Спосіб індикації днк збудників інфекційних захворювань в препаратах біологічної промисловості

Застосування полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) для індикації ДНК збудників інфекційних захворювань в препаратах біологічної промисловості Винахід відноситься до ветеринарної мікробіологи та біотехнологм, а саме до контролю препаратів ветеринарної біологічної промисловості (вакцини, контрольні та специфічні антигени для ретроспективної діагностики інфекційних захворювань, алергени тощо) Метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) застосовується для діагностики інфекційних захворювань, людини, тварин і птахів В його основі лежить виявлення специфічного фрагменту ДНК збудника інфекції в біологічних пробах (бюптати органів, епітеліальні зскрібки, сперма, синовія, фекалії тощо) Є патент України №36260 від 25 11 1999, кл G01 N33/53 "Спосіб детекцм вірусу лейкозу великої рогатої худоби" Спосіб виконується шляхом використання ПЛР тільки при детекцм вірусу лейкозу великої рогатої худоби Існує спосіб визначення ДНК збудника хламідюзу способом ПЛР при застосуванні наборів реагентів ("Полимик", ТУ-9398-17253567-96, производство НВФ "Литех", Москва, Россия, 1996), шляхом індикації ДНК збудника хламідюзу Це технічне рішення може бути прототипом Недоліком його є те, що спосіб призначений для діагностики тільки хламідюзу людини В основу винаходу, що передбачається, поставлено задачу застосувати полімуразну ланцюгову реакцію (ПЛР) для індикації ДНК, щоб забезпечити визначення ДНК збудників інфекційних захворювань в препаратах біологічної промисловості ПЛР-спосіб є високочутливим і специфічним Чутливість способу складає 10-1000 клітин збудника в досліджуваному зразку Специфічність способу зумовлена тим, що у дослідному матеріалі виявляють унікальний, характерний лише для шуканого збудника фрагмент ДНК Специфічність задається нуклеотидною ПОСЛІДОВНІСТЮ праймерів, що виключає можливість отримання хибних результатів ПЛР є не лише якісним а також і КІЛЬКІСНИМ способом індикації антигенів в досліджуваних зразках Спосіб виконується таким чином Для проведення ампліфікації фрагмента ДНК хламідм (ділянка гена, що кодує 16S рибосомальної РНК) необхідно провести ЗО циклів ВІДПОВІДНО, В залежності від КІЛЬКОСТІ антигена в досліджуваному зразку напрацьовується різна КІЛЬКІСТЬ ампліконів в апліфікаті, що відзначається при візуальній ОЦІНЦІ різною інтенсивністю свічення смуг розміром 501 п н , ВІДПОВІДНИХ за електрофоретичною чутливістю фрагменту ДНК хламідм Специфічність способу ПЛР та ДОЦІЛЬНІСТЬ ЙОГО використання для визначення ступеню концентрації антигена в біопрепаратах пояснюється наступними прикладами Приклад 1 У ДОСЛІДІ по індикації ДНК збудника хламідюзу в специфічному (серія №83, держконтроль №83, виготовлений XI 1991 р граничний титр 1 128 ) та контрольному (серія №5, держконтроль №5, виготовлений II 1992 р , граничний титр 1 10) хламідійних антигенів для РЗК виробництва Херсонської бюфабрики нами було взято по ЮОмкл їх нативних розведень у фізіологічному розчині З указаних антигенів було виділено ДНК і проведено ампліфікацію, і електрофорез на агарозному гелі Як видно з фіг1, на електрофореграмі чотирьох зразків ампліфікату, вихідними матеріалами яких були досліджувані специфічний і контрольний 00 00 (О 61288 хламідійні антигени для РЗК та позитивний і негативний контролі, на усіх доріжках спостерігається смуга розміром 308п н , яка за електрофоретичною рухливістю відповідає внутрішньому контролю реакції На першій доріжці ВІДПОВІДНІЙ зразку специфічного антигену і третій доріжці позитивного контролю, позначеній "+", спостерігається смуга розміром 501 п н , яка за електрофоретичною рухливістю відповідає фрагменту ДНК хламідм, що свідчить про наявність ДНК хламідіи в цих зразках Разом з тим, на другій доріжці, ВІДПОВІДНІЙ контрольному антигену і четвертій доріжці негативного контролю, позначеній "-", вказана смуга розміром 501 п н відсутня, що вказує на відсутність в цих зразках ДНК хламідіи Отже, методом ПЛР-аналізу вказаних матеріалів наявність хламідіи виявлена в специфічному хламідійному антигені і не виявлена в контрольному Об'єктивність одержаних результатів підтверджена позитивним, негативним та внутрішнім контролем реакції Приклад 2 В ДОСЛІДІ по індикації ДНК хламідіи в специфічних (серія №102, контрольний №3439, придатний до VI 1984р і серія №104, контрольний №585, придатний до IV 1985р) та контрольних (серія №27, контрольний №564 і серія №45, контрольний №2797) орнітозних алергенів для внутрішньошкірноі проби виготовлених на Одеському підприємстві по виробництву бактерійних препаратів було взято по ЮОмкл кожного з них в нативному вигляДі З указаних алергенів було виділено ДНК і проведено ампліфікацію, і електрофорез на агарозному гелі Як видно з фіг 2, на електрофореграмі шести зразків ампліфікату, вихідними матеріалами яких були два вказані специфічні і два контрольні орнітозні алергени та позитивний і негативний контролі, на усіх доріжках спостерігалась смуга внутрішнього контролю На першій і третій доріжках ВІДПОВІДНИХ двом специфічним алергенам та п'ятій доріжці позитивного контролю, позначеній "+", спостерігалась смуга, відповідна за електрофоретичною рухливістю фрагменту ДНК хламідм, що свідчить про наявність в досліджуваних пробах ДНК хламідіи Разом з тим, на другій і четвертій доріжках, ВІДПОВІДНИХ контрольним антигенам та шостій доріжці ВІДПОВІДНІЙ негативному контролю, позначеній "-", вказана смуга розміром 501 п н відсутня, що вказує на те, що ці зразки не містять ДНКхламідій Отже методом ПЛР-аналізу хламідм не виявлені в контрольних, а виявлені в специфічних орнітозних алергенах Об'єктивність цих результатів підтверджена позитивним, негативним та внутрішнім контролями реакції Приклад З В ДОСЛІДІ по індикації ДНК хламідіи в контрольному (серія №5, держконтроль №5, виготовлений 111992 р, граничний титр 110) та специфічному (серія №83, держконтроль №83, виготовлений XI 1991 р граничний титр 1 128 ) було взято по ЮОмкл хламідійних антигенів вищезгаданих серій контрольного в нативному розведенні та специфічного у восьми різних розве деннях, а саме 1 128, 1 1280, 1 12800, 1 128000, I 256000, 1 512000, 1 768000 та 1024000 Тобто перше розведення відповідає граничному титру антигену в РЗК, а наступні відносно нього в 10, 100, 1000, 2000, 4000, 6000 і 8000 раз З указаних антигенів було виділено ДНК і проведено ампліфікацію, і електрофорез на агарозному гелі Як видно з фіг 3, на електрофореграмі одинадцяти зразків ампліфікату, вихідними матеріалами яких були вказаний контрольний і специфічний (у 8-ми вказаних розведеннях) хламідійні антигени для РЗК та позитивний і негативний контролі, на усіх доріжках спостерігалася смуга розміром 308п н На другій, третій, четвертій, п'ятій, шостій, сьомій, восьмій і дев'ятій доріжках, ВІДПОВІДНИХ восьми розведенням специфічного антигену та десятій доріжці ВІДПОВІДНІЙ позитивному контролю, позначеній "+", спостерігалась смуга розміром 501 п н , яка за електрофоретичною чутливістю відповідає фрагменту ДНК хламідм, що свідчить про наявність цього збудника в означених пробах При цьому слід зазначити, що інтенсивність свічення вказаної смуги в УФ-променях трансілюмінатора на різних доріжках була не однаковою вона є більш інтенсивною на доріжках, ВІДПОВІДНИХ меншому титру розведення специфічного антигену, і менш інтенсивною на доріжках цього антигену в більш високому титрі Разом з тим, на першій доріжці, ВІДПОВІДНІЙ контрольному антигену та одинадцятій, яка відповідає негативному контролю, позначеній "-", вказана смуга розміром 501 п н відсутня, що свідчить про відсутність ДНК хламідіи в цих ампліфікатах Таким чином, методом ПЛР-аналізу хламідм не виявлені в контрольному хламідійному антигені для РЗК та виявлені в усіх розведеннях специфічного хламідійного антигену Об'єктивність цих результатів підтверджена позитивним, негативним та внутрішнім контролями реакції Одержані результати свідчать, що різна інтенсивність свічення смуг, ВІДПОВІДНИХ фрагменту ДНК хламідм, яка знижується пропорційно підвищенню титру розведення, вказує на те, що метод ПЛР-аналізу виступає не лише як якісний, а і, певною мірою, як КІЛЬКІСНИЙ метод Для визначення КІЛЬКІСНОГО складу антигену в зразку, більш конкретно, можна приготувати еталонні ампліфікати із завідомо відомою концентрацією антигену, з яким можна буде порівнюватись досліджуваний зразок Приклад 4 В ДОСЛІДІ по індикації ДНК хламідіи в контрольних (серія №5, держконтроль № 5, виготовлений II 1992р , граничний титр 1 10 і серія №9, держконтроль №9, виготовлений IX 1992р, граничний титр 1 10) та специфічному хламідійному антигені для РЗК (серія №21, держконтроль №21, виготовлений VI 1992р граничний титр 1 40) виробництва Херсонської бюфабрики нами було взято по 100 мкл нативних розведень у фізіологічному розчині контрольних хламідійних антигенів та специфічного хламідійного антигену в п'яти різних розведеннях, а саме 1 40, 1 400, 1 4000, 1 20000, 1 40000 Тобто перше розведення також відповідає граничному титру даного антигену в РЗК, а наступні відносно нього в 10, 100, 500 і 1000 раз 61288 З указаних антигенів було виділено ДНК і проведено ампліфікацію, і електрофорез на агарозному гелі На електрофореграмі дев'яти зразків ампліфікату, вихідними матеріалами яких були два вказані контрольні і специфічний (у 5-ти вищезазначених розведеннях) хламідійні антигени для РЗК та позитивний і негативний контролі, на усіх доріжках спостерігалась смуга розміром 308п н На третій, Разом з тим, на доріжках 1, 2 ВІДПОВІДНИХ контрольним антигенам та доріжці 9 ВІДПОВІДНІЙ негативному контролю, позначеній "-", вказана смуга розміром 501 п н відсутня, що вказує на відсутність ДНК хламідій в цих ампліфікатах Таким чином, методом ПЛР-аналізу ДНК хламідій не виявлені в контрольних хламідійних антигенах для РЗК та виявлені в усіх п'яти розведеннях специфічного хламідійного антигену Об'єктивність цих результатів підтверджена позитивним, негативним та внутрішнім контролями реакції Одержані результати, як і в прикладі 3, свідчать про те, що різна інтенсивність свічення смуг, ВІДПОВІДНИХ фрагменту ДНК хламідм, яка знижується пропорційно підвищенню титру розведення, вказує на ДОЦІЛЬНІСТЬ застосування ПЛР-способу для визначення концентрації антигену в біопрепаратах що контролюються четвертій, п'ятій, ШОСТІЙ І СЬОМІЙ доріжках, ВІДПОВІ ДНИХ п'яти розведенням специфічного антигену та восьмій доріжці, яка відповідає позитивному контролю, позначена "+", спостерігалась смуга розміром 501 п н При цьому слід зазначити, що, як і в прикладі 3, інтенсивність вказаної смуги на різних доріжках була не однаковою більш інтенсивною на доріжках, ВІДПОВІДНИХ меншому титру розведення специфічного антигену, і менш інтенсивною на доріжках цього антигену в більш високому титрі ФІГ.1 Фіг.2 Фіг.З Комп'ютерна верстка Н Лисенко Підписне Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119