорфах з використанням ампліфікатора "Терцик" ("ДНКтехнологія", Росія). Реакційна суміш для проведення ПЛР об'ємом 20 мкл містить: 50 mM KCl, 20 mМ Тріс-НСl рН 8,4 (25°С), 2 mM MgCl2, 0,01% Твін-20, 0,2 mМ кожного dNTP, по 0,25 mкМ прямого і зворотнього праймерів, 20 нг ДНК і 1 одиницю ДНК-полімерази Taq. Поверх реакційного розчину нашаровувати 30 мкл мінеральної олії. Температурний режим ампліфікації такий: денатурація 94°С, 2 хв.; 35 циклів: 94°С 30 сек; 55°С (RM1, RM222, RM307, RM316, RM474, RM552), 57°С (RM510), 61°С (RM21, RM161, RM259, RM283), 63°С (RM20) 30 сек; 72°С 1 хв., фінальна елонгація - 72°С, 4 хв. Аналізувати 12 мікросателітних локусів, розташованих на восьми з дванадцяти хромосомах рису. В таблиці наведено номенклатуру SSRлокусів та послідовність фланкуючих праймерів даних SSR-локусів. 3. Електрофоретичний розподіл продуктів ампліфікації. Продукти ПЛР-ампліфікації фракціонувати в 10% денатуруючому (8 М сечовина) поліакриламідному гелі в 1 х ТВЕ-буфері (89,0 mМ тріс, 89,0 mМ борна кислота, 2,0 mM Na3EDTA) за постійної напруги 550 В 2-2,5 години залежно від довжини фрагментів ампліфікації. Для приготування одного гелю розміром 20x20 см товщиною 0,75 мм слід змішати 12,5 мл розчину 8 М сечовини, 12,5 мл розчину 30% поліакриламіду з 8 М сечовиною, 2,5 мл 10хТВЕ буферу, 20 мкл ТЕМЕД, 250 мкл 10% розчину амонію персульфату. Таблиця Мікросателітні локуси рису та послідовності фланкуючих праймерів SSR-локус (код) RM1 (А) RM20 (В) RM21 (С) RM161 (D) RM222 (Е) RM259 (F) RM283 (G) RM307 (Н) RM316(I) RM474 (J) RM510(K) RM552 (L) прямого F: gcgaaaacacaatgcaaaaa F: atcttgtccctgcaggtcat F: acgtattccgtaggcacgg F: tgcagatgagaagcggcgcctc F: cttaaatgggccacatgcg F: tggagtttgagaggaggg F: gtctacatgtacccttgttggg F: gtactaccgacctaccgttcac F: ctagttgggcatacgatggc F: aagatgtacgggtggcattc F: aaccggattagtttctcgcc F: cgcagttgtggatttcagtg Послідовність праймерів (5'-3') зворотнього R: gcgttggttggacctgac R: gaaacagaggcacatttcattg R: gctccatgagggtggtagag R: tgtgtcatcagacggcgctccg R: caaagcttccggccaaaag R: cttgttgcatggtgccatgt R: cggcatgagagtctgtgatg R: ctgctatgcatgaactgctc R: acgcttatatgttacgtcaac R: tatgagctggtgagcaatgg R: tgaggacgacgagcagattc R: tgctcaacgtttgactgtcc Гель залити у форми згідно керівництва користувача устаткування. Перед нанесенням продуктів ампліфікації провести префорез протягом 10 хв за постійної напруги 500 В. Перед нанесенням на електрофорез 10-12 мкл реакційної суміші змішати з 6 мкл буфера для нанесення (0,25% (w/v) ксиленцианол, 98% (w/v) формамід, 10 mM Na3EDTA pH 8,0) та денатурувати протягом 5 хв при 95°С, швидко охолодити на крижаній бані. Потім проби нанести у лунки поліакриламідного гелю. Провести електрофорез. В якості стандарту молекулярної ваги використовувати стандарт pUC 19 DNA/MspI ("Promega", США), (розміри фрагментів: 501, 489, 404, 331, 242, 190, 147, 111, 110, 67). 4. Візуалізація продуктів ампліфікації. Поліакрил амідні гелі фарбували сріблом відповідно методики: поліакриламід ний гель покласти на 5 хв у 5 60990 10% розчин етанолу, потім перенести у 1% розчин НМО3 на 3 хв. Гель кілька разів промити дистильованою водою. Витримати протягом 20 хв у 0,012 М AgNO3 у темряві. Двічі промити дистильованою водою. Залити гель відновлюючим розчином (0,28 М Na2CO3 (безводний), 0,019% формалін), інкубувати, перемішуючи до появи забарвлення фрагментів ампліфікації. Двічі промити дистильованою водою і покласти у 10% розчин оцтової кислоти на 2 хв. На завершення добре промити дистильованою водою для усування запаху оцтової кислоти. Гель зберігати між двома шарами прозорої поліетиленової плівки. 5. Документування результатів. Відеозображення електрофоретичних профілів ампліфікованої ДНК та оцінки довжини продуктів ампліфікації одержувати за допомогою системи документації і аналізу гелів "Image Master VDS" ("Amersham Pharmacia Biotech", OКB) згідно з інструкцією користувача обладнання. 6. Запис ідентифікаційної формули. За результатами аналізу мікросателітних локусів записати для аналізуємого сорту характерний для нього Комп’ютерна верстка М. Ломалова 6 набір алелів у вигляді формули, де латинськими літерами позначити коди досліджених локусів, а у нижніх індексах числами - розміри алелів відповідних локусам (в парах нуклеотидів). У випадку гомозиготного стану локусу вказувати довжину одного алеля. Приклади конкретного використання запропонованого способу. Приклад 1 Здійснювали ДНК-типування сорту Україна-96 за даними електрофоретичного розподілу ампліфікованих алелів дванадцяти мікросателітних локусів. Сорт Україна-96 є гомозиготним за дванадцятьма дослідженими локусами. Записали ДНК-спектр у вигляді формули: А91В201С143D176E184F159G157Н130І198J253K121L215. Приклад 2 Здійснювали ДНК-типування сорту Агат за даними електрофоретичного розподілу ампліфікованих алелів дванадцяти мікросателітних локусів. Сорт Агат є гетерозиготним за одним локусом (Н). Записали ДНК-спектр у вигляді формули: А97В204С143D176E184F164G155Н133,135І198J253K119 L231. Підписне Тираж 24 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601