Спосіб одержання пробіотика “симбітер-м”

Винахід відноситься до біотехнології і може бути використаний у виробництві пробіотиків. Відомо спосіб одержання бактеріальної закваски «Симбітер», що передбачає спільне культивування в молоці біфідобактерій видів: В. bifidum і В. longum; оцтовокислих бактерій видів: A. aceti і А. pasteurianus; пропіоновокислих бактерій видів: P. freudenreichii і Р. acidipropionici з наступним поєднанням отриманого симбіозу в співвідношенні 1:3 зі сполученням оцтовокислих і молочнокислих бактерій видів: Acetobacter aceti, Lactococcus lactis, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus, L. helveticus, L. delbrueckii ssp. bulgaricus (Патент Російської Федерації №2088660, С12N1/20, А23С9/12, 1997). Недоліком способу є використання в його складі тільки двох видів біфідобактерій і трьох видів лактобацил. Найбільш близьким до способу, що заявляється, є спосіб одержання пробіотика «Симбітер-2», що передбачає спільне культивування в молочному середовищі багатокомпонентної асоціації біфідобактерій, лактобацил, лактококів, стрептококів, пропіоновокислих і оцтовокислих бактерій видів: Bifidobacterium bifidum, В. longum, В. infantis, В. breve, В. adolescentis, Lactococcus lactis, Streptococcus salivarius ssp. thermophilus, Lactobacillus acidophilus, L. casei, L. plantarum, L. gasseri, L. brevis, Propionibacterium freudenreichii, P. acidipropionici та Acetobacter aceti, при цьому попередньо одержаний консорціум молочнокислих стрептококів і лактобацил поєднують з консорціумом біфідобактерій, пропіоновокислих і оцтовокислих бактерій у співвідношенні 1:4 (Патент України №28040, А23С9/12, С12N1/20, 2000) - прототип. Пробіотик, одержаний відомим способом, пригнічує ріст широкого кола патогенних і умовно-патогенних мікроорганізмів, синтезує вітаміни та екзополісахариди, внаслідок чого виявляє високу пробіотичну активність. Однак у відомому способі не реалізована можливість підвищення активності пробіотика та його терміну зберігання за рахунок використання додаткових фізіологічне корисних штамів і спеціальних біотехнологічних прийомів. Завданням винаходу є створення способу одержання пробіотика "Симбітер-М", у якому шляхом уведення додаткових штамів лактобацил: Lactobacillus fermentum 7/lf та Lactobacillus salivarius Pr-13/s, а також змішування біомаси з протекторним середовищем, досягається підвищення активності пробіотика та збільшення терміну зберігання. Поставлене завдання вирішується тим, що в способі одержання пробіотика "Симбітер-М", що передбачає спільне культивування в молочному середовищі полівидового мультисимбіоза біфідобактерій видів: Bifidobacterium bifidum, В. longum, В. breve, В. infantis, В. adolescentis; лактобацил видів: Lactocobacillus acidophilus, L. casei, L. brevis, L. plantarum, L. gasseri; молочнокислих стрептококів видів: Lactococcus lactis і Streptococcus salivarius ssp. thermophilus; пропіоновокислих бактерій видів: Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii, P. acidipropionici та оцтовокислих бактерій виду Acetobacter aceti, нарощування біомаси, відповідно до винаходу до складу пробіотика додатково вводять штами лактобацил Lactobacillus fermentum 7/lf та Lactobacillus salivarius Pr-13/s, а отриману біомасу змішують у співвідношенні 2:1-1:1 із протекторним середовищем, при цьому як протекторне середовище використовують автолізовану клітинну масу симбіозу біфідобактерій, пропіоновокислих та оцтовокислих бактерій, до якої додають 0,02-0,03% солянокислого цистеїну. Спосіб передбачає використання в складі пробіотика додаткових штамів лактобацил Lactobacillus fermentum 7/lf та Lactobacillus salivarius Pr-13/s. Штами характеризуються здатністю синтезувати лізоцим, пригнічувати ріст широкого спектра патогенних і умовно-патогенних мікроорганізмів, характеризуються високою полісахаридсинтезуючою та адгезивною здатністю, активно ферментують вуглеводи з утворенням, як головного продукту бродіння, фізіологічно корисного L+-ізомеру молочної кислоти. Уведення штамів до складу пробіотика дозволяє підвищити його біотерапевтичну активність. Характеристика штамів приведена в таблиці 1. Пропонований спосіб передбачає також змішування біомаси, що отримана після культивування клітин полівидового мультисимбіозу в живильному середовищі, з автолізованою клітинною масою симбіозу біфідобактерій, пропіоновокислих та оцтовокислих бактерій. Як показали спеціально проведені дослідження, автолізат даних мікроорганізмів має високі протекторні властивості щодо біомаси полівидового мультисимбіозу, що є бактеріальною основою пробіотика. У присутності автолізата значно краще зберігається бактеріальний склад і активність пробіотика (табл.2). Крім того, введення до складу пробіотика автолізованої біомаси фізіологічно-корисних бактерій приводить до збагачення препарату фрагментами клітинних стінок, що є могутніми імуностимуляторами і біологічно-активними внутрішньоклітинними компонентами, що підвищують активність пробіотика. Уведення до складу автолізата 0,02-0,03% солянокислого цистеїна сприяє поліпшенню збереження активності пробіотичних клітин, особливо біфідобактерій, у процесі зберігання за рахунок зниження токсичної дії окислювачів. Зазначена концентрація цистеїну є найбільш оптимальною. Зниження концентрації нижче 0,02% недоцільно, оскільки не забезпечує достатню антиоксидантну активність, а збільшення концентрації понад 0,03% не приводить до підвищення антиоксидантної дії, але може виявляти токсичність стосовно окремих бактерій пробіотика. Одержану при нарощуванні клітин багатовидового симбіозу в живильному середовищі пробіотичну біомасу змішують із протекторним середовищем у співвідношенні 1:1-2:1. Дане співвідношення забезпечує максимальний захисний ефект. Зменшення кількості протекторного середовища супроводжується зниженням захисної функції, а збільшення - приводить до зайвого розведення пробіотика і зниження концентрації клітин без помітного збільшення терміну зберігання. Пробіотик "Симбітер-М" одержують у формі бактеріального препарату або бактеріального концентрату. Спосіб здійснюють таким чином. Для одержання пробіотика у формі бактеріального препарату в стерильне знежирене молоко, що містить 810% сухих речовин і 1% лимоннокислого натрію тризаміщеного, вносять 3-5% інокулята мульти-симбіозу біфідобактерій, лактобацил, молочнокислих стрептококів, пропіоновокислих і оцтовокислих бактерій. Інокульоване середовище витримують при температурі 35-37°С протягом 14-18 годин. Отриману біомасу змішують у співвідношенні 1:1-2:1 із протекторним середовищем. Для одержання пробіотика у формі бактеріального концентрату в стерильне знежирене молоко, що містить 35% сухих речовин і 2% лимоннокислого натрію тризаміщеного, вносять 3-5% інокулята симбіозу біфідобактерій, лактобацил, молочнокислих стрептококів, пропіоновокислих і оцтовокислих бактерій. Інокульоване середовище витримують при температурі 35-37°С протягом 16-20 годин при періодичному або безперервному розкисленні до рН 6,6-6,8. Накопичену біомасу клітин відокремлюють від середовища культивування і змішують у співвідношенні 1:1-2:1 із протекторним середовищем. Для приготування протекторного середовища симбіоз біфідобактерій, пропіоновокислих і оцтовокислих бактерій вносять у стерильне знежирене молоко, що містить 10% сухих речовин. Інокульоване середовище витримують при температурі 35-37°С протягом 16-18 годин до одержання концентрації клітин (5-10)x108/cмз. У культуральному середовищі встановлюють рН 8,0-8,5 і витримують при температурі 40-45 °С протягом 24-36 годин при періодичному перемішуванні і підтримці рН на одному рівні. За таких умов автолізові піддається 70-80 % бактеріальних клітин. В автолізовану біомасу додають 0,02-0,03% солянокислого цистеїнe у вигляді стерильного водного розчину. Винахід пояснюється прикладами. Приклад 1. Одержання пробіотика "Симбітер-М" у формі бактеріального препарату. Спочатку готують багатовидовий симбіоз біфідобактерій, лактобацил, молочнокислих стрептококів, пропіоновокислих і оцтовокислих бактерій. Для цього відібрані за необхідними властивостями штами, здатні формувати стабільні багатоштамові симбіози, культивують у стерильному знежиреному молоці при температурі 35°С протягом 16 годин. Штами, що використовуються, та їх кількість в % приведені нижче. Lactobacillus acidophilus ВКПМ В-2846 0,1 Lactobacillus acidophilus B-5863 0,1 Lactobacillus casei ВКПМ В-5724 0,1 Lactobacillus casei ВКПМ B-3960 0,1 Lactobacillus casei ВКПМ В-4542 0,1 Lactobacillus plantarum ВКПМ В-6496 0,1 Lactobacillus gasseri BKM-846 0,1 Lactobacillus fermentum 7/1f 0,2 Lactobacillus salivarius Pr-13/s 0,2 Lactobacillus brevis BKM 1309 0,2 Lactococcus lactis ВКПМ В-3961 0,1 Streptococcus salivarius ssp. thermophilus ВКПМ В-2406 0,1 Streptococcus salivarius ssp. thermophilus ВКПМ В-5388 0,1 Bifidobacterium bifidum ВКПМ В-5795 0,2 Bifidobacterium bifidum ВКПМВ-5799 0,1 Bifidobacterium longum ВКПМ В-4557 0,1 Bifidobacterium longum ВКПМ В-4635 0,1 Bifidobacterium breve в/в-34 0,2 Bifidobacterium adolescentis 146/ав 0,1 Bifidobacterium infantis 14/56 0,2 Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii ВКПМ В-4545 0,1 Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii ВКПМ В-4544 0,1 Propionibacterium acidipropionici ВКПМВ5800 0,2 Acetobacter aceti ВКПМ B-2021 0,1 Потім здійснюють ще три пересівання в стерильне знежирене молоко з періодичністю 2 доби. Для приготування інокулята в 3л середовища, яким є стерильне знежирене молоко, що містить 10% сухих речовин і 2% лимоннокислого натрію тризаміщеного, вносять 100мл багатоштамового пробіотичного симбіозу. Суміш витримують 15 годин при температурі 35°С, після чого додають у 100л стерильного знежиреного молока, що містить 8% сухих речовин і 2% лимоннокислого натрію тризаміщеного. Інокульоване середовище витримують при температурі 35°С протягом 18 годин. Отриману біомасу змішують у співвідношенні 2:1 із протекторним середовищем, що готують у такий спосіб. Симбіоз, що складається зі штамів біфідобактерій, пропіоновокислих і оцтовокислих бактерій, які входять до складу інокулята, вносять у стерильне знежирене молоко, що містить 10% сухих речовин. Інокульоване середовище витримують при температурі 35°С протягом 18 годин до одержання концентрації клітин 7х108/см3. У культуральному середовищі встановлюють рН 8,5 і витримують при температурі 40°С протягом 36 годин при періодичному перемішуванні та підтримці рН на одному рівні. У готове середовище вносять у вигляді стерильного розчину 0,03% цистеїнe солянокислого. Характеристика готового пробіотика приведена в табл.3. Приклад 2. Одержання пробіотика "Симбітер-М" у формі бактеріального концентрату. У 500л стерильного знежиреного молока, що містить 3% сухих речовин і 2% лимоннокислого натрію три заміщеного, вносять 25л інокулята симбіозу біфідобактерій, лактобацил, молочнокислих стрептококів, пропіоновокислих і оцтовокислих бактерій, приготовленого відповідно до приклада 1. Інокульоване середовище витримують при температурі 37°С протягом 20 годин при періодичному або безперервному розкисленні до рН 6,8. Накопичену біомасу клітин відокремлюють від середовища культивування і змішують у співвідношенні 1:1 із протекторним середовищем. Для приготування протекторного середовища симбіоз штамів біфідобактерій, пропіоновокислих і оцтовокислих бактерій, що входять до складу інокулята, вносять у 10%-е стерильне знежирене молоко і витримують при температурі 37°С протягом 16 годин до одержання концентрації клітин 5х108/см. У культуральному середовищі встановлюють рН 8,0 і витримують при температурі 45°С протягом 24 годин при періодичному перемішуванні і підтримці рН на одному рівні. У готове середовище вносять у вигляді стерильного розчину 0,02% цистеїнe солянокислого. Характеристика готового пробіотика приведена в табл.3. Використання пропонованого способу дозволяє одержувати багатовидові пробіотики, що відрізняються високою концентрацією живих клітин найбільш фізіологічних для організму людини мікроорганізмів, широким спектром лікувально-профілактичних властивостей, високою біотерапевтичною ефективністю і збільшеним терміном зберігання. Таблиця 1 Характеристика штамів лактобацил, що додатково використовуються у складі пробіотика Показники Антагоністична активність (зона інгібування росту тест-культури), мм: Escherichia coli Staphylococcus aureus Shigella flexneri Proteus vulgaris Proteus mirabilis Pseudomonas aeruginosa Campylobacter jejuni Enterobacter cloaceae Candida albicans Citrobacter ssp. Salmonella typhimurium Klebsiella pneumoniae Лізоцим синтезуюча здатність (зона лізису клітин тест-культури Micrococcus luteus), мм Індекс адгезивності Синтез полісахаридів, % Концентрація клітин у 16- годинній культурі в молоці, lg КУО/см3 L. fermentum 7/1f L. salivarius Pr-13/s 5,2±0,26 5,8±0,27 4,9±0,36 5,0±0,10 4,5±0,42 5,7±0,П 4,8±0,09 3,9±0,35 5,1±0,27 4,7±0,20 6,6±0,37 5,2±0,32 4,8±0,31 5,5±0,40 5,0±0,17 3,9±0,24 4,2±0,13 5,5±0,24 5,1±0,31 5,7±0,22 5,3±0,18 5,4±0,08 4,8±0,16 5,1±0,16 10,4±0,96 6,6±0,21 1,8±0,12 10,8±1,05 7,2±0,33 1,1±0,08 8,9±0,18 8,3±0,23 Таблиця 2 Вплив протекторного середовища на термін зберігання пробіотика Пробіотик у формі бакпрепарата Показники без протектора Збереження властивостей після двохмісячного зберігання, %: антагоністична активність адгезивні властивості синтез полісахаридів лізоцим синтезуюча активність концентрація активних клітин з протектором 60,6±3,95 71,3±4,11 54,5±2,76 62,9±2,44 51,3±4,77 Пробіотик у формі бакконцентрата без протектора з протектором 84,8±4,05 97,1±2,32 85,0±4,17 77,5±3,15 88,6±3,05 53,9±1,38 68,2±5,21 60,4±1,55 51,7±1,90 54,5±5,18 92,2±2,44 95,0±3,98 91,1±5,1б 90,4±2,68 92,8±3,22 Таблиця 3 Порівняльна характеристика пробіотиків, що одержані відомим і пропонованим способами Показники Концентрація живих бактеріальних клітин, lg КУО/см3 Антагоністична активність відносно патогенних і умовно-патогенних мікробів (зона пригнічення росту тест-культури), мм: Е. соli S. aureus P. mirabilis Бакпрепарат Прототип Приклад 1 Бакконцентрат Прототип Приклад 2 9,0±0,12 9,5±0,31 12,2±0,18 12,7±0,24 5,6±0,47 5,0±0,34 4,8±0,15 6,0±0,33 6,6±0,21 7,1±0,96 5,5±0,27 5,3±0,32 5,2±0,50 6,4±0,15 7,0±0,24 7,3±0,33 P. vulgaris P. aerugmosa S. typhimurium S.flexneri S.sonnet K. pneumoniae Y. enterocolitica C. cloaceae C. albicans Індекс адгезії Синтез полісахаридів, % Лізоцим синтезуюча здатність (зона лізису клітин тест-культури), мм Термін зберігання без зміни складу та властивостей, міс. 3,6±0,37 6,6±0,12 4,3±0,91 5,5±0,35 4,7±0,23 5,0±0,19 4,6±0,34 5,2±0,18 5,5±0,30 0,9±0,31 2,0±0,22 5,1±0,26 6,5±0,40 б,8±0,34 6,4±0,21 5,9±0,2б 6,8±0,10 б,0±0,45 6,7±0,28 7,8±0,39 8,2±0,40 2,5±0,24 4,8±0,37 7,0±0,36 4,9±0,28 5,б±0,54 4,8±0,17 5,2±0,34 4,9±0,36 5,4±0,20 5,7±0,11 0,9±0,51 2,0±0.18 6,5±0,17 7,2±0,25 7,1±0,19 6,8±0,20 6,2±0,33 6,6±0,28 6,1±0,15 7,3±0,36 7,7±0,41 8,4±0,33 2,6±0,21 4,4±0,20 6,7±0,26 4,5±0,23 7,8±0,16 2,2±0,2 3,0±0,1 2,4±0,1 3,2±0,2