Спосіб одержання днк-вмісного волокнистого вуглецевого сорбенту

1. Спосіб одержання ДНК-вмісного волокнистого вуглецевого сорбенту, який відрізняється тим, що волокнистий вуглецевий сорбент обробляють розчином суміші н-ДНК, д-ДНК та ДНП, сушать і фіксують в етанолі. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що співвідношення суміш н-ДНК, д-ДНК, ДНП: волокнистий вуглецевий сорбент становить не більше 1:200. Винахід відноситься до медицини, а саме, до імуносорбції і може бути використаний для очищення крові, плазми крові або раньової поверхні від ДНК-тропних речовин. Відомо, що підвищений рівень згаданих речовин зумовлює тяжкість хвороби і їх видалення з організму сприяє покращанню клінічного стану пацієнтів [Gaubitz, Μ., Schneider, К.М. Immunoadsorption in systemic lupus erythematosus: different techniques and their current role in medical therapy. Therap Apher Dial, 2003, 7, 2, p.183-8, Amosova V.N., Iaremenko O.B., Snezhkova E.A., Drannik G.V Efficacy of immunosorption in patients with systemic lupus erythematosus: double blind controlled trial. Terapevticheskii Arkhiv. 1997, 69 (12), 18-22]. Також відомо, що у плазмі крові хворих на системне аутоімунне захворювання [Tan Е.М. Antinuclear antibodies (ANA s): diagnostically specific immune markers and clues toward the understanding of systemic autoimmunity. Clin. Immunol, Immunopathol, 47, 121, 1988] антинуклеарні антитіла до ДНК мають широкий спектр і можуть бути представлені антитілами до денатурованої, нативної ДНК та ДНП (дезоксірибонуклеінового комплексу). Відомі способи отримання ДНК-вмісних адсорбентів, призначених для клінічного застосування. Так, згідно способу [J.Traeger et al. Extracorporeal immunoadsorption of DNA-antibodies on DNA-coated collagen films. In "Plasmapheresis" Ed.by Y.Nose, P.Malchesky, J.Smiths.ISAO Press, Cleveland, USA, 1983, p.155-166] отримують ДНК, іммобілізовану на колаген. Спосіб зводиться до трьох стадійного активування бокових карбоксильних груп колагену ацил-азидним методом з наступним зшиванням двоспіральної денатурованої ДНК. При цьому на 1г колагенової плівки фіксують лише 0,35-0,5г ДНК. Спосіб відносно складний, потребує для реалізації кількох днів і пов'язаний з використанням такого дефіцитного матеріалу, як хімічно чистий колаген. Крім того, колагенові матриці мають незначну сорбційну активність і внаслідок цього лікувальний ефект від застосування ДНК-сорбента буде пов'язаний виключно з присутністю в матеріалі іммобілізованої ДНК. Метод по [Е.А. Снежкова, В.Г. Николаев, Г.Г. Пухова. Способ получения ДНК-содержащего углеродного гемосорбента. SU 1398160 Α1] заключається у нанесенні розчину ДНК на вуглецевий гемосорбент, сушці та ультрафіолетовому (19) UA (11) 78105 (13) C2 (21) a200502744 (22) 25.03.2005 (24) 15.02.2007 (46) 15.02.2007, Бюл. № 2, 2007 р. (72) Снєжкова Єлизавета Олександрівна, Ніколаєв Володимир Григорович, Сахно Лариса Олексіївна, Сарнацька Вероніка В'ячеславівна, Масленний Віталій Миколайович (73) ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ, ОНКОЛОГІЇ І РАДІОБІОЛОГІЇ ІМ. Р.Є. КАВЕЦЬКОГО НАН УКРАЇНИ (56) SU1398160 A1, 26.02.1986 Эффективность иммуносорбции у больных системной красной волчанкой: двойное слепое контро 3 78105 4 опромінюванні висушеного сорбенту в абсолютлокнистого сорбенту, отримують тим же способом ному спирті із послідуючим відмиванням готового з тими же матеріалами, наносячи ДНК у масовому продукту. Слабкою ланкою цього способу є стадія співвідношенні ДНК:сорбент =1:475. ультрафіолетового опромінювання в середовищі Приклад 2 абсолютного спирту. Для його здійснення необхідТак само, як описано в прикладі 1, обробляють не конструювання спеціального реактора, який 3 зразки, але без фіксації в абсолютному етанолі. повинен забезпечити безпечність опромінювання вуглецевого гемосорбента. Таблиця 1 За прототип обрано спосіб одержання вуглецевого гемосорбента шляхом іммобілізації ДНК на Кількість іммобілізованої суміші ДНК активоване вугілля [Е.А. Снежкова, В.Г. Николаев, Тип обробки на 1г зразка волокнистого сорбенту В.М. Юдин, Ю.В. Волощенко, П.П. Кондратюк, В.Н. Зразок Зразок Зразок Клевцов, И.Н. Гавриш и В.Ф. Литвинов. Способ 1 2 3 получения ДНК-содержащего углеродного сорбен3 фіксацією 9 4,5 2 та. SU 1647973 А1]. Цей спосіб найбільш близький етанолом по технічній суті до способу, що заявляється, і заБез фіксації 6 3 1,5 ключається в обробці розчином ДНК вуглецевих етанолом волокнистих матеріалів медичного призначення, сушці і послідуючому відмиванні готового продукЗ наведених прикладів таблиці 1 видно, що ту. Але цей матеріал має обмежену специфічну завдяки фіксації етанолом вдається іммобілізувати ємність внаслідок використання одного типу ДНК. значно більшу кількість суміші ДНК. Задачею винаходу є вдосконалення технології Приклад 3 одержання ДНК-вмісного вуглецевого сорбенту Для оцінки сорбційних якостей волокнистих для забезпечення високих сорбційних якостей вугсорбентів після іммобілізації ДНК проводять вилецевої матриці та ліганду шляхом нанесення сувчення поглинання маркера сорбційних властивоміші основних типів ДНК на волокнистий сорбент. стей сорбентів - вітаміну В12, одержаними зразкаЗадачу винаходу вирішують завдяки тому, що ми 1, 2, 3 та ви хідним вуглецевим матеріалом. волокнистий вуглецевий сорбент обробляють розСтупінь поглинання вітаміну В12 за 1 годину із чином суміші нативної і денатурованої ДНК та ДНП тест-системи (у % від ви хідної кількості В12) ДНК(ДНК+білок) у масовому співвідношенні - суміш вмісними волокнистими сорбентами з різною кільДНК: волокнистий сорбент не більше 1:200, а після кістю ДНК (мг) на 1г сорбенту. сушки фіксують в етанолі. Тест-ситема: водний розчин В12 (33,3мкг/мл), Суть винаходу полягає в наступному: вуглецеоб'єм - 30мл, навіска сорбенту -50мг. вий волокнистий сорбент обробляють сумішшю розчинів нативної і денатурованої ДНК та ДНП у Таблиця 2 масовому співвідношенні суміш ДНК: волокнистий сорбент не більше 1:200, сушать, фіксують в етаМасове співвідно- Кількість ДНК % поглинання нолі і промивають. шення ДНК: сор- (мг/г сорбенту) вітаміну В 12 Суть винаходу розкривають наступні приклабент ди: целюлоза 0 5 Приклад 1 без ДНК 0 85 На 340мг волокнистого вуглецевого матеріалу 1:100 9 4 АУВМ наносять 1,5мл розчину ДНК, який містить 1:200 4,5 25 1,1мг нативної, 1,1мг денатурованої ДНК та 1,1мг 1:475 2 33 ДНП (масове співвідношення суміш ДНК:сорбент=1:100) та поміщають на чашку Петрі, висушують у струмі холодного повітря. Після сушки, одержаний сорбент фіксують в 5мл абсолютного етанолу, промивають 30мл 0,15Μ р-ну NaCl, 30мл 1,5Μ р-ну NaCl, і 30мл 6Μ р-ном сечевини. В перелічених елюатах визначають концентрацію ДНК. Кількість іммобілізованої ДНК визначають як різницю між вихідною її кількістю, нанесеною на сорбент, та кількістю препарату, знайденого в етанолі та елюатах. Після сушки отримують ДНК-сорбент, який містить 9мг суміші нативної і денатурованої ДНК і ДНП на 1г вуглецевого волокна (зразок 1). Так само обробляють 340мг того ж волокнистого вуглецевого матеріалу, але у масовому співвідношенні ДНК: сорбент=1:200 і отримують ДНКсорбент, який містить 4,5мг суміші нативної і денатурованої ДНК та ДНП на 1г вуглецевого волокна (зразок 2). Зразок 3, який містить 2мг суміші нативної та денатурованої ДНК та ДНП на 1г вуглецевого во Із наведеної таблиці 2 слідує, що при масовому співвідношенні суміші ДНК:сорбент менше 1:200 поглинальні властивості сорбенту нижчі 25%, що стави ть цей сорбент на один рівень зі звичайною целюлозою. Приклад 4 Отриманий зразок 1 тестують для з’ясування специфічної ємності іммобілізованої суміші ДНК у тест-системі з плазмою крові з високою ДНКзв'язучою активністю по відношенню до н-ДНК, дДНК та ДНП. Тест-система: 4мл високомолекулярної фракції плазми крові хворої на СЧВ перфузують по рециркуляційній схемі через колонку, що містить 150мг волокнистого вуглецевого матеріалу АУВМ, який містить 0,675мг іммобілізованої суміші ДНК, протягом однієї години. Зв'язуючу активність плазми до н-ДНК, д-ДНК та ДНП виміряють з допомогою ІФА. Той же самий експеримент повторюють, але вуглецевий матеріал містить замість суміші ДНК, 5 таку ж саму кількість денатурованої ДНК. 78105 д-ДНК+АУВМ Таблиця 3 Остаточна н-ДНК, д-ДНК, ДНП-активність плазми (у % від ви хідної активності плазми) після її контакту з ДНК- волокнистими сорбентами Тип ДНК-сорбенту Суміш ДНК+АУВМ н-ДНК 10 Комп’ютерна в ерстка Л.Литв иненко Д-ДНК 40 ДНП 55 6 29 64 61 З наведеної таблиці видно, що сорбент з іммобілізованою сумішшю ДНК краще адсорбує антитіла до н-ДНК, д-ДНК та ДНП в порівнянні з сорбентом з іммобілізованою лише денатурованою ДНК. А оскільки у кожного хворого індивідуальний спектр антитіл до ДНК, то запропонована іммобілізована суміш основних типів ДНК суттєво покращує їх видалення. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601