Спосіб одержання екзополісахариду

Спосіб одержання екзополісахариду, що включає періодичне культивування Acinetobacter sp. ІMB В-7005 і синтез полісахариду на поживному середовищі, що містить мінеральні солі, ростові фактори і як джерело вуглецевого живлення суміш енергетично нерівноцінних ростових субстратів у масовому співвідношенні 1:1, який відрізняється тим, що як енергетично дефіцитний субстрат у змішаному субстраті використовують гідролізовану мелясу у концентрації 0,75 % за вуглеводами, та тим, що поживне середовище не містить неорганічного азоту. Винахід відноситься до біотехнології, а саме, до способу одержання мікробних екзополісахаридів (ЕПС), які можуть використовуватись у нафтовидобувній, хімічній, парфумерній, харчовій та ін. промисловості, сільському господарстві, медицині. Відомі способи одержання полісахаридів, продуцентами яких є Xanthomonas campestris 8162 [А.с. № 595379, СРСР, опубл. 28.02.78, Бюл. № 8], Xanthomonas campestris NELL В-12075 та NRLL В12074 [патент № 4400467, США, опубл. 23.08.83], Xanthomonas campestris ATCC 31601 [патент № 4418145, США, опубл. 29.11.83]. Однак штами Xanthomonas campestris є фітопатогенними, деякі з них генетично нестабільні, оскільки дисоціюють на мукоїдні і немукоїдні форми, що спричиняє нестабільність якості синтезованих полісахаридів. Вказані негативні особливості штамів-продуцентів завдають шкоду довкіллю, а також обмежують використання препаратів. Найбільш близьким до запропонованого технічного рішення (прототип) є спосіб одержання ЕПС [патент України № 25947, МПК7 С12Ρ19/04. Спосіб одержання полісахариду / Пирог Т.П., Висятецька Н.В. Опубл. 27.08. 2007, Бюл. № 13], який передбачає періодичне культивування Acinetobacter sp. IMB В-7005 і синтез полісахариду на поживному середовищі, що містить як джерело вуглецевого живлення суміш етанолу і глюкози, мінеральні солі і ростові фактори, a як посівний матеріал використовують культуру з середини експоненційної фази росту, вирощену на мінеральному середовищі з етанолом, у кількості 9-11% від об'єму середовища. Недоліком цього способу є занадто висока тривалість процесу культивування продуцента полісахариду (120 год). В основу винаходу поставлено задачу створення нового способу одержання полісахариду, який скорочує тривалість культивування Acinetobacter sp. IMB В-7005. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб одержання полісахариду включає культивування Acinetobacter sp. IMB В-7005 на поживному середовищі, що містить мінеральні солі, ростові фактори і як джерело вуглецевого живлення суміш енергетично нерівноцінних ростових субстратів у молярному співвідношенні 3:1. Згідно винаходу як енергетично дефіцитний субстрат у змішаному субстраті використовується меляса у концентрації 0,75% за вуглеводами. Причинно-наслідковий зв'язок між запропонованими ознаками і очікуваним технічним результатом полягає в наступному. Використання як енер (19) UA (11) 91231 (13) C2 (21) a200801890 (22) 13.02.2008 (24) 12.07.2010 (46) 12.07.2010, Бюл.№ 13, 2010 р. (72) ПИРОГ ТЕТЯНА ПАВЛІВНА, ІВАНУШКІНА ГАННА ОЛЕКСАНДРІВНА (73) НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ (56) Pyroh TP, Korzh IuV, Lashchuk NV, Zborovs'ka BM. Synthesis of microbial exopolysaccharide ethapolan on ethanol and molasses mix. Mikrobiol Z. 2006 May-Jun;68(3):pp. 3-15 (в об'ємі реферату). T. P. Pirog, M. A. Kovalenko, Yu. V. Kuz'minskaya and T. P. Krishtab. Enhanced Synthesis of the Exopolysaccharide Ethapolan by Acinetobacter sp.12S Grown on a Mixture of Substrates. Microbiology. 2003, Volume 72, Number 1, 2003, pp.18-23. 3 91231 4 гетично дефіцитного субстрату у змішаному субKН2РО4 6,8; страті меляси в концентрації 0,75% (за вуглеводаKОН 1,8; ми) дає змогу скоротити тривалість культивування NH4NO3 0,3 продуцента полісахариду до 96 год і виключити з 0,4; MgSO4 7Н2О середовища джерело мінерального азоту. 0,1; СаСl2 2Н2О Експериментально доведено, що використан0,001. FeSO4 7H2O ня як енергетично дефіцитного субстрату у змішаУ середовище додатково вносять 0,5% (об'ємному субстраті меляси в концентрації 0,75% (за на частка) дріжджового автолізату. Як джерело вуглеводами) супроводжується скороченням тривуглецю і енергії використовують глюкозу, фруктовалості процесу культивування зі 120 до 96 год, а зу і сахарозу у концентрації 1% (масова частка), а також дає змогу реалізувати синтез полісахариду також гідролізовану і негідролізовану мелясу у на середовищі, яке не містить джерела мінеральконцентрації 1 і 2% за вуглеводами (масова частного азоту. ка). Гідроліз меляси здійснюють так: до 100 г меСпосіб здійснюється таким чином. ляси додають дистильовану воду до кінцевого Acinetobacter sp. IMB В-7005 вирощують на сереоб'єму 200 мл, в отриманий розчин вносять 20 мл довищі такого складу (г/л): 1н H2SO4, після чого стерилізують при температурі KН2РО4 6,8; 112°С упродовж 30 хв. Як посівний матеріал викоKОН 1,8; ристовують добову культуру, вирощену на ΜΠΑ. 0,4; MgSO4 7Н2О Концентрацію біомаси визначають за оптич0,1; СаСl2 2Н2О ною густиною клітинної суспензії з наступним пе0,001. FeSO4 7Н2О рерахунком на абсолютно суху біомасу клітин У середовище додатково вносять 0,5% (об'єм(АСБ) у відповідності з калібрувальним графіком. на частка) дріжджового автолізату та 0,0006% (маЕфективність трансформації вуглецю субстратів в сова частка) пантотенату кальцію. Як джерело ЕПС оцінюють за такими показниками: кількість вуглецю і енергії використовують суміш етанолу синтезованих ЕПС і ЕПС-синтезувальна здатність. (0,75%, об'ємна частка) і меляси (0,75% за вуглеКількість синтезованого полісахариду встановлюводами, масова частка). Як посівний матеріал виють ваговим методом. ЕПС-синтезувальну здаткористовують культуру з експоненційної фази росність розраховують як відношення кількості синтету (20-24 год), вирощену на мінеральному зованого ЕПС до біомаси та виражають у г ЕПС/г середовищі наведеного вище складу, що містить АСБ. 0,5% (об'ємна частка) етанолу як джерело вуглеЯк видно з наведених у табл. 1 даних, при вицевого живлення. Кількість посівного матеріалу рощуванні продуцента на середовищі з моносахастановить 10%. Культивування здійснюють у колридами (глюкоза, фруктоза) рівень біомаси і ЕПС є бах об'ємом 750 мл з 100 мл середовища на качабільш, ніж удвічі вищим порівняно з культивуванлці (220 об/хв) при 30°С, рН 6,8-7,0 упродовж 96 ням штаму на сахарозі. Очевидно, це зумовлено год. невисокою активністю у бактерій ферментних сисВикористання нового способу дає змогу скоротем, що здійснюють гідроліз сахарози. Ці результити тривалість процесу культивування продуцентати можуть свідчити про необхідність попередта полісахариду зі 120 до 96 год, а також виключинього гідролізу меляси при використанні її як ти з середовища джерело мінерального азоту. джерела вуглецевого живлення для одержання Приклад 1. Вплив способу підготовки меляси ЕПС. Дійсно, при вирощуванні Acinetobacter sp. Вна синтез полісахариду Acinetobacter sp. IMB В7005 на середовищі з гідролізованою мелясою 7005 показники синтезу ЕПС були значно вищими, ніж Культивування бактерій здійснюють на мінена середовищі з мелясою негідролізованою (табл. ральному середовищі такого складу (г/л): 1). Таблиця 1 Вплив джерела вуглецю на ріст Acinetobacter sp. B-7005 і синтез полісахариду Концентрація джерела вуглецю, % АСБ, г/л Сахароза 1,0 0,35 Глюкоза 1,0 0,85 Фруктоза 1,0 0,85 1,0 0,95 Меляса негідролізована 2,0 1,40 1,0 1,60 Меляса гідролізована 2,0 2,80 Джерело вуглецю Приклад 2. Залежність синтезу полісахариду на суміші етанолу і меляси від наявності у середовищі джерела мінерального азоту Культивування бактерій здійснюють на мінеральному середовищі 1 такого складу (г/л): ЕПС, г/л 0,90 2,25 2,30 1,50 2,95 3,80 5,80 Показники процесу ЕПС-синтезувальна здатність, г ЕПС/г АСБ 2,57 2,65 2,71 1,58 2,11 2,37 2,07 KН2РО4 KОН NH4NO3 MgSO4 7Η2Ο СаСl2 2Н2О 6,8; 1,8; 0,3; 0,4; 0,1; 5 91231 6 ний матеріал використовують культуру з експоне0,001, FeSO4 7H2O нційної фази росту (20-24 год), вирощену на мінеа також на середовищі 2, яке відрізняється від ральному середовищі 1, що містить як джерело середовища 1 тим, що не містить NH4NO3. У серевуглецевого живлення етанол (0,5%, об'ємна частдовища додатково вносять 0,5% (об'ємна частка) ка). Кількість посівного матеріалу становить 10% дріжджового автолізату та 0,0006% (масова частвід об'єму середовища. Тривалість культивування ка) пантотенату кальцію. Як джерело вуглецю і 120 год. Показники синтезу полісахариду наведено енергії використовують суміш етанолу (0,5 і 0,75%, у табл. 2. об'ємна частка) і гідролізованої меляси (0,5 і 0,75%, масова частка за вуглеводами). Як посівТаблиця 2 Вплив концентрації джерела мінерального азоту у середовищі на синтез полісахариду на суміші етанолу і меляси Джерело вуглецю в середовищі Концентрація культивування NH4NO3, г/л Етанол, 0,5%+меляса, 0,5% Етанол, 0,75%+меляса, 0,75% Показник процесу ЕПС-синтезувальна здатАСБ, г/л ЕПС, г/л ність, г ЕПС/г АСБ 1,9 6,6 3,5 1,5 6,6 4,4 2,5 9,2 3,7 2,5 9,2 3,7 рНкін 0,3 0 0,3 0 Отже, показники синтезу полісахариду на суміші етанолу і меляси є однаковими незалежно від наявності у середовищі джерела мінерального азоту (нітрату амонію). Оскільки меляса містить 1,8% азоту, то очевидно, тієї кількості азоту, що вноситься у середовище з мелясою, достатньо для росту бактерій. Приклад 3. Вплив тривалості культивування на синтезу полісахариду Культивування бактерій здійснюють на мінеральному середовищі такого складу (г/л): KН2РО4 6,8; KОН 1,8; 0,4; MgSO4 7Η2Ο 0,1; СаСl2 2Η2Ο 0,001. FeSO4 7H2O У середовища додатково вносять 0,5% (об'ємна частка) дріжджового автолізату та 0,0006 % (масова частка) пантотенату кальцію. Як джерело 6,6 6,7 6,4 6,7 вуглецю і енергії використовують суміш етанолу (0,75 %, об'ємна частка) і гідролізованої меляси (0,75%, масова частка за вуглеводами), а також суміш етанолу (0,75%, об'ємна частка) і глюкози (0,75%, масова частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (20-24 год), вирощену на середовищі наведеного вище складу, що містить як джерело вуглецевого живлення етанол (0,5%, об'ємна частка). Кількість посівного матеріалу становить 10% від об'єму середовища. Тривалість культивування становить 96 і 120 год Як видно з даних, наведених у табл. 3, кількість синтезованого полісахариду досягає максимального значення (9,2 г/л) уже на 96 год росту продуцента на суміші етанолу і меляси, у той час як на суміші етанолу і глюкози така концентрація ЕПС спостерігається лише на 120 год культивування бактерій. Таблиця 3 Залежність синтезу полісахариду на суміші субстратів від тривалості культивування Джерело вуглецю в середовищі культивування Етанол, 0,75%+меляса, 0,75% Етанол, 0,75%+глюкоза, 0,75% (прототип) Таким чином, використання запропонованого способу дає змогу без зниження показників синтезу полісахариду скоротити тривалість культиву Комп’ютерна верстка О. Гапоненко Тривалість процесу, год 96 120 96 120 ЕПС, г/л 9,2 9,2 7,8 9,2 вання продуцента на 24 год порівняно з прототипом. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601