Лікарський засіб, який містить бактеріальний лектин, для лікування хворих, уражених грипом

Лікарський засіб для лікування хворих, уражених грипом, який відрізняється тим, що містить як активну речовину позаклітинний лектин сапрофітного штаму Bacillus sub tilis ІМВ В-7014 в концентрації 50,0-10,0мкг/мл, який повністю блокує поверхневі структури глікопротеїнів вірусу грипу, в яких термінальна N-ацетилнейрамінова кислота зв'язана з субтермінальною D-галактозою a2,3- або a2,6-зв'язками, інгібування нейрамінідазної активності вірусу грипу бактерійним лектином полягає у взаємодії нейрамінідази вірусу грипу з лектином як субстратом. Винахід належить до мікробіології, а саме: застосування бактерійного лектину для лікування хворих, уражених грипом. Грип залишається епідемічним вірусним захворюванням, причиною важких ускладнень і навіть смерті. Для запобігання цього захворювання та його ускладнень використовуються актуальні протигрипозні вакцини і антивірусні препарати [1, 3]. Амантадин і Ремантадин є актуальними лише проти вірусів грипу А, вони мають серйозні побічні ефекти нервової системи; до цих препаратів швидко розвивається стійкість [2, 5]. Всі антигрипозні препарати зменшують симптоми грипу та скорочують перебіг хвороби на 1-2 дні, якщо лікування починається через 48 годин після появи симптомів. Невакциновані хворі можуть використовувати ці препарати профілактично, якщо вакцинація їм протипоказана. Найближчими до винаходу, що заявляється, є препарати Занамівірин та Оселтамівір, які активні проти вірусів грипу А і В. Вони блокують нейрамінідазний поверхневий протеїн вірусів А і В, за хищають від інфікування клітини респіраторного епітелію і запобігають розповсюдженню вірусу. Побічні ефекти пов'язані з підвищенням темпера тури, але до цих препаратів відмічається низький рівень резистентності [6-9]. В основу винаходу поставлено задачу створення ефективного лікарського засобу з принципово новим механізмом дії на основі бактерійного лектину для лікування хворих, уражених грипом. Поставлену задачу вирішують тим, що в якості продуцента позаклітинного лектину використовується сапрофітний штам Bacillus subtilis В-7014 з Української колекції мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України. Бактерійний лектин одержують з культуральної рідини осадженням сульфатом амонію, очищенням діалізом, пастерізацією та ліофілізацією, як описано раніше [4]. Лектин являє собою глікопротеїн з мМ 25кДа, стійкий до дії різних факторів зовнішнього середовища (рН, температури, детергентів, іонів металів), тривало зберігається (термін спостереження 10 років). Він є нетоксичною речовиною та має високу специфічну активність: гемаглютинуюча активність лектину коливається в межах 512-51200 гемаглютинуючих одиниць/мл; найбільшу спорід (19) UA (11) 83578 (13) C2 (21) a200613194 (22) 13.12.2006 (46) 25.07.2008, Бюл.№ 14, 2008 р. (72) ПІДГОРСЬКИЙ ВАЛЕНТИН СТЕПАНОВИЧ, UA, КОВАЛЕНКО ЕММА ОЛЕКС АНДРІВН А, U A, РИБАЛКО СВІТЛАН А ЛЕОНТІЇВН А, U A, ШАРИКІНА НАДІЯ ІВАНІВНА, UA, ГЕТЬМАН КАТЕРИНА ІЛЛІВНА, UA (73) ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ІМ. Д.К.ЗАБОЛОТНОГО Н АН УКРАЇНИ, UA (56) RU C1 2185185, 20.07.2002 UA C2 42865, 15.11.2001 Коваленко Е.О Позаклітинні лектини роду Bacillus, автор. дис. К. 1999 UA А 8276, 29.03.1996 3 83578 неність він проявляє до сіалових кислот та сіаловмісних глікокон'югатів, які мають a2,3/6 зв'язки. Задачу вирішують тим, що лікарський засіб на основі бактерійного лектину для лікування хворих, уражених грипом, згідно з винаходом містить активну речовину в дозі 50,0-10,0мкг/мл. Лікарський засіб може бути виконано у пероральній або ін'єкційній формах. Лікарський засіб на основі бактерійного лектину для лікування хворих, уражених на грип, що заявляється, є ефективнішим у порівнянні з прототипом, має принципово новий механізм дії і не втрачає своєї активності протягом тривалого часу. Антигрипозна активність бактерійного лектину. Для визначення перспективності розробки лектину були тестовані його МПК максимально переносима концентрація) - 2500мкг/мл, МАК (мінімально активна концентрація) - 1,0-1,5мкг, ХТІ (хіміотерапевтичний індекс) - 2500-100, що дозво 4 ляє віднести препарат лектину до високоактивних антивірусних препаратів. При вивченні антигрипозної активності бактерійного лектину на моделі грипозної інфекції in ovo, in vivo та in vitro показано, що лектин в дозі 50,0-10,0мкг на ембріон достовірно пригнічує репродукцію вірусу грипу на 5,5lg ІЕ50 (індекс ефективності). На моделі грипозної інфекції in vitro (культура клітин МДСК - перещеплювані клітини нирки собаки) субстанція препарату пригнічувала репродукцію вірусу грипу в дозі 50,0-10,0мкг/мл на 7,5 3,0lg ІЕ50. В експериментах на мишах при профілактичному введені лектину спостерігався повний захист від грипозної інфекції: IE дорівнював 100,0 (табл. 1). Лікувальна дія препарату залежала від шляхів його введення: при інтраназальному введені індекс захисту складав 20,0, а при пероральному 100,0 (табл. 2). Таблиця 1 Захисна дія лектину при профілактичному введені мишам, зараженим вірусом грипу Препарат Доза мкг/кг Кількість мишей Лектин 50,0-10,0 10 Із них загинуло всього % 0 0 КЗ IE 100 Таблиця 2 Захисна дія лектину при лікувальній схемі введення мишам, зараженим вірусом грипу Препарат, шлях введення Лектин пероральний Лектин інтраназальний Доза мкг/кг Кількість мишей 50,0-10,0 50,0-10,0 10 10 Таким чином, бактерійний лектин ефективно інгібує репродукцію вірусу грипу і повністю захищає мишей від даної інфекції при профілактичному введенні. Лікувальна дія субстанції лектину залежала від шляху її введення і досягала максимальних значень при пероральному використанні. Ме ханізм дії бактерійного лектину полягає у блокуванні поверхневих стр уктур глікопротеїнів вірусів грипу, в яких термінальна Nацетилнейрамінова кислота зв'язана з субтермінальною D-галактозою a2,3-або a2,6-зв'язками, що запобігає подальшому інфікуванню клітинмішеней та репродукції вірусу. При вивченні механізму антигрипозної дії препарата лектину проведені також дослідження по визначенню його антинейрамінідазної активності. Антинейрамінідазну активність лектину вивчали на прикладі ингібування нейрамінідази різних типів вірусів грипу та стандартного препарату нейрамінідази, виділеного з Astrobacter ureafaciens, в концентрації 103,0 та 51,5 g/мл/хв розчином лектину в концентрації 1мг/мл. Із них загинуло всього % 0 0 8 80 КЗ IE 1,25 100 20 Показано, що субстанція лектину в дозі 1мг/мл повністю ингібує 1/6 ферментні одиниці або 51,5 g/мл/хв нейрамінідази (Neuraminidase Astrobacter ureafaciens 1 unit Calbiochem, Hoest) та на 84,2 и 85,0% активність нейрамінідази вирусов гриппа А/Гонконг/68/Н3N2/, А/Віктория/75/Н3N2, А/Хабаровськ/H1N1/ на субстраті фетуїну. Враховуючи той факт, що фетуїн взаємодіє з субстанцією лектинів, і, таким чином, інактивує субстрат фе туїн у, механізм антинейрамінідазної активності при взаємодії препарату лектину з нейрамінідазами грипу і бактерій є неспецифічним. Встановлено, що інгібування репродукції вірусів грипу здійснюється за рахунок взаємодії нейрамінідази вірусів грипу з субстанцією лектинів, яку фермент використовує в якості субстрату (табл. 4). Інгібування нейрамінідазної активності вірусу грипу бактерійним лектином полягає у взаємодії нейрамінідази вірусу грипу з лектином в якості субстрату. 5 83578 6 Таблиця 4 Нейрамінідазна активність вірусу грипу Субстрат лектин фетуїн H3N2 0,850 0,790 ОГ (ОГ/549) при взаємодії з вірусами грипу H1N1 В 0,710 0,690 0,720 0,700 Таким чином, механізм дії бактерійного лектину здійснюється двома шляхами: за рахунок блокування поверхневих сіаловмісних глікопротеїнів вірусу грипу та інгібування його нейрамінідазної активності. Список літератури: 1. Галегов Г.А. Современное состояние и перспективы развития химиотерапии вирусных инфекций // ЖВХО им. Д.И. Менделеева, 1973. - Т. 18. № 2. - С. 200-207. 2. Злыдников Д.М., Романов Ю.А. Результаты химического изучения профилактической противогриппозной эффективности амантадина и ремантадина // Химиопрофилактика и химиотерапия гриппа. - Л. - 1972.-С. 71-76. 3. Индулен М.К. Химические ингибиторы вирусов и их механизм действия. - Изв. АН Латв.ССР, 1972. - № 9. - С. 82-87. 4. Подгорский B.C., Коваленко Э.А., Симоненко И.А. Лектины бактерий. - К: Наукова думка, 1992. - 2003с. 5. Смородинцев А.А. Итоги изучения профилактической эффективности амантадина и реман Комп’ютерна в ерстка В. Клюкін A. ureafaciens 0,910 0,950 тадина // Химиопрофилактика гриппа амантадином. - Л.-1971.-С.11-45. 6. Hayden F G., Treanor J.J., Fritz R.S. et al. Use of Oral Neuraminidase Inhibitor Oseltamivir in Experimental Human Influenza // JAMA. - 1999.-Vol 282.-N13. 7. Hayden F.G., Osterhaus A.D., Treanor J.J. et al. Efficacy and safety of the neur-aminidase inhibitor zanamivir in the treatment of influenzavirus infections // GG 167 Influenza Study Group // Engl J. Med., 1997. - 337(13). -P. 874-880. 8. Hedrick J.A., Barzilai A., Behre U. et al. Zanamivir for treatment of symptomatic influenza A and В infection in children five to twelve years of age: a randomized controlled trial // Pediatr. Infect. Dis. J. 2000. - 19(5). - P. 410-417. 9. Monto A.S., Fleming D.M., Henry D. et al. Efficacy and safety of the neuraminidase inhibitor zanamivir in the treatment of influenza A and В virus infections // J. Infect Dis. - 1999. - 180(2). - P. 254261. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601