Спосіб вирощування міцелію гриба pleurotus ostreatus

Винахід належить до біотехнології, а саме до живильних середовищ для культивування міцелію грибів класу Basidiomycetes. Відомий спосіб вирощування міцелію гриба Pleurotus ostreatus, який включає виготовлення субстрату із зерна зернової культури, крейди та гіпсу, інокулювання міцелію вищого їстівного базидіоміцету в субстрат, культивування міцелію вищого їстівного базидіоміцету, який відрізняється тим, що при виготовленні субстрату в нього додатково додають солодові ростки або зародки зернової культури та тирсу дерева листяної породи у масовому співвідношенні 1:0,12 - 1:3,0 відповідно, крім того, в субстрат додають калію йодид та натрію селеніт у масовому співвідношенні між цими компонентами від 1:3 до 3:1 відповідно. [Патент України № 66645 А; 7А01G1/04, Спосіб вирощування міцелію вищого їстівного базидіоміцету та субстрат для вирощування міцелію вищого їстівного базидіоміцета, Бісько Н.А. та ін. О. б. №5, 2004.]. Недоліками відомого способу є велика кількість складових частин субстрату, низька швидкість росту міцелію та малий вихід білків. Відомий спосіб прискорення росту міцелію, де в процесі культивування міцелію грибів у живильне середовище додають циклодекстрин, зокрема, a, b, g-циклодекстрин, розгалужений циклодекстрин, а також їх суміші. Для зменшення вартості культивування використовують порошковий сироп дешевого циклодекстрину. З метою отримання більш дешевого продукту використовують сироп циклодекстрину при желатинізації крохмалю з одночасним додаванням ферменту, який синтезує циклодекстрин. В результаті рівномірно формуються спори грибів. [Патент Японії № 2879177 В2 5192034 А; 6 А01G1/04, Способ ускорения роста грибной гифы и формирования грибов, KOBAYASHI SHOICHI and all., 0161.09.001.2000.]. Недоліками відомого способу є залежність синтезу циклодекстрину від активності доданого ферменту, складність технологічного процесу та низька біосинтетична активність. Найближчий за технічною сутністю та досягаемому результату до заявленого винаходу є спосіб культивування міцелію грибів Pleurotus ostreatus, який включає: виготовлення живильного середовища при рН=6,8-7,1, ущільнення середовища додаванням агар-агару в кількості 2-2,5%, стерилізацію живильного середовища в паровому стерилізаторі при температурі 120-130°С та тиску 1,2-1,5атм. протягом 60 хвилин, розплавлення готових середовищ на водяній бані, внесення стимулятора "Фумар" безпосередньо у розплавлене живильне середовище в концентрації 10-3%, інокуляція живильного середовища маточною культурою міцелію та інкубація в термостаті при температурі 26-28°С протягом 7-10 діб. Як живильні середовища використовують: кукурудзяний відвар; кукурудзяний екстракт та зелену патоку в співвідношенні 1:2; неохмелене пивне сусло та кукурудзяний екстракт у співвідношенні 1:1; неохмелене пивне сусло. "Фумаром" також обробляли посівний міцелій при посіві на середовище (без додавання "Фумару") методом занурення шматочків міцелію в розчин "Фумара" концентрації 10-2% на 3-4 секунди. [Вплив біостимуляторів росту та живильних середовищ на ростові якості міцелію Pleurotus ostreatus / О.В. Кузнецова, Н.В. Заколесник, О.М. Лебедева // Вопр. химии и хим. технологии. - 2004. - №4. - с. 89-93.] (Прототип). До недоліків прототипу слід віднести низьку швидкість росту та низький вихід білків. В основу винаходу поставлена задача підвищення біосинтетичної активності грибів та швидкості росту міцелію шляхом дії "Фумару" на ферментативні системи міцелію гриба Pleurotus ostreatus, які приймають участь у біосинтезі білків. Поставлена задача досягається тим, що у відомому способі вирощування міцелію гриба Pleurotus ostreatus, який включає виготовлення живильного середовища при рН=6,8-7,1, ущільнення середовища за допомогою агарагару в кількості 2-2,5%, стерилізацію живильного середовища, інокуляцію середовища маточним міцелієм та інкубацію в термостаті при температурі 26-28°С протягом 7-10 діб, при цьому в живильні середовища додають розчин "Фумару", відповідно винаходу розчин "Фумару" додають до живильного середовища за 1-1,5 доби до інокуляції середовища маточним міцелієм в концентрації 10-4-10 -5%. Як живильне середовище використовують кукурудзяний відвар. Внесення біостимулятора "Фумара" в концентрації 10-4-10 -5% у живильне середовище дає можливість підвищити швидкість росту та біосинтетичну активність за рахунок дії біостимулятора на ферменти, які приймають участь у синтезі білків, так як стимулююча дія різних рістрегуляторів більш виражена при низьких концентраціях. Внесення "Фумара" за 1-1,5 доби до інокуляції сприяє більш оптимальному розчиненню та активації стимулятора у живильномусередовищі, а також дозволяє контролювати чистоту живильного середовища. "Фумар" - це біологічно активна хімічна сполука, до його складу входить диметиловий ефір амінофумарової кислоти, що утворюється в процесі біологічного окислення органічних кислот. Він здатний підвищувати врожайність зернових культур і, крім того, застосовується для покращення живцювання винограду, яблунь і деяких декоративних культур. [Проблема регуляторів росту у світі та її вирішення в Україні /В.В. Моргун, В.К. Яворська, І.В. Драговоз //Физиология и биохимия культ, растений. - 2002 - т. 34. - №5 - с. 371-375]. Наводимо приклади конкретного виконання представленого винаходу. Приклад 1. Живильне середовище готують наступним чином. 250 г кукурудзяного зерна заливають водопровідною водою в кількості 1,5 л та варять. Проварене зерно охолоджують та подрібнюють на гомогенізаторі, після чого проварюють ще протягом 15 хвилин. Відокремлюють рідину від густини за допомогою сита і доводять об'єм до 1,5 л водою. Перевіряють рН, доводять його до 7 за допомогою 40%-вого розчину NaOH чи 20%-вого розчину ортофосфорної кислоти. У живильне середовище додають агар-агар у кількості 2% від загального об'єму. Живильне середовище стерилізують у паровому стерилізаторі (автоклаві) при температурі 120°С та тиску 1,2 атм протягом 60 хвилин. Розчин біостимулятора "Фумара" готують у стерильній дистильованій воді. Після стерилізації у живильне середовище додають розчин біостимулятора, концентрація якого у середовищі становить 10 %. Готове живильне середовище розливають по чашках Петрі та витримують одну добу. Після цього проводять посів чистою культурою штаму базидіоміцетів. Інокульовані чашки ставлять для пророщення у термостат при температурі 26 С. Час культивування (до повного заростання чашок Петрі) складає у середньому 8 діб. Кінетику росту визначають за зміненням діаметру колоній, константі росту та ростовому коеффіціенту. Підвищення біосинтетичної активності міцелію перевіряють визначенням підвищення кількості білків за методом Лоурі, для цього готують розчини білків. Міцелій багаторазово промивають дистильованою водою, розтирають у ступці для отримання гомогенної маси, відбирають 3 наважки для визначення білків. Наважку міцелію (3 г) у ступці багаторазово піддають дії різної температури (замерзання - відтаювання), розтирають, операцію продовжують до руйнування всіх клітин, далі міцелій витримують у холодильнику протягом 24 годин та центрифугують при 6000 об/хв. 15 хвилин. Змивають розчин білка (альбумін), заливають новою порцією води, центрифугують, надосадові рідини об'єднують (розчин № 1). Осади в центрифужних пробірках заливають 25 мл 10%-вим NaCl, екстрагують глобуліни 20 годин, центрифугують, промивання повторюють 4-5 разів. Надосадові рідини об'єднують, об'єм заміряють (розчин № 2). Осади в центрифужних пробірках заливають 80%-ним етанолом для екстракції проламінів, залишають на 24 години. Центрифугують, відмивають етанолом. Надосадові рідини об'єднують, об'єм заміряють (розчин № 3). Осади заливають 0,2%-вим розчином NaOH для виділення глютелінів, залишають на 10 годин, центрифугують, надосадові рідини об'єднують, об'єм заміряють (розчин № 4). Результати дослідів наведені у таблицях 1, 2 та 3. Таблиця 1 Кінетика росту міцелію гриба Pleurotus ostreatus Ростовий коефіцієнт 3 доба 10 доба 147 156 119 123 Живильне середовище Кукурудзяний відвар із "Фумаром" 10-4% Кукурудзяний відвар із "Фумаром" 10-5% Прототип Варіант без "Фумару" Варіант з "Фумаром" 55,17 81 Константа росту 3 доба 7 доба 11,9 16 10,1 15 85,61 94 5,9 9,0 9,6 9,6 Таблиця 2 Змінення діаметра колоній гриба Pleurotus ostreatus у період росту Поживне середовище Кукурудзяний відвар із "Фумаром" 10-5% Кукурудзяний відвар із "Фумаром" 10-4% Прототип Варіант без "Фумару" Варіант з "Фумаром" Доба / діаметр колоній 5 6 7 1 2 3 4 8 9 10 21 23,8 46,6 59 68,8 83 92,8 94 94 94 19 22,6 46,3 58 68,3 80,8 89,6 94 94 94 16,5 21 21,5 25 34,2 48 47 59 59,7 70 72,5 81 84,2 88 90 90 92,4 92 94 94 Таблиця 3 Біосинтетична активність міцелію гриба Pleurotus ostreatus Концентрація "Фумару", % 10 -4 10-5 Альбуміни Проламіни Глобуліни Глютеліни Альбуміни Проламіни Глобуліни Глютеліни Концентрація білка в сухій речовині, мг/г 8,442 1,444 0,886 0,526 8,190 1,199 0,864 0,413 Альбуміни Проламіни Глобуліни Глютеліни Альбуміни Проламіни Глобуліни Глютеліни 6,759 1,172 0,830 0,118 7,021 1,022 0,755 0,241 Білкові фракції Загальний вміст білка в сухій речовині, мг/г 11,298 10,666 Прототип Варіант без "Фумару" 10-3 8,879 9,039 Як видно з наведених таблиць, винахід підвищує біосинтетичну активність грибів на 18-25% та швидкість росту міцелію гриба Pleurotus ostreatus. Рекомендовано застосовувати біостимулятор "Фумар" у концентрації 10-410-5% для внесення у живильне середовище. Запропонований винахід може бути використаний при промисловому виробництві міцелію та плодових тіл гриба Plewotus ostreatus.