Спосіб кількісного визначення оротової кислоти

Спосіб кількісного визначення оротової кислоти, що включає відбір проби, взаємодію її з хімічними реагентами та вимірювання аналітичного сигналу, який відрізняється тим, що спочатку здійснюють відокремлення оротової кислоти шляхом тонкошарової хроматографії, відокремлену таким чином оротову кислоту піддають взаємодії в шарі сорбенту з іонами тербію (III) в присутності тритону Х-100 та уротропіну при рН 6,8-7,2 і вимірюють інтенсивність люмінесценції іону Тb (III) в тонкому шарі сорбенту. (19) (21) u201103681 (22) 28.03.2011 (24) 25.10.2011 (46) 25.10.2011, Бюл.№ 20, 2011 р. (72) БЕЛЬТЮКОВА СВІТЛАНА ВАДИМІВНА, ЛІВЕНЦОВА ОЛЕНА ОЛЕГІВНА, ТЕСЛЮК ОЛЬГА ІВАНІВНА (73) ОДЕСЬКА НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ, ФІЗИКО-ХІМІЧНИЙ ІНСТИТУТ ІМ. О.В. БОГАТСЬКОГО НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК УКРАЇНИ 3 взаємодію її з хімічними реагентами та вимірювання аналітичного сигналу тим, що спочатку здійснюють відокремлення оротової кислоти методом тонкошарової хроматографії, відокремлену таким чином оротову кислоту піддають взаємодії в шарі сорбенту з іонами тербію (III) в присутності тритону Х-100 та уротропіну при рН 6,8-7,2 і вимірюють інтенсивність люмінесценції іону Тb (III) в тонкому шарі сорбенту. Новим у корисної моделі, що заявляється, є використання реакції взаємодії оротової кислоти з іонами тербію(III), яка проходить у фазі сорбенту на пластинці для тонкошарової хроматографії, з метою відокремлення кислоти із розчину і підсилення сенсибілізованої твердофазної люмінесценції іона Тb (ІІІ) у присутності неіоногенної поверхнево-активної речовини тритону Х-100 та уротропіну при рН 6,8-7,2. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю заявлених ознак і досягненням технічного результату випливає з наступного. Підвищення селективності визначення, зниження межі виявлення стало можливим завдяки наступним прийомам. 1. Застосування методу тонкошарової хроматографії для відокремлення оротової кислоти. Застосування такого прийому дозволяє поєднувати стадію попереднього відокремлення оротової кислоти в тонкому шарі сорбенту з отриманням сорбату комплексу, який проявляє люмінесцентні властивості в твердій фазі сорбенту, що дозволяє проводити селективне твердофазне люмінесцентне визначення оротової кислоти. 2. Застосування сорбції оротової кислоти в шарі сорбенту сприяє збільшенню інтенсивності люмінесценції сорбатів комплексів внаслідок зменшення безвипромінювальних втрат енергії збудження, що веде до зниження межі визначення оротової кислоти. Сенсибілізована люмінесценція іона Тb (III) в шарі сорбенту посилюється у присутності неіоногенної поверхнево-активної речовини тритону Х100, який сприяє дегідратації утвореного комплексу і тим самим зменшенню безвипромінювальних втрат енергії збудження. Найбільша інтенсивність люмінесценції спостерігається при використанні проявляючого роз-2 чину з концентрацією Тb (III) - 110 моль/л. При більших концентраціях спостерігається зростання інтенсивності люмінесценції "холостої" проби. Як проявляючий використаний розчин хло-2 риду Тb (III) з концентрацією 110 моль/л. Інтенсивність люмінесценції (Ілюм) сорбату тербію (III) залежить від кількості тритону Х-100 у розчині. Найбільша Ілюм виявляється в присутності тритону Х-100 у розчині 0,2 %. Сорбат комплексу Тb (III) з оротовою кислотою має люмінесцентні властивості в інтервалі значень рН від 5,5 до 8,5 з максимумом люмінесценції при рН 6,8-7,2. Для створення необхідного значення рН використовували розчин уротропіну 4 %-вого. Як рухома фаза оптимальною виявилася суміш бензол:метанол:оцтова кислота у співвідношенні 10:5:1. 63937 4 Вивчення впливу об'єму проби, що наноситься на пластинку, показало, що найкращий результат досягається при нанесенні проби об'ємом 2 мкл. При менших або більших кількостях проби плями на пластинці набувають витягнутої форми. Приклад. Визначення оротової кислоти проводили в коров'ячому молоці. Вплив білкових компонентів молока, що заважають, усували їх попереднім осадженням. Для цього проби молока об'ємом 10 мл поміщали у мірні колби об'ємом 100 мл, обробляли 1 мл 1,7 моль/л розчином оцтової кислоти і 1 мл 1 моль/л розчином ацетату натрію, додавали 60 мл дистильованої води і нагрівали на водяній бані (40 °C) протягом 5 хвилин при перемішуванні. Потім охолоджували до кімнатної температури і доводили до мітки дистильованої водою, сирну масу фільтрували через подвійний паперовий фільтр "синя стрічка", заздалегідь оброблений гарячою водою. Отриману сироватку попередньо розбавляли дистильованою водою в 5 раз. Для цього до 2 мл сироватки додавали 8 мл дистильованої води. 2 мкл розбавленої проби наносили мікрошприцем на лінію старту хроматографічної пластинки розміром 30×80 мм. Паралельно на пластинку наносили стандартний розчин оротової кислоти. Пластинку поміщали в хроматографічну камеру з рухомою фазою (суміш бензолу: етанолу:оцтової кислоти у співвідношенні 10:5:1). Коли фронт розчинника досягнув висоти 70 мм, пластинку витягали з камери і відмічали положення фронту розчинника. Отриману хроматограму висушували при температурі 40 °C протягом 2 хвилин і рівномірно послідовно обробляли пляму оротової кислоти проявляючими розчинами: хлориду тербію -2 (110 моль/л), а потім тритону Х-100 (0,2 %-вим) і уротропіну 4 %-вим. Ідентифікацію оротової кислоти на пластинці проводили по появі зеленої люмінесценції іону тербію (III) під люмінесцентною лампою зі світлофільтром УФС-2 (збудж=365 нм), візуально порівнюючи інтенсивність люмінесценції проби і стандарту. Кількісне визначення оротової кислоти проводили за калібрувальним графіком, для побудови якого діяли таким чином. На пластинку наносили різні кількості стандартного розчину оротової кислоти і далі проводили хроматографування і прояву хроматограми, як описано вище. Потім з пластинки вирізали плями з оротової кислоти, вміщували в кювету для твердих зразків і вимірювали Ілюм при збудж=545 нм. За отриманими даними будували калібрувальний графік, відкладаючи на осі абсцис концентрацію оротової кислоти, а на осі ординат значення інтенсивності люмінесценції. За допомогою цього графіка визначали вміст оротової кислоти в аналізованій пробі. В коров'ячому молоці знайдено 10 мкг/мл оротової кислоти. Точність і відтворюваність визначення перевірена методом статистичної обробки результатів. При n=5 і Р=0,95 величина відносного стандартного відхилення (Sr) складає 0,07-0,09. Межа вияв-8 лення оротової кислоти складає (110 моль/л) -3 210 мкг/мл. 5 63937 Результати визначення оротової кислоти в молоці перевірена методом "введено-знайдено" 6 (табл.), за допомогою якого показана правильність методики. Таблиця Результати визначення оротової кислоти в молоці методом "введено-знайдено" (мкг/мл) (n=5, Р=0,95) Введено 10 25 Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Знайдено 10,1 20,2 34,8 Підписне Sr 0,09 0,09 0,08 Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601