Спосіб одержання екзополісахариду

Спосіб одержання екзополісахариду, що включає культивування Acinetobacter sp. IMB В7005 і синтез екзополісахариду на поживному середовищі, що містить як джерело вуглецевого живлення суміш етанолу в кількості 0,75 об.% і меляси в кількості 0,75 мас.%, за вуглеводами, мінеральні солі, дріжджовий автолізат в кількості 0,5 об. %, і пантотенат кальцію в кількості 0,0006 мас. %, який відрізняється тим, що вміст мінеральних речовин в середовищі становить КН2РO4 3,2, MgSO4 х 7Н2O - 0,4, CaCl x 2Н2O - 0,1, FeSO4 х 7Н2О - 0,001 г/л, а змішаний субстрат містить нейтралізовану після кислотної обробки мелясу. Винахід відноситься до біотехнології, а саме, до способу одержання мікробних екзополісахаридів (ЕПС), які можуть використовуватись у нафтовидобувній, хімічній, парфумерній, харчовій та ін. промисловості, сільському господарстві, медицині. Відомі способи одержання екзополісахаридів, продуцентами яких є Xanthomonas campestris 8162 [А.с. №595379, СРСР, опубл. 28.02.78, Бюл. №8], Xanthomonas campestris NRLL В-12075 та NRLL В12074 [патент №4400467, США, опубл. 23.08.83], Xanthomonas campestris ATCC 31601 [патент №4418145, США, опубл. 29.11.83]. Однак штами Xanthomonas campestris є фітопатогенними, деякі з них генетично нестабільні, оскільки дисоціюють на мукоїдні і немукоїдні форми, що спричиняє нестабільність якості синтезованих екзополісахаридів. Вказані негативні особливості штамів-продуцентів завдають шкоду довкіллю, а також обмежують використання препаратів. Найбільш близьким до запропонованого технічного рішення (прототип) є спосіб одержання ЕПС [патент України №33173, МПК7 С12Ρ19/04. Спосіб одержання полісахариду / Пирог Т.П., Іванушкіна Г.О. Опубл. 10.06.2008, Бюл. №11], який передбачає культивування Acinetobacter sp. ІMB В-7005 і синтез екзополісахариду на поживному середовищі, що містить мінеральні солі, ростові фактори і як джерело вуглецевого живлення суміш енергетично нерівноцінних ростових у молярному співвідношенні 3:1, а як енергетично дефіцитний субстрат у змішаному субстраті використовується попередньо прогідролізована меляса у концентрації 0,75% за вуглеводами. Недоліком цього способу є занадто висока концентрація солей у середовищі культивування (понад 9г/л). В основу винаходу поставлено задачу створення нового способу одержання екзополісахариду, який знижує у 2,5 рази вміст мінеральних солей у середовищі культивування продуцента і підвищує на 20% кількість екзополісахариду. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб одержання екзополісахариду включає культивування Acinetobacter sp. ІMB В-7005 на поживному сере UA (11) 93078 (13) (21) a200811453 (22) 23.09.2008 (24) 10.01.2011 (46) 10.01.2011, Бюл.№ 1, 2011 р. (72) ПИРОГ ТЕТЯНА ПАВЛІВНА, ІВАНУШКІНА ГАННА ОЛЕКСАНДРІВНА (73) НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ (56) SU 595379, 22.11.1976 US 4400467, 23.08.1983 US 4418145, 14.07.1980. UA U 33173, 10.06.2008 UA U 25947, 27.08.2007 T. P. Pirog, M. A. Kovalenko, Yu. V. Kuz'minskaya and T. P. Krishtab. Enhanced Synthesis of the Exopolysaccharide Ethapolan by Acinetobacter sp. 12S Grown on a Mixture of Substrates. Microbiology. Volume 72, Number 1 / Январь 2003 г., страницы 18-23. Pyroh TP, Korzh IuV, Lashchuk NV, Zborovs'ka BM. Synthesis of microbial exopolysaccharide ethapolan on ethanol and molasses mix. Mikrobiol Z. 2006 MayJun;68(3):Abstract. C2 2 (19) 1 3 93078 довищі, що містить мінеральні солі, ростові фактори і як джерело вуглецевого живлення суміш етанолу і меляси. Згідно винаходу у змішаному субстраті використовують нейтралізовану після кислотної обробки мелясу. Причинно-наслідковий зв'язок між запропонованими ознаками і очікуваним технічним результатом полягає в наступному. Використання у змішаному субстраті нейтралізованої після кислотної обробки меляси дає змогу знизити у 2,5 рази вміст солей у середовищі культивування Acinetobacter sp. ІMB В-7005 і підвищити на 20% кількість синтезованого екзополісахариду. Експериментально доведено, що нейтралізація розчину меляси після його кислотної обробки дає змогу одержати на 20% більше екзополісахариду (11,2г/л) на середовищі, в якому концентрація солей знижена у 2,5 рази (з 9,1 до 3,7г/л). Спосіб здійснюється таким чином. Acinetobacter sp. ІMB В-7005 вирощують на середовищі такого складу (г/л): КН2РО4 - 3,2; MgSO4×7Η2Ο - 0,4; СаСІ2×2Η2Ο - 0,1; FeSO4×7H2O - 0,001. У середовище додатково вносять 0,5% (об'ємна частка) дріжджового автолізату та 0,0006% (масова частка) пантотенату кальцію. Як джерело вуглецю і енергії використовують суміш етанолу (0,75%, об'ємна частка) і нейтралізованої після кислотної обробки меляси (0,75% за вуглеводами, масова частка). Кислотну обробку меляси, яку проводять з метою гідролізу сахарози, здійснюють так: до 100г меляси додають дистильовану воду до кінцевого об'єму 200мл, в отриманий розчин вносять 20мл 1н H2SO4, після чого стерилізують при температурі 112°С упродовж 30хв. Після охолодження розчин меляси нейтралізують 10%ним КОН. Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (20-24год), вирощену на мінеральному середовищі наведеного вище складу, що містить 0,5% (об'ємна частка) етанолу як джерело вуглецевого живлення. Кількість посівного матеріалу становить 10%. Культивування здійснюють у колбах об'ємом з 750мл з 100мл середовища на качалці (220об/хв) при 30°С, рН 6,87,0 упродовж 96год. Використання нового способу дає змогу знизити у середовищі культивування продуцента екзо 4 полісахариду вміст мінеральних солей з 9,1 до 3,7г/л і підвищити кількість екзополісахариду з 9,2 до 11,2г/л. Приклад 1 Синтез екзополісахариду Acinetobacter sp. ІMB В-7005 на середовищах з різним вмістом солей Культивування бактерій здійснюють на мінеральних середовищах такого складу (г/л), середовище 1: КН2РО4 - 6,8; КОН -1,8; MgSO4×7Η2Ο - 0,4; СаСІ2×2Н2О - 0,1; FeSO4×7Н2О - 0,001; середовище 2: КН2РО4 - 3,2; MgSO4×7Η2Ο - 0,4; СаС12×2Н2О - 0,1; FeSO4×7H2O - 0,001. У середовища додатково вносять 0,5% (об'ємна частка) дріжджового автолізату та 0,0006% (масова частка) пантотенату кальцію. Як джерело вуглецю і енергії використовують суміш етанолу (0,75%, об'ємна частка) і меляси (0,75% за вуглеводами, масова частка). Кислотну обробку меляси здійснюють як описано вище. Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (20-24год), вирощену на мінеральному середовищі наведеного вище складу, що містить 0,5% (об'ємна частка) етанолу як джерело вуглецевого живлення. Кількість посівного матеріалу становить 10%. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750мл з 100мл середовища на качалці (220об/хв) при 30°С, рН 6,8-7,0 упродовж 96год. Концентрацію біомаси визначають за оптичною густиною клітинної суспензії з наступним перерахунком на абсолютно суху біомасу клітин (АСБ) у відповідності з калібрувальним графіком. Ефективність трансформації вуглецю субстратів в ЕПС оцінюють за такими показниками: кількість синтезованих ЕПС і ЕПС-синтезувальна здатність. Кількість синтезованого екзополісахариду встановлюють ваговим методом. ЕПС-синтезувальну здатність розраховують як відношення кількості синтезованого ЕПС до біомаси та виражають у г ЕПС/ г АСБ. Як видно з наведених у табл. 1 даних, при вирощуванні продуцента на середовищі 2 із зниженим вмістом солей показники синтезу ЕПС суттєво знижуються. При цьому рН культуральної рідини до кінця культивування на середовищі 2 становить 5,7, що є неоптимальним для синтезу даного екзополісахариду. Таблиця 1 Синтез екзополісахариду на суміші етанолу і меляси на середовищах з різним вмістом солей Середовище культивування 1 (прототип) 2 АСБ, г/л ЕПС, г/л 2,5 1,7 9,2 4,2 Вище значення рН культуральної рідини після вирощування продуцента на середовищі 1 зумовлене, очевидно, вищою молярністю буферу цього середовища (0,05Μ проти 0,02Μ для середовища 2). Цілком ймовірно, що внесення у незабуферене середовище 2 «кислої» меляси супроводжується зниженням рН середовища до рівня, при якому ЕПС-синтезувальна здатність, г ЕПС / г АСБ 3,7 2,5 рН (кінцеве) 6,7 5,7 сповільнюється споживання субстратів штамом В7005. Приклад 2 Вплив рН на швидкість окиснення етанолу і меляси інтактними клітинами Acinetobacter sp. ІMB В-7005. Культивування бактерій здійснюють на середовищі 1 в умовах, описаних вище, до середини 5 93078 експоненційної фази росту. Для визначення швидкості окиснення субстрату клітини Acinetobacter sp. В-7005 центрифугують (4000g, 15хв, 4°С). Отриманий осад клітин двічі відмивають від залишків + середовища 0,05Μ Κ -фосфатним буфером (рН 7,0) центрифугуючи (4000g, 15хв, 4°С). Відмиті клітини ресуспендують у 0,05Μ К+-фосфатному буфері (рН 7,0). Для інкубації клітин при визначенні швидкості окиснення субстратів використовуть трис-НСІ буфер (0,05М, рН 7,0). 6 Швидкість окиснення етанолу і меляси (10мМ) встановлюють за швидкістю поглинання кисню у реакційній суміші полярографічним методом за допомогою електроду закритого типу на полярографі ППТ-1 при температурі 28-30°С. Як видно з наведених у табл. 2 даних, швидкість окиснення субстратів при рН 6,0 і нижче сповільнюється. Таблиця 2 Швидкість окиснення ацетату інтактними клітинами Acinetobacter sp. ІMB В-7005 за різних значень рН Швидкість окиснення (нмоль О2·хв-1мг-1 клітин) етанолу меляси 8,2 4,3 45,3 38,1 97,9 89,5 рН реакційної суміші 5,0 6,0 7,0 Приклад 3 Вплив способу обробки меляси на синтез екзополісахариду Acinetobacter sp. ІMB В-7005 Культивування бактерій здійснюють в умовах, описаних вище. Як ростовий субстрат використовують «кислу» і нейтралізовану після кислотної обробки мелясу. Нейтралізацію розчину меляси здійснюють 10%-ним розчином КОН. Як видно з наведених у табл.3 даних, показники синтезу ЕПС на середовищі 2 з нейтралізованою мелясою були вищими, ніж згідно прототипу. Таблиця 3 Синтез екзополісахариду на залежно від способу обробки меляси Середовище культивування 1 (прототип) 2 2 ЕПС, г/л Джерело вуглецю Етанол + меляса (без нейтралізації) Етанол + меляса (без нейтралізації) Етанол + меляса (нейтралізована) Таким чином, використання як ростового субстрату нейтралізованої після кислотної обробки меляси дає змогу підвищити на 20% кількість синтезованого Acinetobacter sp. ІMB В-7005 екзополі Комп’ютерна верстка А. Рябко ЕПС-синтезувальна здатність, г ЕПС/г АСБ рН (кінцеве) 9,2 3,7 6,7 4,2 2,5 5,7 11,2 4,55 6,7 сахариду (до 11,2г/л) і здійснити процес його одержання на середовищі з етанолом і мелясою, в якому вміст солей знижено з 9,1 до 3,7г/л. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601