Спосіб детекції патогенних лістерій

Спосіб детекції патогенних лістерій L. monocytogenes, L. ivanovii, L. seeligeri, що передбачає детекцію ампліконів, попередньо одержаних за допомогою полімеразної ланцюгової реакції, який відрізняється тим, що для полімеразної ланцюгової реакції використовують праймери, що складаються з таких послідовностей: List 3 5' - CAA TTA GAA CCT АСА AGT CGA AGG Т -3' List 4 5' - ACC GTT CTC CAC CAT TCC CAA -3'. (19) (21) 2000127435 (22) 22.12.2000 (24) 16.07.2001 (33) UA (46) 16.07.2001, Бюл. № 6, 2001 р. (72) Волянський Андрій Юрійович, Лиманський Олександр Петрович, Лиманська Ольга Юріївна (73) Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова, UA 40371 monocytogenes from production lines of fresh to coldsmoked fish // Journal of Microbiological Methods. 2000. - V. 40. - P. 147-151. ). Цей метод може бути використано для швидкого скринінгу клінічних зразків як альтернативний варіант класичному виділенню та ідентифікації. Однак, при серотипуванні лістерій не перекривається діапазон їх антигенної варіабельності. До інших загальних недоліків вище названих методів відносяться більш низькі надійність, точність, чутливість та специфічність у порівнянні з молекулярно-генетичними методами, які базуються безпосередньо на виявленні фрагмента геному збудника. Найбільш близьким є метод детекції та диференційного виявлення лістерій, заснований на ПЛР-детекції фрагментів гена іар, який кодує протеїн р60 (Detection and differentiation of Listeria spp. by a single reaction based on multiplex PCR / A. Bubeil, I. Hein, M. Rauch, A. Lehner et al // Appl. Environ. Microbiol. - 1999. - V. 65, № 10. - P. 46884692). Тест-систему складають 5 праймерів. Один з них є спільним для усіх видів Listeria. Інші 4 праймери є специфічними для L. monocytogenes, L. innocua, L. grayi та згрупованих разом трьох видів: L. ivanovii, L. seeligeri та I. welshimeri. Недоліком цієї тест-системи є неможливість здійснювати диференційну діагностику для L. ivanovii, L. seeligeri та L. welshimeri. В основу винаходу, що передбачається, поставлено задачу створити спосіб детекції патогенних лістерій шляхом створення наборів праймерів для полімеразної ланцюгової реакції для забезпечення 100% специфічності при проведенні ПЛРаналізу. Аналіз доступної літератури показав, що тільки штами L. monocytogenes є патогенними для людини. В той же час L. seeligeri, L. ivanovii та L. innocua містять ген, який кодує фактор патогенності - цитолізин (L. seeligeri, L. ivanovii) або фаголізин (L. innocua). З представлених у базах даних EMBL, GenBank та DDBJ 247 ізолятів L. monocytogenes, 10 L. seeligeri, 12 L. ivanovii, 11 L. innocua було створено підбазу гена ліс-теріолізина (цитолізина). Наявність висококонсервативних фрагментів дозволила сконструювати набір іірогімерів List3List4 (див. табл. 1, табл. 2) для детекції L. мonocytogenes, L. seeligeri та L. ivanovii. Ізолят L. innocua не виявив висококонсервативних фрагментів з вище наведеними видами лістерій. Набор праймерів List 3 - List 4 створено таким чином, що їх температури плавлення співпадають з точністю ±5°С з температурами плавлення праймерів List1List2. Це дозволяє, за умови коректного вибору температури відпалу, проводити мультіплексну ПЛР з одночасним виявленням 6 видів лістерій та диференційну детекцію патогенних лістерій (L. monocytogenes) і лістерій, що містять ген цитолізину (L. seeligeri, L. ivanovii). Довжина продукту ПЛР-детекції лістерій, обмеженого праймерами List3-List4, складає 707 пар нуклеотидів, а довжина амплікона для праймерів List1-List2 варіює від 1437 до 1575 пар нуклеотидів. Приклад 1 Фрагмент комп'ютерного аналізу гена лістеріолізина/цитолізина ізолятів лістерій з баз даних EMBL та GenBank. Таблиця 1 2 40371 Lmlisa, Lm25443, Lm25446, Lm25449, Lm25452 - L. monocytogenes; Liilo - L. ivanovii; Lslso - L. seeligeri. List4 - антисмисловий праймер для ПЛР-детекції лістерій, що містять ген лістеріолізину/цитолізину. Приклад 2 Температура плавлення праймерів для детекції лістерій за різної кількості помилок у комплексі праймер - однонитковий продукт ПЛР Таблиця 2 Число помилок Довжина (пар основ) 0 1 2 3 List1 25 51,2 46,4 41,6 36,8 List2 20 55,7 49,7 43,7 37,7 List3 25 52,7 47,9 43,1 38,3 List4 21 57,8 52,0 46,3 40,6 Праймер Виділено значення температур плавлення праймерів, які необхідно використовувати при проведенні ПЛР. Розроблений варіант ПЛР може бути використано в якості стандартного методу для швидкої ін дикації патогенних лістерій, виділених з молока, молочних продуктів, м'яса тварин та птиці, овочів, морських та інших продуктів. __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2001 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 50 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 3