Pyy агоністи та їх застосування

1. Поліпептид (E10C)hPYY3-36, що має амінокислотну послідовність IKPEAPGCDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRYNH2 [SEQ ID No.:3] або його фармацевтично прийнятна сіль. 2. Поліпептид (D11C)hPYY3-36, що має амінокислотну послідовність IKPEAPGECASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRYNH2 [SEQ ID No.:4] або його фармацевтично прийнятна сіль. 3. Кон'югат, що включає поліетиленгліколь (ПЕГ) і поліпептид (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36. 4. Кон'югат за пунктом 3, що має Формулу 3 O SR 2 (19) 1 3 86686 14. Кон'югат за пунктом 13, що має Формулу 5 CH2 CH (OCH2CH2)mOCH3 (OCH2CH2)mOCH3 CH NHC(O)CH2CH2N SR де кожен m є приблизно таким же самим і є цілим числом в інтервалі приблизно від 450 до 500 і -SR є (E10C)hPYY3-36 поліпептид, де S є атом сірки тіольної групи цистеїну. 15. Кон'югат за пунктом 14, де кожен (ОСН2СН2)m замісник має середньомасову молекулярну масу в інтервалі приблизно від 20кД до 22кД. 16. Кон'югат за пунктом 13, що має Формулу 5 CH (OCH2CH2)mOCH3 (OCH2CH2)mOCH3 O CH2 NHC(O)CH2CH2N SR O де кожен m є приблизно таким же самим і є цілим числом в інтервалі приблизно від 450 до 500 і -SR є (D11C)hPYY3-36 поліпептид, де S є атом сірки тіольної групи цистеїну. 17. Кон'югат за пунктом 16, в якому кожен (ОСН2СН2)m замісник має середньомасову молекулярну масу в інтервалі приблизно від 20кД до 22кД. 18. Кон'югат гліцерин-розгалужений 43k мПЕГ малеімід(E10C)hPYY3.36, що має Формулу 5 CH2 CH (OCH2CH2)mOCH3 (OCH2CH2)mOCH3 O CH2 (OCH2CH2)mOCH3 (OCH2CH2)mOCH3 O O CH2 19. Кон'югат гліцерин-розгалужений 43k мПЕГ малеімід (D11C)hPYY3-36 Формули 5 CH2 O CH2 4 NHC(O)CH2CH2N SR O де кожен m є приблизно таким же самим і -SR є (E10C)hPYY3-36 поліпептид, де S є атом сірки тіольної групи цистеїну, або його фармацевтично прийнятна сіль. Представлений винахід стосується PYY агоністів, більш особливо РYY3-36 варіантів і пегильова CH2 NHC(O)CH2CH2N SR O де кожен m є приблизно таким же самим і -SR є (D11C)hPYY3-36 поліпептид, де S є атом сірки тіольної групи цистеїну, або його фармацевтично прийнятна сіль. 20. Фармацевтична композиція, що містить поліпептид за пунктом 1 або 2 або кон'югат за будьяким з пунктів 3-19 або його фармацевтично прийнятну сіль і фармацевтично прийнятний носій. 21. Фармацевтична композиція за пунктом 20, що також містить другий агент, що є агентом для лікування ожиріння. 22. Спосіб лікування ожиріння або стану надмірної ваги у ссавця, що потребує такого лікування, який включає периферійне введення ссавцю терапевтично ефективної кількості поліпептиду за пунктом 1 або 2 або кон'югату за будь-яким з пунктів 3-19 або його фармацевтично прийнятної солі. 23. Спосіб інгібування набору ваги, зменшення вживання їжі або зменшення поглинання калорій у ссавця, який включає периферійне введення ссавцю терапевтично ефективної кількості поліпептиду за пунктом 1 або 2 або кон'югату за будь-яким з пунктів 3-19 або його фармацевтично прийнятної солі. 24. Спосіб за пунктом 22 або 23, в якому поліпептид, кон'югат або сіль вводять в комбінації з другим агентом, що є агентом для лікування ожиріння. 25. Застосування поліпептиду за пунктом 1 або 2 або кон'югату за будь-яким з пунктів 3-19 або його фармацевтично прийнятної солі при виготовленні медикаменту для лікування ожиріння або стану надмірної ваги у ссавців або інгібування набору ваги, зменшення вживання їжі або зменшення поглинання калорій у ссавця. 26. Полінуклеотид, що кодує поліпептид за пунктом 1 або 2. 27. Моноклональне антитіло, що специфічно зв'язує поліпептид, який включає амінокислотну послідовність, як показано на SEQ ID NO:3 або SEQ ID NO:4. 28. Моноклональне антитіло за пунктом 27, де згаданий поліпептид є пегильованим по цистеїновому залишку. них варіантів похідних PYY3-36 і PYY3-36. композицій, що містять, такі агоністи, виділених 5 нуклеїнових кислот, що кодують такі PYY агоністи, і застосування таких агоністів або композицій при лікуванні ожиріння і супровідної хворобливості, або для зменшення апетиту, прийму їжі або поглинання калорій у ссавця. Ожиріння є основною проблемою охорони здоров'я завдяки підвищенню його розповсюдження і пов'язаних з ним ризиків. Однак, ожиріння може впливати на якість життя осіб через обмеження рухливості і зменшення фізичної витривалості, також як і через соціальну, академічну дискримінацію і дискримінацію на роботі. Ожиріння і надмірна вага загалом визначається як індекс маси тіла (ВМІ), який корелюється загальним жиром тіла і використовується для вимірювання ризику деяких захворювань. ВМІ розраховують шляхом ділення маси в кілограмах на висоту у метрах у квадраті (кг/м2). Надмірна вага типово визначається коли ВМІ становить 2529,9кг/м2, і ожиріння визначається коли ВМІ становить 30кг/м2 або вище. Дивіться, наприклад, National Heart, Lung, and Blood Institute, Clinical Guidelines on the Identification, Evaluation, and Treatment of Overweight and Obesity in Adults, The Evidence Report, Washington, DC: U.S. Department of Health and Human Services, NIH publication no. 98-4083 (1998)]. Нещодавні дослідження показали, що ожиріння і пов'язані з ним ризики для здоров'я не обмежуються тільки повнолітніми, але також уражують дітей і підлітків у неймовірному ступені. Згідно з даними Центру контролю захворювань, відсоток дітей і підлітків, які мають надмірну вагу збільшився більше ніж у двічі порівняно з початком 1970-их, і приблизно 15 відсотків дітей і підлітків зараз мають надмірну вагу· Спостерігається збільшення факторів ризику для хвороби серця, таких як високий рівень холестеролу і високий кров'яний тиск, і у дітей, і підлітків з надмірною вагою порівняно з суб'єктами з нормальною вагою подібного віку. Також, кількість випадків діабету типу 2, раніше відносився до хвороб дорослих, надзвичайно збільшується у дітей і підлітків. Стани з надмірною вагою і ожирінням тісно пов'язані із діабетом типу 2. Нещодавно було встановлено, що надмірна вага у підлітків має 70% шансів перерости у надмірну вагу або ожиріння у зрілому віці. Імовірність підвищується до приблизно 80%. якщо принаймні один з батьків має надмірну вагу або ожиріння. Найбільшим негайним наслідком надмірної ваги, що сприймають діти, є соціальна дискримінація. Надмірна вага або ожиріння підвищують ризик виникнення таких розладів, як гіпертензія, дисліпідемія, діабет типу 2 (неінсулінзалежний), резистентність до інсуліну, непереносимість глюкози, гіперінсулінемія, коронарна хвороба серця, стенокардія, застійна серцева недостатність, інсульт, жовчнокам'яна хвороба, холецистит, холелітіаз, подагра, остеоартрит, обструктивне апное у вісні і респіраторні проблеми, хвороба жовчного міхура, деякі форми раку (наприклад, ендометріальний, грудей, простати і товстої кишки) і психологічні розлади (такі як депресія, розлади харчування, деформування форми тіла і низька самооцінка). Негативний вплив на здоров'я забез 86686 6 печують ожирінню друге місце в переліку причин смертності в Сполучених Штатах і спричиняє значний економічний і психосоціальний вплив на суспільство. Дивіться, [McGinnis Μ, Foege WR, "Actual Causes of Death in the United States," JAMA 270: 2207-12, 1993]. Ожиріння зараз визначається як хронічне захворювання, що потребує лікування для скорочення пов'язаних з ним ризиків для здоров'я. Хоча втрата ваги є важливим елементом лікування, однією з головних цілей лікування ожиріння є покращення кардіоваскулярних і метаболітичних показників для зменшення захворюваності і смертності залежної від ожиріння. Було показано, що 5-10% втрата ваги тіла може значно покращити метаболітичні показники, такі як рівень глюкози в крові, кров'яний тиск і концентрації ліпідів. Однак, зрозуміло, що 5-10% зниження ваги тіла може зменшити захворюваність і смертність. Доступні на сьогоднішній день лікарські засоби для контролювання ожиріння зазвичай зменшують вагу через зменшення абсорбції жирів, що поглинаються з їжею, як наприклад, орлістат, або шляхом створення дефіциту енергії через зменшення вживання їжі і/або підвищуючи розхід енергії, як у випадку сібутраміну. Дослідження альтернативних доступних агентів для лікування ожиріння намітили декілька шляхів один з яких направлений на певні кишкові пептиди, що втягнуті в модулювання насичення, такі як пептид YY (PYY). PYY є членом родини гормонів панкреатичного поліпептиду (РР) (разом з РР і нейропептидом Υ (ΝΡΥ)). Як і інші члени родини, ΡΥΥ є Стермінально амідованим, 36 амінокислотним пептидом. Це кишковий ендокринний пептид, що був спочатку виділений з кишок свиней [Tatemoto і Mutt, Nature 285: 417-418, 1980] і в подальшому повідомлялось про зниження поглинання з їжі вищих жирів у щурів після периферійного введення [Okada et al., Endocrinology Supplement 180, 1993] і втрату ваги у мишей після периферійного введення [Morley and Flood, Life Sciences 41: 2157-2165, 1987]. Відомо про існування багатьох циркулюючих і таких що зберігаються молекулярних форм PYY [Chen et al., Gastroenterology 87: 1332-1338, 1984; і Roddy, et al., Regul Pept 18: 201-212, 1987]. Одна з таких форм, PYY3-36, була виділена з екстрактів мукозальних клітин кишечнику людини [Eberlein et al., Peptides 10: 797-803, 1989], і була встановлена предомінантна форма PYY в післяобідній плазмі людей [Grandt et al., Regul. Pept. 51: 151-159, 1994]. Було показано, що ΡΥΥ3-36 є високоспорідненим селективним агоністом ΝΡΥ Υ2 рецептора (Y2R) [Keire et al., Am. J. Physiol. Gasrointest. Liver Physiol. 279: G126-G131, 2000]. Повідомлялось, що периферійне введення PYY3-36 значно зменшує вживання їжі і набір ваги у щурів, зменшує апетит і поглинання їжі у людей і зменшує поглинання їжі у щурів, але у Y2R-нуль мишей, що свідчить про те, що поглинання їжі потребує Y2R. В дослідженнях людей, було встановлено, що вливання ΡΥΥ3-36 значно зменшує апетит і зменшує поглинання їжі на 33% протягом 24 годин. Вливання ΡΥΥ3-36 з досягненням нормальних післяобідніх циркулюючих концентра 7 цій пептиду призводить до пікових рівнів в сироватці ΡΥΥ3-36 через 15 хвилин, з наступним швидким падінням до базового рівня протягом 30 хвилин. Повідомлялось, що спостерігалось значне інгібування поглинання їжі в 12-годинний період після вливання ΡΥΥ3-36, але це суттєво не впливало на поглинання їжі в період з 12-години до 24-години. В дослідженнях на щурах, швидке введення PYY336 ІП (ін'єкції двічі на день протягом 7 днів) зменшували загальне поглинання їжі [Batterham, et al., Nature 418: 650-654, 2002]. Поліпептидні лікарські засоби є часто ковалентноприєднанами до полімерів, таких як поліетиленгліколі для пролонгування їх часу напіврозкладу in vivo. Однак, це часто призводить до значної втрати біологічної або фармакологічної активності [Shechter et al., FEBS Letters 579: 2439-2444, 2005; Fuerteges and Abuchowski, J. Control Release 11: 139-148, 1990; Katre, Adv. Drug Del. Sys. 10: 91114, 1993; Bailon and Berthold, Pharm. Sci. Technol. Today 1: 352-356, 1996; Nucci et al., Adv. Drug Delivery Rev. 6, 1991; Delgado et al., Critical Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 9: 249-304, 1992; Fung et al., Polym. Preprints 38: 565-566, 1997; Reddy, Ann. Pharmacother. 34: 915-923, 2000; Veronese, Biomaterials 22: 405-417, 2001]. Наприклад, [Shechter et al., supra], показали, що 40кД пегилювання PYY3-36 за допомогою стандартних засобів, через утворення стабільного зв'язку (40кД ПЕГРYY3-36), призводить до їх повної інактивації в дослідженнях поглинання їжі у мишей (п.ш. ін'єктування). Однак, вони також повідомили, що зворотне пегилювання ΡΥΥ3-36 (40кД ПЕГ-FMS-PYY3-36) призводить до восьмикратного підвищення функціонального часу напівжиття (24г порівняно з 3г). Дивіться також [заявки РСТ №WO 2004/089279 і WO 03/026591]. Представлений винахід стосується PYY агоністів, що є варіантами ΡΥΥ3-36. В одному з аспектів представленого винаходу ΡΥΥ агоніст є варіантом ΡΥΥ3-36 ссавця, в якому залишок 10 (глютамінова кислота) або залишок 11 (аспарагінова кислота) замінений амінокислотою "X", яку вибирають з групи, що включає цистеїн, лізин, серин, треонін, тирозин і неприродні амінокислоти, що мають функціональну групу, яка здатна до кон'югації з гідрофільним полімером, таким як поліетиленгліколь (ПЕГ), наприклад, кето, тіол, гідроксил, карбоксил або вільна аміногрупа, такий варіант позначений (Ε10Χ)ΡΥΥ3-36 або (D11X)PYY336 відповідно. Залишком "X" переважно є цистеїн і, тому, відповідними варіантами є (E10C)PYY3-36 i (D11C)PYY3-36. В переважному втіленні представленого винаходу, PYY агоністом є варіант PYY3-36 (hPYY3-36) людини, PYY3-36 собаки, ΡΥΥ3-36 кішки або ΡΥΥ3-36 коняки, більш переважно, hPYY3-36. В переважному втіленні винаходу, PYY агоністом є поліпептид (E10C)hPYY3-36, що має амінокислотну послідовність IKPEAPGCDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQR Y-NH2 [SEQ ID NO:3], або його фармацевтично прийнятна сіль. 86686 8 В наступному переважному втіленні, PYY агоністом є поліпептид (D11C)hPYY3-36, який має амінокислотну послідовність IKPEAPGECASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQR Y-NH2 [SEQ ID NO:4], або його фармацевтично прийнятна сіль. Більш переважно, агоністом є (E10C)hPYY3-36. PYY агоніст винаходу є переважно кон'югованим з гідрофільним полімером, переважно ПЕГ. Агоніст є переважно монопегильованим, тобто, співвідношення агоніста до ПЕГ становить приблизно 1:1, який є приєднаним до здатної до кон'югації групи, такої як кето, тіол, гідроксил, карбоксил або вільна аміногрупа, "X" в (E10X)PYY3-36 і (D11X)PYY3-36 ПЕГ може бути лінійним, розгалуженим або підвішеним; більш переважно, лінійним або розгалуженим; більш переважно, лінійним. В лінійних ПЕГах, один кінець ПЕГ є блокованим групою, що є інертною до умов конденсування ПЕГ до агоніста, наприклад, етерна група, переважно метоксигрупа. ПЕГи закінчені таким чином (метоксигрупою) зазвичай називаються як мПЕГи. Інший кінець є активованим для конденсування з PYY агоністом. Таким чином, в розгалужених ПЕГах корисних в представленому винаході, всі кінці крім одного є етер-захищеними, а не-етерзахищений кінець є активованим для конденсації. В одному з втілень, не-етер-захищений кінець ПЕГ є захищеним лінкерною групою ("L"), що зв'язує ПЕГ з функціональною групою, що є реактивною до здатної до кон'югації групи амінокислоти X в (E10X)PYY3-36 або (D11X)PYY3-36 з утворенням кон'югату, що має ПЕГ ковалентно приєднаний до здатної до кон'югації групи X. В наступному втіленні, ПЕГ є приєднаним безпосередньо до реактивної групи, без застосування лінкерної групи. Такі ПЕГи часто називають "безлінкерні" ПЕГи. Для (E10C)PYY3-36 і (D11C)PYY3-36 поліпептидів, не-етерзахищені кінці ПЕГ є переважно приєднаними до лінкера, що зв'язує ПЕГ з малеімідом або іншою групою, що буде взаємодіяти з тіолом цистеїнового залишку з утворенням кон'югату, що має ПЕГ ковалентноприєднаний до тіольної групи цистеїну. Придатними реактивними ПЕГами для застосування з (E10C)hPYY3-36 або (D11C)PYY3-36 є ПЕГи формул Переважно, ПЕГ є мПЕГ малеімід зображений вище, який включає лінкерну групу -L-. Безлінкерні ПЕГ малеіміди також є придатними для застосування в представленому винаході, переважно з (E10C)hPYY3-36 або (D11C)PYY3-36. Такі безлінкерні ПЕГ малеіміди можна одержати як описано [Goodson and Katre, Bio/Technology 8: 343-346, 1990]. 9 Кон'югати, що утворюються внаслідок конденсування (E10C)hPYY3-36 або (D11C)PYY3-36 поліпептидів з мПЕГами показаними вище зображені на наступних формулах, де -SR є (E10C)hPYY3-36 або (D11C)PYY3-36 поліпептидом, в якому S є атомом сірки тіольної групи цистеїну: мПЕГ —HN-COCH2SR та мПЕГ —S-SR Лінкер -L- просто служить для зв'язування ПЕГ з реактивною функціональною групою і тому його вибір особливо не обмежується, але, переважно, включає алкіленову групу, що містить естерний зв'язок, уретановий зв'язок, амідний зв'язок, етерний зв'язок, карбонатний зв'язок або вторинну аміногрупу. В переважному втіленні, особливо для лінійних ПЕГів, лінкером є група формули -O(CH2)pNHC(O)(CH2)rв якій p є цілим числом від 1 до 6, переважно, 1-3, більш переважно, 2 або 3, найбільш переважно, 3, і r є цілим числом від 1 до 6, переважно, 1-3, більш переважно, 2 або 3, найбільш переважно, 2. Переважним лінкером є група CH2CH2CH2NHCOCH2CH2-. В іншому переважному втіленні, особливо для розгалужених ПЕГів, лінкером є група формули -NHC(O)(CH2)sв якій s є цілим числом від 1 до 6, переважно, 1-3, більш переважно, 2 або 3, найбільш переважно, 2. Переважним лінкером є група NHC(O)CH2CH2-. ПЕГ може бути лінійним або нелінійним, наприклад, розгалуженим або підвішеним. Переважно, ПЕГ є лінійним або розгалуженим, переважно, лінійним або розгалуженим мПЕГ малеімідом. Гліцерин-розгалужений мПЕГ малеімід є переважним розгалуженим ПЕГ. Переважно, ПЕГ є лінійним мПЕГ малеімідом. ПЕГ повинен мати середньо молекулярну вагу в інтервалі приблизно від 1кД до приблизно 50кД. Переважно, середньомасова молекулярна вага знаходиться в інтервалі приблизно від 5кД до приблизно 45кД; більш переважно, приблизно від 10-12кД до приблизно 40-45кД, або приблизно від 20кД до приблизно 40-45кД. Особливо цікавими є лінійні мПЕГ, такі як ті, що показані у Формулі 1, що мають середньомасову молекулярну вагу приблизно від 20 або приблизно 30кД. Гліцерин-розгалужений мПЕГ Формули 2 є також цікавим і, переважно, має середньомасову молекулярну вагу приблизно 20кД або приблизно 43кД. Переважними ПЕГами, прийнятно активованими для кон'югації з тіольною групою цистеїну (E10C)hPYY3-36 або (D11C)PYY3-36, є сполуки Формул 1 і 2. В лінійних мПЕГ Формули 1, n є цілим числом в інтервалі приблизно від 175 до 800; переважно, приблизно від 375 до 525 або приблизно від 600 до 750, або приблизно від 425 до 475 або приблизно від 650 до 700, або приблизно від 437 до 463 або від 675 до 700. В гліцерин 86686 10 розгалуженому мПЕГ формули 2, кожен m є приблизно таким самим і є цілим числом в інтервалі приблизно від 150 до 500; переважно, приблизно від 160 до 285 або приблизно від 400 до 525, або приблизно від 200 до 250 або від 450 до 500. Широкий перелік ПЕГів, прийнятно активованих для кон'югації з цільовими групами в бічному ланцюзі пептидних амінокислот, наприклад, кето, тіол, гідроксил, карбоксил або вільні аміногрупи, є комерційно доступними з ряду джерел, наприклад, від [NOF Corporation, Tokyo, Japan, або Nektar Therapeutics Corporation, Huntsville, AL]. Інший аспект представленого винаходу стосується кон'югатів представлених РYY3-36 варіантів і поліетиленгліколю. В одному з втілень кон'югатом є сполука Формули 3 де мПЕГ замісник є лінійним або розгалуженим і має середньомасову молекулярну вагу в інтервалі приблизно від 1кД до 50кД, переважно, від 5кД до приблизно 45кД, більш переважно, приблизно від 10кД або 12кД до приблизно 40 або 45кД, або приблизно від 20кД до приблизно 40кД або 45кД, L є групою формули -O(CH2)pNHC(O)(CH2)rв якій p є цілим числом від 1 до 6; переважно, 1-3; більш переважно, 2 або 3; найбільш переважно, 3; (як зображено на Формулі 4 нижче); і r є цілим числом від 1 до 6; переважно, 1-3; більш переважно, 2 або 3, найбільш переважно, 2; або L є групою формули -NHC(O)(CH2)s 11 в якій s є цілим числом від 1 до 6; переважно, 1-3; більш переважно, 2 або 3; найбільш переважно 2; і -SR є поліпептид (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36, де S є атом сірки тіольної групи цистеїну. Переважним втіленням винаходу є лінійний мΠΕΓ-ΡΥΥ3-36 варіант кон'югату формули 4 де n є цілим числом в інтервалі приблизно від 175 до 800; переважно, приблизно від 375 до 525 або приблизно від 600 до 750, або приблизно від 437 до 463 або приблизно від 675 до 700; і -SR є поліпептид (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36, де S є атом сірки тіольної групи цистеїну; або його фармацевтично прийнятна сіль. Переважно, (СН2СН2О)n замісник має середньомасову молекулярну вагу приблизно 20кД або 30кД. Кон'югат, в якому -SR є поліпептид (E10C)hPYY3-36 є особливо цікавим. Наступний аспект винаходу стосується кон'югатів, в яких ПЕГ замісник є розгалуженим. Переважними кон'югатами в цій категорії є гліцеринрозгалужений ПЕГ замісник. Особливо цікавим є кон'югат формули 5 де кожен m є приблизно тим же самим і є цілим числом в інтервалі приблизно від 150 до 550; переважно, приблизно від 160 до 285 або приблизно від 400 до 525, або приблизно від 200 до 250 або приблизно від 450 до 500, і -SR є (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 поліпептид, де S є атом сірки тіольної групи цистеїну; або його фармацевтично прийнятна сіль. Переважно, кожен (СН2СН2О)m замісник має середньомасову молекулярну вагу в інтервалі приблизно 9-11кД або приблизно 20-22кД. Переважно, спільна середньомасова молекулярна вага (СН2СН2О)m замісників є приблизно 20кД або приблизно 43кД. Кон'югат, в якому -SR є поліпептид (E10C)hPYY3-36, є особливо цікавим. Представлений винахід також забезпечує моноклональне антитіло, що специфічно зв'язує поліпептид, що включає амінокислотну послідовність, як показано в SEQ ID NO:3 або SEQ ID NO:4. 86686 12 В одному з втілень цього аспекту винаходу, поліпептид є пегильованим по цистеїновому залишку. Крім того, представлений винахід забезпечує полінуклеотидні послідовності, які кодують поліпептидні послідовності винаходу, переважно, вони кодують SEQ ID NO:3 i SEQ ID NO:4. В іншому втіленні винаходу, забезпечується фармацевтична композиція, що включає PYY агоніст представленого винаходу і фармацевтично прийнятний носій. В наступному втіленні, композиція також містить, принаймні, один додатковий фармацевтичний агент, який може бути агентом корисним при лікуванні первинного показання для композиції або супровідної хворобливості первинного показання. Додатковим фармацевтичним агентом переважно є агент для лікування ожиріння. Композиція переважно містить терапевтично ефективну кількість PYY агоніста винаходу або терапевтично ефективну кількість комбінації PYY агоніста винаходу і додаткового фармацевтичного агента. Також забезпечується спосіб лікування захворювання, стану або розладу модульованого Y2R агоністом у ссавців, який включає периферійне введення ссавцю, що потребує такого лікування, терапевтично ефективної кількості PYY агоніста винаходу. PYY агоніст винаходу може бути використаний окремо або в комбінації, з принаймні, одним додатковим фармацевтичним агентом, що є корисним при лікуванні захворювання, стану або розладу або супровідної хворобливості захворювання, стану або розладу. Захворюваннями, станами або розладами модульованими Y2R агоністом у ссавців є ожиріння і надмірна вага. Супровідні хворобливості таких захворювань, станів або розладів будуть імовірно випадково покращуватись при лікуванні таких захворювань, станів або розладів. Надалі забезпечується спосіб лікування ожиріння у ссавця, що потребує такого лікування, який включає периферійне введення ссавцю терапевтично ефективної кількості PYY агоніста представленого винаходу. Також забезпечується спосіб зменшення ваги або стимулювання втрати ваги (включаючи профілактику або інгібування набору ваги) у ссавця, який включає периферійне введення ссавцю вагоконтролюючої або ваго-зменшуючої кількості PYY агоніста представленого винаходу. Також забезпечується спосіб зменшення вживання їжі у ссавця, який включає периферійне введення ссавцю кількості PYY агоніста представленого винаходу, що зменшує вживання їжі. Також забезпечується спосіб індукування ситості у ссавця, який включає периферійне введення ссавцю ситість індукуючої кількості PYY агоніста винаходу. Також забезпечується спосіб зменшення поглинання калорій у ссавця, який включає периферійне введення ссавцю кількості PYY агоніста винаходу, що зменшує поглинання калорій. PYY агоніст може бути введений окремо або в комбінації з, принаймні, одним додатковим фармацевтичним агентом, переважно, агентом для лікування ожиріння. 13 В кожному із способів описаних тут і в пунктах формули винаходу, PYY агоніст може бути введений окремо або в комбінації з, принаймні, одним додатковим фармацевтичним агентом, переважно, агентом для лікування ожиріння. Представлені PYY агоністи і композиції, що їх містять, є також корисними при виготовленні медикаменту для терапевтичних застосування згаданих тут. Визначення і абревіатури Фраза "фармацевтично прийнятний" означає, що речовина або композиція повинна бути сумісна хімічно і/або токсикологічно з іншими інгредієнтами, що містить рецептура, і/або ссавцем яким вона лікується. Термін "ΡΥΎ агоніст" означає будь-яку сполуку, що викликає одну або більше ефектів, що викликає PYY, переважно PYY3-36, in vivo або in vitro. Фраза "терапевтично ефективна кількість" означає кількість PYY агоніста представленого винаходу, що зменшує поглинання калорій, зменшує вагу тіла і/або зменшує кількість жиру в тілі стосовно прийнятного значень контролю визначених раніше при лікуванні або в групі, що лікували розчинником. Термін "ссавець" означає людей, також як і інших теплокровних членів тваринного царства, що мають гомеостатичний механізм в класі Ссавці, наприклад, супутні тварини, зоопаркові тварини і їстівні тварини. Деякими прикладами супутніх тварин є собачі (наприклад, собаки), кошачі (наприклад, коти) і коні; деякими прикладами їстівних тварин є свині, велика рогата худоба, вівці і їм подібні. Переважно, ссавцем є людина або супутня тварина. Більш переважно, ссавцем є людина, чоловік або жінка. Терміни "лікування" або "терапія" поширюються на попереджувальне, тобто, профілактичне, і паліативне лікування. Термін "периферійне введення" означає введення зовні центральної нервової системи. Периферійне введення не включає безпосереднє введення у мозок. Периферійне введення включає, але не обмежується, інтраваскулярне, внутріньом'язове, підшкірне, інгаляційне, пероральне, сублінгкальне, ентеральне, ректальне, трансдермальне або інтраназальне введення. Неприродною амінокислотою придатною для використання в представленому винаході є типово будь-яка амінокислота наступної формули, інша ніж 20 амінокислот, що зустрічаються у природі [Cantor and Shimmel, Biophysical Chemistry, Part 1, WH Freeman & Sons, San Fransisco, 42-43, 1980], де R1 є будь-яким замісником, що включає кето, тіольну, карбоксильну, гідроксильну або вільну аміногрупу, таку як ті, що описані в опублікованій патентній заявці US 2005/0208536, включений сюди як посилання у всій своїй повноті. Такими неприродними амінокислотами, наприклад, є тіотриозин, орнітин, 3меркаптофенілаланін, 3- або 4-амінофенілаланін, 86686 14 3або 4-ацетилфенілаланін, 2- або 3гідроксифенілаланін (о- або м-тирозин), гідроксиметилгліцин, аміноетилгліцин, 1-метил-1меркаптоетилгліцин, аміноетилтіоетилгліцин і меркаптоетилгліцин. Багато неприродних амінокислот корисних в представленому винаході є комерційно доступними. Інші можуть бути одержані за способами відомими в цій галузі. Наприклад, тіотирозин можна одержати за способом описаним [Lu et al., J. Am. Chem. Soc. 119: 7173-7180, 1997], включеним сюди як посилання. Термін "PYY людини" або "hPYY" означає 36амінокислотний амідований по С-кінцю поліпептид, що має наступну амінокислотну послідовність: YPIKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNLVTR QRY-NH2 [SEQ ID NO:1] Термін "hPYY3-36'' означає С-термінальний 34мер, що має наступну амінокислотну послідовність: IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQR Y-NH2 [SEQ ID NO:2] Термін "(E10C)hPYY3-36" означає Стермінальний 34-мер hPYY, в якому залишок глютамінової кислоти 10 hPYY замінений цистеїновим залишком і який має наступну амінокислотну послідовність: IKPEAPGCDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQR Y-NH2 [SEQ ID NO:3]. Термін "(D11C)hPYY3-36" означає Стермінальний 34-мер hPYY, в якому залишок глютамінової кислоти 11 hPYY замінений цистеїновим залишком і який має наступну амінокислотну послідовність: IKPEAPGECASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQR Y-NH2 [SEQ ID NO:4]. Фіг.1 є кривою ВЕРХ з оберненою фазою очищеного (E10C)hPYY3-36 пептиду на колонці Zorbax Eclipse XDB-C8. Фіг.2 є розмірною кривою ексклюзійної ВЕРХ лінійного 30K мПЕГ малеіміду плюс реакційна суміш (E10C)hPYY3-36 на колонці Shodex 804 ЕКС. Фіг.3 є фото SDS PAGE фракцій SP Hitrap очищення лінійного 30K мПЕГ малеіміду (E10C)hPYY3-36. MW= стандарти молекулярної ваги; L= завантаження колонки; FT= потік; 4-23= елюювальні фракції. Фіг.4 є кривою ВЕРХ з оберненою фазою очищеного (D11C)hPYY3-36 пептиду на колонці Zorbax Eclipse XDB-C8. Фіг.5 є розмірною кривою ексклюзійної ВЕРХ лінійного 30K мПЕГ малеіміду плюс реакційна суміш (D11C)hPYY3-36 на колонці Shodex 804 ЕКС. Фіг.6 є розмірною кривою ексклюзійної ВЕРХ, що показує профіль елюювання очищеного продукту лінійний 30K мПЕГ малеімід (E10C)hPYY3-36 на колонці Shodex 804 ЕКС. Фіг.7 є розмірною кривою ексклюзійної ВЕРХ, що показує профіль елюювання очищеного продукту лінійний 30K мПЕГ малеімід (D11C)hPYY3-36 на колонці Shodex 804 ЕКС. Фіг.8 є розмірною кривою ексклюзійної ВЕРХ гліцерин-розгалужений 43K мПЕГ малеіміду плюс реакційна суміш (E10C)hPYY3-36 на колонці Shodex 804 ЕКС. 15 Фіг.9 є розмірною кривою ексклюзійної ВЕРХ, що показує профіль елюювання очищеного продукту гліцерин-розгалужений 43K мПЕГ малеімід (E10C)hPYY3-36 на колонці Shodex 804 ЕКС. Фіг.10 є графіком інгібування сукупного поглинання їжі у мишей, що харчуються, після інтраперітонеальної (ІП) ін'єкції. Фіг.10А показує дію дози природного PYY3-36 порівняно з групою, якій вводили розчинник. Фіг.10В показує дію дози лінійний 30K мПЕГ малеімід (E10C)hPYY3-36. Фіг.11 показує вплив на поглинання їжі ІП ін'єкції у мишей, що харчуються, гліцеринрозгалуження 43K мПЕГ малеімід(Е10С)РYY3-36 порівняно з розчинником і лінійний 30K мПЕГ малеімід(Е10С)РYY3-36. Фіг.11А є лінійним графіком, що показує відповідь через 6 годин після ін'єкції. Фіг.11В є гістограмою порівняльної дії через 24 годин після ін'єкції. Фіг.12 показує дію ІП ін'єкції розчинника, PYY336 і лінійний 30K мПЕГ малеімід(Е10С)РYY3-36 на самовільне харчування мишей. Фіг.12А показує вплив на вживання їжі і Фіг.12В показує вплив на вагу тіла. Фіг.13 показує дію підшкірної (ПШ) ін'єкції розчинника, ΡΥΥ3-36 і лінійний 30K мПЕГ малеімід (Е10С) hРYY3-36 на самовільне харчування мишей. Фіг.13А показує вплив на вживання їжі і Фіг.13В показує вплив на вагу тіла. Фіг.14 показує вміст в плазмі ΡΥΥ у мишей після ІП ін'єкції 0,1мг/кг. Фіг.14А демонструє рівні ΡΥΥ в плазмі після ін'єкції hΡΥΥ3-36 і Фіг.14В демонструє рівні PYY в плазмі після ін'єкції лінійний 30K мПЕГ малеімід (Е10С) hРYY3-36. Фіг.15 є графіком кривої відповіді від концентрації для PYY3-36 або лінійним 30K мПЕГ малеімід (Е10С) РYY3-36 з Сцинтиляційного дослідження близькості (Scintillation Proximity Assay (SPA)), в якому ліганди конкурують із 125Ι-ΡΥΥ1-36 за зв'язування з Y2R експресованим на KAN-TS клітинах. Фіг.16 є графіком кривої відповіді від концентрації для ΡΥΥ3-36 або лінійний 30K мПЕГ малеімід(Е10С)РYY3-36 з дослідження зв'язування GTPgamma[35S] з Y2R експресованим на KAN-TS мембранах. Представлений винахід стосується PYY агоністів, що є варіантами ΡΥΥ3-36 і їх пегильованими кон'югатами, які можуть мати принаймні одну покращену хімічну або фізіологічну властивість вибрану з, але не обмежується, зменшення швидкості кліренсу, збільшення тривалості знаходження в плазмі, пролонгуваня in vivo активності, підвищення активності, підвищення стабільності, покращення розчинності і зменшення антигенності. Переважним варіантом PYY3-36 винаходу є (E10C)hPYY3-36. Іншим переважним варіантом є (D11C)hPYY3-36. Ці і інші варіанти винаходу можна одержати синтетично і рекомбінантно і іншими шляхами, як описано нижче і тут в Прикладах або за аналогічними способами. На додаток до заміщень приведених вище (наприклад, Е10С і D11C), PYY агоністи винаходу також можуть включати один або більше консервативних амінокислотних заміщень в інших амінокислотних положеннях. Консервативні заміни можна зробити, наприклад, згідно з приведеною далі 86686 16 Таблицею. Аліфатичні неполярні, полярнінезаряджені і полярні-заряджені амінокислоти можна замінити іншою аліфатичною амінокислотою, що є неполярною, полярно-незарядженою або полярно-зарядженою амінокислотою, відповідно. Переважно, такі заміни мають місце між амінокислотами в тому ж самому рядку третьої колонки таблиці приведеної далі. Консервативні амінокислотні заміни також можна зробити між ароматичними амінокислотами як приведено в таблиці нижче. АЛІФАТИЧНІ Неполярні Полярні - незаряджені Полярні - заряджені АРОМАТИЧНІ GAP ILV CSTM NQ DE KR HFWY Синтетичне одержання РYY3-36 варіанти цього винаходу, наприклад, (E10C)hPYY3-36 і (D11C)hPYY3-36, можна одержати використовуючи стандартні методики синтезу пептидів відомі в цій галузі, наприклад, твердофазний синтез пептидів, що проводиться використовуючи автоматичні пептидні синтезатори (наприклад, модель 433А; Applied Biosystems, Foster City, CA) використовуючи tBoc або Fmoc групи. Огляд багатьох методик синтезу пептидів можна знайти в Solid Phase Peptide Synthesis 2nd ed. [Stewart, J.M. and Young, J.D., Pierce Chemical Company, Rockford, IL, 1984]. Дивіться також книгу Solidphase Organic Synthesis [Burgess, K., John Wiley & Sons, New York, NY, 2000] і статтю [Engels et al., Angew. Chem. Intl. Ed. 28: 716-34, 1989]. Всі із згаданих вище посилань включені сюди як посилання. PYY3-36 варіанти винаходу є переважно кон'югованими з ПЕГ. Реакції кон'югації, стосується реакції пегилювання, історично проводили в розчині з молярним надлишком полімеру і без зв'язку, куди полімер буде приєднуватись протеїн. Однак, такі загальні методики мають типово доказані невідповідності для кон'югації біоактивних протеїнів до неантигенних полімерів, які в той же час залишаються достатньо біоактивними. Один з шляхів підтримання біоактивності варіантів PYY3-36 агоніста після пегилювання, по суті, анулюється в процесі конденсування, кон'югація будь-яких реактивних груп варіанта, що пов'язується із зв'язуванням агоніста з цільовим рецептором. Аспект представленого винаходу забезпечує спосіб кон'югування поліетиленгліколю до варіанта агоніста РYY3-36 винаходу в специфічних реактивних місцях, які, по суті, не впливають на сайт(и) зв'язування рецептора, із збереженням високих рівнів активності. Іншим аспектом цього винаходу є введення реактивних залишків в ΡΥΥ3-36 із одержанням варіантів агоніста для кон'югування з поліетиленгліколем з мінімальними змінами активності. Хімічну модифікацію через ковалентне зв'язування можна провести за будь-яких придатних умов загалом адаптованих для реакції кон'югації біологічно активної речовини з активованим ПЕГ. 17 Реакцію кон'югації проводять за відносно м'яких умов з одержанням інактивованого варіанта агоніста ΡΥΥ3-36. М'якими умовами є підтримання рН реакційного розчину в інтервалі приблизно від 3 до 10 і температури реакції в інтервалі приблизно від 0° до 40°С. Нецільові функціональності ΡΥΥ3-36 варіантів, що є реактивними по відношенню до активованого ПЕГ за умов пегилювання, переважно захищають використовуючи прийнятну захисну групу, що видаляється після пегилювання цільової функціональної групи. При пегилюванні вільних аміногруп використовуючи такий реагент, як ПЕГ альдегіди або ПЕГ сукциніміди, типово підтримують рівень рН в інтервалі приблизно від 3 до 10, переважно приблизно 4-7,5. Реакцію конденсування типово проводять в придатному буфері (рН310), наприклад, фосфат, MES, цитрат, ацетат, сукцинат або HEPES, протягом приблизно 1-48г при температурі в інтервалі приблизно від 4° до 40°С. При пегилюванні тіольних груп використовують такі реагенти, як ПЕГ малеіміди, ПЕГ вінілсульфони або ПЕГ ортопіридилдисульфіди, рН переважно підтримують в інтервалі приблизно від 4 до 8. ПЕГ аміни є корисними при пегилюванні кетогруп, наприклад, в п-ацетилфенілаланіні і можна одержати як описано [Pillai et al., J. Org. Chem. 45: 53645370, 1980]. Реакції кон'югації представленого винаходу типово забезпечують реакційну суміш або пул, що містить бажаний моно-пегильований PYY3-36 варіант, також як ΡΥΥ3-36 варіант, що непрореагував, ПЕГ, що непрореагував, і зазвичай менше ніж приблизно 20% високомолекулярних одиниць, які можуть включати кон'югати, які містять більше ніж один ПЕГ ланцюг і/або агреговані одиниці. Після видалення одиниць, що непрореагували, і високомолекулярних одиниць, одержують композиції, що містять моно-пeгильовані ΡΥΥ3-36 варіанти. Встановлено, що кон'югати часто включають один ланцюг полімеру, кон'югати є по суті гомогенними. Бажаний кон'югат ΠΕΓ-ΡΥΥ3-36 варіант можна очистити від реакційної суміші використовуючи звичайні методики, що типово використовуються для очищення протеїнів, такі як діаліз, осадження сіллю, ультрафільтрування, іонобмінна хроматографія, хроматографія з гідрофобною взаємодією (НІС), гельхроматографія і електрофорез. Іонобмінна хроматографія є особливо корисною для видалення будь-яких ПЕГ, що непрореагували, або варіанту ΡΥΥ3-36, що непрореагував. Відокремлення бажаного кон'югата ПЕГ-варіант можна здійснити шляхом перенесення реакційної суміші, що містить суміш різних молекул, у розчин буфера, який має рН від приблизно 4 до приблизно 10, переважно, нижче ніж 8, для запобігання деамідування. Розчин буферу переважно містить одну або більше буферувальних солей, які вибирають з, але не обмежується, KСІ, NaCI, K2HPO4, KH2PO4, Na2HPO4, NaH2PO4, NaHCO3, NaBO4 і CH3CO2Na. Якщо буферувальна система, що використовується в реакції пегилювання, відрізняється від тієї що використовується в процесі розділення, пегилювальну реакційну суміш піддають обміну/діафільтруванню або розводять достатньою кількістю початкового розділюючого буфера. 86686 18 Фракціонування кон'югатів в пулі, що містить бажані молекули, переважно проводять використовуючи середовище іонообмінної хроматографії. Таке середовище здатне селективно зв'язувати кон'югати ΠΕΓ-ΡΥΥ3-36 варіанта через різницю в заряді, який змінюється досить прогнозуємим чином. Наприклад, заряд поверхні РYY3-36 варіанта визначається по кількості доступних заряджених груп на поверхні пептиду, що здатні взаємодіяти з носієм колонки, що недискредитований присутністю ПЕГ. Ці заряджені групи типово слугують точками потенційного приєднання ПЕГ полімерів. Тому, кон'югати ПЕГ-ΡΥΥ3-36 варіанта будуть мати різний заряд в залежності від присутнього виду, що дозволяє селективне розділення. Іонобмінні смоли є особливо переважними для очищення представлених кон'югатів ΠΕΓ-ΡΥΥ3-36 варіанта. Катіонообмінні смоли, такі як сульфопропільні смоли, використовуються в способі очищення представленого винаходу. Необмежуючим переліком катіонообмінних смол придатних для застосування з представленим винаходом є SPhitrap®, SP Sepharose HP® і SP Sepharose® з високою швидкістю течії. Також можуть бути використані інші придатні катіонообмінні смоли, наприклад, S і CM смоли. Катіонообмінну смолу переважно пакують у колонку і врівноважують звичайним чином. Використовують буфер, що має те ж саме значення рН і осмотичність як і розчин ПЕГ-кон'югованого PYY336 варіанта. Елюювальний буфер переважно містить одну або декілька солей, що вибирають з, але не обмежується, CH3CO2Na, HEPES, KСІ, NaCI, K2НРО4, KН2РО4, Na2HPO4) NaH2PO4, NaHCO3, NaBO4, i (NH4)2CO3. Кон'югат-вмісний розчин потім адсорбується колонкою, без утримування ПЕГ, що не прореагував, і деяких високомолекулярних молекул. Після завершення завантаження, для елюювання колонки використовують градієнт потоку елюювального буферу з концентрацією солі, що збільшується, одержуючи бажану фракцію ПЕГкон'югованого PYY3-36 варіанта. Елюйовані, розділені фракції переважно характеризуються однорідністю полімерних кон'югатів після стадії катіонообмінного розділення. Будь-які некон'юговані молекули PYY3-36 варіанта можна потім вимити з колонки використовуючи звичайні методики. При бажанні, моно- і полі-пегильовані PYY3.36 варіанти і високомолекулярні молекули можна відокремити одна від одної використовуючи додаткову іонообмінну хроматографію або ексклюзійну хроматографію. Замість лінійного градієнту можна використати методику багаторазових ізократичних стадій підвищення концентрації. Стадії багатократного ізократичного елюювання із збільшенням концентрації будуть забезпечувати послідовне елюювання полі-пегильованих/агрегатованих і тоді монопегильованих кон'югатів РYY3-36 варіанта. Також можуть бути використані методики, що базуються на рН градієнтах. Інтервал температури для елюювання загалом знаходиться в інтервалі від приблизно 4°С до приблизно 25°С. Елюювання ΠΕΓΡΥΥ3-36 варіанта контролюють за УФ абсорбцією при 280нм. Збирання фракцій можна проводити 19 використовуючи профілі простого елюювання з часом. Рекомбінантна експресія Молекули нуклеїнової кислоти Молекули нуклеїнової кислоти, що кодують (E10C)hPYY3-36 поліпептид, можуть включати одну з наступних послідовностей нуклеїнових кислот (мутація кодону для Е10С замісника підкреслена): atcaaacccgaggctcccggctgtgacgcctcgccggaggagct gaaccgctactacgcctccctgcgccactacctcaacctggtcacccgg cagcggtat (SEQ ID NO: 5); або atcaaacccgaggctcccggctgcgacgcctcgccggaggagc tgaaccgctactacgcctccctgcgccactacctcaacctggtcacccg gcagcggtat (SEQ ID NO: 6). Молекули нуклеїнової кислоти, що кодують (D11C)hPYY3-36 поліпептид, можуть включати одну з наступних послідовностей нуклеїнових кислот (мутація кодону для D11C замісника підкреслена): atcaaacccgaggctcccggcgaatgtgcctcgccggaggagct gaaccgctactacgcctccctgcgccactacctcaacctggtcacccgg cagcggtat (SEQ ID NO: 7); або atcaaacccgaggctcccggcgaatgcgcctcgccggaggagc tgaaccgctactacgcctccctgcgccactacctcaacctggtcacccg gcagcggtat (SEQ ID NO: 8). Ці послідовності також можуть включати стопкодон (наприклад, tga, taa, tag) на Стермінальному кінці, і їх можна легко одержати різними шляхами включаючи, без обмеження, хімічний синтез, генетичну мутацію дикого типу полінуклеотидної послідовності hPYY одержаної з кДНК або скринінгу геномної бібліотеки, скринінгу експресійної бібліотеки і/або ампліфікації кДНК полімеразною ланцюговою реакцією (PCR). Молекули нуклеїнової кислоти, що кодують (E10C)hPYY3-36 і (D11C)hPYY3-36 варіанти, можна одержати використовуючи сайтспрямований мутагенез, PCR ампліфікацію або інші прийнятні способи, де праймер(и) мають бажані точкові мутації. Способи рекомбінантної ДНК і способи мутагенезу описані тут загалом є такими як показано в [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) і Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., Green Publishers Inc. and Wiley and Sons 1994)]. При бажанні, щоб інша неприродна амінокислота була б замісником в Е10 або D11, такий пептид можна рекомбінантно експресувати використовуючи способи описані в, наприклад, патентній заявці [US 2005/0208536], включеній сюди як посилання. Нуклеїнові кислоти полінуклеотидів, що кодують амінокислотну послідовність hPYYs, можна ідентифікувати використовуючи експресійне клонування в якому використовується детектування позитивних клонів на основі властивості експресованого протеїну. Типово, бібліотеки нуклеїнових кислот сортували шляхом зв'язування антитіла або іншого партнера зв'язування (наприклад, рецептор або ліганд) з клонованими протеїнами, що експресуються і виділяються на поверхні клітина хазяїна. Антитіло або партнер зв'язування модифікують міткою, що детектується, для визначення тих клітин, що експресують бажаний клон. Методики ексресії рекомбінанта, що проводяться у відповідності з описаним нижче, можна 86686 20 використовувати для одержання (E10C)hPYY3-36 і (D11C)hPYY3-36 кодувальних полінуклеотидів і для експресії кодованих поліпептидів. Наприклад, шляхом введення нуклеїнової послідовності, що кодує амінокислотну послідовність (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 варіант у прийнятний вектор, спеціаліст в цій галузі може легко одержати бажану нуклеотидну послідовность. Послідовності можуть бути в подальшому використані для одержання детекційних зондів або ампліфікаційніх праймерів. Альтернативно, полінуклеотид, що кодує амінокислотну послідовність (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 поліпептиду можна ввести в експресійний вектор. При введенні експресійного вектора в прийнятного хазяїна, кодований (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 варіант можна одержати у великих кількостях. Іншим способом одержання придатної нуклеїнової послідовності є полімеразна ланцюгова реакція (PCR). В цьому способі, кДНК одержують з полі(А)±РНК або загальної РНК використовуючи ферментну ревертазу. Потім до кДНК додають два праймери, типово комплементарні двом окремим регіонам кДНК, що кодують амінокислотну послідовність (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 варіанта, разом з полімеразою такою як Taq полімераза, і полімераза ампліфікує кДНК регіон між двома праймерами. Іншим способом одержання молекули нуклеїнової кислоти, що кодує амінокислотну послідовність (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 варіанта, є хімічний синтез використовуючи методики добре відомі середньому спеціалісту в цій галузі, такі як ті що описані [Engels et al., Angew. Chem. Intl. Ed. 28: 716-34, 1989]. Ці способи включають фосфотриестерний, фосфорамідатний і Н-фосфонатний способи синтезу нуклеїнової кислоти. Переважним способом для такого хімічного синтезу є синтез на полімерному носії використовуючи стандартну фосфорамідатну хімію. Типово, ДНК, що кодує амінокислотну послідовність (E10C)hPYY3-36 буде мати довжину приблизно в одну тисячу нуклеотидів. Нуклеїнові кислоти з довжиною більше ніж приблизно 100 нуклеотидів можна синтезувати як декілька фрагментів використовуючи ці способи. Фрагменти потім можна зв'язати разом з утворенням повнодовжинної нуклеотидної послідовності гену (E10C)hPYY3-36. ДНК фрагмент, що кодує аміно-кінець поліпептиду може мати ATG, який кодує метіоніновий залишок. Цей метіонін може бути присутній або можу бути і відсутній на повній формі (E10C)hPYY3-36 або (DIIC) LP443-36, в залежності від того де продукується поліпептид в клітині хазяїні змодельованій для секретування в цій клітині. Кодон, що кодує ізолейцин, також можна використати як стартовий сайт. Також можуть бути використані інші способи відомі середньому спеціалісту в цій галузі. В деяких втіленнях, варіанти нуклеїнової кислоти, що містять кодони, які змінені для оптимальної експресії (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 в даній клітині хазяїні. Специфічні зміни кодону будуть залежати від (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 клітини хазяїна вибраної для експресії. Така "оптимізація кодону" може проводитись за допомогою 21 різних способів, наприклад, шляхом вибору кодонів, які є переважними для застосування у високоекспресійних генах в даній хазяйській клітині. Для переважного кодону високоекспресійних бактеріальних генів можуть бути використані комп'ютерні алгоритми, які включають таблиці частоти кодонів, такі як "Eco_high.Cod" і пропонується University of Wisconsin Package Version 9,0 (Genetics Computer Group, Madison, Wis.). Іншими корисними таблицями частоти кодонів є "Celegans_high.cod," "Celegansjow.cod," "Drosophila_high.cod," "Human_high.cod," "Maizejiigh.cod," і "Yeast_high.cod." Вектори і хазяйські клітини Молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує амінокислотну послідовність (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 вводять в прийнятний експресійний вектор використовуючи стандартні методики лігування. Вектор типово вибирають для функціонування в певній використовуваній клітині хазяїні (тобто, вектор сумісним з апаратом клітини хазяїна, так що має місце ампліфікація гену і/або експресія гену). Молекула нуклеїнової кислоти, що кодує амінокислотну послідовність (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 може ампліфікуватись/експресуватись у прокаріотичних, дріжджових, комашиних (бакуловірусних системах) і/або еукаріотичних хазяйських клітинах. Для ознайомлення з експресійними векторами дивіться [Meth. Enz., vol.185 (D. V. Goeddel, ed., Academic Press, 1990)]. Типово, експресійні вектори, що використовуються в будь-яких хазяйських клітинах будуть містити послідовності для збереження плазміди і для клонування і експресії екзогенних нуклеотидних послідовностей. Такі послідовності, в деяких втіленнях разом відносяться до "фланкуючих послідовностей", будуть типово включати одну або більше наступних нуклеотидних послідовностей: промотор, одна або декілька підсилюючих послідовностей, початок реплікації, транскрипційну термінальну послідовність, послідовність повного інтрону, що включає донор і акцептор сайта сплайсингу, послідовність, що кодує лідерну послідовність для секреції поліпептиду, рибосомазв'язувальний сайт, поліаденилюючу послідовність, полілінкерний регіон для введення нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, який експресується, і селектуємий маркерний елемент. Кожна з цих послідовностей обговорюється нижче. Необов'язково, вектор може містити "tag''кодуюючу послідовність, тобто, олігонуклеотидну молекулу розташовану на 5' або 3' кінці (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 кодувальної послідовності; олігонуклеотидна послідовність, що кодує поліНіs (такий як гексаHis), або інший "tag", такий як FLAG, НА (гемаглютиніновий вірус грипу), або mус, для яких існують комерційно доступні антитіла. Цей tag є типово приконденсовують до поліпептиду при екпресії поліпептиду і може слугувати засобом, що полегшує афінне очищення (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 з хазяйської клітини. Афінне очищення можна здійснити, наприклад, використовуючи колонкову хроматографію, в якій як афінна матриця використовуються 86686 22 антитіла проти tag. Необов'язково, tag може бути в подальшому виділений з очищеного (E10C)hPYY336 або (D11C)hPYY3-36 за допомогою різних способів, таких як використання деяких пептидаз для розщеплення, наприклад, ентерокіназний гідроліз 3' FLAG tag послідовності, що розташована вище однієї з амінокислотних послідовностей, як показано в SEQ ID NO: 3-4. Фланкуючі послідовності можуть бути гомологічними (тобто, з тих же самих видів і/або штамів як хазяйська клітина), гетерологічними (тобто, з видів інших ніж хазяйська клітина або штам), гібридним (тобто, комбінація фланкуючих послідовностей з більше ніж одного джерела) або синтетичними, або фланкуючі послідовності можуть бути природними послідовностями, які нормально функціонують регулюючи експресію hPYY3-36. Джерелом фланкуюючої послідовності може бути будьякий прокаріотичний або еукаріотичний організм, будь-який хребетний або безхребетний організм, або будь-яка рослина, за умови, що фланкуюча послідовність є функціональною в, і може бути активованою, апаратом хазяйської клітини. Корисні фланкуючі послідовності можна одержати будь-яким з декількох способів добре відомих в цій галузі. Типово, фланкуючі послідовності тут корисні, інші ніж PYY ген фланкуючої послідовності, добре попередньо ідентифікувати шляхом картування і/або шляхом гідролізу ендонуклеазною рестриктазою і, таким чином, можна виділити з типової тканини використовуючи рестрекційні ендонуклеази. В деяких випадках, повні нуклеотидні послідовності фланкуючої послідовності можуть бути відомі. Тут, фланкуючу послідовність можна синтезувати використовуючи способи описані тут для синтезу або клонування нуклеїнової кислоти. Коли відома вся або тільки частина фланкуючої послідовності, її можна одержати використовуючи PCR і/або шляхом скринінгу геномної бібліотеки використовуючи придатний олігонуклеотид і/або фрагмент фланкуючої послідовності з того ж самого або інших видів. Коли фланкуюча послідовність невідома, фрагмент ДНК, що містить фланкуючу послідовність, можна виділити з великого шматка ДНК, що може містити, наприклад, кодувальну послідовність або навіть інший ген або гени. Виділення можна здійснити шляхом гідролізу рестрекційною ендонуклеазою з одержанням необхідного ДНК фрагмента з наступним виділенням використовуючи очищення на агарозному гелі, хроматографічна колонка Qiagen® (Chatsworth, CA), або інші способи відомі спеціалісту в цій галузі. Вибір придатних ферментів для здійснення цієї цілі будуть очевидні для середнього спеціаліста в цій галузі. Реплікатором типово є частина тих прокаріотичних експресійних векторів, що пропонуються комерційно і спочатку допомагають в апмліфікцаії вектора в клітині хазяїні. Ампліфікація вектора в деякій кількості копій може, в деяких випадках, бути важливою для оптимальної експресії (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36. Якщо вибирають вектор, який не містить початковий сайт реплікації, вектор можна хімічно синтезувати ґрунтую 23 чись на відомості послідовності і лігувати у вектор. Наприклад, початок реплікцаії з плазміди pBR322 (New England Biolabs, Beverly, MA) є придатним для більшості грам-негативних бактерій і різних джерел (наприклад, SV40, поліома, аденовірус, вірус везикулярного стоматиту (VSV), або папіломавірус, такий як HPV або BPV) і є корисними для клонувальних векторів в клітинах ссавців. Загалом, реплікатор не є необхідним для експресійних векторів ссавців (наприклад, SV40 вид часто використовується тільки тому, що містить ранній промотор). Транскрипційна термінальна послідовність типова розташована на 3' кінці поліпептидного кодувального регіону і слугує для закінчення транскрипції. Зазвичай, транскрипційна термінальна послідовність в прокаріотичних клітинах є збагаченою G-C фрагментом після полі-Т послідовності. Поряд з ти, що послідовності легко клонується з бібліотеки або навіть пропонується комерційно, як частина вектора, він може бути також легко синтезований використовуючи способи для синтезу нуклеїнової кислоти, такі як ті що тут описані. Вибраний елемент маркерного гену кодує протеїн необхідний для виживання і росту хазяйської клітини, що росте у вибраному культуральноиму середовищі. Типові вибрані маркерні гени кодують протеїни, що (а) забезпечують стійкість до антибіотиків або інших токсинів, наприклад, ампіцилін, тетрациклін або канаміцин для прокаріотичних хазяйських клітин; (б) доповнюють ауксотрофічний дефіцит клітини; або (в) доставляють критичні поживні речовини не доступні із складного середовища. Переважними вибраними маркерами є канаміцинстійкий ген, ампіцилінстійкий ген і тетрациклінстійкий ген. Неоміцинстійкий ген також можна використати для вибору в прокаріотичних і еукаріотичних хазяйських клітин. Інші вибрані гени можуть бути використані для ампліфікації гену, що буде експресуватись. Ампліфікцаія є процесом, в якому гени, що більш необхідні для продукування протеїну критичного для росту, повторюються в тандемі в межах хромосом, що послідовно генеруються в рекомбінантних клітинах. Прикладами придатних вибраних маркерів для клітин ссавців є дегідрофолатредуктаза (DHFR) і тимідинкіназа. Трансформанти клітини ссавця розташовують при певному тиску, де тільки трансформанти є єдино адаптованими для виживання завдяки присутності вибраного гену у векторі. Вибраний тиск прикладають при культивуванні трансформованих клітин за умов, при яких концентрація вибраного гену в середовищі є послідовно змінюваною, що таким чином призводить до ампліфікцаії і вибраного гену, і ДНК, що кодує (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36. Як результат, збільшується кількість (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 синтезованого з ампліфікованих ДНК. Рибосомазв'язувальний сайт зазвичай необхідний для початку трансляції мРНК і характеризується послідовністю Шина-Далгарно (прокаріоти) або послідовністю Козакі (еукаріоти). Елемент типово розташований в 3' для промотору і 5' для кодувальної послідовності (E10C)hPYY3-36 або 86686 24 (D11C)hPYY3-36, що експресується. Послідовність Шина-Далгарно змінюється, але типово є поліурином (тобто, має високий вміст A-G). Було ідентифіковано багато послідовностей Шина-Далгарно, кожна з яких може бути легко синтезована використовуючи способи приведені тут і використовується в прокаріотичному векторі. Лідерна, або сигнальна, послідовність може бути використана для керування виходом (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 з хазяйської клітини. Типово, кодувальна нуклеотидна послідовність сигнальної послідовності розташована в кодувальному регіоні (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 молекули нуклеїнової кислоти, або безпосередньо на 5' кінці кодувального регіону (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36, було ідентифікована багато сигнальних послідовностей і будьяки з них, що функціонують у вибраній клітині хазяїні, може бути використана у поєднанні з (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 молекулою нуклеїнової кислоти. Крім того, сигнальна послідовність може бути гомологічною (що зустрічається у природі) або гетерологічною до (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 молекули нуклеїнової кислоти. На додаток, сигнальну послідовність можна хімічно синтезувати використовуючи способи описані тут. В більшості випадків, секретування (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 з хазяйської клітини через присутність сигнального пептиду буде призводити до видалення сигнального пептиду із декретованого (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36. Сигнальна послідовність може бути компонентом вектора або вона може бути частиною (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 молекули нуклеїнової кислоти, що вставлена у вектор. Нуклеотидна послідовність, що кодує природну сигнальну послідовність hPYY3-36, може бути приєднана до (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 кодувального регіону або нуклеотидна послідовність, що кодує гетерологічну сигнальну послідовність, може бути приєднаною до (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 кодувального регіону. Вибрана гетерологічна сигнальна послідовність повинна бути однією з тих, що розпізнається і обробляється, тобто, відщеплюється сигнальною пептидазою, хазяйської клітини. Для прокаріотичних хазяйських клітин, що не розпізнаються і не обробляється природною сигнальною послідовністю hPYY, сигнальна послідовність замінюється прокаріотичною сигнальною послідовністю, наприклад, з групи лідерів лужних фосфатаз, пеніциліназ або теплостабільного ентеротоксину II. Для дріжджового секретування, природну сигнальну послідовність hPYY можна замінити лідерними дріжджовою інвертазою, альфа фактором або кислотною фосфатазою. При експресії клітини ссавця, природна сигнальна послідовність є задовільною, хоча можуть бути придатними інші сигнальні послідовності ссавців. В багатьох випадках, транскрипція молекули нуклеїнової кислоти підвищується в присутності одного або декількох інтронів у векторі; це є особливо вірним, коли поліпептид продукується в еукаріотичних хазяйських клітинах, особливо, хазяйсь 25 ких клітинах ссавців. Використовувані інтрони можуть бути природними в межах hPYY гену, особливо, коли використовуваний ген є повнодовжинною геномною послідовністю або її фрагментом. Коли інтрон є не природнім в межах гену (як більшість кДНК), інтрон можна одержати з інших джерел. Положення інтрону стосовно фланкуючих послідовностей і hPYY гену є загалом важливим, як і те що інтрон повинен бути ефективно транскрибованим. Таким чином, коли кДНК молекули, що кодують (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36, транскрибуються, переважним положенням для інтрону є 3' до транскрипційного стартового сайту і 5і до полі-Α транскрипційної термінальної послідовності. Переважно, інтрон або інтрони будуть розташовуватись з одного боку або іншого (тобто, 5' або 3') кДНК, так що вони не переривають кодувальну послідовність. Може бути використаний будьякий інтрон з бдуь-якого джерела, включаючи вірусні, прокарітичні і еукаріотичні (рослинні або тваринні) організми, за умови, що він є сумісним з хазяйською клітиною, в яку він введений. Також включеними сюди є синтетичні інтрони. Необов'язково, у векторі може бути використаний більше ніж один інтрон. Експресовані і клоновані вектори будуть типово містити промотор, що розпізнається організмом хазяїном і операбельно зв'язаний з молекулою, що кодує (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36. Промотори є послідовностями, що не траскрибуються, і розташованими вище (тобто, 5') стартового кодону структурного гену (загалом в межах приблизно від 100 до 1000bр), що контролює транскрипцію структурного гену. Промотори умовно розподіляються на два класи: промотори, що індукуються, і конститутивні промотори. Промотори, що індукуються, ініціюють підвищення рівнів транскрипції ДНК за їх контролем у відповідь на деяку зміну культуральних умов, таких як присутність або відсутність поживної речовини або зміна температури. Конститутивні промотори, з іншого боку, ініціюють продукування продукту конститутивного гену; тобто, вони в незначній мірі або зовсім не контролюють надмірну експресію гену. Добре відома велика кількість промоторів, що розпізнаються великою кількістю потенційних хазяйських клітин. Придатний промотор операбельно зв'язується з ДНК, що кодує (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36, через видалення промотору з джерела ДНК за допомогою гідролізу рестрекційним ферментом і введення бажаної промоторної послідовності у вектор. Для безпосередньої ампліфікації і/або експресії (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 молекули нуклеїнової кислоти може бути використана природна послідовність промотору hΡΥΥ3-36. Однак, гетерологічний промотор є переважним, якщо він дозволяє більшу транскрипцію і вищі виходи протеїну, що екпресується, порівняно з природним промотором, і якщо він сумісний з системою хазяйської клітини, що вибирається для застосування. Промоторами придатними для застосування з прокаріотичними хазяєвами є бета-лактамаза і системи промотору лактози; Е. соlі Т7 індукуєма РНК полімеразою; лужна фосфатаза; система промотору триптофану (trp); і гідридні промотори, 86686 26 такі як tac промотор. Також придатні інші відомі бактеріальні промотори. Опубліковані їх послідовності, у зв'язку з чим створюється можливість спеціалісту в цій галузі лігувати їх до бажаної послідовності ДНК, використовуючи лінкери або адаптери, як необхідно для забезпечення будь-яких корисних рестрекційних сайтів. Також в цій галузі добре відомі придатні промотори для застосування з дріжджовими хазяєвами. Дріжджові підсилювачи переважно використовуються з дріжджовими промоторами. Добре відомі придатні промотори для застосування з хазяйськими клітинами і ними є, але не обмежується, промотори одержані з геномів вірусів, таких як вірус поліоми, вірус оспи, аденовірус (такий як аденовірус 2), вірус папіломи великої рогатої худоби, пташиний вірус саркоми, цитомегаловірус, ретровіруси, вірус гепатиту-В і більш переважно мавпячий вірус 40 (SV40). Іншими придатними промоторами ссавців є гетерологічні промотори ссавців, наприклад, промотори теплового шоку і промотор актину. Додатковими промоторами, які можуть бути цікавими при коентролюванні експресії (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 є, але не обмежується: ранній промоторний регіон SV40 [Bemoist and Chambon, Nature 290: 304-10, 1981]; CMV промотор; промотор, що містить в 3' довгий кінцевий повтор вірусу саркоми Роуса [Yamamoto et al, Cell 22: 787-97, 1980]; промотор тимідинкінази герпесу [Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 1444-45, 1981]; регуляторні послідовності металотіонінового гена [Brinster et al., Nature 296: 39-42, 1982]; прокаріотичні експресійні вектори, такі як промотор бета-лактамази [Villa-Kamaroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75: 3727-31, 1978]; або tac промотор [DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 21-25, 1983]. Підсилююча послідовність може бути введена у вектор для збільшення транскрипції в найвищих еукаріотах ДНК, що кодує (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36. Підсилювачі є цис-діючими елементами ДНК, зазвичай приблизно 10-300bр у довжину, що діє на промотор для збільшення транскрипції. Підсилювачі є відносно орієнтованими і розташовані незалежно. Вони можуть розташовуватись 5' і 3' відносно транскрипційної одиниці. Відомі декілька підсилюючих послідовностей доступні з генів ссавців (наприклад, глобін, еластаза, альбумін, альфа-фето-протеїн і інсулін). Однак, типово буде використовуватись підсилювач з вірусу. SV40 підсилювач, цитомегаловірусний раньопромоторний підсилювач, підсилювач поліоми і аденовірусні підсилювачі є прикладами підсилюючих елементів для активації еукаріотичних промоторів. Недивлячись на те, що підсилювач може бути сплайсингований у вектор в положенні 5' або 3' до кодувальної молекули нуклеїнової кислоти (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36, він типово розташований в 5' сайті до промотору. Експресійні вектори можуть бути сконструйовані із стартового вектору, такого як комерційно доступний вектор. Такі вектори можуть містити або можуть не містити всі бажані фланкуючі послідовності. Коли одна або більше фланкуючих послідо 27 вностей описаних тут не завжди присутні у векторі, вони можуть бути одержані індивідуально і ліговані у вектор. Способи, що використовуються для одержання кожної з фланкуючих послідовностей добре відомі спеціалісту в цій галузі. Переважними векторами є вектори, що сумісні з хазяйськими клітинами бактерій, комах і ссавців. Такими векторами є, між тим, pCRII, pCR3, і pcDNA3,1 (Invitrogen, Carlsbad, CA), pBSII (Stratagene, La Jolla, CA), pET15 (Novagen, Madison, Wl), pGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, CA), pETL (BlueBacll, Invitrogen), pDSR-alpha [публікація РСТ №WO 90/14363] і pFastBacDual (GibcoBRL, Grand Island, NY). Додатковими придатними векторами є, але не обмежується, косміди, плазміди або модифіковані віруси, але зрозуміло, що векторна система повинна бути сумісна з вибраною хазяйською клітиною. Такими векторами є, але не обмежується, плазміди, такі як похідні плазімди Bluescript® (висококопійована кількість СоІЕ1-базового фагеміду, Stratagene), PCR клоновані плазімди спроектовані для клонуваня Taq-ампліфікованих PCR продуктів (наприклад, ТОРО® ТА Cloning® Kit, PCR2.1® плазмідін похідні, Invitrogen), і вектори ссавців, дріжджів або вірусів, такі як бакуловірусна експресійна система (рВасРАК плазімідні похідні, Clontech). Після конструювання вектор і молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 поліпептид, вводять в типовий сайт вектора, закінчений вектор може бути введений в придатну клітину хазяїн для ампліфікації і/або експрсеії поліпептиду. Трансформацію експресійного вектора для (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 поліпептиду у вибрану клітину хазяїн можна здійснити використовуючи добре відомі способи, такі як трансфекція, інфекція, електропорація, мікроін'екція, ліпофекція, спосіб DEAEдекстран або інші відомі методики. Вибраний спосіб буде часткою функції типу вибраної хазяйської клітини. Ці способи і інші придатні способи добре відомі середньому спеціалісту в цій галузі і показані, наприклад, в Sambrook et al., supra. Хазяйські клітини можуть бути прокаріотичними хазяйськими клітинами (такі як E. соlі) або еукаріотичними хазяйськими клітинами (такі як клітини дріжджів, комах або хребетних). Хазяйська клітина, коли культивується за прийнятних умов, синтезує (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 поліпептид, який можна пізніше зібрати з культурального середовища (якщо хазяйська клітина секретує її в середовище) або безпосередньо з хазяйської клітини, що її продукує (якщо вона не секретується). Вибір прийнятної клітини хазяїна буде залежати від різних факторів, таких як бажані рівні експресії, модифікації поліпептиду, що є бажаними або необхідними для активності (такої як глікозилювання або фосфорилювання) і легкість укладання в біологічно активну молекулу. В цій галузі відомий ряд придатних хазяйських клітин і багато є доступними з Американської колекції типів культур (АТСС), Manassas, Va. Прикладами є, але не обмежується, клітини ссавців, 86686 28 такі як клітини яєчників китайських хом'яків (СНО), СНО DHFR(-) клітини [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97: 4216-20, 1980], ембріональні клітини нирки людини (НЕК) 293 або 293Т, або 3Т3 клітини. Вибір придатних хазяйських ссавцевих клітин і способів трансформації, культування, ампліфікації, скринінгу, одержання продукту і очищення відомий в цій галузі. Іншими придатними лініями клітин ссавців є лінії клітин мавп COS-1 і COS-7 і лінія клітин CV-1. Додатковими прикладами хазяйських ссавцевих клітин є ліній клітин приматів і ліній клітин гризунів, включаючи трансформовані ліній клітин. Також придатні нормальні діплоїдні клітини, штами клітин одержані з in vitro культури первинної тканини, також як первинні експлантати. Кандидатні клітини можуть бути генотипічно дефіцитними на вибраний ген або можуть містити домінантно діючий вибраний ген. Іншими придатними лініями клітин є, але не обмежується, клітини нейробластоми мишей N2A, HeLa, L-929 клітини мишей, 3Т3 лінії похідні від ліній клітин Swiss, Balb-c або NIH мишей, ВНК або НаK хом’яків. Кожна з цих ліній клітин відома і доступна спеціалісту в галузі експресії протеїну. Аналогічно корисними придатними хазяйськими клітинами є бактеріальні клітини. Наприклад, різні штами Е. соli (наприклад, НВ101, DH5α, DH10, і МС1061) добре відомі як хазяйські клітини в галузі біотехнології. Також в цьому способі можуть бути використані різні штами В. subtilis, Pseudomonas spp., інші Bacillus spp., i Streptomyces spp. Багато штамів дріжджових клітин, що відомі спеціалісту в цій галузі, також доступні як хазяйські клітини для експресії (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 поліпептидів. Переважними дріжджовими клітинами є, наприклад, Saccharomyces cerivisae і Pichia pastoris. Крім того, при бажанні, системи клітин комах можуть бути використані для експресії (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36. Такі системи описуються, наприклад, в [Kitts et аl., 1993, Biotechniques 14: 810-17; Lucklow, Curr. Opin. Biotechnol. 4: 564-72, 1993; і Lucklow et al., J. Virol., 67: 4566-79, 1993]. Переважними клітинами комах є Sf-9 і Ні5 (Invitrogen). Одержання (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 поліпептидів Лінію хазяйських клітин, що включає (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 експресійний вектор, можна культивувати використовуючи стандартне середовище добре відоме спеціалісту в цій галузі. Середовище зазвичай буде містити всі поживні речовини необхідні для росту і виживанні клітин. Придатним середовищем для культивування Е. соlі клітин є, наприклад, бульйон Луріа (LB) і/або бульйон Терріфіка (ТВ). Придатним середовищем для культивування еукаріотичних клітин є середовище Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640), Мінімальне есенціальне середовище (MEM) і/або середовище Ігла модифіковане Дульбекко (DMEM), всі з яких можуть бути доповнені сироваткою і/або факторами росту, як необхідно для культивування певних клітин. Придатним середовищем для комашиних культур є середовище 29 Грейса доповнене дріжджовим екстрактом, гідролізатом лактатальбуміну і/або сироватка ембріону теляти, як необхідно. Типово, як доповнення до середовища додається антибіотик або інша сполука корисна для селективного росту трансфікованих або трансформованих клітин. Сполука, що використовується, буде диктувати через присутній на плазміді маркерний елемент, що селектується, яким хазяйська клітина трансформована. Наприклад, коли вибраний маркерений елемент є канаміцинстійким, сполукою, що додають до культурального середовища, буде канаміцин. Іншими сполуками для селективного росту є ампіцилін, тетрациклін і неоміцин. Кількість (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 поліпептиду, що продукується хазяйською клітиною, можна оцінити використовуючи стандартні способи відомі в цій галузі. Такими способами є, без обмеження, вестерн-блот аналіз, електрофорез на SDS-поліакриламідному гелі, електрофорез на неденатурованому гелі, розділення з використанням високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ), імуноосадження і/або дослідження активності, такі як дослідження зсуву гель-зв'язаної ДНК. Якщо (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 проектувався для секретування з лінії хазяйських клітин, в основному поліпептид можна знайти в культуральному середовищі клітин. Однак, якщо поліпептид не секретуеться з хазяйських клітин, він може бути присутній в цитоплазмі і/або ядрі (для еукаріотичних хазяйських клітин) або в цитозолі (для грам-негативних бактеріальних хазяйських клітин). Для (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 розташованих в цитоплазмі хазяйської клітини і/або ядрі (для еукаріотичних хазяйських клітин) або в цитозолі (для бактеріальних хазяйських клітин), внутрішньоклітинний матеріал (включаючи включені тіла для грам-негативної бактерії) можна екстрагувати з хазяйської клітини використовуючи будь-яку стандарту методику відому спеціалісту в цій галузі. Наприклад, хазяйські клітини можна лізувати для вивільнення вмісту періплазми/цитоплазми використовуючи прес Френча, гомогенізацією і/або сонікуванням, з наступним центрифугуванням. Якщо (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 формується включеними тілами в цитозолі, інклюзійні тіла часто можуть зв'язуватись з внутрішніми і/або зовнішніми клітинними мембранами і, таким чином, будуть знаходитись спочатку в осадженому матеріалі після центрифугування. Осаджений матеріал потім можна обробити граничними рН або використовуючи агентом, що викликає дисоціацію комплексів, таким як детергент, похідні гуанідину, сечовина або похідні сечовини в присутності відновлюючого агенту, такого як дітіотреітол при лужному рН або трискарбоксиетилфосфін при кислотному рН для вивільнення, руйнування на шматки, і солюбілізації включених тіл. Солюбілізовані (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 надалі можна проаналізувати використовуючи гельелектрофорез, імноосадження або т.і.. При бажанні ви 86686 30 ділити поліпептид, ізолювання може здійснити використовуючи способи, такі як ті, що описані тут і в [Marston et al., Meth. Em. 182: 264-75, 1990]. Якщо включені тіла не утворюються у значному ступені при експресії (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36, тоді поліпептид буде первинно знаходитись у надосадковій рідині після центрифугування гомогенату клітин. Поліпептид можна потім виділити з надосадкової рідини використовуючи способи, такі як ті, що тут описані. Очищення (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 з розчину можна здійснити використовуючи різні методики. Якщо поліпептид був синтезований і він містить tag, такий як Гексагістидин 9 або інший малий пептид, такий як FLAG (Eastman Kodak Co., New Haven, CT) або myc (Invitrogen) на або його карбоксильному, або аміно-кінці, його можна очистити у одну стадію шляхом пропускання розчину через афінну колонку, де матрикси колонки має високу спорідненість до tag. Наприклад, полігістидин зв'язується із великою спорідненістю і специфічністю до нікелю. Таким чином, для очищення можуть бути використана нікелева афінна колонка (така як нікелеві колонки Qiagen®). Дивіться, наприклад, Current Protocols in Molecular Biology §10,11,8 [Ausubel et al., eds., Green Publishers Inc. і Wiley and Sons, 1993]. Крім того, (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 поліпептид можна очистити використовуючи моноклональне антитіло, що здатне специфічно розпізнає і зв'язує (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 поліпептид. В ситуації, коли переважним є часткове або повне очищення (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY336 поліпептиду, який є частково або по суті вільним від забруднювачів, можуть бути використані стандартні способи відомі спеціалісту в цій галузі. Такими способами є, без обмеження, розділення за допомогою електрофорезу з наступним електроелююванням, різні типи хроматографії (афінна, імуноафінна, молекулярні сита і іонобмінна), ВЕРХ і препаративне ізоелеткрофокусування (прилад/методика "Ізопрайм", Hoefer Scientific, San Francisco, CA). В деяких випадках, дві або більше методик очищення можуть бути поєднані для досягнення підвищеної чистоти. В цій галузі відомий ряд додаткових способів одержання поліпептидів і способи можуть бути використані для одержання (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 поліпептидів. Дивіться, наприклад, [Roberts et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 12297-303, 1997], який описує одержання злитих протеїнів між мРНК і пептидом, що нею кодується. Дивіться також, [Roberts, Curr. Opin. Chem. Biol. 3: 268-73, 1999]. Способи одержання пептидів або поліпептидів також описуються [в патентах US №:5,763,192; 5,814,476; 5,723,323 і 5,817,483]. Спосіб включає одержання стохастичних генів або їх фрагментів, і наступне введення цих генів в хазяйські клітини, які продукують один або декілька протеїнів, що кодуються стохастичними генами. Хазяйські клітини потім досліджують для ідентифікування тих клонів, що продукують пептиди або поліпептиди, 31 які мають бажану активність. Інші способи для експресії рекомбінантного пептиду описані [в патентах US №:6,103,495, 6,210,925, 6,627,438 і 6,737,250]. Способи використовують Е. соlі і загальне секретування Е. соlі. Пептид зливається із сигнальною послідовністю; таким чином, пептид є цільовим для секретування. Інші способи одержання пептидів або поліпептидів описуються в опублікованій [заявці РСТ №WO 99/15650]. Опублікований спосіб, що називається випадкова активація експресії гену для винайдення гену, включає активацію експресії або надмірну екпресію ендогенного гену використовуючи in situ рекомбінантні способи. Наприклад, екпресія ендогенного гену активується або підвищується шляхом інтеграції регуляторної послідовності в цільову клітину, яка здатна до активуючої екпресії гену використовуючи негомологічну або нестандартну рекомбінацію. Цільову ДНК спочатку піддають редіаційному опроміненню і вводять генетичний промотор. Промотор в кінці кінців розташовується в розриві на фронті гену, ініціюючи транскрипцію гена. Це призводить до експресії бажаного пептиду або поліпептиду. Амідування Амідування пептиду, одержаного або синтетично або рекомбінантно, проводять використовуючи фермент, що називається пептидил-гліцин альфа-амідувальна монооксигеназа (РАМ). Коли для рекомбінантного продукування (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 пептидів використовується бактеріальна екпресійна система, пептиди можна С-термінально амідувати використовуючи in vitro реакцію використовуючи рекомбінантний РАМ фермент. Джерело РАМ ферменту, способи його одержання і очищення і способи, що можуть бути використані для амідування (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 пептидів описуються, наприклад, [в патентах US №:4,708,934, 5,789,234, і 6,319,685]. Селективні (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 антитіла Антитіла і фрагменти антитіла, що специфічно зв'язують (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 поліпептиди, з або без пегилювання в місці заміщеного цистеїну (як тут описано), але селективно не зв'язують природний hPYY3-36, попадають в рамки представленого винаходу. Антитіла можуть бути поліклональними, включаючи моноспецифічні поліклональні; моноклональні; рекомбінантні; хімерні; гуманізоване, таке як CDR-трансплатоване; людське; одноланцюгове і/або біспецифічне; також як і фрагменти; варіанти; або його похідні. Фрагментами антитіла є частини антитіла, що зв'язуються з епітопом на (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 поліпептиді. Прикладами таких фрагментів є Fab і F(ab') фрагменти, одержані ферментним розщепленням повнодовжинних антитіл. Іншими зв'язувальними фрагментами є фрагменти, що утворюються із застосуванням методик рекомбінантного ДНК, таких як експресія рекомбінантних плазмідів, що містять послідовності нуклеїнової кислоти, що кодують змінювані регіони антитіла. 86686 32 Поліклональні антитіла спрямовані проти (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 поліпептиду зазвичай продукуються в тваринах (наприклад, кролях або мишах) за допомогою багатократних ПШ або ІП ін'єкції (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 поліпептиду і ад'юванта. Може бути корисно кон'югувати (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 поліпептид до протеїну носія, що є імуногенним у видах, що імунізуються, таких як гемоціанін лімфи равлика, сироватковий альбумін, коров'ячий тіроглобулін або інгібтор трипсину соєвих бобів, також, агрегатуючі агенти, такі як галуни, використовуються для підвислення імунної відповіді. Після імунізації, у тварин відбирають кров і досліджують сироватку визначаючи титр aанти-(E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 антитіла. Моноклональні антитіла спрямовані проти (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 поліпептидів одержують використовуючи будь-який спосіб, що забезпечує продукування молекул антитіла лініями клітин в культуральному середовищі. Прикладами придатних способів одержання моноклональних антитіл є способи гібридоми [Kohler et al., Nature 256: 495-97, 1975], і спосіб В-клітин гібридоми людини [Kozbor, J. Immunol. 133: 3001, 1984; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51-63 (Marcel Dekker, Inc., 1987)]. Також забезпечується винаходом лінії клітин гібридоми, що продукують моноклональні антитіла, що реагують з (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 поліпептидами. Переважні способи визначення моноклонального антитіла специфічного і спорідненого при конкурентному інгібуванні можна знайти в [Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratories, 1989); Current Protocols in Immunology (Colligan et al., eds., Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, 1993); і Muller, Meth. Enzymol. 92: 589-601, 1988]. Хімерні антитіла представленого винаходу можуть включати індивідуальні Η і/або L імуноглобулінові ланцюги. Переважний хімерний Η ланцюг включає антиген-зв'язувальний регіон, що є похідним від Η ланцюга нелюдського антитіла специфічного для (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 поліпептиду, який зв'язується з, принаймні, частиною людського Η ланцюга С регіону (Сн), такого як СН1 або СН2. Переважний хімерний L ланцюг включає антиген-зв'язувальний регіон, що є похідним від L ланцюга не-людського антитіла спрецифічного для (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 поліпептиду, який зв'язується з, принаймні, частиною людського L ланцюга С регіону (CL). Хімерні антитіла і способи їх одержання відомі в цій галузі. Дивіться [Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 327377, 1984; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.A. 81: 6851-55, 1984; Boulianne et al., Nature 312: 643-46, 1984; Neuberger et al., Nature 314: 268- 70, 1985; Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 3439-43, 1987; і Harlow and Lane, supra]. Селективнозв'язувальні агенти, що мають зв'язувальну специфічність хімерних Η ланцюгів і L ланцюгів того ж самого або іншого змінюваного регіону, також можна одержати шляхом прийнятного поєднання окремих поліпептидних ланцюгів, 33 згідно із способами відомими в цій галузі. Дивіться, наприклад, [Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., Green Publishers Inc. і Wiley і Sons, 1994) і Harlow and Lane, supra]. Використовуючи цей підхід, хазяйські клітини, що експресують хімерні Η ланцюги (або їх похідні) культивують окремо з хазяйських клітин, що екпресують хімерні L ланцюги (або їх похідні), і імуноглобулінові ланцюги окремо виділяються і потім зв'язуються. Альтернативно, хазяйські клітини можуть спільно культивуватись і ланцюги спонтанно зв'язуються в культуральному середовищі, з наступним виділенням зібраного імуноглобуліну. В іншому втіленні, моноклональне антитіло винаходу "гуманізують" антитілом. Способи гуманізації нелюдських антитіл добре відомі в цій галузі. Дивіться [патенти US 5,585,089 і 5,693,762]. Загалом, гуманізовані антитіла мають одну або більше амінокислотних залишків введених в них з джерела, що не є людським. Гуманізацію можна провести, наприклад, використовуючи способи описані в літературі [Jones et al., 1986, Nature 321: 522-25; Riechmann et al., 1998, Nature 332: 323- 27; Verhoeyen et al., 1988, Science 239: 1534-36], шляхом заміни, принаймні, частини гіперваріабельного регіону (CDR) гризуна для відповідних регіонів антитіла людини. Методики створення версій рекомбінантної ДНК антиген-зв'язувальних регіонів молекул антитіла (тобто, Fab або фрагменти варіабельного регіону), які ігнорують генерування моноклональних антитіл, охоплюються рамками представленого винаходу. В цій методиці, антитіло-специфічни месенджер РНК молекул екстрагують з клітин імунної системи взятих у імунізованої тварини і транскрибують в кДНК. кДНК потім клонують в бактеріальну екпресійну систему. Один з прикладів такої методики, придатної для виконання цього винаходу, використовує бактеріофаг лямбда фекторну систему, що має лідерну послідовність, що викликає міграцію експресованого Fab протеїну до періплазматичного простору (між мембраною бактеріальної клітини і стінкою клітини) або секретування. Його можна швидко створити і дослідити велику кількість функціональних Fab фрагментів, які зв'язують антиген. Такі (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36, зв'язувальні молекули (Fab фрагменти із специфічністю до (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 поліпептидів) специфічно охоплюються межами терміну "антитіло", як тут використовується. Також з межах рамок винаходу знаходяться методики дослідження продукування хімерних антитіл використовуючи сплайсинговані гени з молекули антитіла миші з прийнятною антигенною специфічністю з генами з молекули антитіла людини з прийнятною біологічною активністю (така як здатність активувати комплемент людини і опосередковувати антитіло-залежну клітинну цитотоксичність (ADCC)). [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 6851-55, 1984; Neuberger et al., Nature, 312: 604-08, 1984]. Селективні зв'язувальні агенти, такі як антитіла, що продукуються за цією методикою, знаходяться в межах винаходу. 86686 34 Зрозуміло, що винахід не обмежується моноклональними антитілами мишей або щурів; насправді, можуть бути використані антитіла людини. Такі антитіла можна одержати використовуючи гібридоми людини. Таким чином, повністю людські антитіла, що зв'язують (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 поліпептиди, попадають в рамки винаходу. Такі антитіла одержують імунізацією використовуючи антиген (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 (необов'язково кон'югований до носія) трангенних тварин (наприклад, мишей) здатний продукувати набір антитіл людини у відсутності продукування ендогенного імуноглобуліну. Дивіться, наприклад, [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 2551-55, 1993; Jakobovits et al., Nature 362: 255-58, 1993; Bruggemann et al., Year in Immuno. 7: 33-40, 1993]. Також охоплюються винаходом людські антитіла, що зв'язують (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 поліпептиди. Використовуючи трансгенних тварин (наприклад, мишей), що здатні продукувати набір антитіл людини у відсутності продукування ендогенного імуноглобуліну, такі антитіла одержуються імунізацією (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 поліпептидидним антигеном (тобто, що має принаймні 6 суміжних амінокислот), необов'язково, кон'югованим з носієм. Дивіться, наприклад, [Jakobovits et al., 1993 supra; Jakobovits et al., Nature 362: 255-58, 1993; Bruggermann et al., 1993, supra]. В одному із способів, такі трансгенні тварини одержують виведенням з ладу ендогенних локусів, що кодують важкі і легкі імуноглобулінові ланцюги і введення в їх геном локусу, що кодує важкі і легкі ланцюги протеїнів людини. Частково модифіковані тварини, тобто, тварини, що мають менше ніж комплект модифікацій, потім піддають кросбреду одержуючи тварину, що має всі бажані модифікації імунної системи. Коли вводять імуноген, ці трансгенні тварини продукують антитіла з людськими (скоріше ніж, наприклад, мишачими) амінокислотними послідовностями, що включають змінювані регіони, які є імуноспецифічними для цих антигенів. Дивіться заявки РСТ опубліковані під номерами: [WO 96/33735 і WO 94/02602]. Додаткові способи описані [в патенті US 5,545,807, заявки РСТ опубліковані під номерами: WO 91/10741 і WO 90/04036, і в патенті ЕР 0 546 073 В1 і заявку РСТ опубліковану під номером WO 92/03918]. Людські антитіла також можна експресією рекомбінантної ДНК в хазяйських клітинах або експресією клітин гібридоми, як тут описано. В альтернативному втіленні, людські антитіла також можна одержати з фагодисплейних бібліотек [Hoogenboom et al., J. Моl. Biol. 227: 381, 1991; Marks et al., J. Моl. Biol. 222: 581, 1991]. Ці процеси імітують імунний вибір через демонстрацію наборів антитіл на поверхні нитеподібного бактеріофагу і наступний вибір фагу за їх зв'язуванням із вибраним антигеном. Одна з таких методик описана в заявці РСТ опублікованій під номером [WO 99/10494], яка описує виділення високоспоріднених і функціональних агоністичних антитіл для MPL- і msk-рецепторів використовуючи такі підходи. 35 Хімерні, CDR привиті і гуманізовані антитіла типово одержують використовуючи рекомбінантні способи. Нуклеїнові кислоти, що кодують антитіла, вводять в хазяйські клітини і експресують використовуючи матеріали і процедури описані тут і відомі в цій галузі. В переважному втіленні, антитіла одержують в хазяйських клітинах ссавців, таких як СНО клітини. Моноклональні (наприклад, людські) антитіла можна одержати експресією рекомбінантної ДНК в хазяйських клітинах або експресією в клітинах гібридоми, як тут описано. Aнти-(E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 антитіла винаходу можна використати в будь-якому відомому способі дослідження, такому як дослідження конкурентного зв'язування, безпосередні і небезпосередні сендвічні дослідження і дослідження імуноосадження [Sola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, 147-158 (CRC Press, Inc., 1987)] для детектування і кількісного визначення (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 поліпептидів, також як і для очищення поліпептиду. Антитіла будуть зв'язувати (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 поліпептиди із спорідненістю, що є прийнятною для способу дослідження, що використовується. PYY агоністи винаходу можуть бути одержані у формі фармацевтично прийнятних кислотноадитивних солей для застосування в способі аспекту винаходу. Характерними фармацевтично прийнятними кислотно-адитивними солями представлених сполук є гідрохлоридні, гідробромідні, гідройодидні, нітратні, сульфатні, бісульфатні, фосфатні, гідрофосфатні, ізонікотинатні, ацетатні, лактатні, саліцилатні, цитратні, гідроцитратні, тартратні, пантотенатні, бітартратні, аскорбатні, сукцинатні, малеатні, гентизинатні, фумаратні, глюконатні, глюкуронатні, сахаратні, форміатні, бензоатні, глутаматні, метансульфонатні, етансульфонатні, бензолсульфонатні, птолуолсульфонатні, памоатні, пальмітатні, малонатні, стеаратні, лауратні, малатні, боратні, гексафторфосфатні, нафтилатні, глюкогептонатні, лактобіонатні і лаурилсульфонатні солі і т.і.. Солі непегильованих варіантів необов'язково повинні бути фармацевтично прийнятними, коли варіант буде використовуватись як проміжна сполука при одержанні ΠΕΓ-ΡΥΥ3-36 варіанту кон'югата. ΡΥΥ агоністи представленого винаходу будуть зазвичай вводитись у формі фармацевтичної композиції. Фармацевтична композиція може, наприклад, бути у формі придатній для перорального введення (наприклад, таблетка, капсула, пігулка, порошок, розчин, суспензія), для парентеральної ін'єкції (наприклад, стерильний розчин, суспензія або емульсія), для інтраназального введення (наприклад, аерозальні краплі, і т.і.), для ректального введення (наприклад, супозиторій) або для трансдермального введення (наприклад, пластир). Фармацевтична композиція може бути у формі одиничних дозованих форм придатних для одиничного введення чітких доз. Фармацевтична композиція буде включати звичайний фармацевтичний носій і ΡΥΥ агоніст винаходу, як активний інгредієнт. Крім того, вона може включати інші фармацевтичні агенти, ад'юванти, і т.і. 86686 36 Способи одержання різних фармацевтичних композицій біоактивних пептидів добре відомі у фармацевтчиній галузі. Наприклад, дивіться [заявки на патент US 2005/0009748] (для перорального введення); і [2004/0157777, 2005/0002927 і 2005/0215475] (для трансмукозального введення, наприклад, інтраназальне або букальне введення). Дивіться також [Remington: The Practice of Pharmacy, Lippincott Williams and Wilkins, Baltimore, MD, 20th ed. 2000]. PYY агоністи цього винаходу можуть бути використані у поєднанні з іншими фармацевтичними агентами для лікування хворобливих станів або станів описаних тут. Крім того, представленим винаходом також забезпечуються способи лікування, що включають введення сполук представленого винаходу в комбінації з іншими фармацевтичними агентами. Придатними фармацевтичними агентами, що можуть бути використані в комбінації з PYY агоністами представленого винаходу є інші агенти для лікування ожиріння, такі як антагоністи канабіноїда-1 (СВ-1) (такі як римонабант), інгібітори 11βгідроксистероїд дегідрогенази-1 (11β-HSD тип 1), агоністи MCR-4, агоністи холецистокініну-А (ССКА), інгібітори повторного поглинання моноаміну (такі як сібутрамін), симпатоміметичні агенти, агоністи β3 адренергічного рецептора, агоністи допамінового рецептора (такі як бромокриптин), аналоги рецептора меланоцит-стимулюючого гормона, агоністи 5НТ2с рецептора, антагоністи меланінконцентруючого гормону, лептин, аналоги лептину, агоінсти рецептора лептину, антагоністи галаніну, інгібітори ліпази (такі як тетрагідроліпстатин, тобто орлістат), аноректичні агенти (такі як агоніст бомбезину), антагоінсти рецептора нейропептид-Y (наприклад, антагоністи рецептора ΝΡΥ Υ5), тіроміметичні агенти, дегідроепіандростерон або його аналог, агоністи або антагоністи глюкокортикоідного рецептора, антагоністи рецептора орексину, агоністи рецептора глюкагон-подібного пептиду-1, циліарні нейротрофічні фактори (такі як Аксокін™ доступний від Regeneron Pharmaceuticals, Inc., Tarrytown, NY і Procter & Gamble Company, Cincinnati, OH), інгібітори агоуті-залженого протеїну людини (AGRP), антагоністи рецептора греліну, антагоністи або зворотні агоністи рецептора гістаміну 3, агоністи рецептора нейромедину U, МТР/АроВ інгібітори (наприклад, gut-селективні МТР інгібітори, такі як дірлотапід) і т.і. Переважним агентом для лікування ожиріння і використання в комбінації з PYY агоністами представленого винаходу є антагоністи СВ-1 рецептора, gut-селективні МТР інгібітори, агоністи ССKа, агоністи 5НТ2с рецептора, антагоністи ΝΡΥ Υ5 рецептора, орлістат, і сібутрамін. Переважними антагоністами СВ-1 рецептора для застосування в способах представленого винаходу є: рімонабант (SR141716A також відомий під торговою назвою Acomplia™) доступний від Sanofi-Synthelabo або можна одержати як описано [в патенті US 5,624,941]; N-(піперидин-1-іл)-1-(2,4-дихлорфеніл)5-(4-йодофеніл)-4-метил-1Н-піразол-3-карбоксамід (АМ251) доступний від Tocris™, Ellisville, МО; [5-(4бромфеніл)-1-(2,4-дихлор-феніл)-4-етил-N-(1 37 піперидиніл)-1H-піразол-3-карбоксамід] (SR147778) який можна одержати як описано [в патенті US 6,645,985]; N-(піперидин-1-іл)-4,5дифеніл-1-метилімідазол-2-карбоксамід, N(піперидин-1-іл)-4-(2,4-дихлорфеніл)-5-(4хлорфеніл)-1-метилімідазол-2-карбоксамід, N(піперидин-1-іл)-4,5-ди-(4-метилфеніл)-1метилімідазол-2-карбоксамід, N-циклогексил-4,5ди-(4-метилфеніл)-1-метилімідазол-2-карбоксамід, N-(циклогексил)-4-(2,4-дихлорфеніл)-5-(4хлорфеніл)-1-метилімідазол-2-карбоксамід, і N(феніл)-4-(2,4-дихлорфеніл)-5-(4-хлорфеніл)-1метилімідазол-2-карбоксамід, який можна одержати як описано в заявці РСТ опублікованій під номером [WO 03/075660]; гідрохлоридна, мезилатна і безплатна сіль 1-[9-(4-хлор-феніл)-8-(2хлорфеніл)-9Н-пурин-6-іл]-4-етиламіно-піперидин4-карбонової кислоти амід, який можна одержати як описано [в заявці US опублікованій під номером 2004/0092520]; 1-[7-(2-хлор-феніл)-8-(4-хлорфеніл)-2-метил-піразоло[1,5-а][1,3,5]триазин-4-іл]3-етиламіно-азетидин-3-карбоксамід і 1-[7-(2-хлорфеніл)-8-(4-хлор-феніл)-2-метил-піразоло[1,5а][1,3,5]триазин-4-іл]-3-метиламіно-азетидин-3карбоксамід, який можна одержати як описано в заявці US опублікованій під номером 2004/0157839; 3-(4-хлор-феніл)-2-(2-хлор-феніл)-6(2,2-дифтор-пропіл)-2,4,5,6-тетрагідропіразоло[3,4-с]піридин-7-он, який можна одержати як описано [в заявці US опублікованій під номером 2004/0214855]; 3-(4-хлор-феніл)-2-(2-хлор-феніл)7-(2,2-дифтор-пропіл)-6,7-дигідро-2Н,5Н-4-окса1,2,7-триаза-азулен-8-он, який можна одержати як описано [в заявці US опублікованій під номером 2005/0101592]; 2-(2-хлор-феніл)-6-(2,2,2-трифторетил)-3-(4-трифторметил-феніл)-2,6-дигідропіразоло[4,3-сІ]піримідин-7-он, який можна одержати як описано [в заявці US опублікованій під номером 2004/0214838]; (S)-4-хлор-N-{[3-(4-хлорфеніл)-4-феніл-4,5-дигідро-піразол-1-іл]метиламіно-метилен}-бензолсульфонамід (SLV319) і (S)-N-[3-(4-хлор-френіл)-4-феніл-4,5-дигідропіразол-1-іл]-метиламіно-метилен}-4трифторметил-бензолсульфонамід (SLV-326), який можна одержати як описано [в заявці РСТ опублікованій під номером WO 02/076949]; Nпіперидино-5-(4-бромфеніл)-1-(2,4-дихлорфеніл)4-етилпіразол-3-карбоксамід, який можна одержати як описано [в патенті US 6,432,984]; 1-[біс-(4хлор-феніл)-метил]-3-[(3,5-дифтор-феніл)метансульфоніл-метилен]-азетидин, який можна одержати як описано [в патенті US 6,518,264]; 2-(5(трифторметил)піридин-2-ілокси)-N-(4-(4хлорфеніл)-3-(3-ціанофеніл)бутан-2-іл)-2метилпропанамід, який можна одержати як описано [в заявці РСТ опублікованій під номером WO 04/048317]; 4-{[6-метокси-2-(4-метоксифеніл)-1бензофуран-3-іл]карбоніл}бензонітрил (LY320135), який можна одержати як описано [в патенті US 5,747,524]; 1-[2-(2,4-дихлорфеніл)-2-(4фторфеніл)-бензо[1,3]діоксол-5-сульфоніл]піперидин, який можна одержати як описано в [WO 04/013120]; і [3-аміно-5-(4-хлорфеніл)-6-(2,4дихлорфеніл)-фуро[2,3-b]піридин-2-іл]-феніл 86686 38 метанон, який можна одержати як описано в заявці РСТ опублікованій під номером [WO 04/012671]. Переважними кишково-діючими МТР інгібіторами для застосування в комбінаціях, фармацевтичних композиціях і способах винаходу є дирлотапід ((S)-N-{2-[бензил(метил)аміно]-2-оксо-1фенілетил}-1-метил-5-[4'-(трифторметил)[1,1'біфеніл]-2-карбоксамідо]-1Н-індол-2-карбоксамід) і 1-метил-5-[(4'-трифторметил-біфеніл-2-карбоніл)аміно]-1Н-індол-2-карбонової кислоти (карбамоїлфеніл-метил)-амід, обидва з яких можна одержати використовуючи способи описані [в патенті US 6,720,351]; (S)-2-[(4'-трифторметил-біфеніл-2карбоніл)аміно]-хінолін-6-карбонової кислоти (пентилкарбамоїл-феніл-метил)-амід, (S)-2-[(4'-третбутил-біфеніл-2-карбоніл)-аміно]-хінолін-6карбонової кислоти {[(4-фтор-бензил)-метилкарбамоїл]-феніл-метил}-амід і (S)-2-[(4'-третбутил-біфеніл-2-карбоніл)-аміно]-хінолін-6карбонової кислоти [(4-фтор-бензилкарбамоїл)феніл-метил]-амід, всі з яких можна одержати як описано [в заявці US опублікованій під номером 2005/0234099А1], (-)-4-[4-[4-[4-[[(2S,4R)-2-(4хлорфеніл)-2-[[(4-метил-4Н-1,2,4-триазол-3іл)сульфаніл]метил-1,3-діоксолан-4іл]метокси]феніл]піперазин-1-іл]феніл]-2-(1R)-1метилпропіл]-2,4-дигідро-3Н-1,2,4-триазол-3-он (також відомий як Мітратапід або R103757), який можна одержати як описано [в патентах US 5,521,186 і 5,929,075]; і імлітапід (BAY 13-9952), який можна одержати як описано [в патенті US 6,265,431]. Більш переважним є дірлотапід, мітратапід, (S)-2-[(4'-трифторметил-біфеніл-2-карбоніл)аміно]-хінолін-6-карбонової кислоти (пентилкарбамоїл-феніл-метил)-амід, (S)-2-[(4'-трет-бутилбіфеніл-2-карбоніл)-аміно]-хінолін-6-карбонової кислоти {[(4-фтор-бензил)-метил-карбамоїл]феніл-метил}-амід або (S)-2-[(4'-трет-бутилбіфеніл-2-карбоніл)-аміно]-хінолін-6-карбонової кислоти [(4-фтор-бензилкарбамоїл)-феніл-метил]амід. Переважним антагоністом NPY Y5 рецептором є: 2-оксо-N-(5фенілпіразиніл)спіро[ізобензофуран-1(3Н),4'піперидин]-1'-карбоксамід, який можна одержати як описано [в заявці US опублікованій під номером 2002/0151456]; і 3-оксо-N-(5-феніл-2-піразиніл)спіро[ізобензофуран-1(3Н),4'-піперидин]-1'карбоксамід; 3-оксо-N-(7-трифторметилпіридо[3,2b]піридин-2-іл)-спіро-[ізобензофуран-1(3Н),4'піперидин]-1'-карбоксамід; N-[5-(3-фторфеніл)-2піримідиніл]-3-оксоспіро-[ізобензофуран-1(3Н),[4'піперидин]-1'-карбоксамід; транс-3'-оксо-N-(5феніл-2-піримідиніл)]спіро[циклогексан-1,1'(3'Н)ізобензофуран]-4-карбоксамід; транс-3'-оксо-N-[1(3-хіноліл)-4-імідазоліл]спіро[циклогексан-1,1'(3'Н)ізобензофуран]-4-карбоксамід; транc-3-оксо-N-(5феніл-2-піразиніл)спіро[4-азаізобензофуран-1(3Н), 1'-циклогексан]-4'-карбоксамід; транс-N-[5-(3фторфеніл)-2-піримідиніл]-3-оксоспіро[5азаізобензофуран-1(3Н),1'-циклогексан]-4'карбоксамід; транс-N-[5-(2-фторфеніл)-2піримідиніл]-3-оксоспіро[5-азаізобензофуран1(3Н),1'-циклогексан]-4'-карбоксамід; транс-N-[1(3,5-дифторфеніл)-4-імідазоліл]-3-оксоспіро[7азаізобензофуран-1(3Н), 1'-циклогексан]-4' 39 карбоксамід; транс-3-оксо-N-(1-феніл-4піразоліл)спіро[4-азаізобензофуран-1(3Н), 1'циклогексан]-4'-карбоксамід; транс-N-[1-(2фторфеніл)-3-піразоліл]-3-оксоспіро[6азаізобензофуран-1(3Н), 1'-циклогексан]-4'карбоксамід; транс-3-оксо-N-(1-феніл-3піразоліл)спіро[6-азаізобензофуран-1(3Н), 1'циклогексан]-4'-карбоксамід; і транс-3-оксо-N-(2феніл-1,2,3-триазол-4-іл)спіро[6азаізобензофуран-1(3Н),1'-циклогексан]-4'карбоксамід, всі з яких можна одержати як описано [в заявці РСТ опублікованій під номером WO 03/082190]; і їх фармацевтично прийнятні солі і естери. Всі згадані вище патенти US і публікації включені сюди як посилання. В способах аспекту винаходу, PYY агоніст винаходу, окремо або в комбінації з одним або декількома іншими фармацевтичними агентами, переважно вводять суб'єктові окремо або разом використовуючи будь-які звичайні способи периферійного введення відомі в цій галузі. Відповідно, PYY агоніст або комбінацію можна вводити суб'єктові парентерально (наприклад, внутрішньовенно, інтраперітонеально, внутрішньом'язово або підшкірно), інтраназально, орально, сублінгвально, букально, інгаляцією (наприклад, використовуючи аерозоль), ректально (наприклад, використовуючи супозиторії) або трансдермально. Парентеральне введення є переважним способом введення, і підшкірне введення є переважним способом парентерального введення. Композиції придатні для парентеральної ін'єкції зазвичай включають фармацевтично прийнятні стериальні водні або неводні розчини, дисперсії, суспензії або емульсії, і стерильні порошки для відновлення в стерильні розчини або дисперсії для ін'єкції. Прикладами придатних водних і неводних носіїв або розріджувачів (включаючи розчинники і розбавники) є вода, етанол, поліоли (пропіленгліколь, поліетиленгліколь, гліцерин і т.і.), їх придатні суміші, тригліцериди включаючи рослинні олії, такі як оливкова олія і органічні естери придатні для ін'єктування, такі як етилолеат. Ці композиції для парентеральної ін'єкції також можуть містити екціпієнти, такі як консерванти, змочувальні агенти, солюбілізатори, емульсифікатори і диспергувальні агенти. Для попередження забруднення композицій мікроорганізмами, вони можуть містити різні антибактеріальні і протигрибкові агенти, наприклад, парабени, хлорбутанол, фенол, сорбінова кислота і т.і. Також може бути бажано включити ізотонічні агенти, наприклад, цукри, хлорид натрію і т.і. Пролонговану абсорбцію фармацевтичних композицій придатних для ін'єктування можна забезпечити завдяки використанню агентів здатних затримувати абсорбцію, наприклад, моностеарат алюмінію і желатин. PYY агоністи представленого винаходу будуть вводитись суб'єктові в дозах, що змінюються в залежності від ряду факторів, включаючи спосіб введення, вік і вага суб'єкта, складність захворювання, стану або розладу, що лікується, і фармакологічної активності PYY агоніста, що вводиться. Визначення інтервалу дозування і оптимальних 86686 40 доз для окремого пацієнта буде знаходитись в межах знань середнього спеціаліста в цій галузі. Для парентерального введення, PYY агоністи представленого винаходу можна вводити людині в дозах в інтервалі приблизно від 0,01мкг/кг до приблизно 10мг/кг/дозу в розрахунку на непегильований варіант основи. Наприклад, для 30K мПЕГ малеімід(Е10С)hРYY3-36, парентеральний рівень дозування буде в інтервалі приблизно від 0,01мкг/кг до приблизно 10мг/кг/дозу в розрахунку на (E10C)hPYY3-36 основу, переважно в інтервалі приблизно від 0,05мг/кг до приблизно 1,0мг/кг/дозу, або від приблизно 0,05 або 0,1мг/кг до приблизно 1,0мг/кг/дозу, або від приблизно 0,05 або 0,1мг/кг до приблизно 0,3 або 0,5мг/кг/дозу. Наприклад, доза 85мг 30K мПЕГ малеімід(Е10С)hРYY3-36, який має молекулярну вагу приблизно 34024 Da (30K Da ПЕГ плюс 4024, молекулярна вага не-пегильованого пептиду), є еквівалентною 10мг не-пегильованої (E10C)hPYY3-36 основи. Режим дозування може включати одну або більше доз щоденно, переважно перед їжею, або, зокрема 30K мПЕГ малеімід(Е10С)hРYY3-36 або 20K мПЕГ малеімід(Е10С)hРYY3-36, вводиться 2 або 3 три рази на тиждень або один раз на тиждень або переважно один раз кожні 10-14 днів. Втілення представленого винаходу ілюструються наступними Прикладами. Однак, зрозуміло, що втілення винаходу не обмежуються специфічними деталями цих Прикладів, оскільки їх інші варіанти будуть відомі або очевидні в світлі даного опису і формули винаходу, що додається, для середнього спеціаліста в цій галузі. Всі посилання приведені тут включені сюди як посилання. Приклади Приклад 1 Лінійний 30K і 20K мПЕГ і 20K Малеімід(Е10С)hРYY3-36 Цей приклад забезпечує одержання, по суті, гомогенного монопегильованого (E10C)hPYY3-36 з використанням мПЕГ (30K або 20K), що приєднаний по залишку 10. (a) Одержання (Е10С)hРYY3-36 (E10C)PYY3-36 синтезували за допомогою твердо-фазного способу використовуючи Fmoc стратегію з використанням активації 2-(1Нбензотриазол-1-іл)-1,1,3,3-тетраметилуронію гесафторфосфатом (HBTU) (Fastmoc, 0,15ммольні цикли) використовуючи автоматичний пептидний синтезатор (модель 433А; Applied Biosystems, Foster City, CA). Як захисні групи для бічних ланцюгів використвоували Тrt для Asn, Gln, Cys і His; tBu для Ser, Thr, і Туr; Воc для Lys; OtBu для Asp i Glu; і Pbf для Arg Розщеплення пептид-смола проводили використовуючи суміш 9мл трифтороцтової кислоти (TFA), 0,5г фенолу, 0,5мл Н2О, 0,5мл тіоанізолу і 0,2 5мл 1,2-етандітіолу при кімнатній температурі протягом 4г. Пептид осаджували в охолодженому льодом етиловому етері і промивали етиловим етером, розчиняли в ДМСО і очищали за допомогою ВЕРХ з оберненою фазою на колонці Waters Deltapak C18, 15мкм, 100Å, 50´300мм ВД (Cat # WAT011801, Waters, Milford, MA) використовуючи лінійний градієнт від 100% Розчинника А: 0% Розчинника В до 70% розчинни 41 ка А: 30% розчинника В за 30 хвилин при швидкості потоку 80мл/хв. Розчинником А є водний 0,1% розчин TFA (трифтороцтова кислота). Розчинником В є 0,1% розчин TFA в ацетонітрилі. Молекулярну масу очищеного пептиду підтверджували за допомогою ЕСІ-МС (MAvg=4024), і очистку оцінювали за допомогою ВЕРХ з оберненою фазою (Фіг.1). (b) Одержання лінійний 30K мПЕГ малеімід(Е10С)hРYY3-36 Лінійний мПЕГ малеімідний реагент з MB приблизно 30000 (Sunbright ME-300MA, NOF Corporation, Tokyo, Japan) селективно приконденсовували до (E10C)hPYY3-36 по сульфгідрильній групі цистеїну на залишку 10. Лінійний 30K мПЕГ малеімід, розчиняли в 20мМ HEPES (Sigma Chemical, St. Louis, МО) рН7,0, або, альтернативно, 20мМ ацетат натрію (Sigma Chemical, St. Louis, MO) pH4,5, і негайно піддавали реакції з (E10C)hPYY3-36 пептидом шляхом безпосереднього додавання пептиду з одержанням концентрації пептиду 1мг/мл і відносному молярному співвідношенні мПЕГ:(Е10С)hРYY3-36 приблизно 1:1. Реакції проводили в темноті при кімнатній температурі 0,5-24 годин. Реакції в HEPES рН7,0 зупиняли розведенням 20мМ ацетатом натрію рН4,5, для негайного очищення за допомогою катіонообмінної хроматографії. Реакції в 20мМ ацетаті натрію, рН4,5, завантажували безпосередньо в колонку для катіонообмінної хроматографії. Продукти реакцій досліджували використовуючи ЕКС-ВЕРХ (Фіг.2). (c) Очищення лінійний 30K мПЕГ малеімід (E10C)hPYY3-36 Пегильовані (E10C)hPYY3-36 очищали від реакційної суміші до >95% використовуючи одну стадію іонообмінної хроматографії. Монопегильований (E10C)hPYY3-36 очищали від немодифікованого (E10C)hPYY3-36 і високомолекулярних молекул використовуючи катіонообмінну хроматографію. Типову реакційну суміш лінійний 30K мПЕГ малеімід (E10C)hPYY3-36 (10мг протеїну), як описано вище, фракціонували на колонці SPSepharose Hitrap (5мл) (АтегеІіагл Pharmacia Biotech, GE Healthcare, Piscataway, NJ) врівноваженій 20мМ ацетатом натрію, рН4,5 (Буфер А). Реакційну суміш розводили 7´ буферу А і завантажували у колонку при швидкості потоку 2,5мл/хв. Колонку промивали 5-10 об'ємами колонки буферу А. Після цього, різні види (E10C)hPYY3-36 елюювали з колонки 20 об'ємами колонки лінійного градієнту NaCI 0-100мМ. Елюент контролювали по абсорбції при 280нм (A280) і прийнятні за розміром фракції збирали. Фракції об'єднували за ступенем пегилювання, виходячи з даних ®SDS-PAGE (Фіг.3). Очищений пул концентрували до 0,55мг/мл в концентраторі Centriprep 3 (Amicon Technology Corporation, Northborough, MA) або, альтернативно, використовуючи концентратор Vivaspin 10K (Vivascience Sartorius Group, Hannover, Germany). Визначали концентрацію протеїну в очищеному пулі порівнянням площини піку ЗФ-ВЕРХ із стандартної кривою PYY3-36 (не показана) або, альтернативно, визначали концентрацію протеїну в очищеному пулі за абсорбцією при 280нм використовуючи експериментально одер 86686 42 жаний коефіцієнт екстинції. Очищений пул пегильованого (E10C)hPYY3-36 профілювали використовуючи ЕКС-ВЕРХ як показано на Фіг.6. (d) Одержання лінійний 20K мПЕГ малеімід (Ε10C)hΡΥΥ3-36 Лінійний мПЕГ малеімідний реагент з MB приблизно 20000 (Sunbright ME-200MA, NOF Corporation) селективно приконденсовували до (E10C)hPYY3-36 по сульфгідрильній групі цистеїну на залишку 10. Лінійний 20K мПЕГ малеімід, розчинений в 20мМ ацетаті натрію (Sigma Chemical, St. Louis, MO) pH4,5, негайно реагував з (E10C)hPYY3-36 пептидом завдяки безпосередньому додавання пептиду з одержанням концентрації пептиду 1мг/мл і відносному молярному співвідношенні мПЕГ:(Е10С)гіРYY3-36 приблизно 1,3:1. Реакції проводили в темноті при кімнатній температурі 60 хвилин і потім 16 годин при 4°С. Реакції в 20мМ ацетаті натрію, рН4,5, завантажували безпосередньо в катіонообмінну хроматографію. Продукти реакції досліджували за допомогою ЕКСВЕРХ. (e) Очищення лінійним 20К мПЕГ малеімід (E10C)hPYY3-36 Пегильовані (E10C)hPYY3-36 очищали від реакційної суміші до >95% використовуючи одну стадію іонообмінної хроматографії. Монопегильований (E10C)hPYY3-36 відокремлювали від вільного ПЕГ, немодифікованого (E10C)hPYY3-36 і високомолекулярних молекул використовуючи катіонообмінну хроматографію. Типову реакційну суміш лінійний 20K мПЕГ малеімід (E10C)hPYY3-36 (20мг протеїну), як описано вище, фракціонували на колонці SP-Sepharose Hitrap (5мл) (Атегегіат Pharmacia Biotech, GE Healthcare, Piscataway, NJ) врівноваженій 20мМ ацетатом натрію, рН4,5 (Буфер А). Реакційну суміш завантажували у колонку при швидкості потоку 1,0мл/хв. Колонку промивали 4 об'ємами колонки буферу А при швидкості потоку 2,5мл/хв. Після цього, різні види (E10C)hPYY3-36 елюювали з колонки 25 об'ємами колонки лінійного градієнту NaCI 0-200мМ при швидкості потоку 2,5мл/хв. Елюент контролювали по абсорбції при 280нм (А280) і прийнятні за розміром фракції збирали. Фракції об'єднували за ступенем пегилювання, виходячи з даних ЕКС-ВЕРХ. Очищений пул концентрували до 0,5-5мг/мл в концентраторі Vivaspin 10K (Vivascience Sartorius Group). Визначали концентрацію протеїну в очищеному пулі за абсорбцією при 280нм використовуючи експериментально одержаний коефіцієнт екстинції. Загальний вихід очищеного моно 20K мПЕГ малеімід (E10C)hPYY3-36 складав 38%. Очищений пул моно 20K мПЕГ малеімід (E10C)hPYY3-36 мав чистоту 96% за ЕКС-ВЕРХ. Приклад 2 Лінійним 30K мПЕГ Малеімід (D11C)hPYY3-36 Цей приклад демонструє одержання, по суті, гомогенного монопегильованого (D11C)hPYY3-36 з приєднаним мПЕГ по залишку 11. (а) Одержання (D11C)hPYY3-36 (D11C)PYY3-36 синтезували за допомогою твердо-фазного способу використовуючи Fmoc стратегію з використанням активації 2-(1Нбензотриазол-1-іл)-1,1,3,3-тетраметилуронію ге 43 сафторфосфатом (HBTU) (Fastmoc, 0,15 ммольні цикли) використовуючи автоматичний пептидний синтезатор (модель 433А; Applied Biosystems, Foster City, CA). Як захисні групи для бічних ланцюгів використовували Тrt для Asn, Gin, Cys і His; tBu для Ser, Thr, і Туr; Воc для Lys; OtBu для Asp i Glu; і Pbf для Arg. Розщеплення пептид-смола проводили використовуючи суміш 9мл трифтороцтової кислоти (TFA), 0,5г фенолу, 0,5мл Н2О, 0,5мл тіоанізолу і 0,25мл 1,2-етандітіолу при кімнатній температурі протягом 4г. Пептид осаджували в охолодженому льодом етиловому етері і промивали етиловим етером, розчиняли в ДМСО і очищали за допомогою ВЕРХ з оберненою фазою на колонці Waters Deltapak C18, 15мкм, 100Å, 50´300мм ВД (Cat # WAT011801, Waters, Milford, MA) використовуючи лінійний градієнт від 100% Розчинника А: 0% Розчинника В до 70% розчинника А: 30% розчинника В за 30 хвилин при швидкості потоку 80мл/хв. Розчинником А є водний 0,1% розчин TFA (трифтороцтова кислота). Розчинником В є 0,1% розчин TFA в ацетонітрилі. Молекулярну масу очищеного пептиду підтверджували за допомогою ЕСІ-МС (MAvg=4038), і очистку оцінювали за допомогою ВЕРХ з оберненою фазою (Фіг.4). (b) Одержання лінійний 30K мПЕГ малеімід (D11С)hРYY3-36 Лінійний мПЕГ малеімідний реагент з MB приблизно 30000 (Sunbright ME-300MA, NOF Corporation, Tokyo, Japan) селективно приконденсовували до (D11C)hPYY3-36 по сульфгідрильній групі цистеїну на залишку 11. Лінійний 30K мПЕГ малеімід, розчиняли в 20мМ HEPES (Sigma Chemical, St. Louis, МО) рН7,0, і негайно піддавали реакції з (D11C)hPYY3-36 пептидом шляхом безпосереднього додавання пептиду з одержанням концентрації пептиду 1мг/мл і відносному молярному співвідношенні мПЕГ:(D11С)hРYY3-36 приблизно 1:1. Реакції проводили в темноті при кімнатній температурі 0,5-24 годин. Реакції зупиняли розведенням 20мМ ацетатом натрію рН4,5, для негайного очищення за допомогою катіонообмінної хроматографії. Продукти реакцій досліджували використовуючи ЕКС-ВЕРХ (Фіг.5). Альтернативно, замість розчинення лінійним 30K мПЕГ малеіміду в HEPES, як описано вище, його розчиняють в 20мМ ацетаті натрію (Sigma Chemical, St. Louis, МО), рН4,5, і негайно піддають реакції з (D11C)hPYY3-36 пептидом шляхом безпосереднього додавання пептиду з одержанням концентрації пептиду 1мг/мл і відносному молярному співвідношенні мПЕГ:(D11С)hРYY3-36 приблизно 1:1. Реакції проводили в темноті при кімнатній температурі 0,5-24 годин. Реакції безпосередньо використовують на катіонообмінній хроматографії. Продукти реакцій досліджували використовуючи ЕКС-ВЕРХ. (c) Очищення лінійний 30K мПЕГ малеімід (D11C)hPYY3-36 Пегильовані (D11C)hPYY3-36 очищали від реакційної суміші до >95% використовуючи одну стадію іонообмінної хроматографії. Монопегильований (D11C)hPYY3-36 очищали від немодифікованого (D11C)hPYY3-36 і високомолекулярних молекул використовуючи катіонообмінну хро 86686 44 матографію. Типову реакційну суміш лінійний 30K мПЕГ малеімід (D11C)hPYY3-36 (10мг протеїну), як описано вище, фракціонували на колонці SPSepharose Hitrap (5мл) (Amersham Pharmacia Biotech, GE Healthcare, Piscataway, NJ) врівноваженій 20мМ ацетатом натрію, рН4,5 (Буфер А). Реакційну суміш при рН7,0 розводили 7´ буферу А і завантажували у колонку при швидкості потоку 2,5мл/хв. Колонку промивали 5-10 об'ємами колонки буферу А. Після цього, різні види (D11C)hPYY3-36 елюювали з колонки 20 об'ємами колонки лінійного градієнту NaCI 0-100мМ. Елюент контролювали по абсорбції при 280нм (А280) і прийнятні за розміром фракції збирали. Фракції об'єднували за ступенем пегилювання, виходячи з даних SEC ВЕРХ. Очищений пул концентрували до 0,5-5мг/мл в концентраторі Vivaspin 10K (Vivascience Sartorius Group). Визначали концентрацію протеїну в очищеному пулі порівнянням площини піку ЗФ-ВЕРХ із стандартної кривою PYY3-36 (не показана). Очищений пул пегильованого (D11C)hPYY3-36 профілювали використовуючи ЕКС-ВЕРХ як показано на Фіг.7. Альтернативно, реакції при рН4,5, з (b) вище, завантажують безпосередньо на колонку при швидкості потоку 2,5мл/хв. і визначають концентрацію очищеного пулу за абсорбцією при 280нм використовуючи експериментально одержаний коефіцієнт екстинції. Приклад 3 Розгалуженим 43K мПЕГ Малеімід (E10C)hPYY3-36 Цей приклад демонструє одержання, по суті, гомогенного монопегильованого (E10C)hPYY3-36 з приєднаним мПЕГ по залишку 10. (а) Одержання розгалужений 43K мПЕГ малеімід (E10C)hPYY3-36 Розгалужений мПЕГ малеімідний реагент з MB приблизно 43000 (Sunbright GL2-400МА, NOF Corporation, Tokyo, Japan) селективно приконденсовували до (E10C)hPYY3-36, одержували як описано в Прикладі 1(а), по сульфгідрильній групі цистеїну на залишку 10. Розгалужений 43K мПЕГ малеімід, розчиняли в 20мМ HEPES (Sigma Chemical, St. Louis, МО) рН7,0, і негайно піддавали реакції з (E10C)hPYY336 пептидом шляхом безпосереднього додавання пептиду з одержанням концентрації пептиду 1мг/мл і відносному молярному співвідношенні ΜΠΕΓ:(Ε10C)hΡΥΥ3-36 приблизно 1:1. Реакції проводили в темноті при кімнатній температурі 0,5-24 годин. Реакції в HEPES, рН7,0, зупиняли розведенням 20мМ ацетатом натрію, рН4,5, для негайного очищення за допомогою катіонообмінної хроматографії. Продукти реакцій досліджували використовуючи ЕКС-ВЕРХ (Фіг.8). Альтернативно, розгалужений 43K мПЕГ малеімід розчиняють в 20мМ ацетаті натрію (Sigma Chemical, St. Louis, MO), pH4,5, і негайно піддають реакції з (E10C)hPYY3-36 пептидом шляхом безпосереднього додавання пептиду з одержанням концентрації пептиду 1мг/мл і відносному молярному співвідношенні мПЕГ:(Е10С)hРYY3-36 приблизно 1:1. Реакції безпосередньо використовують на катіонообмінній хроматографії. 45 (b) Очищення монопегильованого розгалуженим 43K мПЕГ малеімід (E10C)hPYY3-36 Монопегильований розгалужений 43K мПЕГ малеімід (E10C)hPYY3-36 відокремлювали від немодифікованого (E10C)hPYY3-36 і високомолекулярних молекул використовуючи катіонообмінну хроматографію. Типову реакційну суміш розгалужений 43K мПЕГ малеімід (E10C)hPYY3-36 (10мг протеїну), як описано вище, фракціонували на колонці SP-Sepharose Hitrap (5мл) (Amersham Pharmacia Biotech, GE Healthcare, Piscataway, NJ) врівноваженій 20мМ ацетатом натрію, рН4,5 (Буфер А). Реакційну суміш при рН7,0 розводили 10´ буферу А і завантажували у колонку при швидкості потоку 2,5мл/хв. Колонку промивали 5-10 об'ємами колонки буферу А. Після цього, різні види (E10C)hPYY3-36 елюювали з колонки 20 об'ємами колонки лінійного градієнту NaCI 0-100мМ. Елюент контролювали по абсорбції при 280нм (А2во) і прийнятні за розміром фракції збирали. Фракції об'єднували за ступенем пегилювання, виходячи з даних SEC-BEPX. Очищений пул концентрували до 0,5-5мг/мл в концентраторі Centriprep 3 (Amicon Technology Corporation) або, альтернативно використовуючи концентратор Vivaspin 10K (Vivascience Sartorius Group). Визначали концентрацію протеїну в очищеному пулі використовуючи амінокислотний аналіз. Очищений пул монопегильованого (E10C)hPYY3-36 профілювали використовуючи ЕКС-ВЕРХ як показано на Фіг.9. Альтернативно, концентрацію протеїну визначали порівнянням площини піку ЗФ-ВЕРХ із стандартної кривою PYY3-36 (не показана) або за абсорбцією при 280нм використовуючи експериментально одержаний коефіцієнт екстинції. Приклад 4 Цей приклад розкриває одержання, по суті, гомогенного монопегильованого лінійним 12кД мПЕГ або розгалуженим 20кД мПЕГ (E10C)hPYY336, що приєднані по залишку 10, і одержання, по суті, гомогенного монопегильованого лінійним 20кД мПЕГ, лінійним 12кД мПЕГ або розгалуженим 20кД мПЕГ (D11C)hPYY3-36, що приєднані по залишку 11. (а) Одержання лінійний 12K мПЕГ малеімід (E10C)hPYY3-36 Лінійний мПЕГ малеімідний реагент з MB приблизно 12000 (Sunbright ME-120MA, NOF Corporation, Tokyo, Japan) селективно приконденсовували до (E10C)hPYY3-36 пo сульфгідрильній групі цистеїну на залишку 10. Лінійний 12K мПЕГ малеімід, розчинений в 20мМ ацетаті натрію (Sigma Chemical) pH4,5, негайно піддавали реакції з (E10C)hPYY3-36 пептидом шляхом безпосереднього додавання пептиду з одержанням концентрації пептиду 1мг/мл і відносному молярному співвідношенні мПЕГ:(Е10С)hРYY3-36 приблизно 1:1. Реакції проводили в темноті при кімнатній температурі 0,5-24 годин. Реакції в 20мМ ацетаті натрію, рН4,5, безпосередньо завантажували для катіонообмінної хроматографії. Продукти реакцій досліджували використовуючи ЕКС-ВЕРХ або SDSPAGE. 86686 46 (b) Очищення лінійним 12K мПЕГ малеімід (Е10С)hРYY3-36 Пегильовані (E10C)hPYY3-36 очищали від реакційної суміші до >95% використовуючи одну стадію іонообмінної хроматографії. Монопегильований (E10C)hPYY3-36 відокремлювали від вільного ПЕГ, немодифікованого (E10C)hPYY3-36 і високомолекулярних молекул використовуючи катіонообмінну хроматографію. Типову реакційну суміш лінійний 12K мПЕГ малеімід (E10C)hPYY3-36 (10мг протеїну), як описано вище, фракціонували на колонці SP-Sepharose Hitrap (5мл) (Amersham Pharmacia Biotech, GE Healthcare, Piscataway, NJ) врівноваженій 20мМ ацетатом натрію, рН4,5 (Буфер А). Реакційну суміш завантажували у колонку при швидкості потоку 1,0мл/хв. Колонку промивали 4 об'ємами колонки буферу А при швидкості потоку 2,5мл/хв. Після цього, різні види (E10C)hPYY3-36 елюювали з колонки 25 об'ємами колонки лінійного градієнту NaCI 0-200мМ при швидкості потоку 2,5мл/хв. Елюент контролювали по абсорбції при 280нм (А280) і прийнятні за розміром фракції збирали. Фракції об'єднували за ступенем пегилювання, виходячи з даних ЕКС-ВЕРХ. Очищений пул концентрували до 0,5-5мг/мл в концентраторі Vivaspin 10K (Vivascience Sartorius Group). Визначали концентрацію протеїну в очищеному пулі за абсорбцією при 280нм використовуючи експериментально одержаний коефіцієнт екстинції. Очищений пул 12K мПЕГ малеімід (E10C)hPYY3-36 профілювали використовуючи ЕКС-ВЕРХ або SDS-PAGE. (c) Одержання розгалужений 20K мПЕГ малеімід (E10C)hPYY3-36 Розгалужений мПЕГ малеімідний реагент з MB приблизно 20000 (Sunbright ME-200МА, NOF Corporation) селективно приконденсовували до (E10C)hPYY3-36 по сульфгідрильній групі цистеїну на залишку 10. Розгалужений 20K мПЕГ малеімід, розчинений в 20мМ ацетаті натрію (Sigma Chemical, St. Louis, МО) рН4,5, негайно піддавали реакції з (E10C)hPYY3-36 пептидом шляхом безпосереднього додавання пептиду з одержанням концентрації пептиду 1мг/мл і відносному молярному співвідношенні мΠΕΓ:(Ε10C)hΡΥΥ3-36 приблизно 1:1. Реакції проводили в темноті при кімнатній температурі 0,5-24 годин. Реакції в 20мМ ацетаті натрію, рН4,5, безпосередньо завантажували для катіонообмінної хроматографії. Продукти реакцій досліджували но використовуючи ЕКС-ВЕРХ або SDS-PAGE. (d) Очищення розгалужений 20K мПЕГ малеімід (E10C)hPYY3-36 Пегильовані (E10C)hPYY3-36 очищали від реакційної суміші до >95% використовуючи одну стадію іонообмінної хроматографії. Монопегильований (E10C)hPYY3-36 відокремлювали від вільного ПЕГ, немодифікованого (E10C)hPYY3-36 і високомолекулярних молекул використовуючи катіонообмінну хроматографію. Типову реакційну суміш лінійний 20K мПЕГ малеімід (E10C)hPYY3-36 (10мг протеїну), як описано вище, фракціонували на колонці SP-Sepharose Hitrap (5мл) (Amersham Pharmacia Biotech, GE Healthcare) врівноваженій 20мМ ацетатом натрію, рН4,5 (Буфер А). Реакцій 47 ну суміш завантажували у колонку при швидкості потоку 1,0мл/хв. Колонку промивали 4 об'ємами колонки буферу А при швидкості потоку 2,5мл/хв. Після цього, різні види (E10C)hPYY3-36 елюювали з колонки 25 об'ємами колонки лінійного градієнту NaCI 0-200мМ при швидкості потоку 2,5мл/хв. Елюент контролювали по абсорбції при 280нм (А280) і прийнятні за розміром фракції збирали. Фракції об'єднували за ступенем петлювання, виходячи з даних ЕКС-ВЕРХ. Очищений пул концентрували до 0,5-5мг/мл в концентраторі Vivaspin 10K (Vivascience Sartorius Group). Визначали концентрацію протеїну в очищеному пулі за абсорбцією при 280нм використовуючи експериментально одержаний коефіцієнт екстинції. Очищений пул розгалужений 20K мПЕГ малеімід (E10C)hPYY3-36 профілювали використовуючи ЕКС-ВЕРХ або SDS-PAGE. (е) Одержання лінійний 20K мПЕГ малеімід (D11С)hPYY3-36 Лінійний мПЕГ малеімідний реагент з MB приблизно 20000 (Sunbright ME-200MA, NOF Corporation) селективно приконденсовували до (D11C)hPYY3-36 по сульфгідрильній групі цистеїну на залишку 11. Лінійний 20K мПЕГ малеімід, розчинений в 20мМ ацетаті натрію (Sigma Chemical) pH4,5, негайно піддавали реакції з (D11C)hPYY3-36 пептидом шляхом безпосереднього додавання пептиду з одержанням концентрації пептиду 1мг/мл і відносному молярному співвідношенні мПЕГ:(D11C)hPYY3-36 приблизно 1:1. Реакції проводили в темноті при кімнатній температурі 0,5-24 годин. Реакції в 20мМ ацетаті натрію, рН4,5, безпосередньо завантажували для катіонообмінної хроматографії. Продукти реакцій досліджували використовуючи ЕКС-ВЕРХ або SDS-PAGE. (f) Очищення лінійний 20K мПЕГ малеімід (D11C)hPYY3-36 Пегильовані (D11C)hPYY3-36 очищали від реакційної суміші до >95% використовуючи одну стадію іонообмінної хроматографії. Монопегильований (D11C)hPYY3-36 відокремлювали від вільного ПЕГ, немодифікованого (D11C)hPYY3-36 і високомолекулярних молекул використовуючи катіонообмінну хроматографію. Типову реакційну суміш лінійний 20K мПЕГ малеімід (D11C)hPYY3-36 (10мг протеїну), як описано вище, фракціонували на колонці SP-Sepharose Hitrap (5мл) (Amersham Pharmacia Biotech, GE Healthcare) врівноваженій 20мМ ацетатом натрію, рН4,5 (Буфер А). Реакційну суміш завантажували у колонку при швидкості потоку 1,0мл/хв. Колонку промивали 4 об'ємами колонки буферу А при швидкості потоку 2,5мл/хв. Після цього, різні види (D11C)hPYY3-36 елюювали з колонки 25 об'ємами колонки лінійного градієнту NaCI 0-200мМ при швидкості потоку 2,5мл/хв. Елюент контролювали по абсорбції при 280нм (А280) і прийнятні за розміром фракції збирали. Фракції об'єднували за ступенем пегилювання, виходячи з даних ЕКС-ВЕРХ. Очищений пул концентрували до 0,5-5мг/мл в концентраторі Vivaspin 10K (Vivascience Sartorius Group). Визначали концентрацію протеїну в очищеному пулі за абсорбцією при 280нм використовуючи експериментально одержаний коефіцієнт екстинції. Очищений пул 86686 48 20K мПЕГ малеімід (D11C)hPYY3-36 профілювали використовуючи ЕКС-ВЕРХ або SDS-PAGE. (g) Одержання лінійний 12K мПЕГ малеімід (D11С)hРYY3-36 Лінійний мПЕГ малеімідний реагент з MB приблизно 12000 (Sunbright ME-120MA, NOF Corporation) селективно приконденсовували до (D11C)hPYY3-36 по сульфгідрильній групі цистеїну на залишку 10. Лінійний 12K мПЕГ малеімід, розчинений в 20мМ ацетаті натрію (Sigma Chemical, St. Louis, МО) рН4,5, негайно піддавали реакції з (D11C)hPYY3-36 пептидом шляхом безпосереднього додавання пептиду з одержанням концентрації пептиду 1мг/мл і відносному молярному співвідношенні мПEГ:(D11C)hPYY3-36 приблизно 1:1. Реакції проводили в темноті при кімнатній температурі 0,5-24 годин. Реакції в 20мМ ацетаті натрію, рН4,5, безпосередньо завантажували для катіонообмінної хроматографії. Продукти реакцій досліджували використовуючи ЕКС-ВЕРХ або SDS-PAGE. (h) Очищення лінійний 12K мПЕГ малеімід (D11C)hPYY3-36 Пегильовані (D11C)hPYY3-36 очищали від реакційної суміші до >95% використовуючи одну стадію іонообмінної хроматографії. Монопегильований (D11C)hPYY3-36 відокремлювали від вільного ПЕГ, немодифікованого (D11C)hPYY3-36 і високомолекулярних молекул використовуючи катіонообмінну хроматографію. Типову реакційну суміш лінійний 12K мПЕГ малеімід (D11C)hPYY3-36 (10мг протеїну), як описано вище, фракціонували на колонці SP-Sepharose Hitrap (5мл) (Amersham Pharmacia Biotech, GE Healthcare) врівноваженій 20мМ ацетатом натрію, рН4,5 (Буфер А). Реакційну суміш завантажували у колонку при швидкості потоку 1,0мл/хв. Колонку промивали 4 об'ємами колонки буферу А при швидкості потоку 2,5мл/хв. Після цього, різні види (D11C)hPYY3-36 елюювали з колонки 25 об'ємами колонки лінійного градієнту NaCI 0-200мМ при швидкості потоку 2,5мл/хв. Елюент контролювали по абсорбції при 280нм (А280) і прийнятні за розміром фракції збирали. Фракції об'єднували за ступенем пегилювання, виходячи з даних ЕКС-ВЕРХ. Очищений пул концентрували до 0,5-5мг/мл в концентраторі Vivaspin 10K (Vivascience Sartorius Group). Визначали концентрацію протеїну в очищеному пулі за абсорбцією при 280нм використовуючи експериментально одержаний коефіцієнт екстинції. Очищений пул 12K мПЕГ малеімід (D11C)hPYY3-36 профілювали використовуючи ЕКС-ВЕРХ або SDS-PAGE. (і) Одержання розгалужений 20K мПЕГ малеімід (D11С)hРYY3-36 Розгалужений мПЕГ малеімідний реагент з MB приблизно 20000 (Sunbright ME-200МА, NOF Corporation) селективно приконденсовували до (D11C)hPYY3-36 по сульфгідрильній групі цистеїну на залишку 10. Лінійний 20K мПЕГ малеімід, розчинений в 20мМ ацетаті натрію (Sigma Chemical, St. Louis, МО) рН4,5, негайно піддавали реакції з (D11C)hPYY3-36 пептидом шляхом безпосереднього додавання пептиду з одержанням концентрації пептиду 1мг/мл і відносному молярному співвідношенні мПЕГ:(D11C)hPYY3-36 приблизно 1:1. Реакції проводили в темноті при кімнатній температурі 49 0,5-24 годин. Реакції в 20мМ ацетаті натрію, рН4,5, безпосередньо завантажували для катіонообмінної хроматографії. Продукти реакцій досліджували використовуючи ЕКС-ВЕРХ або SDS-PAGE. (j) Очищення розгалужений 20K мПЕГ малеімід (D11C)hΡΥΥ3-36 Пегильовані (D11C)hPYY3-36 очищали від реакційної суміші до >95% використовуючи одну стадію іонообмінної хроматографії. Монопегильований (D11C)hPYY3-36 відокремлювали від вільного ПЕГ, немодифікованого (D11C)hPYY3-36 і високомолекулярних молекул використовуючи катіонообмінну хроматографію. Типову реакційну суміш розгалужений 20K мПЕГ малеімід (D11C)hPYY3-36 (10мг протеїну), як описано вище, фракціонували на колонці SP-Sepharose Hitrap (5мл) (Атегепат Pharmacia Biotech, GE Healthcare) врівноваженій 20мМ ацетатом натрію, рН4,5 (Буфер А). Реакційну суміш завантажували у колонку при швидкості потоку 1,0мл/хв. Колонку промивали 4 об'ємами колонки буферу А при швидкості потоку 2,5мл/хв. Після цього, різні види (D11C)hPYY3-36 елюювали з колонки 25 об'ємами колонки лінійного градієнту NaCI 0-200мМ при швидкості потоку 2,5мл/хв. Елюент контролювали по абсорбції при 280нм (А280) і прийнятні за розміром фракції збирали. Фракції об'єднували за ступенем пегилювання, виходячи з даних ЕКС-ВЕРХ. Очищений пул концентрували до 0,5-5мг/мл в концентраторі Vivaspin 10K (Vivascience Sartorius Group). Визначали концентрацію протеїну в очищеному пулі за абсорбцією при 280нм використовуючи експериментально одержаний коефіцієнт екстинції. Очищений пул розгалужений 20K мПЕГ малеімід (D11C)hPYY3-36 профілювали використовуючи ЕКС-ВЕРХ або SDS-PAGE. Приклад 5 Біохімічне хараткеризування (E10C)hPYY3-36, (D11C)hPYY3-36 і пегильовані форми (E10C)hPYY3-36 і (D11C)hPYY3-36 характеризували використовуючи різні біохімічні способи включаючи Електроспрей масспектрометрію (ЕСІМС), SDS-PAGE і ЕКС ВЕРХ і ЗФ-ВЕРХ, відповідно. (A) Mac-спектрометрію з електроспрей іонізацією (ЕСІ-МС) проводили на електроспрей масспектрометрі LC/MSD серії 1100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) в позитивному режимі. (Приклад 1(а), 2(а)). (B) Хроматографію із зворотною фазою проводили для аналізу (E10C)hPYY3-36 пептиду (Фіг.1 і 4) на колонці ZORBAX Eclipse XDB-C8, 4,6´150мм, 5мм (Cat # 993967-906, Agilent Technologies, Palo Alto, CA) використовуючи лінійний градієнт від 100% розчинника А, 0% розчинника В до 95% розчинника А, 5% розчинника В до 3 хвилини, потім від 95% Розчинника А, 5% Розчинника В до 50% розчинника А, 50% розчинника В на 12 хвилині при швидкості 1,5мл/хв (Приклад 1(а)). Розчинником А є водний 0,1% розчин TFA. Розчинником В є 0,1% розчин TFA в ацетонітрилі. Хроматографію із зворотною фазою для кількісного визначення пегильованого (E10C)hPYY3-36 і (D11C)PYY3-36 (не показана) проводили на колонці Vydac C18 (2,1´250мм) (Cat # 218MS552, Vydac, 86686 50 Hesperia, CA) використовуючи лінійний градієнт від 80% розчинника А, 20% розчинника В до 40% розчинника А, 60% розчинника В на 48 хвилині при швидкості потоку 0,2мл/хвилину (Приклад 1С, 2С). Розчинником А є водний 0,1% розчин TFA. Розчинником В є 0,085% розчин TFA в ацетонітрилі. (C) Ексклюзійна висоефективна рідинна хроматографія (ЕКС-ВЕРХ) Реакційні суміші лінійний 30K або розгалужений 43K мПЕГ з або (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36, їх катіонообмінноочищеними пулами і кінцевими очищеними продуктами досліджували використвоуючи неденатуруючу ЕКСВЕРХ (Приклад 1(b) і (с), 2(b) і (с)). Аналітичну неденатуруючу ЕКС-ВЕРХ проводили використовуючи Shodex KW804 або TSK G4000PWXL (Tosohaas) в 20мМ фосфаті рН7,4, 150мМ NaCI, при швидкості потоку 1,0мл/хвилину (необов'язково Superdex 200 7,8мм´30см, Amersham Bioscience, Piscataway, NJ). Петлювання значно збільшує гідродинамічний об'єм одержаного протеїну що виражається у зсуві до меншого часу утриимування. В реакційних сумішах 30K мПЕГ малеімід плюс (Ε10C)hΡΥΥ3-36 i, спостерігається маленький пік, що відповідає залишковому немодифікованому (E10C)hPYY3-36, також як і нові піки, що відповідають пегильованим пептидам (Фіг.2). Нові молекули спостерігались в 30K мПЕГ (D11C)hPYY3-36 і реакційної суміші розгалужений 43K мПЕГ (E10C)hPYY3-36 з дуже незначними залишковими кількостями немодифікованого (D11C)hPYY3-36 або (E10C)hPYY3-36 (Фіг.5 і 8). Ці пегильовані і не-пегильовані молекули фракціонували використовуючи SP-Sepharose хроматографію і одержані очищені моно мПЕГ (E10C)hPYY3-36 і мПЕГ (D11C)hPYY3-36 види надалі проявляються при елююванні як один пік на неденатуруючий ЕКС>95% чистота, (Фігю6, 7 і 9). Стадію SPSepharose хроматографії ефективно видаляє вільний мПЕГ, (E10C)hPYY3-36 або (D11C)hPYY3-36 і високомолекулярні молекули від монопегильованого лінійним 30K і розгалуженим 43K ΜΠΕΓ(Ε10С)рΡΥΥ3-36 або мПЕГ (D11C)hPYY3-36. (D) SDS PAGE SDS-PAGE (Приклад 1 (с)) також використовували для дослідження реакції, фракції катіонообмінного очищення (Фіг.3) і кінцевих очищених продуктів. SDS-PAGE проводили на 1мм тонких 10NuPAGE гелях (Invitrogen, Carlsbad, CA) при відновлюючих і невідновлюючих умов і маркували використовуючи набір для маркування Novex Colloidal Coomassie™ G-250 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Біологічні дослідження Корисність PYY агоністів представленого винаходу як фармацевтичноактивних агентів для зменшення набору ваги і лікуванні ожиріння у ссавців (особливо, людей), можна продемонструвати за їх агоністичною активністю у звичайних дослідженнях і в in vitro і in vivo дослідженнях описаних нижче. Такі дослідження також забезпечують методику, що дозволяє порівняти активність представлених агоністів PYY з активністю відомих сполук. 51 Дослідження поглинання їжі Дослідження відновлення харчування після голодування: Самців C57BL/6J мишей (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) розподіляли по 2 на клітку. їх тримали при 12:12 циклі день-ніч (світло з 5:00 ранку до 5:00 вечора), давали гранульовану їжу RMH3000 Purina для гризунів (Research Diets, Inc., New Brunswick, NJ) і дозволяй вільний доступ до води. Одержані миші мали вік 7-8 тижнів і їх акліматизували мінімум 10 днів перед дослідженням. На день дослідження миші мали вік 9-12 тижнів. За день до початку дослідження, мишей поміщали у клітки з свіжою підстилкою і без їжі, але дозволяли вільний доступ до води. Вони голодували протягом ночі (20-24г). В день дослідження, мишам вводили ІП ін'єкцію (об'єм дози =5мл/кг), повертали в їх клітки і в клітки поміщали попередньо зважену їжу. Як розчинник для доз використовували 20мМ Na ацетат, рН4,5, 50мМ NaCI і дозу розраховували за активним PYY без пегилювання. Тестували контрольний розчинник, природний PYY, 30K мПЕГ малеімід (E10C)hPYY3-36 і 43K мПЕГ малеімід (Е10С)hРYY336 в трьох дозах (0,1мг/кг, 0,3мг/кг і 1,0мг/кг). їжу переважували на 2, 4, 6, і 24 годині після введення. Перевіряли втрату ваги підстилки, яку зважували і включали в розрахунки. Розраховували кумулятивне поглинання їжі віднімаючи вагу їжі в кожний момент часу від початкової ваги їжі. Розраховували відсоток інгібування (%) за (ПЇлікуванняПЇроз)/ПЇроз´100. Фіг.10 показує 6-годинне кумулятивне поглинання їжі після ІП ін'єкції трьох доз природного ΡΥΥ3-36 (Фіг.10А) і 30K мПЕГ малеімід (Е10С)hРYY3-36 (Фіг.10В). І природний ΡΥΥ3-36, і 30K мПЕГ малеімід (Е10С)hPYY3-36 демонструють дозо-залежне зменшення кумулятивного поглинання їжі протягом 6 годин. 43K мПЕГ малеімід (E10C)hPYY3-36 також продукує дозозалежне зменшення на 6 годині (Фіг.11 А) і 24 годині (Фіг.11В) кумулятивного поглинання їжі. Однак, 43K мПЕГ малеімід (Е10С)hРYY3-36 зменшував кумулятивне поглинання їжі не більше ніж показував 30K мПЕГ малеімід (Е10С)hPYY3-36 при тій же самій дозі (0,1мг/кг) після 6 годин і 24 годин. Також порівнювали дію 30K мПЕГ малеімід (Е10С)hРYY3-36 на відновлення харчування після голодування після ін'єкції 0,1мг/кг (ПШ) з дією 30K малеімід (D11C)hPYY3-36. В той час як 30K мПЕГ малеімід (D11С)hРYY3-36 поліпептид не викликає зменшення кумулятивного поглинання їжі (ПЇ) протягом 24 годин, як показано в таблиці нижче, дія не є такою значною порівняно з тією що спостерігається для 30K малеімід (Е10C)hPYY3-36. 86686 52 Дію лінійний 20K мПЕГ малеімід (Е10С)hРYY3порівнювали з 30K мПЕГ малеімід (Е10С)hРYY336 (обидва з Прикладу 1) В одному з досліджень, де самцям мишей вводилась доза 0,1мг/кг (ІП), результати були наступними і показані в таблиці нижче. 36 Подібно, в другому досліджені порівнювали вплив на годування лінійний 20K мПЕГ малеімід (Е10С)hРYY3-36 і 30K мПЕГ малеімід (E10C)hPYY336, після 0,1мг/кг дози (ПШ), результати якого показані далі в наступній таблиці. Дослідження спонтанного поглинання їжі: Самців C57BL/6J мишей (The Jackson Laboratory) поміщали окремо і залишали на 2 тижні акліматизації перед дослідженням. їх витримували при циклі 12/12 світло/темінь, вільному доступі до гранульованої їжі гризунів і дозволяли вільний доступ до води. В день введення препарату, мишей поміщали у клітки для годування і дозволяли 1 день акліматизуватись. На наступний день, мишам вводили ІΠ або за допомогою підшкірної (ПШ) ін'єкції тільки перед початком світлого періоду (4:00 ранку). Прийом їжі автоматично контролювали з 10 хвилинними інтервалами протягом всього часу і щоденно вимірювали вагу тіла. Результати показані для ІΠ ін'єкції природного ΡΥΥ3-36 і 30K мПЕГ малеімід (Е10С)hРYY3-36 (Фіг.12) і для ПШ ін'єкції природного ΡΥΥ3-36 і 30K ПЕГ малеімід (Е10С)hРYY3-36 (Фіг.13). В той час як і природний ΡΥΥ3-36, і 30K мПЕГ малеімід (Е10С)hРYY3-36 викликають негайне зменшення кумулятивного прийому їжі порівняно з мишами яким вводили розчинник, дія по зменшенню прийому їжі викликана 30K мПЕГ малеімід (Е10С)hРYY3-36 була набагато довшою, ніж дія викликана природним РYY3-36. Більш тривалий вплив на прийом їжі пояснюється тим, що 30K мПЕГ малеімід (Е10С)hРYY3-36 також демонструє тривале збереження вмісту в плазмі після однієї ін'єкції (0,1мг/кг, ІП) (Фіг.14). В той час як природний ΡΥΥ3-36 має швидкість кліренсу 16мл/хв/кг і Смакс 38нМ, 30K мПЕГ малеімід (Е10С)hРYY3-36 має швидкість кліренсу 0,2мл/хв/кг і Смакс 267нМ. Значення ΡΥΥ в плазмі вимірювали 53 у мишей використовуючи набір для радіомінодослідження hPYY (Linco Research, Inc., St. Louis, MO). Дослідження мінінасосу використовуючи ob/ob мишей: Самцям ob/ob мишей (The Jackson Laboratory), віком 8-9 тижнів (n=26), яких тримали на нормальному кормі і яким імплантували 14 днів тому осмотичні міні-насоси (Alza Corp., Mountain View, CA), вводили або розчинник (салін), РYY3-36 (0,1мг/кг/день), або 30K ПЕГ малеімід (Е10С)hРYY3-36 (0,03мг/кг/день). Щоденно вимірювали вагу їжі і вагу тіла. Склад жиру тіла вимірювали на 0 і день 13. В кінці дослідження відбирали зразки крові. Не спостерігали значної відмінності в прийом їжі, вазі тіла або складі жиру тіла для цих груп. Визначали рівень PYY в плазмі в кінці дослідження використовуючи радіоімунодослідження, як описано раніше. В групі якій вводили природний РYY3-36, виміряні рівні PYY в плазмі становили 15+2нг/мл; в групі, якій вводили 30K мПЕГ малеімід (Е10С)hРYY3-36, рівні PYY були 132±22нг/мл. In vitro дослідження зв'язування SPA для зв'язування ліганда: SPA для зв'язування ліганду вимірювали використовуючи конкурентне заміщення радіомічених PYY з Y2 рецепторів і використовуючи мікросфери, що містять сцинтиляційні (SPA кульки) вкриті аглютиніном лектину з паростків пшениці (WGA) одержаним від Amersham Biosciences (Cat. No. RPNQ 0085). Суспензії нейробластом KAN-TS людини, що експресує Y2 рецептори на своїй поверхні [Fuhlendorf et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 182-186, 1990] одержували використовуючи буфер для збору клітин, що включає 50мМ Hepes буфер (рН7,4), 145мМ NaCI, 2,5мМ СаСІ2, 1мМ МgСІ2, 10мМ глюкози, 0,1% БСА, 5% ДМСО і інгібітор протеази Роше. SPA дослідження проводили в 96-лунковому форматі по три рази використовуючи 50000 клітин/лунку, 125I-PYY (40000кнх/лунку) і SPA кульки (0,5мг/лунку) в буфері дослідження, що містить 50мМ Hepes буфер, рН7,4, 1мМ МgСІ2, 2,5мМ СаСІ2, 0,1% (в/о) БСА, 0,025% (в/о) бацит 86686 54 рацину і 0,025% азиду натрію. Ліганди, що тестуються, в різних концентраціях (від 0,032 до 500нМ) додавали досліджуваної суміші, яку інкубували 1624г при кімнатній температурі, при збовтуванні. Планшети залишали стояти протягом однієї години і потім підраховували використовуючи детектор MicroBeta® Trilux (Perkin Elmer, Boston, MA). Результати для hPYY3-36 і 30K мПЕГ малеімід (Е10С)hРYY3-36 Прикладу 1 показані на Фіг.15. Дослідження зв'язування GTPg [35S] при NPY Y2R рецепторах Функціональним дослідженням є дослідження зв'язування GTPg [35S], що проводиться на NEN Flashplates (96-лунковий формат). Мембрани одержували з KAN-TS клітин як описано в [Bass et al., Моl. Pharm. 50: 709-715, 1990]. Дослідження зв'язування GTPg [35S] проводили в 96 лунковому FlashPlate™ форматі в двох варіантах використовуючи 100пМ GTPg [35S] і 10мкг мембран на лунку в буфері дослідження, що містить 50мМ Tris Нcl, рН7,4, 3мМ МgСІ2, рН7,4, 10мМ МgСІ2, 20мМ EGTA, 100мМ NaCI, 5мкМ GDP, 0,1% сироваткового альбуміну теляти і наступні інгібітори протеази: 100мкг/мл бацитрацину, 100мкг/мл бензамідину, 5мкг/мл апротиніну, 5мкг/мл леупептину. Досліджувану суміш потім інкубували з підвищуваними концентраціями сполуки, що тестується, (6точкових концентрацій на кривій; log розведення в інтервалі від 10-12Μ до 10-5М) 60хв. при 30°С. FlashPlates™ потім центрифугували при 2000хg протягом 10 хвилин. Стимулювання GTPg [35S] зв'язування визначали використовуючи Microbeta™ детектор. ЕС50 і внутрішню активність розраховували використовуючи Prism від Graphpad. Результати для hPYY3-36 і 30K мПЕГ малеімід (Е10С)hРYY3-36 Прикладу 1 показані на Фіг.16. ЕС50 значення для 30K мПЕГ малеімід (Е10С)hРYY3-36 і 20K мПЕГ малеімід (Е10С)hРYY336 Прикладу 1 були порівнюваними (наприклад, 4,3нм і 4,6нМ, коли вимірювати в тому ж самому дослідженні). 55 86686 56 57 86686 58 59 86686 60