Спосіб детекції proteus vulgaris

Винахід, що заявляється, відноситься до мікробіології та молекулярної біології, а саме до створення наборів праймерів для внутрішньовидового виявлення бактерій Proteus vulgaris за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Він може бути використаний у системі бактеріологічного контролю внутрішньо-лікарняних інфекційних спалахів, при проведенні комплексних діагностико-профілактичних заходів з ідентифікації патогенних та непатогенних збудників, що ін фікують сечовий тракт людини, а також при бактеріологічних дослідженнях для контролю контамінації бактеріями Proteus vulgaris. Бактерії Proteus vulgaris відносяться до роду Proteus, що містить чотири види бактерій - P. vulgaris, P. mirabilis, P. penneri та Р. myxofaciens. Ці представники родини Enterobacteriaceae викликають особливий інтерес мікробіологів через їхні як патогенні, так і непатогенні зв'язки з шлунково-кишковим трактом та статевою системою людини. Вони часто (8-15% серед представників видів, що виявляють, родини Enterobacteriaceae) інфікують верхню частину сечового тракта, що може призводити до гострого пієлонефриту, утворення цисти або ниркових каменів, лихоманки або бактеріємії. Для детекції Proteus sp. використовують бактеріологічні, серологічні та численні сучасні молекулярногенетичні методи. Існує спосіб детекції грамнегативних бактерій, заснований на порівнянні профілів резистентності мікроорганізмів-продуцентів b -лактамази IMP-1-тип у до антибіотиків (Y. Arakawa, N. Shibata, K. Shibayama et al. Convenient test for screening metallo- b -lactamase-producing gram-negative bacteria by using thiol compounds // J. of Clinical Microbiology. - 2000. - V.38, No.1. - P.41-43). У даній роботі було порівняно профілі резистентності різних штамів-продуцентів ІМР-1 ряду грамнегативних бактерій, зокрема Proteus vulgaris, до антибіотику цефтазидіну (ЦАЗ). Для цього бактерії було висіяно на агарові диски, два із яких містили по 30мкг ЦАЗ кожний, а один фільтрувальний - диск містив інгибітор b -лактамази. Чашки з агаровим середовищем інкубували за температури 37°С протягом ночі і спостерігали появу між дисками зон інгибування росту мікроорганізмів. Як інгибітори b лактамази було використано ЕДТА; тіолові сполуки, зокрема меркаптооцетову кислоту, 2-меркаптопропіонову кислоту та меркаптоетанол; солі важких металів, таких як СuСl2, FeCl2, HgCl2. Контролем при виконанні дослідженьбули штами-продуценти b -лактамаз типів SHV-12 та AmpC. При використанні ЕДТА як інгибітора b лактамази IMP-1-типу спостерігалась поява зон інгібування росту мікроорганізмів, але результати характеризувались низькою відтвореністю. Використання хлоридів міді та заліза звичайно призводило до утворення сферичної області преципітації навколо фільтрувального диска, що обумовлено бактеріцидною активністю саме інгібітора. При цьому зона інгібування росту мікроорганізмів сягала диска, що містив ЦАЗ. Але для ряду штамів було отримано неоднозначні результати. Використання солі HgCl2 дало змогу отримати більш чіткі профілі резистентності, але застосування іонів Hg 2+ обмежено у зв'язку з токсичністю солей ртуті. Найбільш чіткі профілі резистентності було отримано для IMP-1-продуцентів при використанні 2-меркаптопропіонової кислоти як інгибітора b -лактамази. Недоліком пропонуємого способу детекції грамнегативних бактерій, зокрема P. vulgaris, є неможливість чітко диференціювати мікроорганізми-продуценти ІМР-1, до яких належать бактерії P. vulgaris, від мікроорганізмів-продуцентів b -лактамаз типів ESBLs та AmpC внаслідок майже однакових профілів резистентності до даного антибіотика продуцентів різних b -лактамаз. Існує також спосіб детекції Proteus sp., заснований на можливості утворення мікроорганізмами забарвлених колоній на хромогенному середовищі CHROM-agar Orientation внаслідок взаємодії родо- та видоспецифічних білків з відповідним хромогенним субстратом (Samra Z., Heifetz M., Talmor J., Bain E., Bahar J. Evaluation of use of a new chromogenic agar in detection of urinary tract pathogens // J. of Clinical Microbiology. - 1998. - V.36, No.4. P.990-994). Можливості застосування хромогенного середовища CHROMagar Orientation для детекції та диференціації мікроорганізмів було оцінено для грампозитивних та грамнегативних патогенних мікроорганізмів, зокрема Proteus sp., на 900 клінічних зразках сечі від госпіталізованих хворих. Середовище, що пропонується, дозволяє легко детектувати бактерії Proteus sp., оскільки вони утворюють характерні колонії коричневого кольору на дифузному фоні. Недоліком цього способу детекції є неможливість диференціювати Proteus vulgaris, P. mirabilis, P. penneri та Р. myxofaciens. Найбільш близьким є спосіб детекції Proteus vulgaris на основі ряду молекулярно-генетичних та біохімічних тестів, в тому числі на основі секвенування гена 16S РНК P. vulgaris після ампліфікації з універсальними праймерами (J.M. Janda, S.L. Abbott, S. Khashe, W. Probert. Biochemical identification and characterization ofDNA groups within the Proteus vulgaris complex // J. of Clinical Microbiology. - 2001. - V.39, No.4. - P.1231-1234). У роботі було досліджено 47 ізолятів бактерій, отриманих із різних джерел, - клінічний матеріал екстрагували з сечі, крові, мокрот, ран людини, а також від тварин (змії, миші та ящірки). Штами було віднесено до бактерій роду Proteus на основі їх біохімічних властивостей, а саме: бактерії були позитивними за результатами тесту на фенілаланіндезаміназу, здійснювали ферментацію D-маннози, руйнували кристали L-тірозину тощо. Проведені в подальшому біохімічні тести на утворення індолу, втрату орнітин-декарбоксилазної активності, утворення кислоти при ферментації мальтози дозволили ідентифікувати 43 ізоляти як Proteus vulgaris. Авторами роботи було зроблено спробу типувати штами Proteus vulgaris, що досліджено, та віднести їх до різних геномоварів (ДНК-груп) за результатами ряду біохімічних тестів: гідроліз ескуліну, утворення кислоти із саліцину, бродіння L-рамнози. Крім того, відповідні штами кожної ДНК-групи було оцінено за ферментативними або вірулентноасоційованими властивостями: за утворенням стафолізину, муцинази, естерази, хітонази тощо). Проте з 47 штамів, що досліджували і отримали як ізоляти P. vulgaris, три штами було відненсено до P. mirabilis, один ідентифікували як штам, що не відноситься до роду Proteus. Недоліком вищенаведеного способу детекції P. vulgaris є те, що ряд біохімічних тестів (з утворення ацетату та тартрату) мають низьку дискримінаційну потужність - більшість штамів (77%) були позитивними відносно утворення ацетату, а результати реакцій щодо тартрату було важко інтерпретува ти. Крім того, недоліком запропонованого способу детекції Proteus vulgaris є його тривалість, громіздкість, а також недостатня надійність, оскільки не всі ізоляти Р. vulgaris можна чітко ідентифікувати навіть на основі секвенування гена 16S РНК. У зв'язку з вищевикладеним в основу винаходу покладено задачу підвищення точності детекції Proteus vulgaris шляхом забезпечення видоспецифічної ідентифікації P. vulgaris. Задача, яку покладено в основу винаходу, вирішується тим, що у відомому способі детекції P. vulgaris за допомогою полімеразної ланцюгової реакції шляхом створення набору специфічних праймерів, згідно з винаходом, використовують праймери, що складаються з таких послідовностей: Рr4 5' - cgc ttt gcg atg gca agt аса agt aag - 3' Pr5 5' - cgt tta tga gtg act ttg gca cct gg - 3'. При розробці набору праймерів було проаналізовано різні гени Proteus sp. -гени, що кодують сечовину, плазмідну та хромосомну (3-лактамази, 16S РНК, гіразу, фрагменти яких можуть бути маркерами для диференційної детекції Р. vulgaris. Проведений швидкий пошук гомології по базах даних показав, що ген 16SPHK має висококонсервативні фрагменти не тільки для P. mirabilis та P. vulgaris, а і для інших ентеробактерій, наприклад, для Е. соlі та Klebsiella pneumoniae. В той же час було знайдено, що гени, які кодують протеїни родини b -лактамаз розширеного спектру, є видоспецифічними: висококонсервативні локуси було ідентифіковано для 7 ізолятів гена b -лактамази P. mirabilis, а також для 3 ізолятів гена b -лактамази P. vulgaris. З іншого боку, гени b лактамази P. mirabilis та P. vulgaris не мають спільних мотивів. Крім того, для комп'ютерного аналізу (множинного вирівнювання з наступним статистичним аналізом множинного вирівнювання) використовували послідовність єдиного відомого ізоляту гена b -лактамази Hug A Proteus penneri. Проведений комп'ютерний аналіз показав, що ген b -лактамази, що локалізований на хромосомній ДНК Р. vulgaris, має достатню потужність для диференціації P. vulgaris від близькоспоріднених штамів Р. реппегі та P. mirabilis. За допомогою комп'ютерного та термодинамічного аналізу було створено набір праймерів Рr4-Рr5, який дозволяє ампліфікувати фрагмент гена b -лактамази хромосомної ДНК Р. vulgaris довжиною 263 пн. Розроблений набір праймерів Рr4-Рr5 було тестовано на шести лабораторних та клінічних штамах Р. mirabilis та P. vulgaris, люб'язно наданих Salmonella Genetic Stock Centre (SGSC, Канада). За допомогою стандартної ПЛР з набором праймерів Рr4-Рr5 амплікон очікуваної довжини 263пн було детектовано тільки для штамів Р. vulgaris, в той час як для трьох ізолятів найбільш близькоспорідненого до Р. vulgaris штаму P. mirabilis результати ПЛР-аналізу були негативними. Винахід, що пропонується, ілюстровано конкретними прикладами. Приклад 1. Фрагмент множинного вирівнювання гена, що кодує b -лактамазу, для 3 ізолятів Proteus vulgaris та одного ізоляту Proteus реппегі. Номера ізолятів у базі секвенованих послідовностей нуклеїнових кислот GenBank: 1AF324468; 2-D37831; 3-Х80128; 4-D29982. Розроблений праймер Рr4 дозволяє проводити видоспецифічну детекцію P. vulgaris за допомогою ПЛР з набором праймерів Рr4-Рr5. Приклад 2. Детекція ПЛР-продуктів ампліфікації фрагмента хромосомної ДНК Proteus vulgaris після проведення полімеразної ланцюгової реакції та електрофореза у 2% агарозному гелі. М-100пн маркер молекулярної маси (можна бачити смуги, що відповідають фрагментам 200пн та більше); 1 - негативний контроль ампліфікації; 2,4специфічний продукт ампліфікації з очікуваною довжиною 263 пари нуклеотидів після проведення ПЛР з праймерами Рr4-Рr5, комплементарними фрагментам гена b -лактамази, для клінічного ізолята P.vulgaris та лабораторного штамма P.vulgaris ATCC 1331 відповідно; 3-ДНК, що була екстрагована з клінічного ізолята P.mirabilis. Таким чином, у даному винаході представлено набір праймерів для полімеразної ланцюгової реакції для видоспецифічної детекції бактерій Proteus vulgaris, а також надійний метод ідентифікації Р.vulgaris за допомогою ПЛР-аналізу.