Спосіб одержання пробіотика

Винахід відноситься до біотехнології і може бути використаний у виробництві пробіотиків, збагачених рослинними добавками. Відомий спосіб одержання засобу для лікування діареї, що передбачає змішування в стерильній ємності 5%ної закваски лактобактерина і харчового желатину з продуктами рослинного походження, такими як сік плодів граната, сік чорноплідної горобини та відвар шкурок плодів граната (патент Російської Федерації №2070051, А61К35/78, А23L1/308, 1996). Недоліком способу є низька концентрація в препараті живих клітин пробіотичної мікрофлори, обмеженої одним видом лактобацил, і невеликий термін зберігання. Відомо також засіб для стимуляції моторно-евакуаторної функції кишечнику в дітей, що містить лактобактерин, лізоцим, екстракт цикорію і сироп шипшини (патент Російської Федерації №2070050, А61К35/78, 35/66, 38/43, 1996). Недоліком даного засобу є вузький спектр лікувальної дії, що обумовлено обмеженням складу тільки одним видом лактобацил і низькою концентрацією живих бактеріальних клітин. Найбільш близьким до способу, що заявляється, є спосіб одержання активованих форм пробіотика, що передбачає культивування "Лактобактерина сухого" на фітоосновах, що містять відвари лікарських рослин, сахарозу або глюкозу і цистин (Лисенко Г.І., Білко І.П., Нікольська 0.1., Теслюк Л.В. Діагностика та лікування дисбактеріозу кишечнику в ревматологічних хворих: Методичні рекомендації. - К., 1999. - 22с.). Недоліком відомого способу є невисока концентрація живих клітин пробіотичних мікроорганізмів, одновидовий бактеріальний склад, недостатня антагоністична активність, зокрема стосовно грибів роду Candida, і низький термін зберігання. Завданням винаходу є створення способу одержання пробіотика, в якому шляхом уведення до складу препарату додаткових штамів пробіотичних мікроорганізмів і збагачення відварів лікарських рослин зародками пшениці, забезпечується підвищення антагоністичної активності пробіотика, концентрації живих клітин пробіотичної мікрофлори і збільшення його терміну зберігання. При цьому з пробіотичних мікроорганізмів використовують бактерії родів: Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Bifidobacterium, Propionibacterium, а також оцтовокислі бактерії виду Acetobacter aceti, а зародки пшениці вводяться у відвари лікарських рослин у кількості 5-10%. Поставлене завдання вирішується шляхом добору штамів лактобацил, біфідобактерій і пропіоновокислих бактерій з високою пробіотичною активністю, здатних довгостроково зберігати життєздатність і біологічні властивості у відварах лікарських рослин, а також уведення до складу фітооснови зародків пшениці. Пропонований спосіб передбачає введення до складу пробіотика додаткових штамів роду Lactobacillus, а також бактерій родів: Lactococcus, Streptococcus, Bifidobacterium, Propionibacterium i Acetobacter. Розширення видового складу препарату сприяє підвищенню його біологічної активності і збільшенню спектра фізіологічне корисних властивостей. При цьому з лактококів і стрептококів до складу пробіотика відбирають штами, що активно розмножуються у відварах лікарських рослин з утворенням популяцій клітин чисельністю не менш 5,0х10КУО/мл, що мають високу полісахаридсинтезуючу, адгезивну і антагоністичну здатність. З лактобацил використовують штами, що накопичують у відварах лікарських рослин не менш 1,5х109 життєздатних клітин і, крім того, вони мають полісахаридсинтезуючу, адгезивну здатність й антагонізм відносно патогенних і умовнопатогенних мікроорганізмів. З біфідобактерій відбирають штами, що утворюють при розвитку у фітовідварах клітинні популяції чисельністю не менш 1,0х109КУО/мл, здатні адгезувати на епітеліальних клітинах людини і пригнічувати ріст патогенних і умовно-патогенних мікроорганізмів, у тому числі грибів. Використовувані в складі пробіотика пропіоновокислі бактерії відбираються за врожайністю клітин у фітовідварах (не менш 3,0х109КУО/мл), здатністю синтезувати вітаміни і полісахариди, адгезувати на епітеліальних тканинах людини, пригнічувати ріст патогенних і умовно-патогенних мікроорганізмів, у тому числі грибів, активізувати розвиток біфідобактерій, лактобацил, лактококів і стрептококів. Спеціально проведені дослідження установили, що в багатовидовому симбіозі відібраних штамів значно підсилюються їхні пробіотичні активності і врожайність клітин у відварах лікарських рослин. Ця особливість ще яскравіше виявляється в присутності оцтовокислих бактерій, які використовуються у складі пробіотика. До складу пробіотика вводять 5-10% зародків пшениці. Це дозволяє збагатити пробіотик незамінними амінокислотами, поліненасиченими жирними кислотами, антиоксидантами. Крім того, додавання зародків пшениці у відвари лікарських рослин у 10-50 разів збільшує врожайність клітин пробіотичної мікрофлори. Концентрація зародків пшениці 5-10% є найбільш оптимальною. Зменшення концентрації нижче 5% приводить до збідніння пробіотика фізіологічно корисними компонентами і зниження концентрації активних бактеріальних клітин. Збільшення концентрації зародків пшениці вище 10% недоцільно, оскільки не приводить до подальшого збільшення концентрації клітин. Спосіб здійснюють таким чином. Зародки пшениці змішують з відварами лікарських рослин з розрахунку одержання в суміші лікувальної концентрації фітоекстракту і 5-10% зародків пшениці, суміш витримують протягом 1-2 годин при кімнатній температурі, потім стерилізують при температурі 121°С протягом 10-15 хвилин і охолоджують до температури 3740°С. У підготовлене середовище вносять 3-5% симбіозу пробіотичних бактерій і витримують при температурі 3537°С протягом 10-14 годин. Готовий пробіотик має густу, в’язку консистенцію, кисломолочний смак із присмаком використаної лікарської рослини, містить (1,5-3,0)х1011 біологічно активних клітин пробіотичної мікрофлори. Винахід пояснюється прикладами. Приклад 1. Одержання пробіотика з використанням відвару ромашки аптечної. Готують 2%-й відвар ромашки у воді, настоюють 2 години і фільтрують. У 100л отриманого фітоекстракту додають 5кг сухих зародків пшениці, перемішують, витримують 1 годину при кімнатній температурі, стерилізують при температурі 121°С протягом 10 хвилин і охолоджують до температури 37°С. У підготовлене фітосередовище вносять 3% інокулята симбіозу пробіотичної мікрофлори. Для одержання симбіозу в стерильне знежирене молоко вносять культури наступних штамів у кількостях, %: Lactobacillus acidophilus ВКПМ В-2846 0,1 Lactobacillus casei ВКПМ В-5724 0,1 Lactobacillus plantarum ВКПМ В-6496 0,1 Lactobacillus helveticus ВКПМ В-3967 0,1 Lactobacillus fermentum ВКПМ В-5798 0,3 Lactobacillus brevis BKM 1309 0,2 Lactobacillus delbmeckii ssp. bulgaricus ВКПМВ-3964 0,1 Lactococcus lactis ВКПМ B-3961 0,1 Streptococcus salivarius ssp. thermophilus ВКПМ В-2406 0,1 Streptococcus salivarius ssp. thermophilus ВКПМ В-5388 0,1 Bifidobacterium bifidum ВКПМ В-5798 0,2 Bifidobacterium bifidum ВКПМ В-5799 0,1 Bifidobacterium longum ВКПМ В-4557 0,3 Bifidobacterium breve в/в-34 0,2 Bifidobacterium adolescentis 146/ав 0,1 Bifidobacterium infantis 14/56 0,2 Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii ВКПМ В-4545 0,3 Propionibacterium acidipropionici ВКПМ В5800 0,2 Acetobacter aceti ВКПМ В-2021 0,1 Інокульоване молоко витримують при температурі 36°С протягом 16 годин. Потім роблять ще три пересівання в стерильне знежирене молоко з періодичністю 2 доби. Для приготування інокулята в 3л фітосередовища вносять 100мл багатоштамового пробіотичного симбіозу. Суміш витримують 15 годин при температурі 37°С, після чого додають в основну масу фітосередовища. Культивування проводять при температурі 37°С протягом 14 годин. У готовому пробіотику міститься 2,7х1011 живих клітин пробіотичної мікрофлори. Характеристика препарату приведена в таблиці. Приклад 2. Одержання пробіотика з використанням відвару листа подорожника. Готують 1%-й відвар листа подорожника, настоюють 3 години і фільтрують. 50л отриманого водного екстракту змішують з 5кг сухих зародків пшениці, суміш витримують 2 години при кімнатній температурі і стерилізують при температурі 121°С протягом 15 хвилин. У стерильне фітосередовище, охолоджене до температури 35°С вносять 2,5л інокулята, приготовленого на основі симбіозу пробіотичної мікрофлори, що одержують відповідно до приклада 1. Інокульовану суміш витримують при температурі 35°С протягом 12 годин. У готовому пробіотику міститься 1,9х1011 живих клітин пробіотичної мікрофлори. Характеристика препарату приведена в таблиці. Приклад 3. Одержання пробіотика з використанням відвару жовчогінного збору. Готують 2%-й відвар жовчогінного збору, настоюють 2 години і фільтрують. 10л отриманого відвару змішують з 700г сухих зародків пшениці, суміш витримують 1,5 годин при кімнатній температурі і стерилізують при температурі 121°С протягом 12 хвилин. В охолоджене до температури 36°С середовище вносять 400 мл інокулята, отриманого відповідно до приклада 1. Інокульоване фітосередовище витримують при температурі 36°С протягом 10 годин. У готовому пробіотику міститься 2,3х1011 живих клітин пробіотичної мікрофлори. Характеристика препарату приведена в таблиці. Пропонований спосіб дозволяє одержати пробіотик, що має високу біологічну активність за рахунок уведення до складу препарату широкого видового спектра пробіотичних бактерій, забезпечення високої концентрації клітин фізіологічно активної мікрофлори і раціонального доповнення пробіотичних властивостей цілющих мікроорганізмів лікувально-пробіотичними властивостями лікарських рослин і зародків пшениці. Таблиця Характеристика пробіотиків, отриманих пропонованим і відомим способами Показники 1 Концентрація живих бактеріальних клітин, КУО/г Антагоністична активність (зона пригнічення росту тест-культур), мм S. aureus 209 P. mirabilis 403 P. vulgaris 52 К. pneumonia 5055 С. albicans 1b С. tropicalis ct-37 S.sonneі 115 Прототип 2 Приклад 1 3 Приклад 2 4 Приклад 3 5 1,5х107-1,0х109 2,7х1011 1,9х1011 2,3х1011 0-3,3 2,5-3,4 0-1,8 0-2,6 0 0 0-2,7 8,9 7,7 7,8 8,5 9,6 10,2 5,5 7,1 11,0 8,6 5,7 11,3 9,1 8,6 11,6 10,4 6,6 7,9 10,1 11,2 11.5 E.coli 0111 P. aeruginosa 9027 E. cloaceae 16 С. freundii 22fr Y. enterocolitica 16 S. typhimurium 7st Синтез кислот, %: молочна оцтова пропіонова Індекс адгезивності Концентрація бактеріальних полісахаридів, % Термін зберігання при температурі 4-6°С, діб Синтез вітамінів, мкг/кг: В1 В2 В12 2,2-3,8 3,0-5,7 0-2,2 0-3,0 0 0 9,0 5,7 9,4 11,3 6,9 7,5 9,2 10,5 8,8 9,6 9,0 10,1 8,6 9,3 10,0 10,9 8,6 11,3 1,2-1,8 0 0 1,6-3,4 1,5 1,8 0,9 8,0 1,7 2,0 1,0 7,9 1,6 2,1 1,2 8,5 0 2.2 2,6 2,5 2-5 60 60 60 0-50 0 0 480 1670 960 510 1640 930 770 1360 900