Спосіб одержання екзополісахариду

Спосіб одержання екзополісахариду, що включає культивування Acinetobacter sp. ІMB В7005 на поживному середовищі, що містить суміш ростових субстратів, мінеральні солі, дріжджовий автолізат в кількості 0,5 об. % і пантотенат кальцію в кількості 0,0006 мас. %, який відрізняється тим, що вміст мінеральних речовин у середовищі становить KН2РO4 - 6,8, КОН - 1,8, NH4Cl - 0,4, MgSO4 х 7Н2О - 0,4, СаСl2 х 2H2O - 0,1, FeSO4 x 7Н2О 0,001 г/л, а як джерело вуглецевого живлення використовують суміш двох енергетично дефіцитних субстратів - ацетату натрію і глюкози масовою часткою 1,1 і 0,75 % відповідно. UA (21) a200811452 (22) 23.09.2008 (24) 10.01.2011 (46) 10.01.2011, Бюл.№ 1, 2011 р. (72) ПИРОГ ТЕТЯНА ПАВЛІВНА, ІВАНУШКІНА ГАННА ОЛЕКСАНДРІВНА (73) НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ (56) SU 595379, 22.11.1976 US 4400467, 23.08.1983 US 4418145, 14.07.1980 UA U 33117, 10.06.2008 RU C1 2241037, 27.11.2004 UA A 19138, 15.12.2006 UA A 25947, 27.08.2007 UA A 83318, 25.06.2008 T. P. Pirog, M. A. Kovalenko, Yu. V. Kuz'minskaya and T. P. Krishtab. Enhanced Synthesis of the Exopolysaccharide Ethapolan by Acinetobacter sp. 12S Grown on a Mixture of Substrates. Microbiology. Volume 72, Number 1 / Январь 2003 г., страницы1823. Пирог Т. П., Высятецкая Н. В. Интенсификация синтеза экзополисахарида этаполана на смеси C2 2 (19) 1 3 Поставлена задача вирішується тим, що спосіб одержання екзополісахариду включає культивування Acinetobacter sp. IMB В-7005 на поживному середовищі, що містить суміш ростових субстратів, мінеральні солі і ростові фактори. Згідно винаходу як джерело вуглецевого живлення використовують суміш двох енергетично дефіцитних субстратів (ацетату натрію і глюкози масовою часткою 1,1 і 0,75 % відповідно). Причинно-наслідковий зв'язок між запропонованими ознаками і очікуваним технічним результатом полягає в наступному. Використання як джерела вуглецю суміші двох енергетично дефіцитних субстратів (1,1 % ацетату натрію і 0,75 % глюкози) дає змогу підвищити ЕПС-синтезувальну здатність у 2,5 раза. Експериментально доведено, що використання суміші ацетату натрію (1,1 %) і глюкози (0,75 %) як ростового субстрату дає змогу підвищити у 2,5 раза ЕПС-синтезувальну здатність Acinetobacter sp. IMB В-7005. Спосіб здійснюється таким чином. Acinetobacter sp. IMB В-7005 вирощують на середовищі такого складу (г/л) : КН2РО4 - 6,8; КОН - 1,8; NH4CI - 0,4; MgSO4 х7Н2О - 0,4; СаСl2 х+ 2Н2О 0,1; FeSO4 x 7Н2О - 0,001. У середовище додатково вносять 0,5% (об'ємна частка) дріжджового автолізату та 0,0006 % (масова частка) пантотенату кальцію. Як джерело вуглецю та енергії використовують суміш ацетату натрію (1,1 %, масова частка) і глюкози (0,75 %, масова частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (20-24 год), вирощену на мінеральному середовищі наведеного вище складу, що містить 0,5 % (об'ємна частка) етанолу як джерело вуглецевого живлення. Кількість посівного матеріалу становить 10 %. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750 мл з 100 мл середовища на качалці (220 об/хв) при 30 °С, рН 6,8-7,0 упродовж 120 год. Використання нового способу дає змогу підвищити у 2,5 раза ЕПС-синтезувальну здатність Acinetobacter sp. IMB В-7005. 93077 4 Приклад 1. Синтез екзополісахариду за умов росту Acinetobacter sp. IMB В-7005 на суміші ацетату калію і глюкози Культивування бактерій здійснюють на середовищі такого складу (г/л): КН2РО4 - 6,8; КОН - 1,8; NH4NO3 - 0,3; MgSO4 х 7Н2О - 0,4; СаСl2 х 2Н2О 0,1; FeSO4 x7H2O - 0,001. У середовища додатково вносять 0,5% (об'ємна частка) дріжджового автолізату та 0,0006 % (масова частка) пантотенату кальцію. Як джерело вуглецю і енергії використовують суміш ацетату калію (0,65; 1,0 і 1,3 %, масова частка) і глюкози (0,38; 0,57 і 0,75 %, масова частка) відповідно, а також суміш етанолу (0,75%, об'ємна частка) і глюкози (0,75 %, масова частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (20-24 год), вирощену на мінеральному середовищі наведеного вище складу, що містять як джерело вуглецевого живлення етанол (0,5 %, об'ємна частка). Кількість посівного матеріалу становить 10 % від об'єму середовища. Концентрацію біомаси визначають за оптичною густиною клітинної суспензії з наступним перерахунком на абсолютно суху біомасу клітин (АСБ) у відповідності з калібрувальним графіком. Ефективність трансформації вуглецю субстратів в ЕПС оцінюють за наступними показниками: кількість синтезованих ЕПС, вихід ЕПС від субстрату, ЕПС-синтезувальна здатність. Кількість синтезованого екзополісахариду встановлюють ваговим методом. ЕПС-синтезувальну здатність розраховують як відношення кількості синтезованого ЕПС до біомаси та виражають у г ЕПС/ г АСБ. З даних, наведених у табл. 1, видно, що ЕПСсинтезувальна здатність за умов росту продуцента на суміші ацетату калію і глюкози становить 7,8-7,9 г ЕПС/ г АСБ, що вище, ніж згідно прототипу (6,2 г ЕПС/ г АСБ). Проте кількість синтезованого ЕПС є недостатньо високою - залежно від концентрації ацетату калію і глюкози у середовищі культивування становить 3,2-4,5 г/л, у той час як згідно прототипу цей показник є 2-3 раза вищим (9,2 г/л). Таблиця 1 Синтез екзополісахариду Acinetobacter sp. IMB В-7005 на суміші ацетату калію і глюкози Джерело вуглецю і енергії Ацетат калію (0,65 %) + Глюкоза (0,38 %) Ацетат калію (1,0 %) + Глюкоза (0,57 %) Ацетат калію (1,3 %) + Глюкоза (0,75 %) Етанол (0,75 %) + Глюкоза (0,75 %) (прототип) ЕПС, г/л 3,2 4,0 4,5 ЕПС-синтезувальна здатність, г ЕПС/ г АСБ 7,8 7,8 7,9 9,2 6,2 Примітка. Концентрація ацетату калію 1,3 % еквімолярна за вуглецем концентрації етанолу 0,75 %. Приклад 2. Синтез екзополісахариду за умов росту Acinetobacter sp. IMB В-7005 на суміші ацетату натрію і глюкози Культивування бактерій здійснюють на середовищі такого складу (г/л) : КН2РО4 - 6,8; КОН - 1,8; NH4NO3 - 0,3; MgSO4 х 7Н2О - 0,4; СаСl2 х 2Н2О 0,1; FeSO4 x7H2O - 0,001. У середовища додатково вносять 0,5% (об'ємна частка) дріжджового автолізату та 0,0006 % (масова частка) пантотенату кальцію. Як джерело вуглецю і енергії використовують суміш ацетату натрію (0,55 і 1,1 %, масова частка) і глюкози (0,38 і 0,75 %, масова частка) відповідно, а також суміш етанолу (0,75 %, об'ємна частка) і глюкози (0,75 %, масова частка). Як посі 5 93077 вний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (20-24 год), вирощену на мінеральному середовищі наведеного вище складу, що містять як джерело вуглецевого живлення 6 етанол (0,5 %, об'ємна частка). Кількість посівного матеріалу становить 10 % від об'єму середовища. Результати культивування продуцента на суміші ацетату натрію і глюкози наведено у табл. 2 Таблиця 2 Синтез екзополісахариду Acinetobacter sp. IMB В-7005 на суміші ацетату натрію і глюкози 5,2 8,9 ЕПС-синтезувальна здатність, г ЕПС/ г АСБ 8,8 12,0 9,2 Джерело вуглецю і енергії 6,2 ЕПС, г/л Ацетат натрію (0,55 %) + Глюкоза (0,38 %) Ацетат натрію (1,1 %) + Глюкоза (0,75 %) Етанол (0,75 %) + Глюкоза (0,75 %) (прототип) Примітка. Концентрація ацетату натрію 1,1 % еквімолярна за вуглецем концентрації етанолу 0,75 %. Отже, за заміни у змішаному субстраті ацетату калію на ацетат натрію показники синтезу екзополісахариду підвищуються. Так, ЕПСсинтезувальна здатність у 1,5-1,7 і майже 2 раза вища, ніж на суміші ацетату калію і глюкози і згідно прототипу відповідно. Проте кількість ЕПС, синтезованого на суміші ацетату натрію і глюкози є дещо нижчою порівняно з культивуванням бактерій згідно прототипу (8,9 і 9,2 г/л відповідно). Приклад 3. Вплив природи джерела азоту на синтез ЕПС за умов росту Acinetobacter sp. IMB В7005 на суміші ацетату натрію і глюкози Культивування бактерій здійснюють на середовищах такого складу (г/л): середовище 1: КН2РО4 - 6,8; КОН - 1,8; NH4NO3 - 0,3; MgSO4 х 7Н2О - 0,4; СаСl2 х 2Н2О - 0,1; FeSO4 x7H2O 0,001; середовище 2: аналогічне за складом середовищу 1, за винятком джерела азоту. Середовище 2 містить NH4CI у концентрації 0,4 г/л. Така концентрація хлориду натрію є еквімолярною за азотом 0,3 г/л NH4NO3. У середовища додатково вносять 0,5% (об'ємна частка) дріжджового автолізату та 0,0006 % (масова частка) пантотенату кальцію. Як джерело вуглецю і енергії використовують суміш ацетату натрію (1,1 %, масова частка) і глюкози (0,75 %, масова частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (20-24 год), вирощену на мінеральному середовищі наведеного вище складу, що містять як джерело вуглецевого живлення етанол (0,5 %, об'ємна частка). Кількість посівного матеріалу становить 10 % від об'єму середовища. Як видно з даних, наведених у табл. 3, заміна джерела азоту у середовищі культивування штаму В-7005 дає змогу підвищити кількість синтезованого ЕПС до рівня, одержуваного згідно прототипу, при цьому ЕПС-синтезувальна здатність є майже у 2,5 раза вищою. Таблиця 3 Синтез екзополісахариду на суміші ацетату натрію і глюкози залежно від природи джерела азоту у середовищі культивування Acinetobacter sp. IMB В-7005 Джерело азоту у середовищі NH4NO3 (середовище 1) NH4CI (середовище 2) ЕПС, г/л 8,9 9,3 Таким чином, порівняно з прототипом використання запропонованого способу дає змогу підви Комп’ютерна верстка В. Мацело ЕПС-синтезувальна здатність, г ЕПС/ г АСБ 12,0 15,5 щити ЕПС-синтезувальну здатність штаму В-7005 у 2,5 раза (з 6,2 до 15,5 г ЕПС/ г біомаси). Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601