Кон`югати нейбластину з полімерами та способи їх застосування

Реферат: Винахід належить до поліпептиду нейбластину, придатного для утворення кон'югата, що містить поліпептид нейбластину, зв'язаний з поліалкіленгліколем. Даний кон'югат має UA 100967 C2 (12) UA 100967 C2 пролонговану біологічну активність у порівнянні з немодифікованими формами або формами дикого типу нейбластину. Кон'югати відповідно до винаходу застосовують при лікуванні або профілактиці захворювання або розладу нервової системи. UA 100967 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід, загалом, належить до поліпептидів і більш конкретно до модифікованих нейротрофічних поліпептидів і способів застосування вказаних модифікованих поліпептидів. Нейротрофічні фактори є білками природного походження, які підвищують життєздатність, підтримують фенотипічне диференціювання, запобігають дегенерації та підвищують активність нервових клітин і тканин. Нейротрофічні фактори виділяють з нервової тканини і з ненервової тканини, яка іннервована нервовою системою, та поділяють на функціонально і структурно споріднені групи, які також називаються сімействами, суперсімействами або підсімействами. Серед суперсімейств нейротрофічних факторів є суперсімейства фактора росту фібробластів, нейротрофіну і трансформуючого фактора росту  (TGF-  ). Окремі види нейротрофічних факторів відрізняються за своєю фізичною структурою, їх взаємодією із спорідненими їм рецепторами та їх впливами на різні типи нервових клітин. До суперсімейства TGF-  відносять ліганди, подібні до нейротрофічного фактора, одержаного з лінії гліальних клітин, (GDNF), які включають GDNF, персефін (PSP) і нейртурин (NTN). Ліганди підсімейства GDNF мають спільну здатність індукувати передачу сигналу за допомогою тирозинкінази рецептора RET. Три вказаних ліганди підсімейства GDNF відрізняються за їх відносними афіностями відносно сімейства нейротрофічних рецепторів, рецепторів GFR  . Нещодавно описаним нейротрофічним фактором є "нейбластин" або "NBN". Нейбластин відносять до підсімейства GDNF, оскільки він має спільні ділянки гомології з іншими GDNFлігандами і за його здатність зв'язуватися та активувати RET. На відміну від інших GDNFлігандів нейбластин є високо вибірковим відносно комплексу GFR  S-рецептор RET. Крім того, NBN містить унікальні підділянки у своїй амінокислотній послідовності. На жаль нейбластин зазнає швидкого кліренсу в організмі. Вказаний швидкий кліренс може перешкоджати використанню нейбластину у терапевтичних застосуваннях. Таким чином, існує необхідність в ідентифікації варіантів нейбластину, які мають підвищену біодоступність. Даний винахід частково базується на відкритті нових форм нейбластину, які виявляють підвищені фармакокінетичні властивості і біодоступність in vivo. Вказані нові форми включають варіантні поліпептиди нейбластину, кон'юговані з полімерними молекулами. В одному аспекті відмітною ознакою винаходу є варіантний поліпептид нейбластину або мутеїн поліпептиду нейбластину, що містить амінокислотну послідовність, яка має одну або декілька амінокислотних замін у положеннях зрілого димеру нейбластину, що експонуються у розчинник. Дані заміни вводять у нативний поліпептид нейбластину один або декілька сайтів, в яких з поліпептидом можуть бути зв'язані такі речовини, як ті, що мають природне походження або синтетичні полімери, для того, щоб збільшити його розчинність і, отже, його біодоступність in vivo. Переважно дані варіантні поліпептиди містять амінокислотну послідовність щонайменше на 70 % ідентичну амінокислотам 8-113 SEQ ID NO: 1. Варіантний поліпептид нейбластину включає одну або декілька амінокислотних замін, при яких у положенні 14 в амінокислотній послідовності варіантного поліпептиду знаходиться амінокислота, що відрізняється від аргініну, у положенні 39 амінокислотної послідовності варіантного поліпептиду знаходиться амінокислота, що відрізняється від аргініну, у положенні 68 варіантного поліпептиду знаходиться амінокислота, що відрізняється від аргініну, або у положенні 95 варіантного поліпептиду знаходиться амінокислота, що відрізняється від аспарагіну, у тому випадку, коли положення амінокислот пронумеровані відповідно до поліпептидної послідовності SEQ ID NO: 1. "Нейбластин дикого типу" або "wt-NBN" у значенні, що використовується у даному описі, належить до послідовності поліпептиду нейбластину, яка має природне походження або є нативною, такого як нейбластин щура, миші або людини (дивись, наприклад, SEQ ID NO: 2, 3 або 4). Конкретні варіантні поліпептиди нейбластину називаються у даному описі "NBN-X1N1X2" або "X1N1X2-NBN", де X1 належить до амінокислоти поліпептиду нейбластину дикого типу, N1 належить до номера положення амінокислоти X 1 у послідовності, яке нумерується відповідно до SEQ ID NO: 1. Х2 належить до амінокислоти, що замінює амінокислоту дикого типу у вказаному пронумерованому положенні у послідовності. Таким чином, наприклад, NBN-N95K означає варіантні поліпептиди нейбластину, в яких аспарагін у положенні 95 замінений лізином. Варіантний поліпептид нейбластину може бути одержаний у вигляді мультимерного поліпептиду. Наприклад, варіантний поліпептид нейбластину може бути одержаний у вигляді димеру, який містить щонайменше один варіантний поліпептид нейбластину. У деяких випадках димер є гомодимером варіантного поліпептиду нейбластину. В інших випадках димер є гетеродимером, який містить один варіантний поліпептид нейбластину і один поліпептид нейбластину дикого типу. Інші димери можуть містити дві різні варіантні форми поліпептиду нейбластину. 1 UA 100967 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 У деяких варіантах варіантний поліпептид нейбластину крім амінокислот 8-113 містить амінокислоти 1-7 SEQ ID NO: 1. У переважних варіантах варіантний поліпептид нейбластину при димеризації зв'язує GFR  3. У додаткових переважних варіантах варіантний поліпептид нейбластину при димеризації стимулює фосфорилювання тирозину поліпептиду RET, або сам по собі, або у випадку зв'язування з GFR  3. В інших переважних варіантах варіантний поліпептид нейбластину при димеризації підвищує життєздатність нейрона, наприклад, підвищує життєздатність чутливого нейрона. В інших переважних варіантах варіантний поліпептид нейбластину при димеризації нормалізує патологічні зміни нейрона, такого як чутливий нейрон. У наступних переважних варіантах варіантний поліпептид нейбластину при димеризації підвищує життєздатність нейрона, наприклад, автономного нейрона або допамінергічного нейрона. У деяких варіантах варіантний поліпептид містить дві, три або більше амінокислотних замін, вибраних з групи, яка складається з амінокислоти, що відрізняється від аргініну, у положенні 14 амінокислотної послідовності варіантного поліпептиду, амінокислоти, що відрізняється від аргініну, у положенні 39 амінокислотної послідовності варіантного поліпептиду, амінокислоти, що відрізняється від аргініну, у положенні 68 варіантного поліпептиду та амінокислоти, що відрізняється від аспарагіну, у положенні 95 варіантного поліпептиду. У переважних варіантах амінокислотою в одному або декількох положеннях 14, 39, 68 і 95 є лізин. Переважно амінокислоти 8-94 і 96-113 варіантного поліпептиду нейбластину щонайменше на 90 % ідентичні амінокислотам 8-94 і 96-113 SEQ ID NO: 1. Більш переважно послідовності амінокислот ідентичні щонайменше на 95 %. Найбільш переважно амінокислотна послідовність варіантного поліпептиду нейбластину містить амінокислотну послідовність поліпептиду нейбластину щура, людини або миші природного походження у положеннях амінокислот 8-94 і 96-113 варіантного поліпептиду нейбластину. Наприклад, амінокислоти 8-94 і 96-113 варіантного поліпептиду нейбластину можуть містити амінокислотну послідовність амінокислот 8-94 і 96-113 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 або SEQ ID NO: 4. Також винахід належить до злитого білка або поліпептиду, який включає в себе варіантний поліпептид нейбластину або поліпептид нейбластину дикого типу, або білка, який є димером двох злитих білків нейбластину. Злиті білки нейбластину також мають посилені фармакокінетичні властивості і підвищену біодоступність in vivo. В іншому аспекті винахід належить до молекули нуклеїнової кислоти, що кодує варіантний поліпептид нейбластину. Нуклеїнова кислота, яка кодує варіантний поліпептид нейбластину, переважно приготована у векторі, наприклад, в експресуючому векторі. Нуклеїнова кислота варіантного нейбластину або вектор, який її містить, можуть бути надані у клітині. Клітина може являти собою, наприклад, клітину ссавця, клітину гриба, дріжджову клітину, клітину комахи або бактеріальну клітину. Переважною клітиною ссавця є клітина яєчника китайського хом'ячка ("клітина СНО"). Винахід також стосується способу одержання варіантного поліпептиду нейбластину за допомогою культивування клітини, яка містить нуклеїнову кислоту, що кодує варіантний нейбластин, в умовах, які забезпечують експресію варіантного поліпептиду нейбластину. За бажанням варіантний полі пептид нейбластину потім можна дістати. Винахід, крім того, включає варіантний поліпептид нейбластину, що продукується клітиною. Подібні нуклеїнові кислоти, вектори, клітини-хазяї та способи одержання поліпептидів представлені у даному описі для злитих білків (таких як злиті білки нейбластин-сироватковий альбумін) відповідно до даного винаходу. Винахід також належить до композиції, яка містить поліпептид нейбластину або варіантний поліпептид нейбластину, зв'язаний з полімером неприродного походження. Варіантний поліпептид нейбластину у композиції переважно містить амінокислотну послідовність, щонайменше на 70 % ідентичну амінокислотам 8-113 SEQ ID NO: 1, за умови, що варіантний поліпептид нейбластину містить одну або декілька амінокислотних замін, вибраних з групи, яка складається з амінокислоти, що відрізняється від аргініну, у положенні 14 амінокислотної послідовності варіантного поліпептиду, амінокислоти, що відрізняється від аргініну, у положенні 39 амінокислотної послідовності варіантного поліпептиду, амінокислоти, що відрізняється від аргініну, у положенні 68 варіантного поліпептиду та амінокислоти, що відрізняється від аспарагіну, у положенні 95 варіантного поліпептиду, при цьому положення амінокислот пронумеровані відповідно до поліпептидної послідовності SEQ ID NO: 1. 2 UA 100967 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 У переважних варіантах полімер містить компонент, представлений поліалкіленгліколем, наприклад поліетиленгліколевий компонент (ПЕГ). У переважних варіантах поліалкіленгліколевий компонент зв'язаний з аміногрупою поліпептиду нейбластину або лізином у варіантному поліпептиді нейбластину. Зв'язування може здійснюватися за допомогою активованого складного ефіру Nгідроксилсукциніміду (NHS). Активований складний ефір може являти собою, наприклад, сукцинімідилсукцинат (SS-ПЕГ), сукцинімідилбутират (SPB-ПЕГ) або сукцинімідилпропіонат (SPA-ПЕГ) ПЕГ. Поліалкіленгліколевий компонент може, наприклад, являти собою карбоксиметил-NHS, норлейцин-NHS, SC-ПЕГ, трезилат, альдегід, епоксид, карбонілімідазол або карбонат PNP. У деяких варіантах поліалкіленгліколевий компонент зв'язаний з групою цистеїну поліпептиду нейбластину або варіантного поліпептиду нейбластину. Наприклад, зв'язування може здійснюватися за допомогою малеімідної групи, вінілсульфонової групи, галогенацетатної групи та тіольної групи. У деяких варіантах поліпептид нейбластину або варіантний поліпептид нейбластину у композиції глікозилований. У тому випадку, коли поліпептид нейбластину або варіантний поліпептид глікозилований, полімер може бути зв'язаний з вуглеводним компонентом глікозилованого поліпептиду нейбластину або варіантного поліпептиду нейбластину. Наприклад, полімер може бути зв'язаний з глікозилованим поліпептидом нейбластину або варіантним поліпептидом нейбластину після окислення групи гідразолу або аміногрупи глікозилованого поліпептиду нейбластину або варіантного поліпептиду нейбластину, або окислення реакційноздатної групи полімеру. У різних варіантах поліпептид нейбластину або варіантний поліпептид нейбластину містить один, два, три або чотири ПЕГ-компоненти. У переважних варіантах поліпептид нейбластину, варіантний поліпептид нейбластину або кон'югат з полімером має більш тривалий час напівжиття у сироватці у порівнянні з часом напівжиття поліпептиду або варіантного поліпептиду за відсутності полімеру. У переважних варіантах поліпептид нейбластину, варіантний поліпептид нейбластину або кон'югат з полімером у комплексі має фізіологічну активність, вибрану з групи, яка складається з: зв'язування GFR  3, активації RET, нормалізації патологічних змін нейрона або підвищення життєздатності нейрона. Під "нормалізацією патологічних змін нейрона" мають на увазі, що даний кон'югат індукує зміну одного або декількох з наступних параметрів клітини: рівня експресії структурного білка, рецептора нейротрофічного фактора, іонного каналу або нейромедіатора, або індукує зміну морфології клітини, у кожному випадку так, що значною мірою відновлює такий параметр до його рівня у нейроні такого ж або подібного фенотипу, який не порушений захворюванням, дегенерацією, інсультом або пошкодженням. Нормалізацію патологічних змін нейрона можна контролювати імуногістохімічно або шляхом оцінки змін рівнів клітинних продуктів, що секретуються або виділяються, або за допомогою оцінки змін in vivo у виявленні, фізіологічно властивому функції ураженого нейрона(нів). Наприклад, у випадку патологічних змін, зв'язаних з синдромом невропатичного болю, контролюють такі виявлення болю, як гіперальгезію, гіпоальгезію або алодинію. Під "підвищеною життєздатністю нейрона" мають на увазі продовжене виживання ураженого нейрона понад період життєздатності, що спостерігається у відповідному нейроні, ураженому тим же типом захворювання, розладу, інсульту або пошкодження, але не обробленому кон'югатом нейбластину або злитим білком відповідно до винаходу. У деяких варіантах полімер зв'язаний з поліпептидом у сайті нейбластину, який є N-кінцем. У деяких варіантах полімер зв'язаний з поліпептидом у сайті у некінцевій амінокислоті поліпептиду нейбластину або варіантного поліпептиду нейбластину. У переважних варіантах полімер зв'язаний з амінокислотою поліпептиду нейбластину або варіантного поліпептиду нейбластину, яка експонується у розчинник. У переважних варіантах полімер зв'язаний з поліпептидом нейбластину або варіантним поліпептидом нейбластину біля залишку, вибраного з групи, яка складається з амінокінцевої амінокислоти варіантного поліпептиду, положення 14 в амінокислотній послідовності поліпептиду нейбластину або варіантного поліпептиду нейбластину, положення 39 в амінокислотній послідовності поліпептиду нейбластину або варіантного поліпептиду нейбластину, положення 68 в амінокислотній послідовності поліпептиду нейбластину або варіантного поліпептиду нейбластину і положення 95 в амінокислотній послідовності поліпептиду нейбластину або варіантного поліпептиду нейбластину. 3 UA 100967 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід також належить до фармацевтичної композиції, яка включає фізіологічно прийнятний наповнювач, що містить або має диспергований у ньому поліпептид нейбластину, варіантний поліпептид нейбластину або кон'югат відповідно до даного винаходу. У наступному аспекті винахід включає стабільний водорозчинний кон'югований комплекс поліпептиду нейбластину або варіантного поліпептиду нейбластину, що містить поліпептид нейбластину або варіантний полі пептид нейбластину, зв'язаний з поліетиленгліколевим компонентом, в якому поліпептид нейбластину або варіантний поліпептид нейбластину зв'язаний з поліетиленгліколевим компонентом за допомогою лабільного зв'язку. У деяких варіантах лабільний зв'язок розщеплюється при біохімічному гідролізі, протеолізі або сульфгідрильному розщепленні. У переважних варіантах лабільний зв'язок розщеплюється в умовах in vivo. Винахід також стосується способу одержання модифікованого поліпептиду нейбластину, який має пролонговану активність in vitro або in vivo у порівнянні з нейбластином дикого типу, шляхом приготування поліпептиду нейбластину або варіантного поліпептиду нейбластину і зв'язування поліпептиду або модифікованого варіантного поліпептиду нейбластину з полімерним компонентом неприродного походження з утворенням таким чином композиції поліпептиду нейбластину, зв'язаного з полімером. У наступному аспекті винахід стосується способу лікування або профілактики порушення нервової системи у суб'єкта (такого як людина) за допомогою введення суб'єкту, який потребує цього, терапевтично ефективної кількості варіантного поліпептиду нейбластину, композиції, що містить поліпептид нейбластину або варіантний поліпептид нейбластину, зв'язаний з полімером, або комплексу, який включає в себе стабільний водорозчинний кон'югований комплекс поліпептиду нейбластину або варіантного поліпептиду, що містить поліпептид нейбластину або варіантний поліпептид нейбластину, зв'язаний з поліетиленгліколевим компонентом. Переважно розладом нервової системи є розлад периферичної нервової системи, такий як периферична невропатія або синдром невропатичного болю. Переважними суб'єктами для лікування є люди. Введення може бути, наприклад, системним або локальним. Якщо не обумовлено особливо, всі технічні і наукові терміни, що використовуються у даному описі, мають таке ж значення, яке звичайно мається на увазі фахівцем в області, до якої належить даний винахід. Хоча на практиці або при тестуванні даного винаходу можна використовувати способи і речовини, подібні або еквівалентні приведеним у даному описі, придатні способи і речовини описані нижче. Всі публікації, заявки на видачу патентів, патенти та інші Джерела інформації, які згадуються у даному описі, включені у вигляді посилання у повному обсязі. У випадку конфліктної ситуації даний опис, включаючи визначення, буде перевірений. Крім того, матеріали, способи і приклади є тільки ілюстративними і не розглядаються як такі, що обмежують. Інші відмітні ознаки і переваги винаходу стануть зрозумілими з наступного докладного опису і формули винаходу. Винахід належить до нових варіантних поліпептидів нейбластину, які можуть бути модифіковані для того, щоб посилити їх фармакокінетичні властивості і підвищити біодоступність. Переважні варіантні поліпептиди нейбластину мають змінені амінокислотні послідовності, які полегшують зв'язування з полімерним агентом, таким як полімер поліалкіленгліколю. Варіантні поліпептиди нейбластину Винахід належить до поліпептидів нейбластину, які мають варіантні амінокислотні послідовності у порівнянні з послідовністю поліпептиду нейбластину дикого типу. Амінокислотні послідовності поліпептидів нейбластину людини і миші описані у WO 00/01815. Приклади варіантних поліпептидів нейбластину відповідно до винаходу представлені у таблиці 1. Переважно змінені залишки у варіантному поліпептиді нейбластину вибрані для забезпечення зв'язування полімеру, такого як полімер поліалкіленгліколю, у положенні модифікованої амінокислоти. Переважними сайтами модифікації поліпептиду нейбластину є сайти у доступних для розчинника ділянках поліпептиду нейбластину. Такі сайти можна вибрати на основі перегляду кристалічної структури спорідненого нейротрофічного фактора, GDNF, кристалічна структура якого описана у Nat. Struct. Biol. 4:435-38, 1997. Сайти також можна вибрати на основі структурно-функціональної інформації, одержаної для химерних білків персефін/нейбластин. Вказані химери описані у J. Biol. Chem. 275:3412-20, 2000. Приблизний 4 UA 100967 C2 5 список доступних для розчинника або експонованих на поверхні амінокислот нейбластину, ідентифікованих за допомогою вказаної методики, вказаний у таблиці 2. Винахід включає варіантний поліпептид нейбластину, що містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 70 % ідентична амінокислотам 8-113 SEQ ID NO: 1, що показана у таблиці 1. У деяких варіантах один або декілька аргінінів у положенні 14, положенні 39, положенні 68 або аспарагін у положенні 95 амінокислотної послідовності поліпептиду замінюють амінокислотою, що відрізняється від аргініну або аспарагіну. Переважно амінокислоту дикого типу замінюють лізином або цистеїном. Таблиця 1 10 Консенсусна послідовність: де Xaa1 є Хаа2 є Хаа3 є Хаа4 є Хаа5 є Хаа6 є Хаа7 є Хаа8 є Хаа9 є Хаа10 є Хаа11 є Хаа12 є Хаа13 є 15 Gly Pro Gly Ala Ala Gly Arg Arg Val Pro Pro Val Arg або або або або або або або або або або або або або Thr Arg Ser Thr Thr Asp Ser Ser Ile Gln Ser Ile His У таблиці 2 представлений список залишків та їх номери у нейбластині людини, які ймовірно є такими, що експонуються на поверхні. Залишки, що експонуються на поверхні, визначали за 5 UA 100967 C2 5 допомогою оцінки структури димеру GDNF щура, утвореного ланцюгами А і В (PDB код 1AGQ), і визначення того, чи присутній залишок на поверхні структури. Потім дану структуру порівнювали з вирівнюванням послідовностей GDNF і нейбластину у Baloh et al., Neuron, vol. 21, p. 1291, 1998, щоб визначити придатні залишки у нейбластині. Схема нумерації являє собою схему, показану у таблиці 1. Таблиця 2 10 н/а вказує, що залишки не присутні у структурі GDNF. Це відбувається або внаслідок дизайну конструкції, гнучких ділянок, або вставок у нейбластині у порівнянні з GDNF (залишки 68-71): 6 UA 100967 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 - вказує, що залишки приховані і не розташовані на поверхні або є залишками цистеїну, залученими до дисульфідного зв'язку. Оскільки даний білок є цистеїновим вузлом, величезна кількість залишків розташована на поверхні. + вказує, що даний залишок у структурі GDNF експонований на поверхні, і таким чином ймовірно експонований на поверхні нейбластину, хоча петля, що містить залишки 66-75, спостерігається тільки в одному з мономерів GDNF (ймовірно гнучкому). Вказана петля також містить вставку з 4 залишків у нейбластині у порівнянні з GDNF. У значенні, що використовується у даному описі, терміни "ідентичність" або "гомологічний", або "гомологія" використовуються взаємозамінно і належить до подібності послідовностей між двома поліпептидами, молекулами або між двома нуклеїновими кислотами. У тому випадку, коли положення в обох порівнюваних послідовностях зайняте однією і тією ж основою або мономерною амінокислотною субодиницею (наприклад, якщо положення у кожній з двох молекул ДНК зайняте аденіном або положення у кожному з двох поліпептидів зайняте лізином), то відповідні молекули є гомологічними по даному положенню. Процент гомології між двома послідовностями є функцією кількості співпадаючих або гомологічних положень, що є у двох послідовностях, розділеної на кількість порівнюваних положень, х 100. Наприклад, якщо 6 з 10 положень у двох послідовностях співпадають або є гомологічними, то дві послідовності гомологічні на 60 %. Як приклад послідовності ДНК CTGACT і CAGGTT мають 50 % гомологію (3 із загальної кількості 6 положень співпадають). Звичайно порівняння виконують у тому випадку, коли дві послідовності вирівнюють, щоб одержати максимальну гомологію. Таке вирівнювання можна здійснити, використовуючи, наприклад, спосіб Needleman et al., J. Мої Biol. 48:443.453 (1970), що для зручності виконується за допомогою комп'ютерних програм, таких як програма Align (DNAstar, Inc.). "Подібними" послідовностями є послідовності, які при вирівнюванні мають ідентичні або подібні амінокислотні залишки, де подібні залишки є консервативними замінами або "допустимими точковими мутаціями" відповідних амінокислотних залишків у вирівняній еталонній послідовності. У цьому відношенні "консервативна заміна" залишку в еталонній послідовності є заміною залишком, який фізично або функціонально подібний до відповідного еталонного залишку, наприклад, який має подібний розмір, форму, електричний заряд, хімічні властивості, включаючи здатність утворювати ковалентні або водневі зв'язки, або тому подібне. Таким чином, "варіантною послідовністю з консервативними замінами" є послідовність, яка відрізняється від еталонної послідовності або послідовності дикого типу тим, що у ній присутня одна або декілька консервативних замін або допустимих точкових мутацій. У переважних варіантах поліпептид відповідно до винаходу на 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % або 99 % ідентичний амінокислотам 8-113 SEQ ID NO: 1. У деяких варіантах амінокислотна послідовність варіантного поліпептиду нейбластину містить послідовність амінокислот поліпептиду нейбластину щура, людини або миші природного походження у положеннях амінокислот 1-94 і 96-113 варіантного поліпептиду нейбластину, наприклад, поліпептид має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 2, 3 або 4 у вказаних положеннях. Варіантний поліпептид нейбластину, який відрізняється за послідовністю від поліпептидів, описаних у SEQ ID NO: 1-4, може містити одну або декілька консервативних амінокислотних замін. Альтернативно або додатково варіантний поліпептид нейбластину може відрізнятися однією або декількома неконсервативними амінокислотними замінами або делеціями, або інсерціями. Переважно заміни, інсерції або делеції не порушують біологічну активність виділеного білка. Консервативні заміни звичайно включають заміну однієї кислоти іншою з подібними характеристиками, такі як заміни у межах наступних груп: валін, аланін і гліцин; лейцин, валін та ізолейцин; аспарагінова кислота і глутамінова кислота; аспарагін і глутамін; серин, цистеїн і треонін; лізин та аргінін; і фенілаланін і тирозин. Неполярні гідрофобні амінокислоти включають аланін, лейцин, ізолейцин, валін, пролін, фенілаланін, триптофан і метіонін. Полярні нейтральні амінокислоти включають гліцин, серин, треонін, цистеїн, тирозин, аспарагін і глутамін. Позитивно заряджені (основні) амінокислоти включають аргінін, лізин і гістидин. Негативно заряджені (кислі) амінокислоти включають аспарагінову кислоту і глутамінову кислоту. Будь-яку заміну одного представника вказаної вище групи полярних, основних або кислих амінокислот іншим представником тієї ж групи можна вважати консервативною заміною. Інші заміни легко можуть ідентифікувати фахівці у даній області. Наприклад, у випадку амінокислоти аланіну заміна може бути вибрана з будь-якої заміни D-аланіном, гліцином, бетааланіном, L-цистеїном і D-цистеїном. У випадку лізину заміною може бути будь-яка з амінокислот: D-лізин, аргінін, D-аргінін, гомо-аргінін, метіонін, D-метіонін, орнітин або D-орнітин. Як правило, замінами у функціонально важливих ділянках, які ймовірно можуть індукувати зміни властивостей ізольованих поліпептидів, є заміни, при яких: (і) полярний залишок, наприклад, 7 UA 100967 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 серин або треонін, замінює гідрофобний залишок, наприклад, лейцин, ізолейцин, фенілаланін або аланін (або замінюється ними); (іі) залишок цистеїну замінює будь-який інший залишок (або замінюється ним); (ііі) залишок, що має електропозитивний бічний ланцюг, наприклад, лізин, аргінін або гістидин, замінює залишок, що має електронегативний бічний ланцюг, наприклад, глутамінову кислоту або аспарагінову кислоту (або замінюється ними); або (iv) залишок, що має великий бічний ланцюг, наприклад, фенілаланін, замінює залишок, що не має такого бічного ланцюга, наприклад, гліцин (або замінюється ним). Ймовірність того, що одна із згаданих вище неконсервативних замін може змінити функціональні властивості білка, також корелює з положенням заміни щодо функціонально важливих ділянок білка: отже, деякі неконсервативні заміни можуть здійснювати невеликий або не здійснювати впливу на біологічні властивості. Винахід також належить до мультимерних поліпептидів, які містять варіантний поліпептид нейбластину. Мультимерні поліпептиди переважно готують у вигляді очищених мультимерних поліпептидів. Приклади мультимерних комплексів включають, наприклад, димерні комплекси. Мультимерний комплекс можна одержати у вигляді гетеромерного або гомомерного комплексу. Таким чином, мультимерний комплекс може бути гетеродимерним комплексом, що включає один варіантний поліпептид нейбластину і один неваріантний нейбластин, або гетеродимерним комплексом, що включає два або більше варіантних поліпептидів нейбластину. У деяких варіантах варіантний поліпептид нейбластину зв'язує GFR  3. Переважно зв'язування варіантного поліпептиду нейбластину стимулює фосфор плювання поліпептиду RET. Щоб визначити, чи зв'язує поліпептид GFR  3, можна провести аналіз, як описано у WO 00/01815. Наприклад, присутність нейбластину у середовищі у надосадах лінії клітин СНО можна описати з використанням модифікованої форми аналізу потрійного комплексу, описаного Sanicola et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94:6238). У даному аналізі можна оцінити GDNFподібні молекули відносно їх здатності опосередковувати зв'язування між позаклітинним доменом RET і різними корецепторами, GFR  1, GFR  2 і GFR  3. Розчинні форми RET і корецептори створюють у вигляді злитих білків. Описаний злитий білок між позаклітинним доменом RET щура і плацентарною лужною фосфатазою (RET-AP) і злитий білок між позаклітинним доменом GFR  -1 щура (описаний в опублікованій заявці W09744356; 27 листопада 1997, включеної у даний опис у вигляді посилання) і Fc-доменом IgGl людини rGFR(  1-Ig) (Sanicola et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94:6238). У деяких варіантах варіантний поліпептид нейбластину підвищує життєздатність нейрона або нормалізує патологічні зміни нейрона або і те і інше. Аналізи для визначення того, чи підвищує поліпептид життєздатність нейрона або нормалізує патологічні зміни нейрона, описані, наприклад, у WO 00/01815. Переважно нейрон є чутливим нейроном, автономним нейроном або допамінергічним нейроном. Синтез і виділення варіантних поліпептидів нейбластину Варіантні поліпептиди нейбластину можна виділити, використовуючи способи, відомі у даній області. Поліпептиди нейбластину природного походження можна виділити з клітин або тканинних джерел відповідно до придатної схеми очищення з використанням стандартних способів очищення білка. Альтернативно варіантні поліпептиди нейбластину можна синтезувати хімічно, використовуючи стандартні способи синтезу пептидів. Синтез коротких амінокислотних послідовностей добре розроблений в області пептидів. Дивись, наприклад, Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis (2d ed., 1984). В іншому варіанті варіантні поліпептиди нейбластину одержують способами на основі рекомбінантної ДНК. Наприклад, молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує варіантний поліпептид нейбластину, можна вбудувати у вектор, наприклад, вектор, який експресує, і нуклеїнову кислоту можна ввести у клітину. Відповідні клітини включають, наприклад, клітини ссавців (такі як клітини людини або клітини яєчника китайського хом'ячка), клітини грибів, дріжджові клітини, клітини комах і бактеріальні клітини. При експресії у рекомбінантній клітині клітину переважно культивують в умовах, що забезпечують експресію варіантного поліпептиду нейбластину. Варіантний поліпептид нейбластину за бажанням можна дістати з клітинної суспензії. Термін "дістати" означає, що варіантний поліпептид видаляють з тих компонентів клітини або культурального середовища, в яких він присутній до діставання. Спосіб діставання може включати одну або декілька стадій згортання білка або очищення. Варіантні поліпептиди нейбластину можна сконструювати, використовуючи будь-який з декількох способів, відомих у даній області. Одним з таких способів є сайт-специфічний мутагенез, при якому змінюють конкретний нуклеотид (або за бажанням невелику кількість конкретних нуклеотидів) для того, щоб змінити одну амінокислоту (або за бажанням невелику кількість заздалегідь визначених амінокислотних залишків) у поліпептиді, що кодується, нейбластину. Фахівцям у даній області зрозуміло, що сайт-специфічний мутагенез є звичайним 8 UA 100967 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 способом, який широко використовується. Насправді велика кількість наборів для сайтспецифічного мутагенезу комерційно доступна. Одним з таких наборів є "набір для сайтспецифічного мутагенезу, що трансформує", який продається Clontech Laboratories (Palo Alto, Calif.). При здійсненні даного винаходу на практиці, якщо не обумовлено особливо, будуть використані звичайні способи клітинної біології, культивування клітин, молекулярної біології, мікробіології, рекомбінантної ДНК, хімії білків та імунології, які відомі фахівцям у даній області. Такі способи описані у літературі. Дивись, наприклад, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition. (Sambrook, Fritsch and Maniatis, eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover, ed), 1985; Oligonucleotide Synthesis, (M. J. Gait, ed.), 1984; патент США No. 4683195 (Mullis et al.); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Haines and S. J. Higgins, eds.), 1984; Transcription and Translation (B. D. Hames and S. J. Higgins, eds.), 1984; Culture of Animal Cells (R. I. Freshney, ed). Alan R. Liss, Inc., 1987; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning (13. Perbal), 1984; Methods in Enzymology, Volumes 154 and 155 (Wu et al., eds), Academic Press, New York; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos, eds.), 1987, Cold Spring Harbor Laboratory; Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, eds.), Academic Press, London, 1987; Handbook of Experiment Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and С С. Blackwell, eds.), 1986; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986. Варіантні злиті білки нейбластину За необхідності варіантний поліпептид нейбластину можна приготувати у вигляді злитого білка. Злиті поліпептидні похідні білків відповідно до винаходу також містять різні структурні форми первинного білка, які зберігають біологічну активність. "Злиття" у значенні, що використовується у даному описі, належить до колінеарного ковалентного зв'язку двох або більше білків або їх фрагментів між їх окремими пептидними кістяками, найбільш переважно за допомогою генетичної експресії молекули полінуклеотиду, що кодує дані білки в одній і тій же рамці зчитування (тобто, "у рамці"). Переважно, щоб білки або їх фрагменти були з різних джерел. Таким чином, переважні злиті білки включають варіантний білок нейбластину або фрагмент, ковалентно зв'язаний з другим компонентом, який не є варіантним нейбластином. Переважно другий компонент одержують з поліпептиду, який існує у вигляді мономеру і достатній для того, щоб додати властивості підвищеної розчинності і/або біодоступності поліпептиду нейбластину. Наприклад, "злиття варіантний нейбластин/сироватковий альбумін людини" є білком, що містить варіантний поліпептид нейбластину відповідно до винаходу або його фрагмент, N-кінець або С-кінець якого зв'язаний у рамці з поліпептидом сироваткового альбуміну людини (дивись Syed et al, Blood, 1997, 89:3243 і Yeh et al., P.N.A.S. USA 1992, 89:1904 і патенти США No. 5876969 і 5302697). Термін "злитий білок" крім того включає в себе варіантний нейбластин, хімічно зв'язаний за допомогою моно- або гетерофункціональної молекули з другим компонентом, який не є варіантним білком нейбластину і одержаний de novo з очищеного білка, як описано нижче. Злиття нейбластин-сироватковий альбумін можна сконструювати з використанням способів, відомих у даній області. Будь-який з ряду перехресно зшивальних агентів, який містить відповідну групу, що реагує з аміногрупою, або групу, що реагує з тіолом, можна використовувати для зв'язування нейбластину з сироватковим альбуміном. Приклади придатних лінкерів включають перехресно зшивальні агенти, реакційноздатні щодо аміну, які вбудовують малеімід, що реагує з тіолом. Вказані лінкери включають, наприклад, SMCC, AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS або GMBS. Інші придатні лінкери вбудовують групу галогенацетату, яка реагує з тіолом. Вказані лінкери включають, наприклад, SBAP, SIA, SIAB, а лінкери, які надають захищений або незахищений тіол для реакції з сульфгідрильними групами, щоб одержати зв'язок, який відновлюється, включають SPDP, SMPT, SATA або SATP, всі з яких є комерційно доступними (наприклад, Pierce Chemicals). Фахівець у даній області може подібним чином представити альтернативні методики, які дозволять зв'язати N-кінець нейбластину з сироватковим альбуміном. Також передбачається, що фахівець у даній області може створити кон'югати з сироватковим альбуміном, для яких N-кінець NBN або тіольний компонент сироваткового альбуміну не є мішенню. За бажанням злиття NBN-сироватковий альбумін можна створити з використанням способів генетичної інженерії, при яких NBN зливають з геном сироваткового альбуміну на його N-кінці, С-кінці або на обох кінцях. 9 UA 100967 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Крім того, передбачається, що з використанням подібної методики можна створити будьякий кон'югат NBN, результатом якого є продукт з пролонгованим часом напівжиття у тварин (включаючи людину). Інші похідні варіантних нейбластинів включають ковалентно зв'язані або агреговані кон'югати варіантного нейбластину або його фрагментів з іншими білками або поліпептидами, наприклад, шляхом синтезу у рекомбінантній культурі у вигляді додаткових N-кінців або С-кінців. Наприклад, кон'югований пептид може являти собою сигнальну (або лідерну) поліпептидну послідовність у N-кінцевій ділянці білка, яка котрансляційно або посттрансляційно керує перенесенням білка від місця його синтезу до місця його функціонування з внутрішньої або зовнішньої сторони клітинної мембрани або стінки (наприклад, лідер альфа-фактора дріжджів). Рецепторні білки нейбластину можуть містити пептиди, що додаються для полегшення очищення або ідентифікації нейбластину (наприклад, злиття гістидин/нейбластин). Амінокислотна послідовність нейбластину також може бути зв'язана з пептидом Asp-Tyr-LysAsp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK) (Hopp et al., Biotechnology 6:1204, 1988). Остання послідовність є високоантигенною і дає епітоп, який оборотно зв'язується специфічним моноклональним антитілом, що забезпечує швидкий аналіз і просте очищення експресованого рекомбінантного білка. Вказана послідовність також специфічно відщеплюється ентерокіназою слизової оболонки бика біля залишку, що безпосередньо слідує за парою Asp-Lys. Варіантні поліпептиди нейбластину, кон'юговані з полімером За необхідності можна використовувати одну молекулу полімеру для кон'югування з поліпептидом нейбластину, хоча також припускається, що можна також зв'язувати декілька молекул полімеру. Композиції кон'югованого нейбластину відповідно до винаходу можна використовувати для застосувань як in vivo, так і не in vivo. Крім того, буде зрозуміло, що у полімері, який кон'югується, можна використовувати будь-які інші групи, компоненти або інші кон'юговані види, які підходять для кінцевого застосування. Як приклад при деяких застосуваннях корисним може бути ковалентне зв'язування з полімером функціонального компонента, який додає полімеру стійкість до деградації УФ або антиоксидантні або інші властивості або характеристики. Як наступний приклад при деяких застосуваннях може бути корисною функціоналізація полімеру для того, щоб зробити його реакційноздатним або особливо здатним до перехресного зшивання, щоб посилити різні властивості або характеристики кон'югованого матеріалу загалом. Таким чином, полімер може містити будь-яку функціональну групу, групи, що повторюються, зв'язки або інші складові структури, які не заважають ефективності композиції кон'югованого мутеїну нейбластину при одержанні планованого результату. Ілюстративні полімери, які можна успішно використовувати для одержання вказаних необхідних характеристик, приведені у даному описі нижче у типових схемах реакцій. У випадку застосувань ковалентно зв'язаного пептиду полімер може бути функціоналізований і потім зв'язаний з вільною амінокислотою(ами) пептиду (дів) з утворенням лабільних зв'язків. У деяких варіантах поліпептид нейбластину зв'язують з полімером за допомогою кінцевої реакційноздатної групи поліпептиду. Альтернативно або додатково поліпептид нейбластину можна зв'язати через аміногрупу бічного ланцюга внутрішнього залишку лізину, наприклад, залишку лізину, введеного в амінокислотну послідовність поліпептиду нейбластину природного походження. Таким чином, кон'югати також можуть бути розгалуженими від некінцевих реакційноздатних груп. Полімер з реакційноздатною групою(ами) у даному описі називають "активованим полімером". Реакційноздатна група вибірково реагує з вільною аміногрупою або іншими реакційноздатними групами білка. Зв'язування активованого полімеру може відбуватися біля будь-якої доступної аміногрупи нейбластину, такої як альфа-аміногрупа або епсілон-аміногрупа залишку лізину або залишків, введених в амінокислотну послідовність поліпептиду нейбластину або його варіанту. Вільні карбоксильні групи, відповідним чином активовані карбонільні групи, гідроксил, гуанідил, імідазол, окислені вуглеводні компоненти і меркаптогрупи нейбластину (якщо вони є) також можна використовувати як місця зв'язування. Звичайно використовують приблизно від 1,0 до 10 моль активованого полімеру на моль білка в залежності від концентрації білка. Кінцева кількість являє собою баланс між максимізацією ступеня реакції при мінімізації неспецифічних модифікацій продукту і в той же час визначенням хімічних складів, які будуть підтримувати оптимальну активність, одночасно з оптимізацією, якщо це можливо, часу напівжиття білка. Переважно зберігається щонайменше приблизно 50 % біологічної активності білка і найбільш переважно зберігається близько 100 %. 10 UA 100967 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Реакції можна здійснювати будь-яким відповідним способом, що використовується для здійснення реакцій біологічно активних речовин з інертними полімерами, переважно приблизно при рН 5-8, наприклад, рН 5, 6, 7 або 8, у тому випадку, якщо реакційноздатні групи являють собою альфа-аміногрупу на N-кінці. Загалом, спосіб полягає в одержанні активованого полімеру і потім здійсненні реакції білка з активованим полімером, щоб одержати розчинний білок, придатний для композиції. Вказану вище реакцію модифікації можна здійснити декількома способами, які можуть включати одну або декілька стадій. Полімер можна зв'язати з варіантним поліпептидом нейбластину з використанням способів, відомих у даній області. Наприклад, в одному варіанті поліалкіленгліколевий компонент зв'язують з групою лізину поліпептиду нейбластину або варіантного поліпептиду нейбластину. Зв'язування з групою лізину можна здійснити з використанням активованого складного ефіру Nгідроксилсукциніміду (NHS), такого як сукцинімідилсукцинат (SS-PEG) і сукцинімідилпропіонат (SPA-PEG) ПЕГ. Відповідні поліалкіленгліколеві компоненти включають, наприклад, карбоксиметил-NHS, норлейцин-NHS, SC-ПЕГ, трезилат, альдегід, епоксид, карбонілімідазол і карбонат PNP. Сукцинімідиловий компонент може бути замінений додатковими реагуючими з аміном лінкерами ПЕГ. Вказані лінкери включають, наприклад, ізотіоціанати, нітрофенілкарбонати, епоксиди і карбонати бензотриазолу. Переважно вибирають умови, щоб максимізувати вибірковість і ступінь реакції. Можна використовувати лінійні та розгалужені форми ПЕГ, а також інші форми алкілу. Довжина ПЕГ може варіювати. Розмір найбільш звичайних форм варіює від 2 кД до 100 кД. Поряд з тим, що у даних прикладах повідомляється, що цілеспрямоване пегилювання на N-кінці не впливає на фармакокінетичні властивості, той факт, що речовина зберігала фізіологічну функцію, свідчить про те, що модифікація у сайті або сайтах, вказаних у даному описі, не здійснює негативного впливу. Тому при створенні мутантних форм NBN, які можуть забезпечувати додаткові сайти зв'язування, за допомогою інсерції залишків лізину, вважається допустимим, що можливим результатом буде те, що вказані форми можуть бути пегильовані як біля лізину, так і на N-кінці. За необхідності варіантні поліпептиди нейбластину можуть містити мітку, наприклад, мітку, яку згодом можна вивільнити за допомогою протеолізу. Таким чином, представлений лізином компонент можна вибірково модифікувати спочатку внаслідок реакції варіанту, що містить hisмітку, з лінкером з низькою молекулярною масою, таким як реагент Траута (Pierce), який буде реагувати як з лізином, так і з N-кінцем, і потім вивільняючи his-мітку. Потім поліпептид буде містити вільну SH-групу, яку можна вибірково модифікувати ПЕГ, що містить реагуючу з тіолом головну групу, таку як група малеіміду, вінілсульфонова група, галогенацетатна група або вільна або захищена група SH. Реагент Траута можна замінити будь-яким лінкером, який буде забезпечувати специфічний сайт для зв'язування ПЕГ. Як приклад реагент Траута можна замінити SPDP, SMPT, SATA або SATP (всі доступні з Pierce). Подібним чином можна здійснювати реакцію білка з реакційноздатним щодо аміну лінкером, який вбудовує малеімід (наприклад, SMCC, AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS або GMBS), галогенацетатну групу (SBAP, SIA, SIAB) або вінілсульфонову групу, і здійснювати реакцію одержаного у результаті продукту з ПЕГ, який містить вільну SH. Єдине обмеження розміру лінкеру, який використовують, полягає у тому, щоб він не міг блокувати подальше видалення N-кінцевої мітки. Таким чином, в інших варіантах поліалкіленгліколевий компонент зв'язують з групою цистеїну поліпептиду нейбластину або варіантного поліпептиду нейбластину. Зв'язування можна здійснити, наприклад, з використанням малеімідної групи, вінілсульфонової групи, галогенацетатної групи і тіольної групи. З полімером може бути зв'язаний один або декілька сайтів варіантного поліпептиду нейбластину. Наприклад, з полімером можуть бути зв'язані один, два, три, чотири або п'ять ПЕГ-компонентів. У деяких варіантах ПЕГ-компонент зв'язують з амінокінцем і/або амінокислотами 14, 39, 68 і 95 поліпептиду нейбластину, пронумерованими, як описано у таблиці 1. У переважних варіантах варіантний поліпептид нейбластину у композиції має більш тривалий час напівжиття у сироватці у порівнянні з часом напівжиття варіантного поліпептиду за відсутності полімеру. Альтернативно або додатково варіантний поліпептид нейбластину у композиції зв'язує GFRa3, активує RET, нормалізує патологічні зміни нейрона або підвищує життєздатність нейрона або виконує комбінацію вказаних фізіологічних функцій. У переважних варіантах композицію готують у вигляді стабільного водорозчинного кон'югованого комплексу поліпептиду нейбластину або варіантного поліпептиду нейбластину, що містить поліпептид нейбластину або варіантний поліпептид нейбластину, зв'язаний з 11 UA 100967 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 поліетиленгліколевим компонентом. За бажанням поліпептид нейбластину або варіантний полі пептид нейбластину можна зв'язати з поліетиленгліколевим компонентом за допомогою лабільного зв'язку. Лабільний зв'язок можна розщепити, наприклад, при біохімічному гідролізі, протеолізі або сульфгідрильному розщепленні. Наприклад, зв'язок можна розщепити в умовах in vivo (фізіологічних умовах). Фармацевтичні композиції, що містять кон'югати варіантний нейбластин-полімер Також представлена фармацевтична композиція, що містить кон'югат варіантний нейбластин-полімер відповідно до даного винаходу. "Фармацевтичну композицію" у значенні, що використовується у даному описі, визначають як композицію, яка містить білок або кон'югат нейбластину відповідно до винаходу, диспергований у фізіологічно прийнятному наповнювачі, яка необов'язково містить один або декілька інших фізіологічно сумісних інгредієнтів. Таким чином, фармацевтична композиція може містити ексципієнт, такий як вода, одну або декілька неорганічних речовин, цукрів, детергентів і один або декілька носіїв, таких як інертний білок (наприклад, гепарин або альбумін). Кон'югати полімер-нейбластин відповідно до винаходу можна вводити як такі, а також у формі їх фармацевтично прийнятних складних ефірів, солей та інших фізіологічно функціональних похідних. У таких фармацевтичних і лікарських композиціях кон'югат варіантного нейбластину переважно використовують разом з одним або декількома фармацевтично прийнятними носіями і необов'язково будь-якими іншими терапевтичними інгредієнтами. Носій(ї) повинен бути фармацевтично прийнятним у значенні сумісності з іншими інгредієнтами композиції і не бути занадто небезпечним для реципієнта. Варіантний нейбластин вводять у кількості, ефективній для досягнення необхідної фармакологічної дії або корисного лікарського ефекту, які описані у даній заявці, і у кількості, придатній для досягнення необхідної біодоступної дози або концентрації in vivo. Композиції включають композиції, придатні для парентерального, а також для непарентерального введення, і конкретні способи введення включають пероральне, ректальне, трансбукальне, місцеве, назальне, очне, підшкірне, внутрішньом'язове, внутрішньовенне, трансдермальне, інтратекальне, внутрішньосуглобове, внутрішньоартеріальне, підарахноїдальне, бронхіальне, лімфатичне, вагінальне та внутрішньоматкове введення. Переважні композиції, придатні для аерозольного і парентерального введення, як локально, так і системно. У тому випадку, коли варіантний нейбластин використовують у композиції, яка містить рідкий розчин, композицію переважно можна вводити перорально, бронхіально або парентерально. У випадку використання нейбластину у рідкій суспензійній композиції або у вигляді порошку у біосумісній композиції носія, композицію переважно можна вводити перорально, ректально або бронхіально. Альтернативно її можна вводити назально або бронхіально за допомогою розпилення порошку у газі-носії, щоб утворити газоподібну дисперсію порошку, який вдихає пацієнт з дихального контуру, що містить відповідний пристрій для розпилення. Композиції, які містять білки відповідно до даного винаходу, зручно можуть бути представлені у дозованих лікарських формах і можуть бути приготовані будь-яким із способів, добре відомих в області фармації. Такі способи, як правило, включають стадію введення активного інгредієнта(тів) в асоціацію з носієм, до складу якого входить один або декілька додаткових інгредієнтів. Звичайно композиції готують шляхом одержання однорідної і тісної асоціації активного інгредієнта(ів) і рідкого носія, тонко диспергованого твердого носія або обох носіїв і потім за необхідності, формуванням продукту у вигляді дозованих форм необхідної композиції. Композиції відповідно до даного винаходу, придатні для перорального введення, можуть бути представлені у вигляді дискретних одиниць, таких як капсули, облатки, таблетки або пастилки, кожна з яких містить заздалегідь визначену кількість активного інгредієнта у вигляді порошку або гранул; або у вигляді суспензії у водному розчині або неводному розчині, такої як сироп, еліксир, емульсія або рідкі ліки, що дозуються. Композиції, придатні для парентерального введення, для зручності містять стерильний водний препарат активного кон'югата, який переважно є ізотонічним крові реципієнта (наприклад, фізіологічний розчин солі). Такі композиції можуть містити агенти, що суспендують, і загусники або інші системи мікрочастинок, які розроблені для цілеспрямованої доставки сполуки до компонентів крові або одного або декількох органів. Композиції можуть бути представлені у формі одноразової дози або у формі багаторазових доз. 12 UA 100967 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Композиції назального спрею містять очищені водні розчини активного кон'югата з консервантами і агентами для ізотонічності. Такі композиції переважно доводять до рН та ізотонічного стану, сумісного з мембранами слизової оболонки носа. Композиції для ректального введення можуть бути представлені у вигляді супозиторія з відповідним носієм, таким як олія какао, гідрогенізовані жири або гідрогенізована жирна карбонова кислота. Очні композиції, такі як очні краплі, готують способом, подібним до способу одержання назального спрею, за винятком того, що рН і фактори для ізотонічності переважно доводять так, щоб вони підходили для ока. Місцеві композиції містять кон'югати відповідно до винаходу, розчинені або суспендовані в одному або декількох середовищах, таких як мінеральне масло, гас, багатоатомні спирти або інші основи, що використовуються для місцевих фармацевтичних композицій. Крім вказаних вище інгредієнтів композиції відповідно до даного винаходу можуть додатково містити один або декілька допоміжних інгредієнтів, вибраних з розріджувачів, буферів, коригентів, агентів, що дезінтегрують, поверхнево-активних речовин, загусників, речовин, що ковзають, консервантів (включаючи антиоксиданти) і тому подібного. Вказані вище міркування також застосовні до злитих білків нейбластину відповідно до винаходу (наприклад, злиття нейбластин-HSA). Таким чином, даний винахід охоплює одержання придатних злитих білків для стабілізації кон'югата варіантного нейбластину у розчині in vitro як переважне ілюстративне застосування винаходу. Злиті білки можна використовувати, наприклад, для того, щоб підвищити стійкість варіантного поліпептиду нейбластину до деградації ферментами і надати способи підвищення терміну зберігання, стабільності при кімнатній температурі і тому подібного. Зрозуміло, що вказані вище міркування також застосовні до злитих білків нейбластин-сироватковий альбумін (включаючи злиті білки нейбластин людини-сироватковий альбумін людини) відповідно до винаходу. Способи лікування Варіантні поліпептиди нейбластину, а також їх злиті білки або кон'югати можна використовувати для лікування або ослаблення розладу або захворювання в організмі існуючих тварин, переважно ссавця, більш переважно примата, включаючи людину, коли вказаний розлад або захворювання піддається впливу активності нейротрофічних агентів. Композиції відповідно до винаходу можна використовувати безпосередньо, наприклад, за допомогою фармацевтичних композицій, які ін'єкують, проковтують або імплантують для лікування патологічного процесу, що відповідає на поліпептиди нейбластину. Композиції можна використовувати для ослаблення розладу або захворювання в організмі існуючих тварин, включаючи людину, коли розлад або захворювання піддається впливу активності нейротрофічних агентів. Розладом або захворюванням, зокрема, може бути пошкодження нервової системи, викликане травмою, хірургічною операцією, ішемією, інфекцією, метаболічними захворюваннями, недостатністю харчування, злоякісним новоутворенням або токсичними агентами, і генетичними або ідіопатичними процесами. Пошкодження, зокрема, може відбутися у чутливих нейронах або клітинах ретинального ганглія, включаючи нейрони у гангліях дорзальних корінців спинного мозку, або у будь-якій з наступних тканин: ганглій колінця, позачерепний ганглій і вузлуватий ганглій; присінковозавитковий комплекс восьмого черепно-мозкового нерва; вентролатеральний полюс верхньощелепової-нижньощелепової частки трійчастого ганглія; і мезенцефалічне ядро трійчастого нерва. У переважному варіанті способу відповідно до винаходу захворюванням або розладом є нейродегенеративне захворювання, до якого залучені пошкоджені і травмовані нейрони, а саме травматичні пошкодження периферичних нервів, довгастого мозку і/або спинного мозку, пошкодження нейронів при церебральній ішемії, невропатія і особливо периферична невропатія, травма або пошкодження периферичного нерва, ішемічнийінсульт, гостре пошкодження головного мозку, гостре пошкодження спинного мозку, пухлини нервової системи, множинний склероз, вплив нейротоксинів, метаболічні захворювання, такі як діабет або дисфункція нирок, і пошкодження, викликане інфекційними агентами, нейродегенеративні розлади, що включають хворобу Альцгеймера, хворобу Хантінгтона, хворобу Паркінсона, синдроми з виявленнями хвороби Паркінсона, супрануклеарний параліч, що прогресує (синдром Стіла-Річардсона-Ольшевського), оливо-понто-церебелярну дегенерацію (ОПЦД), синдром Шая-Дрейджера (множинна системна атрофія), комплекс деменція-паркінсонізм (Гуамтип), бічний аміотрофічний склероз, або будь-яке інше природжене або нейродегенеративне захворювання, і погіршення пам'яті, зв'язане з деменцією. 13 UA 100967 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У переважному варіанті можна лікувати чутливі нейрони і/або нейрони автономних систем. Зокрема, можна лікувати ноцицептивні та механорецептивні нейрони, більш конкретно нейрони з дельта-волокнами і С-волокнами. Крім того, можна лікувати симпатичні і парасимпатичні нейрони автономної системи. В іншому переважному варіанті можна лікувати захворювання мотонейронів, такі як бічний аміотрофічний склероз ("БАС") і спінальна аміотрофія. У ще одному переважному варіанті молекули нейбластину відповідно до даного винаходу можна використовувати для прискорення відновлення нервів після травматичного ураження. Альтернативно або додатково у приведених у даному описі способах можна використовувати канал керування нервом за допомогою матриксу, що містить варіантні поліпептиди нейбластину або злиття або кон'югати варіантних поліпептидів нейбластину. Такі канали керування нервами заявлені, наприклад, у патенті США No. 5834029, включеному у даний опис у вигляді посилання. У переважному варіанті вказані у даному описі композиції (і фармацевтичні композиції, які їх містять) використовують для лікування периферичних невропатій. Серед периферичних невропатій, які передбачається лікувати молекулами відповідно до даного винаходу, знаходяться індуковані травмами невропатії, наприклад, такі, які викликані фізичним пошкодженням або патологічним станом, фізичне пошкодження головного мозку, фізичне пошкодження спинного мозку, інсульт, зв'язаний з пошкодженням головного мозку, і неврологічні порушення, зв'язані з нейродегенерацією. Також включені у даний винахід невропатії, які є вторинними після інфекції, впливу токсину і впливів лікарського засобу. Крім того, у даний винахід включені невропатії, які є вторинними після системного або метаболічного захворювання. Заявлені у даному описі композиції також можна використовувати для лікування невропатій, індукованих хіміотерапією (таких як невропатії, викликані надходженням хемотерапевтичних засобів, наприклад, таксолу або цисплатину); невропатій, індукованих токсинами, невропатій, індукованих лікарськими засобами, невропатій, індукованих недоліком вітамінів; ідіопатичних невропатій; та діабетичних невропатій. Дивись, наприклад, патенти США 5496804 і 5916555, кожний з яких включений тут у вигляді посилання. Додатковими станами, які можна лікувати з використанням приведених у даному описі композицій, є мононевропатії, множинні мононевропатії і поліневропатії, включаючи аксональну невропатію і невропатію, що димієлінізує, з використанням вказаних у даному описі композицій. В іншому переважному варіанті композиції відповідно до винаходу (і фармацевтичні композиції, які їх містять) використовують для лікування різних захворювань ока, включаючи руйнування фоторецепторів сітківки у пацієнтів, які страждають дегенерацією жовтої плями, пігментним ретинітом, глаукомою та подібними захворюваннями. Винахід буде далі ілюстрований наступними необмежувальними прикладами. Приклад 1 - Біодоступність пегильованого на N-кінці нейбластину Виявили, що одержаний у клітинах СНО рекомбінантний нейбластин людини зазнає швидкого кліренсу з циркуляції у випадку внутрішньовенного введення щурам. Після підшкірного введення не виявляли білка у сироватці. Щоб підвищити біодоступність нейбластину конструювали пегильовані форми. Оскільки у послідовності NBN не зустрічаються лізини, то результатом специфічних відносно аміну хімічних реакцій пегилювання буде пегилювання поліпептиду NBN по його амінокінцю. Отже, для кожного димеру нейбластину необхідно зв'язати два ПЕГ-компоненти. Таким чином, спочатку безпосередньою мішенню ПЕГ-форм був N-кінець за рахунок специфічних відносно аміну хімічних реакцій. Несподівано навіть пегилювання двома зв'язаними ПЕГ з М.м. 20 кД було мало корисним відносно часу напівжиття, що свідчить про те, що механізм, який лежить в основі шляху кліренсу, домінував над збільшенням часу напівжиття, якого очікували при пегилюванні. Приклад 2 - Конструювання пегильованого мутеїну нейбластину N95K Потім визначали біодоступність мутантних форм NBN, пегильованих по внутрішніх амінокислотних залишках. Конструювали серію з чотирьох мутантів із замінами залишків природного походження у положеннях 14, 39, 68 і 95, щоб вбудувати лізин у вибрані місця у послідовності. Вказані лізини могли б забезпечувати альтернативні сайти для зв'язування ПЕГ. Вказані сайти вибирали з використанням кристалічної структури GDNF (Nat. Struct. Biol. 4:435-8, 1997) як основи для ідентифікації поверхневих залишків і мутагенного дослідження химери персефін/нейбластин (J. Biol. Chem. 275:3412-20, 2000), щоб ідентифікувати функціонально важливі ділянки структури, які не треба зачіпати. Дві мутації (R39 і R68) були цілеспрямовано введені у ділянку, яка на основі розподілу позитивних зарядів на поверхні, може являти собою сайт зв'язування гепарину, властивість білка, яка ймовірно здійснює внесок в його швидкий кліренс. Третій сайт був цілеспрямовано 14 UA 100967 C2 5 10 15 20 25 введений у N95, сайт природного глікозилування NBN дикого типу. Даний сайт модифікується у природних умовах складною вуглеводною структурою. Таким чином, очікувалося, що ПЕГмодифікація у вказаному сайті не порушить функцію. Четвертий сайт (R14) вибрали у ділянці, що не містить яких-небудь інших модифікацій. Для вказаних у даному описі досліджень вибрали мутант, в якому залишок аспарагіну у положенні 95 замінювали лізином ("мутант N95K"). Конструювали чотири різних мутеїни нейбластину щура, що містять одну або декілька змін у послідовності поліпептиду нейбластину щура дикого типу. Мутеїни включають мутеїн N95K з однією зміною і мутеїни, що містять одиничні заміни в інших сайтах амінокислотної послідовності нейбластину щура: R14K; R68K і R39K. У номенклатурі "X1N1×2" X1 належить до амінокислоти поліпептиду нейбластину дикого типу, N 1 належить до номеру положення амінокислоти Х1 у послідовності, яка пронумерована відповідно до SEQ ID NO: 1. Х 2 належить до амінокислоти, яка заміщує амінокислоту дикого типу у вказаному пронумерованому положенні послідовності. Щоб сконструювати мутацію нейбластину N95K, здійснювали сайт-специфічний мутагенез у рСМВ020, плазміді, що кодує нейбластин щура дикого типу. Нуклеотидна послідовність нейбластину дикого типу і амінокислотна послідовність поліпептиду, що кодується нею, представлені нижче: Мутагенез рСМ020 з використанням олігонуклеотидів KD2-310 і KD3-211 приводив до утворення плазміди рСМВ027: KD2-310 5'GTATCTTTCATGGACGTAAAGTCTACATGGAGAACCGTAGATCATCTATCTGCAACC-3' (SEQ ID NO: 6) KD2-311 5'-GGTTGCAGATAGATGATCTACGGTTCTCCATGTAGACTTTA CGTCCATGAAAGATAC-3' (SEQ ID NO: 7) У рСМВ027, кодон, що кодує аспарагін у положенні 95, замінили кодоном, який кодує лізин. 15 UA 100967 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Мутеїн нейбластину R14K утворювали заміною ко дону, що кодує аргінін, у положенні 14 послідовності рСМВ020, яка кодує нейбластин, кодоном, що кодує лізин. Сайт-специфічний мутагенез здійснювали у рСМВ020 з використанням олігонуклеотидів KD3-254 і KD3-255: KD3-254 5'-GCTGGAACTCGCAGCTCTCGTGCTCGTGCAACGGATGCAAAAGGCTGTCG-3' (SEQ ID NO: 8) KD2-255 5'-CGACAGCCTTTTGCATCCGTTGCACGAGCACGAGAGCTGCGAGTTCCAGC-3' (SEQ ID NO: 9) Одержана у результаті конструкція була названа рСМВ029. Мутеїн нейбластину R68K утворювали заміною кодону, що кодує аргінін, у положенні 68 послідовності рСМВ020, яка кодує нейбластин, кодоном, що кодує лізин. Сайт-специфічний мутагенез здійснювали у рСМВ020 з використанням олігонуклеотидів KD3-258 і KD3-259: KD3-258 5'-GGAGCCGGAGCACTAAAATCTCCCCGGGATCTAGACC-3' (SEQ ID NO: 10) KD3-259 5'-GGTCTAGATCCCGGGGGAGATTTTAGTGCTCCGGCTCC-3' (SEQ ID NO: 11) Одержана у результаті конструкція була названа рСМВ030. Мутеїн нейбластину R39K утворювали заміною аргініну лізином у положенні амінокислоти 39 послідовності рСМВ020, яка кодує нейбластин. Сайт-специфічний мутагенез рСМВ020 здійснювали з використанням олігонуклеотидів KD3-256 і KD3-257: KD3-256 5'-GACGAATTAATTAAGTTTCGTTTTTGTTCAGG-3' (SEQ ID NO: 12) KD3-257 5'-CCTGAACAAAAACGAAACTTAATTAATTCGTC-3' (SEQ ID NO: 13) Для експресії і очищення плазміду, яка кодує мутеїн NBN N95K щура, експресували в Е. coli у вигляді міченого His злитого білка з сайтом розщеплення ентерокіназою, що безпосередньо прилягав до початку послідовності зрілого 113-амінокислотного NBN. Е. coli вирощували у ферментері об'ємом 500 л і готували заморожену клітинну масу. Клітини Е. coli лізували у пресфільтрі Manton Gaulin, і NBN NK щурів діставали з нерозчинної промитої фракції осаду. NBN екстрагували з осаду гуанідинхлоридом, піддавали згортанню і his-мітку видаляли ентерокіназою. Потім продукт піддавали хроматографії на Ni NTA-агарозі (Qiagen) та на катіонообмінній смолі WP СВХ Bakerbond. Оброблення ентерокіназою his-міченого продукту приводило до аберантного розщеплення білка біля аргініну у положенні 7 зрілої послідовності. Одержаний у результаті продукт des-l-7NBN був повністю активним в ELISA KIRA і структурно не відрізнявся від зрілої форми за своєю чутливістю до індукованої гуанідином денатурації і тому був використаний для подальшої роботи. NBN N95K щура пегилювали у середньому 3,3 ПЕГ-компонентів/молекулу, використовуючи як реагент метоксиполі(етиленгліколь)сукцинімідилпропіонат (SPA-ПЕГ) з молекулярною масою 10000 Д. Одержаний у результаті пегильований продукт всебічно характеризували, включаючи аналіз за допомогою електрофорезу у SDS-ПААГ, ексклюзійну хроматографію по розміру (SEC), обернено-фазову ВЕРХ, мас-спектрометрію з лазерною десорбцією/іонізацією з матриці (MALD/IMC), картування пептидів, оцінку активності в ELISA KIRA і визначення вмісту ендотоксину. Чистота продукту NBN N95K перед пегилюванням, виміряна за допомогою SDSПААГ і SEC, складала більше 95 %. Продукт NBN N95K в умовах, які не відновлюють, мігрував у вигляді димеру, що відповідало його розрахованій структурі. Після пегилювання одержаний продукт складався з серії модифікованих аддуктів, що містять 2 ПЕГ/молекулу - 5 % продукту, З ПЕГ/молекулу - 60 % продукту, 4 ПЕГ/молекулу - 30 % продукту і декілька мінорних форм більш високої маси. У пегильованому зразку не було ознак агрегатів. Залишкові рівні немодифікованого NBN у продукті були нижче меж кількісного вимірювання. Вміст ендотоксину у матеріалі звичайно складає менше 1 EU/мг. Питома активність пегильованого NBN в ELISA KIRA складає 10 нМ. Пегільований продукт готували при концентрації 1,1 мг/мл у PBS, рН 6,5. Матеріал, який за ефективністю подібний до NBN дикого типу, можна постачати у вигляді замороженого розчину, який зберігають при -70 °C. Мутеїни R14K, R39K і R68K експресували в Е. соlі і їх можна піддавати таким же способам очищення, пегилювання та оцінки функції, які описані вище для N95K-NBN. Приготування пегильованого NBN 230 мл підданого згортанню NBN N95K щура (2,6 мг/мл), який одержували в Е. соlі і зберігали при 4 °C в 5 мМ фосфаті натрію, рН 6,5, 100 мМ NaCl, розбавляли 77 мл води, 14,4 мл 1 М HEPES, рН 7,5 і 2,8 г (кінцева концентрація 10 мг/мл) ПЕГ SPA, 10000 Д (Shearwater Polymers, Inc.). Зразок інкубували при кімнатній температурі протягом 4 годин у темряві, потім обробляли 5 мМ імідазолу (кінцева концентрація), фільтрували і зберігали протягом ночі при 4 °C. Продукт готували у двох партіях, одна з яких містила 130 мл NBN N95K по об'єму, а інша містила об'єм 100 мл. Пегільований NBN очищали від реакційної суміші на колонці Fractogel EMD SO3 (M) (EM Industries). Розгонку на колонці проводили при кімнатній температурі. Всі 16 UA 100967 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 буфери готували апірогенно. До реакційної суміші додавали хлорид натрію до кінцевої концентрації 87 мМ і зразок наносили на колонку Fractogel об'ємом 45 мл (внутрішній діаметр 5 см). Колонку промивали одним об'ємом колонки 5 мМ фосфату натрію, рН 6,5, 80 мМ NaCl, потім трьома аліквотами об'ємом, що дорівнює об'єму колонки, 5 мМ фосфату натрію, який містить 50 мМ NaCl. Смолу переносили на колонку діаметром 2,5 см і пегильований NBN елюювали з колонки шістьма аліквотами об'ємом по десять мл, які містять 5 мМ фосфат натрію, рН 6,5, 400 мМ NaCl, трьома аліквотами, що містять 500 мМ NaCl, і шістьма аліквотами, які містять 600 мМ NaCl. Елюйовані фракції аналізували відносно вмісту білка по оптичній щільності при 280 нм і потім відносно ступеня модифікації за допомогою електрофорезу в SDS-ПААГ. Вибрані фракції об'єднували, фільтрували через фільтр з діаметром пор 0,2 мкм і розбавляли водою до 1,1 мг пегильованого NBN щурів/мл. Після оцінки рівнів ендотоксину в окремих партіях їх об'єднували і повторно фільтрували через 0,2 мкм-мембрану. Кінцеву речовину ділили на аліквоти і зберігали при -70 °C. УФ-спектр очищеного пегильованого NBN NK УФ-спектр (240-340 нм) пегильованого NBN NK вимірювали на чистому зразку. Зразок аналізували у трьох повторах. Пегильований зразок виявляв максимум поглинання при 275-277 нм і мінімум поглинання при 247-249 нм. Одержаний результат узгоджується з результатом, який спостерігається у випадку немодифікованої проміжної сполуки основної маси NBN. Концентрацію білка пегильованого продукту оцінювали на основі спектра, використовуючи коефіцієнт екстинкції  280 0,1%  0,50 . Концентрація білка основної маси пегильованого NBN складала 1,1 мг/мл. У зразку не було каламутності, що очевидно, виходячи з відсутності поглинання при 320 нм. Характеристика пегильованого NBN NK за допомогою електрофорезу в SDS-ПААГ. Аліквоти пегильованого NBN, щомістять 3; 1,5; 0,75 і 0,3 мкг продукту, піддавали аналізу у SDS-ПААГ в 4-20 % градієнтному гелі (Ow1). Гель забарвлювали Кумасі яскраво-синім R-250. Паралельно розганяли маркери молекулярної маси (GIBCO-BRL). Аналіз у SDS-ПААГ пегильованого NBN NK в умовах, що не відновлюють, виявив серію смуг, які відповідають модифікаціям 2, 3, 4 і більше 4 ПЕГ/молекулу. Основна смуга з видимою масою 98 кД містить 3 ПЕГ/молекулу. В очищеному пегильованому продукті немодифікований NBN не виявляли. Наявність суміші продуктів з 2, 3 і 4 зв'язаними ПЕГ підтверджували за допомогою MALDI-мас-спектрометричного аналізу. Співвідношення продуктів, які містять 2, 3 і 4 ПЕГ, визначали за допомогою денситометрії і встановили, що воно дорівнює 7, 62 і 30 процентів від сумарної кількості, відповідно. Характеристика пегильованого NBN за допомогою ексклюзійної хроматографії по розміру Пегільований NBN піддавали ексклюзійній хроматографії по розміру на аналітичній колонці Superose 6 HR10/30 FPLC з використанням як рухомої фази 5 мМ MES, рН 6,5, 300 мМ NaCl. Розгонку на колонці проводили із швидкістю 20 мл/годину. Елюйовані фракції контролювали відносно оптичної щільності при 280 нм. Пегільований NBN елюювали у вигляді окремого піку з видимою молекулярною масою приблизно 200 кД відповідно до великого гідродинамічного об'єму ПЕГ. Не спостерігали ознак агрегатів. Вільний NBN, який елююється з видимою молекулярною масою приблизно 30 кД, у препараті не виявляли. Аналіз пегильованого NBN обернено-фазовою ВЕРХ Пегільований NBN NK піддавали обернено-фазовій ВЕРХ на колонці Vydac С4 (5 мкм, 1 × 250 мм). Колонку обробляли, використовуючи 60 мм градієнт від 40 до 60 % В (буфер А: 0,1 % ТФУ, буфер В: 75 % ацетонітрил/0,085 % ТФУ). Потік, що витікає з колонки, контролювали відносно оптичної щільності при 214 нм і збирали фракції для подальшого аналізу. Пегильований NBN NK фракціонували на його різні ди-(60,5 мм), три-(63,3 мм) і тетра-(67,8 мм) пегильовані компоненти обернено-фазовою ВЕРХ на колонці С4. Відносна інтенсивність піків свідчить, що співвідношення компонентів складають 5,4; 60,5 і 30,1 %, відповідно. Інтенсивності піків підтверджували за допомогою MALDI-MC. Не було ознак непегильованого NBN NK (елююється при 5-15 мм) у продукті. Аналіз пегильованого NBN мас-спектрометрією Пегільований NBN NK знесолювали на С4 Zip Tip і аналізували масспектрометрією у часопролітному мас-спектрометрі з лазерною десорбцією/іонізацією з матриці (MALDI-TOF) Voyager-DE™ STR (PerSeptive Biosystems) з використанням як матриці синапінової кислоти. 0,5 мкл очищеного білка змішували з 0,5 мкл матриці на пластині для мішеней. Мас-спектрометрія пегильованого NBN виявила форми трьох аддуктів з одним і двома зарядами. Маси, що спостерігаються, 43803 Д, 54046 Д і 64438 Д відповідають модифікаціям 2, 3 і 4 ПЕГ/молекулу. Аналіз пегильованого NBN за допомогою картування пептиду 17 UA 100967 C2 5 10 15 Специфічність реакції пегилювання оцінювали за допомогою картування пептидів. Пегільований NBN розділяли на ди-, три- і тетрапегиільовані компоненти, які потім відновлювали, алкілували і далі розділяли на їх одноланцюгові компоненти за допомогою ВЕРХ на колонці С4. Одержані компоненти і відновлений та алкілований немодифікований NBN NK як контроль розщеплювали Asp-N-протеїназою і одержані у результаті продукти розщеплення фракціонували обернено-фазовою ВЕРХ на колонці Vydac С18 (5 мкм, 1 × 250 мм), використовуючи 60 мм - градієнт від 0 до 60 % В (буфер А: 0,1 % ТФУ, буфер В: 75 % ацетонітрил/0,085 % ТФУ). Потік, що витікає з колонки, контролювали відносно оптичної щільності при 214 нм. Послідовність NBN щурів містить чотири внутрішніх аспарагінових кислоти і тому передбачається, що вона дає простий профіль розщеплення у випадку розщеплення ендопротеїназою Asp-N. Всі піки з продукту розщеплення NBN NK щура ендопротеїназою Asp-N ідентифікували мас-спектрометрією і/або N-кінцевим секвенуванням за Едманом і таким чином пептидну карту можна використовувати як простий засіб для дослідження сайтів модифікації по наявності або відсутності піку. Ідентифікація різних піків сумарно показана у таблиці 3 нижче. Таблиця 3 Пік за часом утримання (мм) 388 407 446 Маса, що спостерігається (середнє) 1261 1 (М) 1090 9 2508 4 460 Теоретична маса (середнє) Розподіл 1262,4 1092,2 2508,9 102-113 93-101 35-54 2437 0 2437,8 12-34 514 3456 7 3456,0 519 4134 4 532 4136 3* 55-86 55-92 (оксид) 55-92 4120,8 Амінокислотна послідовність DHLSATACGCLG DVKSTWRTV DELIRFRFCSGSCRRARSPH DARGCRLRSQLVPVSALGL GHSS DLSLAS CRPTRY DLSLAS CRPTRYEAVSFM DLSLAS CRPTRYEAVSFM (М): monolostopic маса *: у результаті окислення пептиду, що містить метіонін, при MALDI. 20 25 30 35 40 Оскільки NBN існує у вигляді гомодимеру, продукт NBN NK щура містить чотири можливих сайти для пегилювання, два N-кінцевих аміни з кожного ланцюга і два сайти N95K, які були створені у конструкції. У пептидній карті дипегильованого ланцюга тільки пік, який містить пептид з мутацією NK, був змінений ПЕГ-модифікацією. ПЕГ-модифікація не впливала ні на які інші піки. Таким чином, дані картування свідчать про те, що ПЕГ-компонент специфічно зв'язаний з даним пептидом і не зв'язаний ні з якими іншими пептидами, які піддавали скринінгу. Другий можливий сайт зв'язування, N-кінець, знаходиться на пептиді, який має довжину тільки з трьох амінокислот і не виявляється у пептидній карті. Припускається, що додаткове зв'язування ПЕГ відбувається у даному сайті. Відповідно до цієї точки зору невеликий процент NBN NK щура не укорочений і містить зрілу послідовність А1а-1. Даний пептид елююється при 30 мкм і помітний на пептидній карті непегильованого продукту розщеплення, але відсутній у продуктах розщеплення пегильованого NBN NK. Приклад 3. Оцінка ефективності внутрішньо пегильованого нейбластину в ELISA активації кіназного рецептора (KIRA) Ефективність пегильованого NBN щура вимірювали з використанням NBN-залежної активації/фосфорилювання c-RET як репортера активності NBN в ELISA, який був специфічний відносно присутності фосфорильованого RET. Клітини NB41A3-mRL3 лінії адгезивних клітин 5 нейробластоми мишей, яка експресує RET і GFRa3, висівали при концентрації 2 × 10 клітин на ямку у 24-ямкові планшети у середовище Ігла модифіковане Дульбеко (DMEM) з додаванням 10 % фетальної сироватки теляти і культивували протягом 18 годин при 37 °C і 5 % СО2. Клітини промивали PBS і обробляли серійними розведеннями NBN в 0,25 мл DMEM протягом 10 хв. при 37 °C і 5 % СО2. Кожний зразок аналізували у двох повторах. Клітини промивали 1 мл PBS та лізували протягом 1 години при 4 °C за допомогою 0,30 мл 10 мМ ТрисНСl, рН 8,0, 0,5 % Nonidet P40, 0,2 % дезоксихолату натрію, 50 мМ NaF, 0,1 мМ Na 3VO4, 1 мМ фенілметилсульфонілфториду при обережному струшуванні планшетів. Потім лізати додатково перемішували багаторазовим піпетуванням і 0,25 мл зразку переносили у 96-ямкові планшети 18 UA 100967 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 для ELISA, які були покриті 5 мкг/мл анти-RЕТ-мАт (AA.GE7.3) в 50 мМ карбонатному буфері, рН 9,6, при 4 °C протягом 18 годин, і блокували при кімнатній температурі протягом однієї години блокувальним буфером (20 мМ Трис-НСl, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 0,1 % Твін-20 (TBST), що містить 1 % нормальної сироватки миші і 3 % бичачого сироваткового альбуміну). Після 2 годин інкубації при кімнатній температурі ямки 6 разів промивали TBST. Фосфорильований RET реєстрували, інкубуючи ямки при кімнатній температурі протягом 2 годин з 2 мкг/мл кон'югованого з пероксидазою хрону (HRP) антитіла проти фосфотирозину 4G10 у блокувальному буфері, 6 разів промиваючи TBST і вимірюючи активність HRP при 450 нм за допомогою реагенту для колориметричної реєстрації. Вимірювали значення оптичної щільності для ямок, оброблених лізатом або буфером, що лізує, і скоригований відносно фону сигнал наносили на графік у вигляді функції концентрації NBN, який присутній в активаційний суміші. Ефективність пегильованого NBN в ELISA KIRA складала 10 нМ, що не відрізняється від ефективності вихідної речовини NBN NK. Два цикли заморожування-відтавання не впливали на ефективність, і після вказаної обробки не було істотного збільшення каламутності зразка, що свідчить про те, що зразки можна безпечно розморожувати для дослідження. У незалежних дослідженнях за оцінкою активності продукту з трьома і чотирма 10 кД-ПЕГ/молекулу окремо, визначили, що аддукт з трьома ПЕГ був повністю активним, тоді як продукт з чотирма ПЕГ мав знижену активність. Приклад 4. Фармакокінетичні дослідження внутрішньо пегильованого нейбластину щура у щурів і мишей Досліджували фармакокінетичні властивості різних пегильованих і непегильованих продуктів NBN у моделях на щурах і мишах. Результати показали, що пегилювання NBN NK щура 3,3 ПЕГ, 10000 Д приводило до істотного впливу на час напівжиття і біодоступність нейбластину. Після в/в-введення 1 мг/кг щурам Sprague Dawley, пікові рівні пегильованого NBN, що складають 3000 нг/мл, реєстрували через 7 хвилин, і рівні 700 нг/мл реєстрували через 24 години, 200 нг/мл - через 48 годин і 100 нг/мл - через 72 години. На відміну від цього, для непегильованого NBN після в/в-введення 1 мг/кг рівні 1500 нг/мл реєстрували через 7 хвилин, але потім рівні швидко падали до 70 нг/мл через 3 години і не реєструвалися через 7 годин. Вплив пегилювання був навіть більш вираженим у тварин, оброблених пегильованим NBN при підшкірному введенні. Після п/к-введення 1 мг/кг циркулюючі рівні пегильованого NBN досягали максимуму 200 нг/мл через 24 години і зберігалися на вказаному рівні протягом трьох днів дослідження. На відміну від цього, не спостерігали NBN, що реєструється, ні в якій тимчасовій точці після введення немодифікованого NBN. Аналізи зразків пегильованого NBN ускладнюються присутністю аддуктів, що містять 2, 3 і 4 ПЕГ на молекулу, кожний з яких буде демонструвати різний ФК-профіль. У ранніх ФКдослідженнях використовували мишей, щоб забезпечити скринінг великої кількості вибраних для дослідження речовин і способів введення. Дослідження на мишах виявили вражаючі відмінності у біодоступності вибраних речовин. Однак у тому випадку, коли оцінювали аддукт 3,3 ПЕГ 10 кД у щурів, виявили, що він є менш біодоступним у щурів, ніж у мишей. Вказана відмінність у біодоступності була особливо виражена після в/ч-введення. Рівні у мишей досягали 1600 нг/мл через 7 годин і зберігалися на рівні 400 нг/мл через 24 години. Навпаки, рівні у щурів були постійними при 100 нг/мл протягом 4-48 годин. Як нейбластин щурів дикого типу (wt-NBN), так і нейбластин із заміною Asn на Lys у положенні 95 (NK-NBN) піддавали згортанню і очищали до > 95 % для тестів на ефективність у моделі невропатії у діабетичних щурів STZ. NBN дикого типу готували у композиції для безпосереднього дослідження на тварині, тоді як NK-NBN готували для пегилювання ПЕГ-SPA 10 кД. Для здійснення згортання і з метою очищення розробили спосіб згортання з використанням ексклюзійної хроматографії по розміру (SEC), який дозволяє проводити ренатурацію NBN з тілець включення Е. соlі у великих кількостях і при високих концентраціях. Для підвищення чистоти кінцевого білка додатково до SEC застосовували стадії хроматографії як на колонці з Ni-NTA, так і на колонці з діоксидом кремнію CM. Білки піддавали всебічній характеризації, включаючи аналіз за допомогою електрофорезу у SDS-ПААГ, ексклюзійну хроматографію по розміру, ESMS, оцінку активності в ELISA KIRA та визначення вмісту ендотоксину. SDS-ПААГ і SEC кінцевих білкових продуктів показав чистоту більше 95 %. Рівень ендотоксину у кожному продукті складав < 0,2 EU/мг. Питома активність обох білків в ELISA KIRA складала приблизно 10 нМ. NBN дикого типу готували у концентрації 1,0мг/мл, a NK-NBN готували у концентрації 2,6 мг/мл у фосфатно-сольовому буфері (PBS), рН 6,5. NBN дикого типу ділили на аліквоти у пробірки об'ємом 15 мл і зберігали замороженими при -70 °C, тоді як NK 19 UA 100967 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 NBN перед поділом на аліквоти і заморожуванням піддавали пегилюванню. Приклад 5. Згортання нейбластину дикого типу і мутеїну нейбластину N95K Обидві форми NBN експресували в Е. coli у вигляді His-мічених злитих білків з сайтом розщеплення ентерокіназою, що безпосередньо прилягає до початку зрілої послідовності з 113 амінокислот. Бактерії, які експресують або NBN дикого типу (1,8 кг осаду), або NK-NBN (2,5 кг осаду), піддавали лізису у 2 літрах PBS, використовуючи прес Gaulin. Після центрифугування (10000 об./хв.) для осадження тілець включення з кожного препарату видаляли надосади. Осади тілець включення два рази промивали буфером (0,02 М Трис-НСl, рН 8,5, 0,5 мМ EDTA), потім два рази промивали таким же буфером, що містить Тритон Х-100 (2 %, об./об.), з подальшими двома додатковими промиваннями буфером без детергенту. Обидва осади солюбілізували з використанням 6 М гуанідин-гідрохлориду, 0,1 М Трису, рН 8,5, 0,1 М ДТТ і 1 мМ EDTA. Щоб сприяти процесу солюбілізації кожний осад піддавали гомогенізації з використанням гомогенізатора Polytron з подальшим перемішуванням протягом ночі при кімнатній температурі. Розчинні білки освітлювали центрифугуванням перед хроматографією, що денатурує, через Superdex 200 (колонка об'ємом 5,5 літрів, зрівноважена 0,05 М гліцином/ Н3РО4, рН 3,0 з 2 М гуанідин-НСl) при швидкості 20 мл за хвилину. Денатурований NBN ідентифікували у SDS-ПААГ. Фракції, що містять або NBN дикого типу, або NK-NBN об'єднували і концентрували приблизно до 250 мл, використовуючи концентратор клітин з мішалкою Amicon об'ємом 2,5 літри. Після фільтрування для того, щоб видалити якийнебудь осад, концентрований білок піддавали хроматографії, що ренатурує, по розміру через Superdex 200, зрівноважений 0,1 М Трис-НСl, рН 7,8, 0,5 М гуанідин-НСl, 8,8 мМ відновленим глутатіоном і 0,22 мМ окисленим глутатіоном. Колонку обробляли, використовуючи 0,5 М гуанідин-НСl при швидкості 20 мл за хвилину. Фракції, які містять ренатурований NBN дикого типу або NK-NBN, ідентифікували у SDS-ПААГ, об'єднували і зберігали при 4 °C аж до того, як було необхідно видалити His-мітку. Концентрування NBN при Ni-NTA-хроматографії (TR5919-138) Ренатурований NBN зберігали при 4 °C щонайменше протягом 24 годин до здійснення очищення, щоб стимулювати дисульфідне утворення між мономерами NBN. За цей час утворювався осад, і його видаляли фільтруванням через фільтрувальну установку 0,2 мк PES. Щоб зменшити неспецифічне зв'язування концентрацію імідазолу у розчині білка доводили до 20 мМ перед завантаженням на колонку Ni-NTA (Qiagen) об'ємом 100 мл, зрівноважену буфером для колонки (0,5 М гуанідин і 20 мМ імідазол) із швидкістю 50 мл за хвилину. Після нанесення білка колонку промивали до встановлення базової лінії тим же самим буфером. NBN елюювали зі смоли, використовуючи приблизно 300 мл буферу, що елюює, який містить 0,5 М гуанідин-НСl і 0,4 М імідазол. Після елюювання NBN діалізували протягом ночі (використовуючи діалізні трубки на 10 кД) при кімнатній температурі проти десяти об'ємів 5 мМ НСl. Діаліз стимулював гідроліз забруднюючих речовин і знижував концентрації гуанідин-НСl та імідазолу до 0,05 М і 0,04 М, відповідно. Відщеплення His-мітки лізилендопептидазою або ентерокіназою На наступний день будь-який осад, який утворювався під час діалізу, видаляли фільтруванням. Концентрацію NaCl у зразку білка робили такою, що дорівнює 0,1 М додаванням 5 М маткового розчину до кінцевої концентрації солі, при цьому він містив приблизно 150 мМ залишкового гуанідин-НСl. Вказану концентрацію підтверджували з використанням вимірника провідності. Крім того, додавали 1 М HEPES, рН 8, до кінцевої концентрації 25 мМ. Щоб відщепити мітку, до NBN дикого типу додавали лізилендопептидазу і до NK-NBN додавали ентерокіназу, обидва ферменти приблизно при співвідношенні протеази до NBN 1:300. У випадку NK-NBN використовували ентерокіназу замість лізилендо-пептидази через додатковий сайт розщеплення у мутантному білку біля Lys95. Зразки перемішували при кімнатній температурі протягом 2 годин і розщеплення контролювали за допомогою електрофорезу у SDS-ПААГ. Видалення His-мітки Ni-NTA-хроматографією Оброблений протеазою NBN наносили на колонку Ni-NTA об'ємом 100 мл, зрівноважену 0,5 М гуанідин-НСl і 20 мМ імідазолом, із швидкістю 50 мл за хвилину. Колонку промивали до встановлення базової лінії таким же буфером. Будь-який білок, який вимивається з колонки, об'єднували з білком, що протікає, який містить NBN без His-мітки. Хроматографія на діоксиді кремнію CM Після Ni-NTA-хроматографії білок відразу ж піддавали подальшому очищенню пропусканням через смолу на основі діоксиду кремнію СМ. На колонку з діоксидом кремнію об'ємом 20 мл, зрівноважену буфером для нанесення (5 мМ фосфат, рН 6,5, 150 мМ NaCl), завантажували NBN із швидкістю 20 мл за хвилину. Колонку промивали двадцятьма об'ємами колонки буфера 20 UA 100967 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 для промивання (5 мМ фосфат, рН 6,5, 400 мМ NaCl) і білок елюювали буфером, що елюює, який містить 5 мМ фосфат, рН 6,5, але 1 М NaCl. Елюйований білок діалізували протягом ночі проти одного фосфату, щоб знизити концентрацію солі до 100 мМ у випадку NK-NBN і 150 мМ у випадку NBN дикого типу. Обидва зразки фільтрували через фільтрувальну установку 0,2 мк PES, аналізували у SDS-ПААГ і зберігали при 4 °C аж до того, як була потрібна подальша характеристика і/або пегилювання. NBN дикого типу і NK-NBN піддавали аналізу відносно УФ-спектрів, щоб оцінити їх поглинання при 280. Використовуючи кварцову мікрокювету і обнуління у порівнянні з одним буфером, 100 мкл або NBN дикого типу, або NK-NBN безперервно сканували від 230 до 330 нм, використовуючи спектрофотометр Beckman. На основі даного аналізу визначили, що концентрація NBN дикого типу складала 1,1 мг/мл, а концентрація NK-NBN-2,6 мг/мл (для 0,1 % кожного білка використовували А280 нм-Е =0,5). Менше 1 % осадженої речовини ідентифікували на основі поглинання при 330 нм. Щоб оцінити чистоту обох препаратів білка, кожний зразок (0,5 мг) піддавали ексклюзійній хроматографії по розміру через колонку 16/30 Superdex 75. Колонку зрівноважували 5 мМ фосфатом, рН 6,5, що містить 400 мМ NaCl, і обробляли при швидкості потоку 1,5 мл за хвилину. На основі поглинання при 280 нм і NBN дикого типу, і NK-NBN мігрували у вигляді окремого піку з очікуваною молекулярною масою (23-24 кД) і вони не містили якого-небудь істотного забруднення білка. І NBN дикого типу, і NK-NBN відновлювали у 2,5 М гуанідин-НСl, 60 мМ Трис, рН 8,0 і 16 мМ ДТТ. Відновлені зразки знесолювали на короткій колонці С4 та аналізували в оперативному режимі за допомогою ESMS, використовуючи потрійний квадрупольний прилад. Вихідні дані ESMS піддавали розгортці за допомогою програми MaxEnt, щоб створити мас-спектр. Даний спосіб дозволяє звести численні заряджені сигнали в один пік, який прямо відповідає молекулярній масі у кілодальтонах (кД). Розгорнутий мас-спектр для NBN дикого типу показав, що переважний вигляд має М.м. 12046 кД, яка відповідає розрахованій молекулярній масі 12046,7 кД для форми білка із 113 амінокислот. Також спостерігали мінорний компонент (12063 кД), що свідчить про присутність продукту окислення. У зразку NK-NBN ідентифікували три піки. Основний компонент показав видиму молекулярну масу 11345 кД відповідно до розрахованої маси для форми білка із 106 амінокислот. Два інших піки мали масу 11362 і 12061 кД, що свідчило про окислення NK-NBN і присутність форми із 113 амінокислот, відповідно. Присутність у препараті NK-NBN форм із 106 і 113 амінокислот можна віднести до розщеплення ентерокіназою. Вказана протеаза від Biozyme є препаратом природного ферменту, очищеного із слизової оболонки кишечнику теляти, і за повідомленнями містить невелику домішку трипсину (0,25 нг трипсину на мкг ентерокінази). Таким чином, трипсин може діяти на NK-NBN з карбоксикінцевої сторони Arg7, продукуючи переважаючу форму із 106 амінокислот. З іншого боку лізилендопептидаза, яка використовується для розщеплення NBN дикого типу, має єдину протеазну активність, діючи з карбоксикінцевої сторони залишку лізину, що знаходиться у ділянці His-мітки, даючи форму зрілого NBN із 113 амінокислот. Обидві форми NBN із 106 і 113 амінокислот однаково активні у всіх досліджених аналізах і виявляють подібність у тестах на стабільність у гуанідин-НСl. Активність NBN визначали за його здатністю стимулювати фосфорилювання c-RET у клітинах NB41A3-mRL3 з використанням ELISA KIRA, описаного у прикладі 3. Фосфорилювання RET визначали при інкубації (2 години) іммобілізованого рецептора з кон'югованим з HRP антитілом проти фосфотирозину (4G10; 0,2 мкг на ямку). Після інкубації ямки шість разів промивали TBST і потім активність HRP реєстрували при 450 нм за допомогою колориметричного аналізу. Вимірювали значення оптичної щільності для ямки, обробленої лізатом або одним буфером, що лізує, коригували відносно фону і дані наносили на графік у вигляді функції концентрації нейбластину, присутнього в активаційний суміші. Дані показують, що очищений NBN приводив до появи фосфорильованого RET, що свідчить про те, що очищений NBN був активним у даному аналізі. Приклад 6. Одержання кон'югата сироватковий альбумін-нейбластин Нейбластин щура дикого типу у концентрації 1 мг/мл у PBS обробляли 1 мМ сульфо-SMCC (Pierce) та знесолювали, щоб видалити надлишок агента, який перехресно зшиває. Оскільки білок NBN дикого типу містить тільки єдиний амін на своєму N-кінці і не має вільних сульфгідрильних груп, припускали, що результатом реакції з SMCC буде сайт-специфічна модифікація NBN за допомогою SMCC, зв'язаним з N-кінцем. 60 мкг кон'югата NBN-SMCC інкубували з 120 мкг бичачого сироваткового альбуміну та аналізували відносно ступеня перехресного зшивання у SDS-ПААГ. БСА містить одну вільну SH-групу і, отже, очікується, що реакція з кон'югатом NBN-SMCC приведе до модифікації у 21 UA 100967 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вказаному сайті за допомогою малеіміду на SMCC. При вказаних умовах спостерігали дві додаткові смуги з більш високою молекулярною масою, які відповідають за масою модифікації NBN одним БСА-компонентом і двома молекулами БСА, оскільки кожна молекула NBN містить два N-кінці, які можуть піддаватися реакції і, отже, смуги узгоджуються з даною точкою зору. Утворення вказаних смуг супроводжувало зменшення інтенсивності смуг NBN-SMCC і БСА. На основі інтенсивності смуги NBN, що залишається, реакція, можливо, протікала до завершення на 70-80 %. Однозаміщений продукт очищали від реакційної суміші, піддаючи матеріал катіонообмінній хроматографії та ексклюзійній хроматографії по розміру на колонці Superdex 200 (Pharmacia), по суті як описано для досліджень пегилювання, що обговорюються вище. Фракції з колонки при гель-фільтрації аналізували у SDS-ПААГ, і фракції, що містять однозаміщений продукт, аналізували відносно вмісту білка по оптичній щільності при 280 нм. Оскільки маса БСА приблизно у два рази вище маси нейбластину, уявну концентрацію ділили на 3, щоб одержати еквівалент NBN. Вказану фракцію піддавали аналізу відносно функції в ELISA KIRA. Значення ІС50 і для NBN дикого типу, і для БСА-кон'югованого NBN складали 3-6 нМ, що свідчить про те, що кон'югація з БСА не заважає функціонуванню. Хоча вказані попередні дослідження проводили з БСА, відповідні білки сироваткового альбуміну щурів і людини також містять вільну групу SH. Отже, подібний спосіб можна застосовувати для створення кон'югата сироватковий альбумін щура-NBN щура для проведення досліджень ФК та ефективності у щурів і кон'югата сироватковий альбумін людиниNBN людини для проведення клінічних випробувань. Подібним чином SMCC можна замінити будь-яким з ряду агентів, що перехресно зшивають, які містять групу, що реагує з аміногрупою, з одного боку і групу, що реагує з тіолом, з іншого боку. Прикладами агентів, які перехресно зшивають, що реагують з аміном, які вбудовують малеімід, що реагує з тіолом, є AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS або GMBS, прикладами агентів, які вбудовують галогенацетатну групу, що реагує з тіолом, є SBAP, SIA, SIAB, і прикладами агентів, які надають захищений або незахищений тіол для реакції з сульфгідрильними групами з одержанням зв'язку, що відновлюється, є SPDP, SMPT, SATA або SATP, які всі доступні з Pierce. Такі агенти, що перехресно зшивають, є тільки приблизними, і є допустимою велика кількість альтернативних способів зв'язування N-кінця NBN з сироватковим альбуміном. Фахівець у даній області також може створити кон'югати з сироватковим альбуміном, мішенню в яких не є Nкінець NBN або тіольний компонент сироваткового альбуміну. Також передбачається, що функціональними будуть злиття NBN-сироватковий альбумін, створені з використанням генетичної інженерії, коли NBN зливають з геном сироваткового альбуміну на N-кінці, С-кінці або на обох кінцях. Даний спосіб можна поширити за допомогою звичайного адаптування на будь-який кон'югат NBN-сироватковий альбумін, результатом якого може бути продукт з пролонгованим часом напівжиття у тварин і, отже, у людини. СПИСОК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ Biogen, Inc. Sah, Dinah W.Y. Pepinsky, Blake R Borjack-Sjodin, Paula Ann Miller, Stephan S Rossomando, Anthony Кон'югати нейбластину з полімерами та способи їх застосування 00689-506-061 Ще не передана 2002-01-23 60/266,071 2001-02-01 13 Патент, версія 2.1 1 113 Білок Штучна послідовність Опис штучної послідовності: консенсусна послідовність ВАРІАНТ 22 UA 100967 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 (3) Де Хаа являє собою Gly або Thr ВАРІАНТ (4) Де Хаа являє собою Pro або Arg ВАРІАНТ (5) Де Хаа являє собою Gly або Ser ВАРІАНТ (10) Де Хаа являє собою Ala або Thr ВАРІАНТ (11) Де Хаа являє собою Ala або Thr ВАРІАНТ (12) Де Хаа являє собою Gly або Asp ВАРІАНТ (26) Де Хаа являє собою Arg або Ser ВАРІАНТ (33) Де Хаа являє собою Arg або Ser ВАРІАНТ (38) Де Хаа являє собою Val або Ilе ВАРІАНТ (51) Де Хаа являє собою Val або Ilе ВАРІАНТ (53) Де Хаа являє собою Pro або Gin ВАРІАНТ (69) Де Хаа являє собою Pro або Ser ВАРІАНТ (76) Де Хаа являє собою Val або Ilе ВАРІАНТ (103) Де Хаа являє собою Arg або His 55 23 UA 100967 C2 5 2 113 Білок Homo sapiens 10 3 113 Білок Mus musculus 24 UA 100967 C2 5 4 113 Білок Rattus norvegicus 10 5 675 ДНК Rattus norvegicus 25 UA 100967 C2 5 10 6 57 ДНК Штучна послідовність Опис штучної послідовності: KD2-310 Олігонуклеотид 7 57 ДНК Штучна послідовність Опис штучної послідовності: KD3-211 Олігонуклеотид 15 20 25 30 35 8 50 ДНК Штучна послідовність Опис штучної послідовності: KD3-254 Олігонуклеотид 9 50 ДНК Штучна послідовність Опис штучної послідовності: KD2-255 Олігонуклеотид 10 37 ДНК Штучна послідовність Опис штучної послідовності: KD3-258 Олігонуклеотид 26 UA 100967 C2 5 10 11 38 ДНК Штучна послідовність Опис штучної послідовності: KD3-259 Олігонуклеотид 12 32 ДНК Штучна послідовність Опис штучної послідовності: KD3-256 Олігонуклеотид 15 20 25 30 35 40 45 50 13 32 ДНК Штучна послідовність Опис штучної послідовності: KD3-257 Олігонуклеотид ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 1. Поліпептид, який містить амінокислотну послідовність, щонайменше на 90 % ідентичну амінокислотам 8-113 SEQ ID NO: 1, при цьому поліпептид містить щонайменше одну амінокислотну заміну, вибрану з групи, яка складається з: (а) амінокислоти, що відрізняється від аргініну, у положенні, яке відповідає положенню 14 в SEQ ID NO: 1; (b) амінокислоти, що відрізняється від аргініну, у положенні, яке відповідає положенню 39 в SEQ ID NO: 1; (c) амінокислоти, що відрізняється від аргініну, у положенні, яке відповідає положенню 68 в SEQ ID NO: 1; де поліпептид при димеризації зв'язує GFRα3, і де щонайменше одна амінокислотна заміна, визначена в (а) - (c), вводить один або більше сайтів, в яких поліалкіленгліколь може бути зв'язаним з поліпептидом. 2. Поліпептид за п. 1, де амінокислотна послідовність щонайменше на 95 % ідентична амінокислотам 8-113 SEQ ID NO: 1. 3. Поліпептид за п. 1, де амінокислотна послідовність щонайменше на 95 % ідентична амінокислотам 8-113 SEQ ID NO: 2. 4. Злитий білок, що містить поліпептид за будь-яким з попередніх пунктів, злитий з другим компонентом. 5. Злитий білок за п. 4, де другим компонентом є послідовність сироваткового альбуміну людини. 6. Нуклеїнова кислота, що кодує поліпептид за будь-яким з пп. 1-3 або злитий білок за п. 4. 7. Вектор, що містить нуклеїнову кислоту за п. 6. 8. Клітина-хазяїн, що містить вектор за п. 7. 9. Клітина-хазяїн за п. 8, де клітиною-хазяїном є клітина яєчника китайського хом'ячка. 27 UA 100967 C2 5 10 15 20 10. Спосіб одержання поліпептиду за будь-яким з пп. 1-3 або злитого білка за п. 4, що включає (а) культивування клітини-хазяїна за п. 8 або 9 в умовах, які забезпечують експресію поліпептиду за будь-яким з пп. 1-3 або злитого білка за п. 4, і (b) витягання вказаного поліпептиду або злитого білка. 11. Димер, який містить два поліпептиди за будь-яким з пп. 1-3 або два злиті білки за п. 4. 12. Кон'югат, який містить поліпептид за будь-яким з пп. 1-3, кон'югований з поліалкіленгліколем, де поліалкіленгліколь кон'югований з поліпептидом в амінокислотному залишку, введеному як заміна в положення, що відповідає положенню 14, 39 або 68 SEQ ID NO: 1. 13. Кон'югат, що містить злитий білок за п. 4, кон'югований з поліалкіленгліколем, де поліалкіленгліколь кон'югований зі злитим пептидом в амінокислотному залишку, введеному як заміна в положення, що відповідає положенню 14, 39 або 68 SEQ ID NO: 1. 14. Кон'югат за п. 12 або п. 13, де поліалкіленгліколем є поліетиленгліколь. 15. Кон'югат за будь-яким з пп. 12-14, де поліпептид глікозилований. 16. Фармацевтична композиція, що містить поліпептид за будь-яким з пп. 12-15 і фізіологічно прийнятний наповнювач. 17. Кон'югат за будь-яким з пп. 12-15 для застосування в терапії. 18. Кон'югат за будь-яким з пп. 12-15 для застосування при лікуванні або профілактиці захворювання або розладу нервової системи. 19. Кон'югат за п. 18, де захворюванням або розладом є периферична невропатія або синдром невропатичного болю. Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 28