Спосіб одержання пробіотика

Винахід відноситься до біотехнології і може бути використаний у виробництві пробіотиків. В даний час спостерігається розширення асортименту пробіотиків, що містять крім біомаси клітин фізіологічної мікрофлори добавки зернових продуктів, що підсилюють пробіотичну дію препарату. Відомий спосіб одержання харчової добавки, передбачає приготування суміші пшеничних висівок, моркви та капусти, гомогенізацію, пастеризацію і ферментацію підготовленої суміші культурами видів: Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium adolescentis, Propionibacterium shermanii, Lactobacillus plantarum, що вводять окремо або в суміші в рівних кількостях (Патент Російської Федерації № 2136175, А 23 L 1/105, 1/212, 1999). Недоліком способу є низька концентрація клітин фізіологічно корисної мікрофлори в продукті, низький термін зберігання і можливість використання тільки як добавки до готових продуктів харчування. Відомо також спосіб одержання сухого вуглеводного продукту лікувально-профілактичної дії "Лактовіт", що передбачає змішування сахарози, глюкози і бактеріального концентрату, що містить ацидофільну паличку, лактококи та ентерококи, з ячмінно-солодовим екстрактом (патент України № 22774, А 61 К 35/66, А 61 К 47/26, 1998). Недоліком способу є введення до складу препарату ентерококів, що є умовно-патогенними мікроорганізмами, здатними викликати широкий спектр інфекційних ускладнень в організмі людей, особливо у дітей і осіб з імунодефіцитами. Найбільш близьким до способу, що заявляється, є спосіб одержання харчового продукту, що передбачає приготування ячмінного борошна, його ферментативний гідроліз, одержання водного екстракту, стерилізацію, охолодження екстракту ячмінного борошна і заквашування його спочатку культурою біфідобактерій виду В. adolescentis, або В. bifidum, або В. longum, культивування їх протягом 3-6 годин, а потім внесення закваски лактобацил виду Lactobacillus acidophilus і додаткове культивування протягом 1821 годин (Патент України № 26871, А 23 L 1/105, A 61 К 35/74, 1999) - прототип. Недоліком способу є трудомісткість і тривалість процесу готування середовища культивування; низька пробіотична ефективність продукту внаслідок обмеження бактеріального складу препарату одним видом лактобацил і одним видом біфідобактерій. Завданням винаходу є створення способу одержання пробіотика з використанням у складі середовища культивування екстракту зернової культури, у якому шляхом використання як зернової культури суспензії зародків пшениці, а як закваскової культури багатоштамового симбіозу біфідобактерій, лактобацил, лактококів, стрептококів, пропіоновокислих та оцтовокислих бактерій, забезпечується розширення видового складу, підвищення концентрації клітин і активності пробіотичної мікрофлори. У способі одержання пробіотика, що передбачає спільне культивування в середовищі, що містить екстракт зернової культури, лактобацил виду L. acidophilus і біфідобактерій видів В. bifidum, В. longum, В. adolescentis, відповідно до винаходу як екстракт зернової культури використовують суспензію зародків пшениці, а до складу пробіотика додатково вводяться лактобацили видів: L. casei, L. plantarum, L. fermentum, L. brevis, біфідобактерії видів: В. infantis, В. breve, лактококи виду L. lactis, стрептококи виду S. salivarius ssp. thermophilus, пропіоновокислі бактерії виду P. freudenreichii ssp. shermanii та оцтовокислі бактерії виду A. aceti, причому всі мікроорганізми вводяться одночасно у вигляді багатоштамового симбіозу, а суспензію зародків пшениці готують на воді або на знежиреному молоці. Пропонований спосіб передбачає введення до складу пробіотика суспензії зародків пшениці, приготовленої на воді або знежиреному молоці. Введення зародків пшениці до складу пробіотика дозволяє поліпшити умови для розвитку клітин пробіотичної мікрофлори за рахунок збагачення середовища рістстимулюючими і захисними факторами при одночасному доповненні складу препарату фізіологічно корисними компонентами. Завдяки вмісту у використовуваній харчовій добавці до 30% рослинного білка, а також вуглеводів, поліненасичених жирних кислот, незамінних амінокислот, мінеральних компонентів і антиоксидантів, зародки пшениці виявилися могутнім стимулятором росту популяцій та кислотосинтезуючої активності сахаролітичних анаеробних бактерій. При цьому пробіотичні бактерії всіх досліджуваних родів (Bifidobacterium, Lactobacillus, Lactococcus, Propionibacterium) в однаковому ступені активізуються зародками пшениці (табл. 1). Спеціально проведені дослідження установили, що оптимальна концентрація зародків пшениці при приготуванні їхньої суспензії на основі знежиреного молока складає 3%, а на основі води - 15%. Подальше збільшення концентрації не приводить до помітних змін концентрації клітин і кислотоутворюючої активності пробіотичної флори. Зменшення ж концентрації зародків пшениці приводить до зниження біомаси клітин і її біологічної активності. Відповідно до запропонованого способу до складу пробіотика додатково вводять лактобацили видів: L. casei, L. plantarum, L. fermentum, L. brevis, біфідобактерії видів: В. infantis, В. breve, лактококи виду L. lactis, стрептококи виду S. salivarius ssp. thermophilus, пропіоновокислі бактерії виду P. freudenreichii ssp. shermanii та оцтовокислі бактерії виду A. aceti, причому усі використовувані в складі пробіотика мікроорганізми вводяться одночасно у вигляді багатоштамового симбіозу. Використання додаткових видів пробіотичної мікрофлори сприяє розширенню спектра пробіотичних властивостей препарату. Проведені дослідження показали, що сполучення біфідобактерій видів В. bifidum, В. longum, В. adolescentis, В. infantis і В. breve значно перевершує монокультури цих мікроорганізмів по активності розвитку, чисельності клітинних популяцій, кислотоутворюючій і антагоністичній активності. Ці властивості ще більше підсилюються в присутності пропіоновокислих та оцтовокислих бактерій. Крім того, пропіоновокислі й оцтовокислі бактерії збагачують пробіотик вітамінами. Уведення до складу пробіотика додаткових видів лактобацил сприяє підвищенню його антагоністичної, адгезивної та полісахаридсинтезуючої здатності. Використання всіх мікроорганізмів у вигляді єдиного багатоштамового симбіозу сприяє більш активному розмноженню клітинних популяцій при збереженні співвідношення між окремими штамами і збільшенню біологічної активності пробіотика. Спосіб здійснюють таким чином. Харчову добавку "Зародки пшениці" подрібнюють і суспендують у воді або знежиреному молоці, витримують 1-2 години для набрякання. Отриману суспензію стерилізують при температурі 121°С протягом 10-15 хвилин, охолоджують до температури 36-38°С та інокулюють 3-5% попередньо отриманого багатоштамового симбіозу лактобацил, лактококів, біфідобактерій, стрептококів, пропіоновокислих та оцтовокислих бактерій. Суміш суспензії та інокулята перемішують і витримують при температурі 34-36°С протягом 10-12 годин. Винахід пояснюється прикладами. Приклад 1. Одержання пробіотика на основі водної суспензії зародків пшениці. 15 кг сухої харчової добавки "Зародки пшениці" суспендують у 10 л води, залишають при кімнатній температурі на 2 години для набрякання, потім доводять об’єм водою до 100 л. Приготовлену суспензію стерилізують при температурі 121°С протягом 10 хвилин і охолоджують до температури 36°С. У підготовлене середовище вносять 5кг інокулята, приготовленого на основі симбіозу пробіотичних мікроорганізмів. Для одержання симбіозу в стерильне знежирене молоко вносять культури наступних штамів у кількостях, %: Lactobacillus acidophilus ЦКПМ У-2846 0,3 Lactobacillus casei ВКПМ У-4542 0,2 Lactobacillus casei ВКПМ У-3960 0,2 Lactobacillus plantarum ВКПМ У-5494 0,3 Lactobacillus fermentum ВКПМ У-5798 0,4 Lactobacillus brevis BKM 1309 0,4 Lactococcus lactis ВКПМ У-3393 0,2 Lactococcus lactis ВКПМ У-3961 0,1 Streptococcus salivarius ssp. thermophilus ВКПМ У-5388 0,3 Bifidobacterium bifidum ВКПМ У-5795 0,2 Bifidobacterium bifidum ВКПМУ-5799 0,2 Bifidobacterium longum ВКПМ У-4635 0,4 Bifidobacterium breve в/в-21 0,5 Bifidobacterium adolescentis BA 18 0,2 Bifidobacterium infantis Вин-47 0,4 Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii ВКПМ У-4544 0,5 Acetobacter aceti ЦМП М У-33 74 0,2 Інокульоване молоко витримують при температурі 34°С протягом 15 годин, потім здійснюють ще 3 пересівання в молоко з періодичністю 2 доби. Для приготування інокуляту в 5л стерильної 15%-ї водної суспензії зародків пшениці вносять 0,25л багатоштамового симбіозу. Суміш перемішують і ви тримують при температурі 34°С протягом 12 годин. Отриманий інокулят змішують з основною масою приготовленого середовища культивування і культивують при температурі 34°С протягом 10 годин. У готовому пробіотику міститься 3,7х1010 живих клітин біфідобактерій, 2,5х1010 - лактобацил, 1,1х109 - лактококів, 1,0х109 - стрептококів, 2,0х1011 пропіоновокислих бактерій і 4,8х105 - оцтовокислих бактерій (табл. 2). Приклад 2. Одержання пробіотика на основі суспензії зародків пшениці в знежиреному молоці. 6 кг сухої харчової добавки "Зародки пшениці" суспендують у 20 л знежиреного молока, залишають при кімнатній температурі на 1 годину для набрякання, потім доводять об’єм знежиреним молоком до 200л. Приготовлену суспензію стерилізують при температурі 121°С протягом 15 хвилин і охолоджують до температури 38°С. У підготовлене середовище вносять 3 кг інокуляту, приготовленого на основі симбіозу пробіотичних мікроорганізмів. Для одержання симбіозу в стерильне знежирене молоко вносять культури наступних штамів у кількостях, %: Lactobacillus acidophilus ВКПМ У-5388 0,2 Lactobacillus casei ВКПМ У-5724 0,2 Lactobacillus plantarum ВКПМ У-6496 0,2 Lactobacillus plantarum ВКПМ У-5494 0,1 Lactobacillus fermentum ВКПМ У-5798 0,3 Lactobacillus brevis BKM 1309 0,2 Lactococcus lactis ВКПМ У-3961 0,1 Streptococcus salivarius ssp. thermophilus ВКПМ У-2406 0,1 Streptococcus salivarius ssp. thermophilus ВКПМ У-5388 0,1 Bifidobacterium bifidum ВКПМ У-5798 0,2 Bifidobacterium bifidum ВКПМУ-5799 0,1 Bifidobacterium longum ВКПМ У-4557 0,3 Bifidobacterium breve в/в-34 0,2 Bifidobacterium adolescentis 146/ав 0,1 Bifidobacterium infantis 14/56 0,2 Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii ВКПМ У-4545 0,3 Acetobacter aceti ВКПМ У-2021 0,1 Інокульоване молоко витримують при температурі 36°С протягом 14 годин, потім здійснюють ще 3 пересівання в молоко з періодичністю 2 доби. Для приготування інокулята в 6л стерильного знежиреного молока вносять 0,2л багатоштамового симбіозу. Суміш перемішують і витримують при температурі 36°С протягом 14 годин. Отриманий інокулят змішують з основною масою стерильного знежиреного молока і культивують при температурі 36°С протягом 12 годин. У готовому пробіотику міститься 4,4х1010 живих клітин біфідобактерій; 3,0х1010 - лактобацил; 1,4Х109 - лактококів; 1,5х109 - стрептококів; 2,4х1011 - пропіоновокислих бактерій і 2,7х105 - оцтовокислих бактерій (табл. 2). Пропонований спосіб дозволяє одержати пробіотик, що відрізняється від відомих більш широким складом фізіологічно корисних мікроорганізмів, збільшеною концентрацією біологічно активних клітин і підвищеною пробіотичною активністю. Таблиця 1. Вплив різних кількостей харчової добавки "Зародки пшениці" на концентрацію клітин та кислотоутворюючу здатність у молоці молочнокислих та пропіоновокислих бактерій. Концентрація Показники Lactobacillus Lactococcus Bifidobacterium Propionibacterium зародків пшениці, % 0 8,2±0,47 7,8±0,50 6,5±0,55 6,9±0,70 Концентрація 0,5 8,5±0,34 8,6±0,81 7,7±0,39 8,4±0,59 клітин після 121,0 8,9±0,56 9,0±0,66 8,9±0,48 9,4±0,46 годинного 2,0 9,3±0,88 9,8±0,54 9,2±0,64 9,8±0,51 культивування, 3 3,0 10,1±1,01 9,7±0,73 9,9±0,58 10,6±0,79 lgKУO/см 5,0 10,0±0,84 10,2±0,80 9,9±0,67 10,7±0,80 0 78±1,25 66±0,55 48±0,44 59±0,51 0,5 85±2,33 75±1,40 63±0,37 72±0,48 Кислотність 1,0 91±0,88 86±2,15 79±0,50 96±0,64 ферментованого 2.0 119±1,58 100±3,04 92±0,61 103±0,80 молока, °Т 3,0 161±2,12 120±3,45 104±0,54 158±1,22 5,0 160±3,10 120±3,88 105±1,10 160±2,35 Таблиця 2. Властивості пробіотиків, приготовлених на молоці та в середовищах, що містять зародки пшениці. Характеристика мультисимбіоза Показники 15 %-на водна суспензія Молоко з додаванням 3 Молоко зародків пшениці % зародків пшениці Концентрація клітин, lgKУO/см 3: Bifidobacterium 8,8±0,23 9,7±0,66 9,9±0,34 Lactobacillus 8,1±0,30 9,4±0,26 9,3±0,41 Lactococcus 7,9±0,41 8,5±0,40 8,6±0,47 Propionibacterium 9,0±0,29 10,3±0,29 10,4±0,28 Синтез полісахаридів, % 2,01±0,33 2,56±0,52 2,76±0,38 Синтез органічних кислот, %: молочна 0,75±0,12 1,06±0,19 1,02±0,23 оцтова 0,49±0,08 0,73±0,11 0,78±0,15 пропіонова 0,32±0,04 0,66±0,15 0,64±0,10 Накопичення біомаси клітин симбіоза, 9,6±0,88 12,6±0,77 12,8±1,05 г/л Тривалість життя популяції при 20,6±1,78 79,8±3,08 88,5±2,13 оптимальній температурі росту, діб Streptococcus salivarius ssp. thermophilus ВКПМ У-5388 0,1 Bifidobacterium bifidum ВКПМ У-5798 0,2 Bifidobacterium bifidum ВКПМ У-5799 0,1 Bifidobacterium longum ВКПМ У-4557 0,3 Bifidobacterium breve в/в-34 0,2 Bifidobacterium adolescentis 146/ав 0,1 Bifidobacterium infantis 14/56 0,2 Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii ВКПМ У-4545 0,3 Acetobacter aceti ВКПМ У-2021 0,1 Інокульоване молоко витримують при температурі 36°С протягом 14 годин, потім здшснюють ще 3 пересівання в молоко з періодичністю 2 доби. Для приготування інокулята в 6л стерильного знежиреного молока вносять 0,2л багатоштамового симбіозу. Суміш перемішують i витримують при температурі 36°С протягом 14 годин. Отриманий інокулят змішують з основною масою стерильного знежиреного молока i культивують при температурі 36°С протягом 12 годин. У готовому пробіотику міститься 4,4x1010 живих клітин біфідобактерій; 3,0х1010 - лактобацил; 154Х109 - лактококів; 1,5х109 - стрептококів; 2,4х1011 - пропіоновокислих бактерій i 2,7x105 - оцтовокислих бактерій (табл.2). Пропонований спосіб дозволяє одержати пробіотик, що відрізняється від відомих більш широким складом фізіологічно корисних мікроорганізмів, збільшеною концентрацією біологічно активних клітин i підвищеною пробіотичною активністю.