Спосіб одержання пробіотика “апібакт”

1 Спосіб одержання пробютика, що передбачає спільне культивування в молочному середовищі багатокомпонентної бактеріальної культури, яка включає біфідобактерм видів В ifi do bacterium bifidum, Bifidobactenum longum, Bifidobactenum mfantis, Bifidobactenum breve, Bifidobactenum adolescentis, молочнокислі стрептококи видів Lactococcus lactis ssp cremons і Streptococcus sahvanus ssp thermophilus, лактобацили видів Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus gassen, Lactobacillus brevis, пропюновокислі бактерії виду Propionibactenum freudenreichii ssp shermann і оцтовокислі бактерії виду Acetobacter aceti, нарощування біомаси і відокремлення її від середовища культивування, Винахід відноситься до біотехнологм і може бути використаний у виробництві бактеріальних препаратів із пробютичними властивостями В останні роки значно розширився асортимент бактеріальних препаратів, які містять ЖИТТЄДІЯЛЬНІ ляє сконцентрувати в ньому широкий спектр пробютичних властивостей Відомий також спосіб одержання засобу, що має антибактеріальну активність, передбачає змішування живої культури ацидофільних лактобактерій з концентрацією клітин 107 - 108 / 0,1г із комплексом сироваткових імуноглобулінів G, М, А В результаті використання спеціально підібраних антагоністично активних штамів Lactobacillus acidophilus і включення до складу препарату імунних білків засіб відрізняється підвищеною антагоністичною активністю у відношенні до патогенних і умовно-патогенних мікроорганізмів (Авт св СРСР № 1779377, А 61 К 35/74, 39/395,1992) Недоліком засобу є використання тільки одного виду пробютичних мікроорганізмів і низька концентрація в препараті живих клітин, що звужує спектр його лікувально-профілактичної ефективності Найбільш близьким до способу, що заявляється, є спосіб одержання пробютика "Симбітер-2", що передбачає спільне культивування в молочному середовищі біфідобактерій видів Bifidobactenum bifidum, В longum, В infants, В breve, В adolescentis, оцтовокислих бактерій виду Acetobacter aceti, пропюновокислих бактерій видів Ргорюпі КИШКОВІ мікроорганізми і використовуються для профілактики і лікування дисбютичних порушень травного тракту Найбільш широко в складі пробютичних препаратів використовують живі клітини біфідобактерій і лактобацил, що є найбільш цінними представниками нормальної мікрофлори кишечнику людини З метою підвищення біологічної активності пробютиків у їхній склад включають речовини, що посилюють лікувально-профілактичну дію бактеріальних препаратів Відомо спосіб одержання препарату молочнокислих культур, що передбачає збагачення біомаси клітин консорціуму молочнокислих бактерій виду Lactobacillus acidophilus полісахаридом кефірних грибків (Патент Роси № 2001580, А 23 С 9/12, C 1 2 N 1/20,1993) Включення до складу бактеріального препарату мікробного полісахариду сприяє збільшенню біологічної активності, проте, обмеження складу препарату одним видом мікроорганізмів не дозво який відрізняється тим, що до складу пробютика додатково вводять лізоцим синтезуючий штам лактобацил Lactobacillus fermentum ВКПМ В-5798 і прополіс у КІЛЬКОСТІ 0,5-2,5 % 2 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що прополіс вводять у вигляді спиртового екстракту або прополісового молока CO о> Ю Ю 55913 bacterium freudenreichu, Pr acidipropiomci, молочнокислих бактерій видів Lactococcus lactis ssp lactis, L lactis ssp cremons, L lactis ssp lactis biovar diacetylactis, Streptococcus sahvanus ssp thermophilus, Lactobacillus acidophilus, Lb casei, Lb plantarum, Lb gassen, Lb brevis, при цьому попередньо одержаний консорціум молочнокислих бактерій з'єднують з консорціумом біфідобактерій, пропюновокислих і оцтовокислих бактерій у співвідношенні 1 4, нарощування біомаси і відокремлення її від середовища культивування (Патент України № 28040, А 23 С 9/12, С 12 N 1/20, 2000 р — прототип) Пробютик, одержаний відомим способом, має антагоністичну активність по відношенню до широкого кола патогенних і умовно-патогенних мікроорганізмів, збагачений вітамінами і мікробними полісахаридами, що обумовлює широкий спектр його пробютичних активностей Проте, у відомому способі не використана можливість підвищення лікувально-профілактичної ефективності пробіотика за рахунок додаткового введення до його складу біологічно активних інгредієнтів Завданням винаходу є створення способу одержання пробіотика "Апібакт", в якому шляхом введення додаткового штаму лактобацил виду Lactobacillus fermentum і прополісу забезпечується підвищення антагоністичної активності проти патогенних і умовно-патогенних мікроорганізмів, адгезивної і полісахаридсинтезуючої здатності пробіотика, а також збільшення його терміну зберігання В запропонованому способі одержання пробіотика "Апібакт", що передбачає спільне культивування в молочному середовищі багатокомпонентної бактеріальної культури, яка включає біфідобактерм видів Bifidobactenum bifidum, Bifidobactenum longum, Bifidobactenum infants, Bifidobactenum breve, Bifidobactenum adolescentis, молочнокислі стрептококи видів Lactococcus lactis ssp cremons і Streptococcus sahvanus ssp thermophilus, лактобацили видів Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus gassed, Lactobacillus brevis, пропюновокислі бактерії виду Propiombactenum freudenreichn ssp shermami і оцтовокислі бактерії виду Acetobacter aceti, нарощування біомаси і відокремлення її від середовища культивування, згідно з винаходом до складу пробіотика додатково вводять лізоцимсинтезуючий штам лактобацил Lactobacillus fermentum ВКПМ В-5798 і прополіс Штами біфідобактерій, лактобацил, лактококів, пропюновокислих і оцтовокислих бактерій, що використовуються у складі пробіотика, характеризу ються широким набором пробютичних властивостей і виявляють синергізм у присутності прополісу Запропонований спосіб передбачає введення до складу пробіотика прополісу в КІЛЬКОСТІ ВІД 0,5% до 2,5% у вигляді спиртового екстракту або прополісового молока Прополіс широко використовується в медицині як антисептик біологічної природи, що має антибактеріальну, антивірусну й антигрибкову активності У зв'язку з цим його застосовують у лікуванні різноманітних інфекційних захворювань Введення прополісу до складу пробіотика, що заявляється, дозволяє підвищити його лікувальнопрофілактичні властивості, зокрема антагоністичну дію на патогенні й умовно-патогенні мікроорганізми Крім того, спеціальними дослідженнями встановлено, що введення прополісу сприяє підвищенню адгезивної і полісахаридсинтезуючої здатностей пробіотика Прополіс вводиться до складу препарату в КІЛЬКОСТІ ВІД 0,5% до 2,5% у вигляді спиртового екстракту або прополісового молока Дана концентрація є найбільш оптимальною для посилення пробютичної ефективності препарату Зниження концентрації прополісу недоцільне, оскільки призводить до зменшення терапевтичного ефекту пробіотика Збільшення концентрації вище 2,5% буде інгібувати пробютичну мікрофлору Запропонований спосіб передбачає використання в складі пробіотика додаткового штаму лактобацил ВКПМ В-5798, що має здатність синтезувати лізоцим Введення до складу пробіотика штаму Lb fermentum ВКПМ В-5798 дозволяє підвищити антагоністичну й адгезивну здатність запропонованого препарату Характеристика штаму наведена в таблиці 1 Штами усіх видів бактерій, введених до складу пробіотика, відрізняються СТІЙКІСТЮ ДО концентрацій прополісу, що використовують Крім того, штами оцтовокислих бактерій виду Acetobacter aceti, що є одним із компонентів пробіотика, інтенсивно окислюють етиловий спирт, що міститься в спиртовому екстракті прополісу, з утворенням оцтової і піровиноградної кислот, що активізують зростання біфідобактерій, лактобацил і пропюновокислих бактерій Пробютик "Апібакт" одержують у вигляді рідкого бактеріального концентрату Виключення операцій по заморожуванню і висушуванню бактеріальної біомаси дозволяє зберегти найбільш високу активність клітин пробіотика, що Таблиця 1 Характеристика штаму Lb fermentum ВКПМ В-5798, що додатково використовують у складі пробіотика № п/п 1 Показники Антагоністична активність (зона інгібування росту тест-культури), мм Eschenchia coll Характеристика 5,6 ±0,4 55913 Продовження таблиці 1 № п/п 1 2 3 4 5 6 7 Показники Staphilococcus aureus Shigella flexnen Candida albicans Bacillus cereus Proteus vulgans Campylobacterjejuni Адгезивна здатність, індекс адгезивності Лізоцимсинтезуюча здатність (зона лізісу клітин тест-культури Місгососcus luteus), мм Резистентність до концентрації жовчі, %, не менше Резистентність до концентрації фенолу, %, не менше Резистентність до концентрації NaCI, %, не менше Резистентність до концентрації прополісу, %, не менше сприяє збільшенню його лікувальнопрофілактичної ефективності Введення до складу препарату прополісу приводить також до збільшення терміну зберігання пробютика до трьох МІСЯЦІВ Спосіб здійснюють таким чином При одержанні пробютика спочатку готують багатокомпонентну бактеріальну культуру пробютичних мікроорганізмів (шокулят) Для цього відібрані за необхідними властивостями молочнокислі, пропюновокислі, оцтовокислі і біфідобактерм з'єднують у заданому співвідношенні і культивують у поживному середовищі, приготовленому на основі знежиреного молока, збагаченого стимуляторами росту Накопичену біомасу клітин відокремлюють від середовища культивування і змішують з спиртовим екстрактом прополісу або прополісовим молоком Винахід пояснюється прикладами Приклад 1 Одержання пробютика "Апібакт", що містить 0,5% прополісу, із використанням спиртового екстракту прополісу Для приготування шокуляту в стерильне знежирене молоко додають 1% стерильного розчину лимоннокислого натрію тризаміщеного і 10% стерильного пдролізованого молока, рН середовища доводять до 7,4 і вносять культури таких штамів, Lb acidophilus ВКПМ В-5863 Lb casei ВКПМ В-3960 Lb fermentum ВКПМ В-5798 Lb plantaram ВКПМ В-5494 Lb gassen BKM 846 Lb brevisBKM1309 L lactisssp cremons ЦМПМ B-3389 S sahvanus ssp thermophilus ВКПМ В2406 В bifidum ВКПМ В-5795 В longum ВКПМ В-4635 В infants Bm-47 В breve о/в -21 В adolescentisBA-18 Pr freudenreichn ssp shermanii ВКПМ B-4544 Pr freudenreichn ssp shermanii ВКПМ B-4545 A aceti ВКПМ В-3373 -0,2 - 0,3 - 0,5 - 0,3 - 0,2 -0,3 -0,2 - 0,2 - 0,5 -0,5 - 0,4 - 0,4 -0,2 - 0,3 - 0,2 -0,1 Характеристика 6,2 ±2,1 5,0 ±0,3 3,2 ±0,6 8,8 ±1,3 11,3 ± 0,6 9,8 ±0,5 7,8 ±0,4 10,7 ± 1,5 40 0,5 0,4 1,5 A aceti ВКПМ В-2021 - 0,2 Інокульоване середовище старанно перемішують і витримують при температурі 34°С протягом 16 год 5л одержаного інокулята вносять у 100л поживного середовища, приготовленого на основі знежиреного молока з вмістом сухих речовин 3%, збагаченого 10% пдролізованого молока і 2% лимоннокислого натрію тризаміщеного (рН 7,4) Культивування проводять при температурі 34°С протягом 14 год, підтримуючи рН культуральної рідини в межах 6,8 - 7,2 за допомогою 20%-ного стерильного розчину гідроксиду натрію Нарощену біомасу відокремлюють від середовища за допомогою супер-центрифуги і змішують в асептичних умовах із спиртовим екстрактом прополісу Для приготування спиртового екстракту прополісу беруть 225г подрібненого до невеликих шматочків прополісу, поміщають його у скляний посуд із притертою кришкою, заливають 0,8 літра 70%-ного етилового спирту і лишають для розчинення при кімнатній температурі на 5 діб при періодичному струшуванні Потім розчин фільтрують для видалення нерозчинних пластівців воску та механічних домішок, які зважують, відраховують із 225г взятого для приготування розчину прополісу, розраховують точну концентрацію розчиненого прополісу і доводять її до 20% додаванням визначеної КІЛЬКОСТІ 70%-ного спирту Перед використанням спиртовий екстракт прополісу розводять у співвідношенні 1 4 20%-ним стерильним розчином лимоннокислого натрію тризаміщеного з одержанням 4%-ноі емульсії та змішують з біомасою пробютичних клітин з розрахунку вмісту в біомасі 0,5% прополісу З цією метою до 1кг одержаної біомаси вводять 143мл емульсії 20%-ного спиртового екстракту прополісу в розчині лимоннокислого натрію тризаміщеного (1 4) Суміш старанно перемішують і розфасовують у стерильну тару Розфасований пробютик витримують протягом 12 годин при кімнатній температурі до повного окислення спирту оцтовокислими бактеріями, а потім поміщають у холодильник Термін зберігання препарату при температурі 4 - 6°С не менше 3-х МІСЯЦІВ Характеристика одержаного пробютика наве 55913 дена в таблиці 2 Приклад 2 Одержання пробютика "Апібакт", що містить 2,5% прополісу, з використанням спиртового екстракту прополісу Спосіб здійснюють ВІДПОВІДНО до прикладу 1, але 1кг біомаси змішують з 1670мл 4%-ноі емульсії, що відповідає введенню до складу біомаси 2,5% прополісу Характеристика пробютика наведена в таблиці 2 Приклад 3 Одержання пробютика "Апібакт", що містить 1,5% прополісу, з використанням спир 8 тового екстракту прополісу Для приготування шокуляту в стерильне знежирене МОЛОКО, ЩО МІСТИТЬ 1 % ЛИМОННОКИСЛОГО натрію тризаміщеного та 10% пдролізованого молока (рН 7,2 ) вносять культури таких штамів, % Lb acidophilus ВКПМ В-5264 -0,1 Lb acidophilus ЦМПМ В-2846 -0,1 Lb fermentum ВКПМ В-5798 - 0,5 Lb casei ВКПМВ-5724 - 0,4 Lb plantarum ВКПМ В-6496 - 0,2 Lb plantarum ВКПМ В-5494 - 0,3 Таблиця 2 Порівняльна характеристика пробютиків, що одержані відомим і запропонованим способами N° п/п Характеристика пробютиків Прототип "Апібакт" (2,6 - 3,1) х Ю " (3,0 - 3,5) х Ю " Показники 1 КІЛЬКІСТЬ ЖИВИХ КЛІТИН у пробютику, КУО/г 2 Антагоністична активність тест-культури), мм Е соїі St aureus Sh flexnen С albicans В cereus Pr vulgans С jejuni 3 4 5 6 (зона інгібування росту 5,9 6,8 8,7 5,3 8,9 7,4 5,5 Лізоцимсинтезуюча здатність (зона лізісу клітин тесткультури Micrococcus luteus), мм Адгезивна здатність (індекс адгезивності) Концентрація полісахаридів, % Термін зберігання при температурі 4 - 6°С, не менше, МІСЯЦІВ Lb gassen BKM 846 - 0,3 Lb brevisBKM 1309 -0,3 L lactisssp cremons ВКПМ В-3390 -0,2 S sahvanus ssp thermophilus ВКПМ В3386 - 0,3 В bifidum ВКПМ В-5799 - 0,4 В bifidum ВКПМ В-5798 - 0,3 В longum ВКПМ В-4635 -0,5 В infants 14/56 -0,5 В breve Be-34 - 0,5 В adolescentis146/ab -0,2 Pr freudenreichii ssp shermami ВКПМ B-4545 - 0,4 A aceti ВКПМ В-2021 -0,1 A aceti ЦМПМ В-3374 -0,1 Середовище після внесення культур штамів старанно перемішують і витримують при температурі 35°С протягом 12 год 6л одержаного шокуляту вносять у 200л поживного середовища, що складається із знежиреного молока з вмістом 3% сухих речовин, збагаченого 10% пдролізованого молока і 2% лимоннокислого натрію тризаміщеного (рН 7,2 ) Культивування проводять при температурі 35°С протягом 12 год, підтримуючи рН культуральної рідини в межах 6,8 - 7,2 за допомогою 20%-ного стерильного розчину гідроксиду калію Одержану біомасу відокремлюють від середовища культивування за допомогою суперцентри ±0,2 ±0,7 ±1,2 ±0,6 ±1,7 ±0,9 ±1,0 8,7 ±0,6 10,2 ±2,0 9,6 ±0,3 8,3 ±1,1 11,5 ± 2,5 11,9 ± 0,7 10,9 ±0,5 4,4 ±0,2 10,5 ±0,8 0,9 1,8-2,2 8,6 ±1,2 2,5-2,6 2 3 фуги і змішують з приготовленою ВІДПОВІДНО до прикладу 1 емульсією 20%-ного спиртового екстракту прополісу в стерильному розчині лимоннокислого натрію тризаміщеного До одного кілограму одержаної біомаси додають 600мл емульсії, що містить прополіс Це відповідає введенню до складу біомаси 1,5% прополісу Розфасований пробютик витримують протягом 14 год при кімнатній температурі з метою повного окислення спирту оцтовокислими бактеріями, а потім поміщають у холодильник Характеристика пробютика наведена в таблиці 2 Приклад 4 Одержання пробютика "Апібакт" з використанням прополісового молока Для приготування шокуляту в стерильне знежирене МОЛОКО, ЩО МІСТИТЬ 1 % ЛИМОННОКИСЛОГО натрію тризаміщеного та 10% пдролізованого молока (рН 7,3) вносять культури таких штамів, % Lb acidophilus ВКПМ В-5254 -0. Lb fermentum ВКПМ В-5798 -0. ,2 ,4 Lb casei ВКПМ В-5724 -0. ,1 Lb plantarum ВКПМ В-6496 -0. ,3 Lb gassen BKM-846 -0. ,2 Lb brevisBKM-1309 -0. ,3 L lactisssp cremons ВКПМ В-3392 -о,,2 S sahvanus ssp thermophilus ВКПМ В3386 -0.,2 S sahvanus ssp thermophilus ВКПМ В-0..2 55913 10 помішуванні Потім МОЛОКО фільтрують для вида5388 лення нерозчинних часток, а після охолодження з В bifidum ВКПМ В-5795 -0,3 поверхні видаляють прошарок воску, що утворивВ bifidum ВКПМ В- 5799 -0,3 ся Нерозчинні частки і віск зважують, відраховуВ longum ВКПМ В-4635 -0,2 ють із 100г використаного прополісу, розраховують В longum ВКПМ В-4557 -0,3 концентрацію розчиненого в молоці прополісу і В infants 18-Bm -0,4 доводять до 10%-ноі концентрації додаванням В breve b/b-21 -0,3 відповідної КІЛЬКОСТІ кип'яченого молока В adolescentis Ba-18 -0,2 Pr freudenreichu ssp shermami ВКПМ Один кілограм одержаної біомаси змішують з 53мл прополісового молока, що відповідає концеB-4544 -0,3 нтрації прополісу в пробютику 0,5% Суміш стаA aceti ВКПМ В-3373 -0,1 ранно перемішують і розфасовують в стерильну A aceti ВКПМ В-3374 -0,1 тару Інокульоване середовище перемішують І ВИХарактеристика пробютика наведена в таблиці тримують при температурі 33°С протягом 14год 2 4,5л одержаного шокуляту вносять у 150л поживного середовища, приготовленого на основі Приклад 5 Спосіб здійснюють ВІДПОВІДНО ДО знежиреного молока з вмістом 3% сухих речовин, прикладу 4, але 1кг одержаної біомаси змішують з збагаченого 10% пдролізованого молока та 2% ЗЗОмл прополісового молока, що відповідає конлимоннокислого натрію тризаміщеного (рН 7,3 ) центрації прополісу в пробютику 2,5% Культивування проводять при температурі 33°С Приклад 6 Спосіб здійснюють ВІДПОВІДНО ДО протягом 15 год з підтримкою рН культуральної прикладу 4, але 1кг одержаної біомаси змішують з рідини в межах 6,8 - 7,2 за допомогою 20%-ного 176мл прополісового молока, що відповідає констерильного розчину бікарбонату натрію центрації прополісу в пробютику 1,5% Одержану біомасу відокремлюють від середоЗапропонований спосіб дозволяє одержати вища культивування за допомогою суперцентрипробютик, що відрізняється від відомих широким фуги і змішують в асептичних умовах з прополісоспектром лікувально-профілактичних властивосвим молоком тей за рахунок раціонального доповнення потужного пробютичного потенціалу спеціально підібраДля приготування прополісового молока до ної цілющої мікрофлори унікальними лікувальними одного літру киплячого незбираного або знежиревластивостями прополісу ного молока додають 100г подрібненого прополісу, витримують на слабкому вогні протягом 10 хв при Підписано до друку 05 05 2003 р Тираж 39 прим ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)236-47-24