Спосіб одержання рідкого пробіотика з аерококів

Спосіб одержання рідкого пробіотика з аерококів, що полягає в тім, що біомаса A.viridans для засіву у рідке живильне середовище накопичується у пробірках зі скошеним м'ясо-пептонним агаром (МПА) при 37°С протягом 24 годин, клітини аерококів змивають фізіологічним розчином і засівають у рідке живильне середовище, що виготовлено на основі бульйону грибів гливи звичайної з рівнем амінного азоту 150мг % та вмістом 1% глюкози, засів інкубують при 37°С протягом 16 годин, який відрізняється тим, що після вирощування до препарату додають 0,5-1,5% альгінату натрію. Винахід відноситься до мікробіології, а саме, до способу одержання рідких лікувальнопрофілактичних бактеріальних препаратів з мікроорганізмів. Метою винаходу є підвищення рівня збереження концентрації клітин аерококів при зберіганні препарату протягом 3-х місяців. Відомій спосіб одержання пробіотику з Aerococcus viridans 167, що включає вирощування виробничого штаму культури аерококів на живильному середовищі у пробірках з м'ясо-пептоновим агаром при температурі (36±1)°С, бактеріоскопічний та бактеріологічний контроль чистоти культури, розлив препарату у ємності, наступну ліофілізацію у вакуум-сушильних апаратах і герметизацію [1]. Згідно винаходу, вирощування культури вказаного штаму проводять в декілька етапів, причому на першому етапі вирощують першу генерацію культури протягом 18-48 годин, на другому етапі вирощують наступну генерацію маткової культури протягом 18-48 годин, а на третьому етапі генерацію маткової культури засівають в матраци з казеїновим агаром, який містить 10мг/мл глюкози, 2050мкг/мл грамуріну, 1-5мкг/мл етонію, і протягом 18-48 годин вирощують виробничу культур у, а по закінченні строку інкубації здійснюють змив мікробної маси в асептичних умовах додаванням водного розчину стабілізатора. На наступному етапі проводиться ліофілізація суспензії, що зменшує концентрацію клітин у препараті і дає неактивні клітини. Для їх активації необхідно додавати розчинник і витримувати певний час для відновлення життєдіяльності. У розчиненому вигляді клітини аерококів зберігаються тільки 24 години. Найбільш близьким рішенням (прототипом) до "Способу одержання рідкого пробіотику " Абактерину®", що заявляється, є " Технологія одержання рідкого пробіотику з аерококів" [2]. На відміну від сухого, головна перевага рідкого «А-бактерина» полягає в тім, що бактерії в ньому перебувають у біологічно активній формі. Свій корисний вплив вони роблять негайно - відразу після прийому препарату, що привабливо відрізняє його від аналогічних сухи х препаратів. Крім живих бактерій, рідкі пробіотики містять їх продукти життєдіяльності та корисні для організму людини біологічно активні речовини: незамінні амінокислоти, органічні кислоти, вітаміни, стимулятори імунітету та продукції інтерферону [3, 4]. (19) UA (11) 85272 (13) C2 (21) a200702466 (22) 06.03.2007 (24) 12.01.2009 (46) 12.01.2009, Бюл.№ 1, 2009 р. (72) КРЕМЕНЧУЦЬКИЙ ГЕННАДІЙ МИКОЛАЙОВИЧ, UA, РИЖЕНКО СЕРГІЙ АН АТОЛІЄВИЧ, UA (73) КРЕМЕНЧУЦЬКИЙ ГЕННАДІЙ МИКОЛАЙОВИЧ, UA, РИЖЕНКО СЕРГІЙ АН АТОЛІЄВИЧ, UA (56) UA 53270 A, 15.01.03. UA 53301 A, 15.01.03. Риженко С.А., Кременчуцький Г.М., Бредихіна М.О., Дикленко Т.В., Дробот О.В., Степанський Д.О., Хілько Л.В., Вальчук C.I., Юргель Л.Г., Кондратьєв А.Ю., Кошева І.П. Те хнологія одержання рідкого пробіотику з аерококів.- Annals of Mechnicov Institute.- 2006.- N 4.-C.23 - 28 UA 52151 A, 16.12.02. 3 85272 Конструювання живильного середовища, що враховує біохімічні аспекти метаболізму пробіотичного мікроорганізму A.viridans дозволило приступити до розробки технології виробництва рідкого пробіотику «А-бактерин». Об'єкт дослідження - популяція виробничого штаму A.viridans № 167, що вирощувалася в грибному живильному середовищі (грибний відвар гливи звичайної -Pleurotus ostreatus) [5]. У середовище додавався гідролізат рибного борошна до наявності в середовищі 150мг % амінного азоту. Для нейтралізації активних форм кисню, насамперед перекису водню, у середовище додавалися антиоксиданти - вітамін С и вітамін Е в концентрації 10мг на 1л середовища. Для зменшення конвекції кисню в середовище додавався агар-агар до 0,1%. Для накопичення біомаси A.viridans 167 застосовувалися рідкі живильні середовища різного складу, що виготовлені на основі бульйону грибів гливи звичайної: грибний бульйон; грибний бульйон з рівнем амінного азоту 150мг %; грибний бульйон з додаванням різних вуглеводів, амінокислот і вітамінів. У експерименті використані різні сполучення й концентрації (глюкоза, цистеїн солянокислий, цистин солянокислий, амонію хлорид, амонію нітрат, натрію сульфат, калій водень фосфат, калій водень діфосфат, магній сульфат, нікотинова кислота, пантотенат кальцію, інозит, аденін, натрію хлорид, аскорбінова кислота, вітамін Е, ембріональна теляча сироватка, глютамінова кислота, гліцин, натрію гідроселеніт, агар-агар). Біомасу A.viridans для засіву у рідке живильне середовище накопичували у пробірках зі скошеним м'ясо-пептонним агаром (МПА). Після чого проводили мікроскопічний і біохімічний контроль чистоти культури, що виросла на середовищі. Контроль рівня концентрації мікробних клітин здійснювали шляхом титрування куль 4 тури і висіву із рідкого живильного середовища на живильні середовища різного складу (МП А, ентерокок-агар, гонокок-агар, живильний агар з додаванням 1-3% дефібрінованої крові, середовище Блаурока). У результаті проведених досліджень була обрана основа живильного середовища, що є невід'ємною частиною рідкої форми пробіотику «Абактерин» наступної рецептури: грибний бульйон, амінний азот (NH2) - 150мг %, глюкоза - 1%, цистеїн солянокислий - 100мг/л. Основним недоліком прототипу є падіння концентрації клітин аерококів у процесі зберігання препарату протягом 3-х місяців до 105- 106КУО/мл, що недостатньо для його пробіотичної дії. В основу винаходу поставлено задачу створити спосіб одержання рідкого пробіотику з аерококів, при зберігання якого протягом 3-х місяців концентрація клітин аерококів не знижувалась менш ніж 108КУО/мл. Задача винаходу вирішується тим, що для одержання рідкого пробіотику з аерококів біомаса A.viridans для засіву у рідке живильне середовище накопичується у пробірках зі скошеним м'ясопептонним агаром (МПА) при 37°С на протязі 24 годин. Клітини аерококів змиваються фізіологічним розчином і засіваються у рідке живильне середовище наступного складу: - грибний бульйон з вмістом амінного азоту 150мг %, - глюкоза - 1%, Далі проводиться інкубація культури на протязі 16 годин при температурі 37°С, після чого у препарат додається альгінат натрію у концентрації 0,5 - 1,5%, після чого проводиться контроль концентрації клітин, рН розчину і розлив рідкого препарату у ємності. Концентрація клітин аерококів контролюється протягом 3-х місяців. Збереження концентрації аерококів наведено у таблиці. Таблиця Збереження концентрації клітин аерококів протягом 3-х місяців у препараті різного способу виготовлення А-бактерин, виготовлений № п/п різними способами 1 За прототипом За заявленим рішенням з 2 0,5% альгінату натрія За заявленим рішенням з 1 % 3 альгінату натрія За заявленим рішенням з 4 1,5% альгінату натрія Концентрація клітин аерококів у препараті при зберіганні протягом 3-х місяців (КУО/мл) 0 9 1,4·10 ±0,9·10 1 7 8 1,6·10 ±0,5·10 2 7 6 3 5 1,2·10 ±0,6·10 2,4·10 ±0,8·105 2,7·109±0,5·107 1,6·109±3,5·107 1,8·108±0,3·106 1,6·108±0,3·106 2,6·109±1,5·107 2,5·109±1,3·107 7,6·108±1,2·106 5,3·108±0,8·106 2,8·109±0,7·107 2,7·109±0,7·107 3,8·108±0,5·106 2,6·108±0,9·106 Вирішення поставленого завдання ілюструється наступними прикладами. 5 85272 Приклад 1 Біомаса A.viridans для засіву у рідке живильне середовище накопичується у пробірках зі скошеним м'ясо-пептонним агаром (МПА) при 37°С на протязі 24 годин. Клітини аерококів змиваються фізіологічним розчином і засіваються у рідке живильне середовище, що виготовлено на основі бульйону грибів гливи звичайної: грибний бульйон з рівнем амінного азоту 150мг % із вмістом 1% глюкози. Засів інкубується при 37°С на протязі 16 годин. Після вирощування до препарату додається 0,5% альгінату натрія і проводиться мікроскопічний і біохімічний контроль чистоти культури, що виросла на середовищі. Контроль рівня концентрації мікробних клітин здійснюється шляхом згідно стандартного методу висіву аерококів із рідкого живильного середовища на щільні живильні середовища різного складу (МЛА, ентерокок-агар) протягом 3-х місяців. У кінці зберігання протягом 3-х місяців концентрація клітин аерококів дорівнює 1,6·108±0,3·106 КУО/мл Приклад 2 Біомаса A.viridans для засіву у рідке живильне середовище накопичується у пробірках зі скошеним м'ясо-пептонним агаром (МЛА) при 37°С на протязі 24 годин. Клітини аерококів змиваються фізіологічним розчином і засіваються у рідке живильне середовище, що виготовлено на основі бульйону грибів гливи звичайної: грибний бульйон з рівнем амінного азоту 150мг % із вмістом 1% глюкози. Засів інкубується при 37°С на протязі 16 годин. Після вирощування до препарату додається 1% альгінату натрія і проводиться мікроскопічний і біохімічний контроль чистоти культури, що виросла на середовищі. Контроль рівня концентрації мікробних клітин здійснюється шляхом згідно стандартного методу висіву аерококів із рідкого живильного середовища на щільні живильні середовища різного складу (МЛА, ентерокок-агар) протягом 3-х місяців. У кінці зберігання протягом 3-х місяців концентрація клітин аерококів дорівнює 5,3·108±0,8·106KУO/мл. Приклад 3 Біомаса A.viridans для засіву у рідке живильне середовище накопичується у пробірках зі скоше Комп’ютерна в ерстка В. Клюкін 6 ним м'ясо-пептонним агаром (МЛА) при 37°С на протязі 24 годин. Клітини аерококів змиваються фізіологічним розчином і засіваються у рідке живильне середовище, що виготовлено на основі бульйону грибів гливи звичайної: грибний бульйон з рівнем амінного азоту 150мг % із вмістом 1% глюкози. Засів інкубується при 37°С на протязі 16 годин. Після вирощування до препарату додається 1,5% альгінату натрія і проводиться мікроскопічний і біохімічний контроль чистоти культури, що виросла на середовищі. Контроль рівня концентрації мікробних клітин здійснюється шляхом згідно стандартного методу висіву аерококів із рідкого живильного середовища на щільні живильні середовища різного складу (МЛА, ентерокок-агар) протягом 3-х місяців. У кінці зберігання протягом 3-х місяців концентрація клітин аерококів дорівнює 2,6·-108±0,9·106 КУО/мл. Література: 1. Пат. 53301, UA, Спосіб одержання пробіотику з аерококів / Г.М. Кременчуцький (Україна). № заявки 2002043334; Заявл. 10.05.2002. Опубл. 15.01.2003. Бюл. №l. -7c. 2. Риженко С.А., Кременчуцький Г.М., Бредихіна М.О., Дикленко Т.В., Дробот О.В., Степанський Д.О., Хілько Л.В., Вальчук C.I., Юргель Л.Г., Кондратьєв А.Ю., Кошева І.П. Те хнологія одержання рідкого пробіотику з аерококів.- Annals of Mechnicov Institute. - 2006. - N 4. - C.23-28 3. Конструирование питательных сред для производства препаратов - пробиотиков / Р.Х. Тимербаева, Т.А. Баталова // Актуальные вопросы разработки и производства диагностических питательных сред и тест-систем: матер. III Международ, науч.-практ. конфер. - Ма хачкала, 2001. - С. 20-21. 4. Tuomola E., Crittenden R., Playne M., Isolauri E, Salminen S. Quality assurance criteria for probiotic bacteria. // Am.J.Clіn.Nutr. - 2001. - Т. 73 - P.393398. 5. Пат. 53270, UA, Живильне середовище для виділення та ідентифікації мікроорганізмів / Г.М. Кременчуцький (Україна). № заявки 2002043159; Заявл. 15.01.2003. Опубл. 15.10.2004. Бюл. №10. 6с. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601