Антиметастатичний засіб

Винахід, що заявляється, стосується медицини, а саме онкології, і може використовуватись як засіб інгібіції метастазування злоякісних пухлин. Проблема метастазування є найактуальнішою в онкологічній клініці, бо як відомо, більшість хворих на рак вмирає від метастазів у віддалені органи. Це обумовлено пізньою діагностикою захворювання, оскільки більшість хворих звертається до лікаря в передостанній або останній стадії злоякісного процесу і не підлягає радикальному лікуванню. І якщо первинну пухлину можна видалити хірургічним або променевим шляхом, то видалити всі метастази цими методами технічно неможливо. В певній мірі це здійснюється за приміненням хіміотерапевтичних препаратів. Враховуючи це, значні зусилля вчених направлені на пошук ефективніших засобів пригнічення метастазування. З цією метою в багатьох лабораторіях світу досліджується величезна кількість хімічних речовин різного походження і тільки незначна їх частка використовується в онкологічній клініці. На жаль, практично всі синтезовані, або одержані природним шляхом хіміотерапевтичні препарати, як і променева терапія, мають значний токсичний вплив на організм людини, широко уражуючи життєво важливі органи та системи організму, серед яких найбільш чутливими є кістковий мозок і периферична кров, лімфоїдні органи, епітелій шлунковокишкового тракту [1]. Крім цього згодом у онкологічних хворих розвивається стійкість до хіміопрепаратів, що призводить до зниження адаптивно-компенсаторних механізмів і являється серйозною перешкодою для подальшого подовження курсів хіміотерапії [2]. Багато десятиліть разом з розробкою і відбором хімічних протипухлинних препаратів для лікування злоякісних пухлин йде пошук речовин біологічного походження - вакцин з пухлинних, дендритних клітин, застосовується введення соматичних клітин і тканин зрілих, а частіше ембріональних організмів, мікробів та продуктів їх життєдіяльності [3, 4, 5]. Перевагою таких методів лікування виявилась повна відсутність, або низька токсичність такого роду терапії, однак і значно скромнішими виявились результати лікування пухлинної хвороби. Задачею винаходу є розширення арсеналу засобів антиметастатичного призначення. З цією метою були використані клітини периферичної крові - еритроцити барана (ЕБ), які широко використовуються в експериментальних імунологічних дослідженнях в якості корпускулярного тимусзалежного антигена (АГ). Розподіл АГ на тимуснезалежні і тимусзалежні базувався на їх спроможності або неспроможності індукувати імунну відповідь in vivo у тимектомованих або безтимусних (nude) мишей. Встановлено, що для реалізації гуморальної імунної відповіді до Т-залежних АГ потрібна кооперація лімфоцитів тимічного (Т-клітин) та кістковомозкового походження (В-клітин) [6]. Еритроцити барана використовують в експериментах для виявлення аглютининів, кількості антитілоутворюючих клітин (АУК) у селезінці, при дослідженні реакцій клітинного імунітету, найчастіше в реакції гіперчутливості сповільненого типу (РГСТ), матеріальним субстратом якої є Т-лімфоцити-ефектори, які відповідають за захист при бактеріальних (туберкульоз), вірусних та паразитарних інфекціях, різних видах імунопатологій, визначають трансплантаційний і протипухлинний імунітет [7]. На Т-лімфоцитах людини присутні рецептори до ЕБ, таким чином вони являються специфічними маркерами Т-клітин, в зв'язку з чим цей феномен широко використовується у клініці при вивченні імунодефіцитів різного походження, в тому числі при лікуванні онкологічних хворих, для визначення кількості таких клітин в периферичній крові. В процесі експериментальних досліджень нами вперше виявлено нову властивість ЕБ - їх здатність пригнічувати приживлення і ріст метастазів, тобто виявлено антиметастатичну активність ЕБ. При вивченні РГСТ на ЕБ встановлено, що у мишей С57В1/6 з перещепленою карциномою Льюїс, яким згідно з методикою РГСТ вводили у вену сенсибілізуючу (2.105), а за добу до кінця експерименту - розв'язуючу дозу ЕБ (108), різниця в масі первинних пухлин карциноми Льюїс була несуттєвою, однак у легенях таких тварин виявилось достовірно менше метастазів, ніж у мишей, яким не вводили ЕБ. При повторенні експерименту було отримано відтворення даних. Слід відзначити, що серед речовин біологічного походження, які використовуються з метою лікування злоякісних пухлин невідоме примінення з цією метою ЕБ. Щодо використання ЕБ за іншим, не загальноприйнятим призначенням відома здатність великих доз ЕБ (15% суспензії) відновлювати у мишей гемота лімфопоез, порушений внаслідок токсичної дії цитостатиків циклофосфану і платидіаму [8]. З метою підтвердження властивості ЕБ пригнічувати метастазування проведено додатковий експеримент на 48 самках мишей лінії С57В1/6 віком 2,5-3 місяці, масою 20-22г, розводки віварію ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України. Для порівняння використали циклофосфан - протипухлинний препарат з відомим антиметастатичним ефектом. Мишей розподілили на 6 груп по 8 тварин у кожній: 1-а контрольна, введення фізіологічного розчину; 2-а введення ЦФ; 3-я - введення ЕБ у вену в дозі 2×105; 4-а - введення ЕБ у вену в дозі 2×105 разом з ЦФ; 5-а введення ЕБ внутрішньочеревно в дозі 108; 6-а - введення ЕБ внутрішньочервно в дозі 108 разом з ЦФ. Всім мишам перещепили загальноприйнятим способом карциному Льюїс у м'язи правої задньої кінцівки по 2,5×105 трипсинізованних клітин у 0,1мл середовища Хенкса. Суспензію ЕБ вводили мишам одноразово, у вену, в ретроорбітальний синус по 2×105 клітин в 0,1мл фізіологічного розчину, або внутрішньочеревне по 108 клітин в 0,3 мл фізіологічного розчину на 7 добу після перещеплення пухлин. Хіміопрепарат ЦФ (Україна, ТОВ Київмедпром) вводили внутрішньочеревне, в курсовій дозі 150мг/кг. До початку і в кінці есперименту у камері Горяєва загальноприйнятим способом визначали абсолютну кількість лейкоцитів та еритроцитів периферичної крові. На 28 добу після перещеплення пухлин тварин забили дислокацією шийних хребців і визначали параметри росту пухлин: масу первинної пухлини, кількість і масу легеневих метастазів, а також масу тимуса і селезінки. Результати експерименту, оброблені статистично з використанням t-критерію Стьюдента, наведені в таблицях 1 і 2. Таблиця 1. Вплив ЕБ і ЦФ на ріст та метастазування карциноми Льюїс у мишей С57В1/6 № п/п 1 2 3 4 5 6 Частота метастазування (перещеплення), % Контроль 100(75) ЦФ 100(87,5) 100(75) ЕБ(2×105) 100(33,3) ЦФ+ЕБ(2×105) ЕБ(108) 100(50) ЦФ+ЕБ(108) 75(66,6) Характер впливу Маса % гапервинних льмупухлин, г вання 3,62±0,26 1,91±0,37* 2,54±0,52 1,9±0,18* 3,73±0,14 1,94±0,42* -47,2 -29,8 -47,5 +3,0 -46,4 Метастази % гаКількість Маса, мг льмування 15,5±3,22 115,1±40,2 9,0±0,84 -41,9 37,7±10,7* 11,5±1,94 -25,8 65,1±29,9 8,0±1,25* -48,4 23,4±13,2* 8,2±1,21* -47,1 33,2±10,0* 6,7±0,20*’** -56,8(-5,6) 10,7±8,32*'**(-1,7) % гальмування -67,2 -43,4 -88,4 -71,1 -90,7 * Р < 0,05 в порівнянні з інтактним контролем. ** Р < 0,05 в порівнянні з контролем ЦФ. У дужках - % гальмування порівняно з ЦФ. Таблиця 2. Вплив ЕБ і ЦФ на морфологічні показники периферичної крові і імунокомпетентних органів у мишей С57В1/6 з карциномою Льюіс № п/п 1 2 3 4 5 6 Показники периферичної крові Маса Маса Кількість % гальмуванКількість тимуса, мг селезінки, мг лейкоцитів х ня або еритроцитів х 109/л стимуляції 1012/л Контроль 59,5±1,8 164,9±16,0 8,3±1,47 7,24±0,16 ЦФ 50,7±3,1* 134,2±15,2 4,2±0,35* -49,4 3,76±0,93* ЭБ(2.105) 48,2±4,7* 154,1±16,8 6,25±1,31 -24,7 6,92±0,54 ЦФ+ЭБ(2.105) 55,3±8,3 130,0±14,1 4,42±0,29* -47,0 7,62±0,55** ЕБ(108) 51,1±5,2 165,7±15,5 7,92±1,27 -4,9 6,84±0,11 ЦФ+ЕБ(108) 52,5±4,8 131,2±12,1 5,24±0,64 -36,9 6,88±0,16** Характер впливу % гальмування, або стимуляції -48,0 -9,5 +5,5(+102) -5,3 -4,8(+82,9) *Р < 0,05 в порівнянні з інтактним контролем. **Р < 0,05 в порівнянні з контролем ЦФ. У дужках % гальмування порівняно з ЦФ. В результаті досліду було виявлено, що введення мишам препарату ЦФ призводить до суттєвого зниження маси первинних пухлин і легеневих метастазів карциноми Льюїс в порівнянні з показниками контрольної групи тварин - на 47,2% і 67,2% відповідно (Р0,05). У мишей, яких імунізували ЕБ в малій, сенсибілізуючій дозі виявлено тенденцію гальмування росту первинних пухлин, кількості і маси метастазів карциноми Льюїс на 29,8%, 25,8% і 43,4% відповідно. В цей же час у мишей, яких імунізували великою (10) дозою ЕБ було виявлено суттєвий антиметастатичний ефект - на 47,1% зменшилась кількість метастазів і на 71,1% їх маса (Р