Комбінований лікарський препарат та методи лікування захворювань або станів, пов’язаних з нейродегенеративними захворюваннями

Реферат: Винахід стосується комбінованого лікарського препарату, що містить суміш розчинів гомеопатично потенційованих форм а) антитіла до гамма-інтерферону у суміші трьох гомеопатичних розведень С12, С30 та С 200 або С12, С30 та С50, та b) антитіла до протеїну S100 у суміші трьох гомеопатичних розведень С12, С30 та С 200 або С12, С30 та С50. Також винахід стосується методів лікування або зниження частоти виникнення рецидивів розсіяного склерозу, лікування інших нейродегенеративних захворювань й захворювань та станів, пов'язаних з нейроінфекціями. UA 112751 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ Даний винахід стосується комбінованих лікарських препаратів та методу лікування розсіяного склерозу та інших нейродегенеративних захворювань, а також захворювань або станів, повязаних з нейроінфекціями. РІВЕНЬ ТЕХНІКИ Розсіяний склероз (РС) – це хронічне захворювання, що задіює головний та спинний мозок, що призводить до втрати контролю м'язів, балансу та відчуттів (наприклад, оніміння). На цей час точна причина РС залишається невідомою, однак дослідники вважають, що цьому може сприяти поєднання декількох факторів. Вважається, що РС виникає у генетично схильних до цього осіб, імовірно, у присутності специфічних зовнішніх факторів, що обумовлюють розвиток РС. Зараз встановлено, що при РС задіюється автоімунний процес – аномальна реакція імунної системи організму, спрямована проти мієліну (жирової оболонки, що оточує та огортає нервові волокна) у центральній нервовій системі (ЦНС — головному мозку, спинному мозку та зорових нервах). РС призводить до потоншання або повної втрати мієліну та, по мірі прогресування захворювання, перерізання (розрізання) відростків нейронів (аксонів). При втраті мієліну нейрон не здатний й надалі ефективно проводити електричні сигнали. Процес відновлення, що називається «ремієлінізація», відбувається на ранніх стадіях захворювання, але мієлінову оболонку клітини повністю відновити неможливо. Повторні напади призводять до зменшення кількості випадків успішної та ефективної ремієлінізації, доки навколо пошкоджених аксонів не утвориться шрамоподібний наліт. На додаток до втрати мієліну, іншою патологічною властивістю захворювання є запалення. Відповідно до суто імунологічного пояснення, запальний процес спричиняється T-клітинами, різновидом лімфоциту. Лімфоцити - це клітини, що відіграють важливу роль у захисних функціях організму. При РС T-клітини здатні проникати у мозок через гемоенцефалітичний бар’єр. Вважається, що T-клітини сприймають мієлін як інородний організм та атакують його, що обумовлює запальні процеси, стимуляцію інших імунних клітин та розчинних факторів, таких як цитокіни та антитіла. На додаток до автоімунного розладу, деякі дослідники вважають, що інфекції можуть якимось чином «примушувати» імунну систему атакувати нервові клітини. Загалом, вважається, що вірус (або бактерія), що спричиняє вихідну інфекцію, «виглядає» як нервова клітина. Імунна система продукує T-клітини для боротьби з вірусом. Ці T-клітини залишаються в організмі після усунення інфекції, та «побачивши» нервову клітину, плутають її зі збудником. В результаті імунна система атакує нервову систему. Існують чотири основні різновиди РС. 1. Повторний/рецидивуючий розсіяний склероз (RRРС): характеризується рецидивами, при яких можуть виникати нові симптоми, а старі можуть повторно проявлятися або погіршуватися. 2. Вторинний прогресуючий розсіяний склероз (SPРС): характеризується поступовим погіршенням захворювання в періоди між рецидивами. 3. Прогресуючий рецидивуючий розсіяний склероз (PRРС): ця форма РС є прогресуючою від самого початку захворювання та перемежовується рецидивами. 4. Первинний прогресуючий розсіяний склероз (PPРС): цей вид РС характеризується поступовим прогресуванням захворювання від самого початку взагалі без ремісій. Наразі ліків від РС не відомо. Проте, існують різновиди терапії, що здатні уповільнити захворювання. Метою лікування є контроль симптомів. Для терапії розсіяного склерозу використовуються ліки, що коригують імунну систему, наприклад, інтерферони. Інтерферони це білкові месенджери, що виробляються клітинами імунної системи і використовуються ними для зв'язку між собою. Існують різні види інтерферонів, такі як альфа, бета і гамма. Всі інтерферони здатні регулювати імунну систему та відіграють важливу роль у захисті від сторонніх організмів, включаючи віруси. Всі інтерферони мають різні функції, які при цьому перетинаються. Було виявлено, що бета-інтерферони є корисними для контролю розсіяного склерозу. Існує постійна потреба у пошуку нових препаратів, які б володіли бажаною терапевтичною ефективністю при лікуванні РС та відповідних симптомів. Терапевтичний ефект максимально розведеної (або наднизької) форми антитіл, потенційованих за допомогою гомеопатичної технології (активована потенційована форма) був виявлений винахідником за даною патентною заявою, д-ром О.І. Епштейном. Патент США № 7,582,294 описує засіб для лікування доброякісної гіперплазії передміхурової залози або простатиту шляхом введення гомеопатично активованої форми антитіл до простатоспецифічного антигену (ПСА). Протеїн S-100 - це цитоплазматичний кислотний кальцій-зв'язуючий протеїн, що утворюється в основному у сірій речовині мозку, перш за все в гліях та шваннівських клітинах. Протеїн існує у декількох гомо- або гетеродимерних ізоформах, що складається з двох 1 UA 112751 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 імунологічно відокремлених субодиниць – альфа та бета. Протеїн S-100 пропонується до застосування як допомога при діагностуванні та оцінці уражень головного мозку та неврологічних пошкоджень внаслідок травми головного мозку, як при інсульту. Див. Yardan et al., Usefulness of S100B Protein in Neurological Disorders, J Pak Med Assoc Vol. 61, No. 3, March 2011, що включається до цього документу шляхом посилання. Було встановлено, що наднизькі дози антитіл до протеїну S-100 мають анксіолітичну, антиастенічну, антиагресивну, стрес-захисну, антигіпоксичну, антиішемічну, нейропротекторну та ноотропну активність. Див.Castagne V. et al., Antibodies to S100 proteins have anxiolytic-like activity at ultra-low doses in adult rat, J Pharm Pharmacol. 2008, 60(3):309-16; Епштейн O. I., Антитіла до кальцій-зв'язуючого протеїну S100B блокують утворення довгострокової сенсибілізації у земляного равлика, Pharmacol Biochem Behav., 2009, 94(1):37-42; Вороніна T.A. і співавт., Розділ 8. Антитіла до протеїну S-100 при тривожно-депресивних розладах в експериментальних та клінічних умовах. У кн. "Тваринні моделі у біологічній психіатрії", під ред. Калуєва A. В. N-Y, "Nova Science Publishers, Inc.", 2006, стор. 137-152, що включаються до цього документу шляхом посилання. Було виявлено, що наднизькі дози антитіл до гамма-інтерферону є корисними при лікуванні та профілактиці захворювань вірусної етиології. Див. Патент США № 7,572,441, що повністю включається до цього документу шляхом посилання. СТИСЛЕ ВИКЛАДЕННЯ ВИНАХОДУ В одному аспекті даний винахід представляє комбінований лікарський препарат, що містить a) активовану потенційовану форму антитіла до гамма-інтерферону та b) активовану потенційовану форму антитіла до протеїну S-100. В одному варіанті даний винахід представляє комбінований лікарський препарат, що містить a) активовану потенційовану форму антитіла до гамма-інтерферону та b) активовану потенційовану форму антитіла до протеїну S-100, де присутнє антитіло до цілого гаммаінтерферонц або його частин. В одному варіанті даний винахід представляє комбінований лікарський препарат, що містить a) активовану потенційовану форму антитіла до гамма-інтерферону та b) активовану потенційовану форму антитіла до протеїну S-100, де антитіло до протеїну S-100 є антитілом до цілого протеїну S-100 або його частин. В одному варіанті комбінований лікарський препарат цього аспекту винаходу включає активовану потенційовану форму антитіла до гамма-інтерферону у формі суміші гомеопатичних розведень (C12, C30, та C50) або (C12, C30 та C200), просочених на твердому носії. Активована потенційована форма антитіла до протеїну S-100, представлена у формі суміші гомеопатичних розведень (C12, C30, та C50) або (C12, C30 та C200), може в подальшому бути просочена на твердому носії. В іншому варіанті комбінований лікарський препарат цього аспекту винаходу включає активовану потенційовану форму антитіла до протеїну S-100 у формі суміші гомеопатичних розведень (C12, C30, та C50) або (C12, C30 та C200), просочених на твердому носії. Активована потенційована форма антитіла до гамма-інтерферону, представлена у формі суміші гомеопатичних розведень (C12, C30, та C50) або (C12, C30 та C200), може в подальшому бути просочена на твердому носії. За можливості, активована потенційована форма антитіла до гамма-інтерферону є моноклональним, поліклональним або природним антитілом, переважно - поліклональним антитілом. В одному варіанті цього аспекту винаходу активована потенційована форма антитіла до гамма-інтерферону готується шляхом послідовних сотенних розведень в поєднанні зі струшуванням кожного розведення. За можливості, активована потенційована форма антитіла до протеїну S-100 є моноклональним, поліклональним або природним антитілом, переважно - поліклональним антитілом. В одному варіанті цього аспекту винаходу активована потенційована форма антитіла до протеїну S-100 готується шляхом послідовних сотенних розведень в поєднанні зі струшуванням кожного розведення. Спеціально передбачається вертикальне струшування. В іншому аспекті винахід представляє метод лікування пацієнтів, що страждають на розсіяний склероз, шляхом введення a) активованої потенційованої форми антитіла до гаммаінтерферону та b) активованої потенційованої форми антитіла до протеїну S-100. За можливості, активована потенційована форма антитіла до гамма-інтерферону та активована потенційована форма антитіла до протеїну S-100 мають вводитися в формі комбінованого лікарського препарату. В іншому аспекті винахід представляє метод суттєвої затримки виникнення симптомів у пацієнтів, що страждають на розсіяний склероз, шляхом введення комбінованого лікарського 2 UA 112751 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 препарату, де лікарський препарат містить a) активовану потенційовану форму антитіла до гамма-інтерферону та b) активовану потенційовану форму антитіла до протеїну S-100. В іншому аспекті даний винахід також представляє метод зниження частоти виникнення рецидивів у пацієнтів, що страждають на розсіяний склероз, шляхом введення комбінованого лікарського препарату, де лікарський препарат містить a) активовану потенційовану форму антитіла до гамма-інтерферону, та b) активовану потенційовану форму антитіла до протеїну S100. В одному варіанті винаходу передбачається введення від 1 до 2 стандартних лікарських форм активованої потенційованої форми антитіла до гамма-інтерферону, та від 1 до 2 стандартних лікарських форм активованої потенційованої форми антитіла до протеїну S-100, причому кожна лікарська форма вводиться від 1 до 4 разів на добу. За можливості, 1-2 стандартних лікарських форм кожної активованої потенційованої форми антитіла мають вводитися двічі на добу. У варіанті цього аспекту винаходу, якому віддається перевага, передбачається введення від 1 до 2 стандартних лікарських форм комбінованого препарату, що містить a) активовану потенційовану форму антитіла до гамма-інтерферону та b) активовану потенційовану форму антитіла до протеїну S-100, причому кожна лікарська форма вводиться від 1 до 4 разів на добу. За можливості, 1-2 стандартних лікарських форм кожної активованої потенційованої форми антитіла мають вводитися двічі на добу. В іншому варіанті цього аспекту винаходу, якому віддається перевага, комбінований препарат вводиться у вигляді 1 стандартної лікарської форми, що містить a) активовану потенційовану форму антитіла до гамма-інтерферону та b) активовану потенційовану форму антитіла до протеїну S-100, за можливості, двічі на добу. ОПИС РИСУНКІВ Фіг. 1 – ілюструє імунну реакцію при патогенезі розсіяного склерозу Фіг. 2 – показує середній період виникнення клінічних симптомів Фіг. 3 – показує ступінь тяжкості захворювання (бали) Фіг. 4 – показує ступінь тяжкості на різних стадіях (бали) Фіг. 5 – показує частоту виникнення рецидивів ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Винахід визначається з посиланням на заяви, що додаються. Що стосується заяв, у наведеному нижче глосарії представлені відповідні визначення. Термін "антитіло" при використанні у цьому документі означає імуноглобулін, що специфічно зв’язується (та відповідно визначається як додатковий) із конкретною просторовою та полярною організацією іншої молекули. Як вказано у заявах, антитіла можуть включати цілий імуноглобулін або його частину, можуть бути природними, поліклональними або моноклональними, та можуть включати різні класи та ізотипи, такі як IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b та IgG3, IgM тощо. Його частини можуть включати Fab, Fv та F(ab')2, Fab' тощо. Термін "антитіло" в однині включає "антитіла" у множині. Термін "активована потенційована форма" або "потенційована форма", відповідно, по відношенню до антитіл, зазначених у цьому документі, застосовується для позначення продукту гомеопатичної потенціації будь-якого вихідного розчину антитіл. "Гомеопатична потенціація" означає застосування методів гомеопатії для додавання гомеопатичної активності до вихідного розчину відповідної речовини. Хоча цей термін не настільки обмежений, «гомеопатична потенціація" може включати, наприклад, повторні послідовні розведення в поєднанні з зовнішньою обробкою, зокрема, вертикальним (механічним) струшуванням. Іншими словами, вихідний розчин антитіла піддається послідовним повторним розведенням та багаторазовому вертикальному струшуванню кожного отриманого розчину згідно з гомеопатичною технологією. Концентрація, якій віддається перевага, вихідного розчину антитіла у розчиннику, за можливості, воді або суміші води з етиловим спиртом, варіюється приблизно від 0.5 до 5.0 мг/мл. Процедурою приготування кожного компоненту (тобто розчину антитіла), якій віддається перевага, є використання суміші з 3 водних або водно-спиртових розведень первинного матричного розчину 12 30 200 (материнська тинктура), антитіл, розведених у 100 , 100 та 100 разів, відповідно, що еквівалентно сотенним гомеопатичним розведенням (C12, C30, та C200), або використання суміші з трьох водних або водно-спиртових розведень первинного матричного розчину антитіл, 12 30 50 розведених у 100 , 100 та 100 разів, відповідно, що еквівалентно сотенним гомеопатичним розведенням (C12, C30 та C50). Приклади гомеопатичної потенціації описані в Патентах США №№ 7,572,441 та 7,582,294, що повністю включаються до цього документу шляхом посилання та з заявленою метою. В той час як термін "активована потенційована форма" використовується у заявах, у прикладах використовується термін "наднизькі дози". Вираз "наднизькі дози" став спеціальним терміном, створеним у ході дослідження та використання 3 UA 112751 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гомеопатично розведеної та потенційованої форми речовини. Термін "наднизька доза" або "наднизькі дози" повністю підтримує та є перш за все синонімом терміну «активована потенційована» форма, що використовується у формулі винаходу. Іншими словами, антитіло знаходиться в "активованій потенційованій" або "потенційованій" формі за наявності трьох факторів. Перш за все, "активована потенційована" форма антитіла є продуктом процесу приготування, загальновідомого у гомеопатичній сфері. По-друге, "активована потенційована" форма антитіла повинна мати біологічну активність, визначену методами, прийнятими у сучасній фармакології. По-третє, біологічна активність, що проявляється "активованою-потенційованою" формою антитіла не може бути пояснена наявністю молекулярної форми антитіла в кінцевому продукті гомеопатичного процесу. Наприклад, активовану потенційовану форму антитіл можна готувати шляхом піддавання вихідного, ізольованого антитіла в молекулярній формі послідовним багаторазовим розведенням в поєднанні з зовнішньою дією, наприклад, механічним струшуванням. Зовнішня обробка в ході зменшення концентрації також може супроводжуватися, наприклад, впливом ультразвукових, електромагнітних або інших фізичних факторів. В. Швабе "Гомеопатичні лікарські засоби", M., 1967, Патенти США №№ 7,229,648 та 4,311,897, що повністю включаються до цього документу шляхом посилання та з заявленою метою, описують такі процеси, що є загальновідомими методами гомеопатичної потенціації у гомеопатичній практиці. Ця процедура обумовлює рівномірне зменшення молекулярної концентрації вихідної молекулярної форми антитіла. Цю процедуру повторюють до отримання необхідної гомеопатичної активності. Щодо окремого антитіла, необхідну гомеопатичну активність можна визначити, піддаючи проміжні розведення біологічним випробуванням за бажаною фармакологічною моделлю. Хоча цей термін не настільки обмежений, «гомеопатична потенціація» може включати, наприклад, повторні послідовні розведення в поєднанні з зовнішньою обробкою, зокрема, вертикальним (механічним) струшуванням. Іншими словами, вихідний розчин антитіла піддається послідовним повторним розведенням та багаторазовому вертикальному струшуванню кожного отриманого розчину згідно з гомеопатичною технологією. Концентрація, якій віддається перевага, вихідного розчину антитіла у розчиннику, за можливості, воді або суміші води з етиловим спиртом, варіюється приблизно від 0.5 до 5.0 мг/мл. Процедурою приготування кожного компоненту (тобто розчину антитіла), якій віддається перевага, є використання суміші з 3 водних або водно-спиртових розведень первинного 12 30 200 матричного розчину (материнська тинктура) антитіл, розведених у 100 , 100 та 100 разів, відповідно, що еквівалентно сотенним гомеопатичним розведенням C12, C30 та C200, або використання суміші з 3 водних або водно-спиртових розведень первинного матричного розчину 12 30 50 (материнська тинктура) антитіл, розведених у 100 , 100 та 100 разів, відповідно, що еквівалентно сотенним гомеопатичним розведенням C12, C30 та C50. Приклади отримання бажаної активності також наводяться, наприклад, в Патентах США №№ 7,229,648 та 4,311,897, що включаються до цього документу шляхом посилання з заявленою метою. Процедура, що застосовується до "активованої потенційованої" форми антитіла, яка описується вцьому документі, більш детально описана нижче. В наукових колах ведеться багато суперечок стосовно гомеопатичного лікування людей. В той час як даний винахід ґрунтується на загальноприйнятих гомеопатичних процесах отримання "активованої потенційованої" форми антитіл, для підтвердження ефективності він базується не лише на застосуванні гомеопатії у людей. Винахідник неочікувано виявив та, у даній заявці достатньою мірою, продемонстрував на загальноприйнятих фармакологічних моделях, що розчинник, зрештою отриманий після послідовних багаторазових розведень вихідної молекулярної форми антитіл, мав визначну активність, не пов’язану з наявністю залишків молекулярної форми антитіла у цільовому розведенні. "Активована потенційована" форма антитіла, що визначається у цьому документі, проходить випробування на біологічну активність на загальноприйнятих фармакологічних моделях активності, або у ході відповідних експериментів in vitro, чи in vivo на придатних тваринних моделях. Описані нижче експерименти підтверджують біологічну активність на таких моделях. Клінічні дослідження за участю людей також підтверджують, що активність, яка спостерігається на тваринних моделях, добре корелюється з лікуванням людей. Дослідження за участю людей також підтвердили існування "активованих-потенційованих" форм, описаних у цьому документі, для лікування визначених захворювань або розладів у людей, загальноприйнятих у медицині як патологічні стани. Крім того, заявлена "активована потенційована" форма антитіла охоплює лише розчини або тверді препарати, чию біологічну активність не можна пояснити наявністю молекулярної форми антитіла, що залишається з вихідного, початкового розчину. Іншими словами, хоча й передбачається, що "активована потенційована" форма антитіла може містити залишки вихідної молекулярної форми антитіла, досвідчений спеціаліст не може приписувати біологічну активність, що спостерігається у відомих фармакологічних моделях, решті молекулярної форми 4 UA 112751 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 антитіла із принаймні якоюсь мірою вірогідності, зважаючи на дуже низькі концентрації молекулярної форми антитіла, що залишається після послідовних розведень. В той час як винахід не обмежується якоюсь конкретною теорією, біологічна активність "активованої потенційованої» форми антитіл у даному винаході не пов’язується із вихідною молекулярною формою антитіла. Перевага віддається "активовані-потенційованій" формі антитіла у рідкому або твердому стані, в якому концентрація вихідної молекулярної форми антитіла є нижче порогу виявлення згідно з загальноприйнятими методами аналізу, такими як капілярний електрофорез та високоефективна рідинна хроматографія. Зокрема, перевага віддається "активованій потенційованій" формі у рідкому або твердому стані, в якому концентрація вихідної молекулярної форми антитіла є нижче числа Авогадро. У фармакології молекулярних форм терапевтичних речовин звичайною практикою є складання кривої залежності "доза-ефект", в якій рівень фармакологічної реакції будується по відношенню до концентрації активного препарату, що вводиться пацієнту або випробовується in vitro. Мінімальний рівень препарату, що забезпечує хоч якусь реакцію, яку можна виявити, називають пороговою дозою. Цим спеціально передбачається та віддається перевага тому, що "активована потенційована" форма антитіл містить молекулярне антитіло, за наявності, у концентрації нижче порогової дози для молекулярної форми антитіла у даній біологічній моделі. Відомі експериментальні моделі розсіяного склерозу. Наприклад, Експериментальний аутоімунний енцефаломієліт, що іноді іменується Експериментальним алергічним енцефаломієлітом (EAE), – це модель на тваринах запальних демієлінізуючих захворювань центральної нервової системи. Вона здебільшого використовується на гризунах та нокаутних мишах. Ця експериментальна модель є широко дослідженою тваринною моделлю демієлінізуючих захворювань центральної нервової системи людини, таких як розсіяний склероз. EAE можна викликати у сприйнятливих тварин за допомогою гомогенату гомологічної або гетерологічної тканини головного мозку, очищеного мієліну або протеїнів, що вводяться у препарат (Raine, et al., Ann. NY Acad. Sci., 1984, 436: 33-51; McCombe, et al., J. Neuroimmunol. 1994; 51 (2): 153-167). На даний момент описано більш ніж 20 мієлінових протеїнів, що мають імуногенні властивості та найчастіше застосовуються для індукування EAE (Baumann, et al., Physiol. Rev. 2001, 81(2): 871-927). Серед них: основний мієліновий протеїн (“MBP”) (Hashim, Immunol. Rev., 1978, 39:60-107); протеоліпідний протеїн (“PLP”) (Bradl, et al., Brain Pathol., 1996, 6(3): 303-311; Tuohy, Neurochem. Res., 1994, 19(8):935-944); глікопротеїни: мієлін-асоційований глікопротеїн (“MAG”) (Weerth et al, 1999); мієліновий олігодендроцитовий глікопротеїн (“MOG”); та олігодендроцит-специфічний протеїн (“OSP”) (Stevens, et al., J Immunol., 1999; 162 (12): 75017509). Загальновизнано, що не лише цілі протеїни, а й специфічні частини цих протеїнів здатні викликати EAE при введенні тваринам. Найчастіше використовуваними антигенами у гризунів є гомогенат спинного мозку (SCH), очищений мієлін, мієліновий протеїн, такий як MBP, PLP та MOG або пептиди цих протеїнів, кожен з яких обумовлює чіткі моделі з різними характеристиками захворювання по відношенню до як імунології, так і патології. Найбільш репрезентативна модель РС викликається в моделях EAE шляхом введення гомогенату спинного мозку (Гілерович та співавт., 2010; Жаботинський, Джоффе, 1975; Житнухін та співавт., 2008; Sinha et al, 2009). У цій моделі, які і при вихідному захворюванні, забезпечується імунна реакція на всі компоненти мієліну: викликається з подальшою демієлінізацією, розпадом аксонів та потім самих нервових клітин (Гілерович та співавт., 2010; Sinha et al, 2009). Патологічний ланцюжок подій проявляється через розвиток парезів, паралічів та інших симптомів захворювання. Можна встановити чотири стадії розвитку EAE: 1. Сенсибілізація периферичних T-лімфоцитів під впливом церебрального антигену з CFA та підвищенням проникності GEB. 2. Міграція активованих T-клітин до ЦНС та активація антиген-репрезентуючих клітин (астроцитів та мікроглій) безпосередньо у мозку. Ці дві стадії відповідають латентному періоду (індукції), коли клінічні прояви не спостерігаються 3. Розвиток аутоімунних та запальних реакцій у мозку, що призводить до де мієлінізації нервових волокон (клінічний період). 4. Пригнічення патологічних процесів та відновлення пошкоджених тканин (фаза відновлення). Протягом цього періоду у більшості тварин усуваються нейрологічні та моторні розлади, після чого настає повне або часткове одужання та тварини стають резистентними до повторної стимуляції EAE. Середня тривалість EAE становить 30 днів: латентна стадія, клінічна стадія та стадія одужання. Тривалість кожної стадії, як правило, становить 7-10 днів. Аналогічні фази розвитку патологічного процесу в ЦНС також спостерігаються при розсіяному склерозі. Див. мал. 1 - Імунна реакція при патогенезі розсіяного склерозу (Wiendl & Kieseier, 2003). 5 UA 112751 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Даний винахід описує комбінований лікарський препарат, що містить a) активовану потенційовану форму антитіла до гамма-інтерферону та b) активовану потенційовану форму антитіла до протеїну S-100. Як викладено вище у цьому документі, кожен з окремих компонентів комбінації є загальновідомим та широко застосовується в лікарській практиці. Проте, винахідники по даній заявці з подивом виявили, що введення комбінації істотно затримує появу симптомів та зменшує імовірність рецидиву у пацієнтів з розсіяним склерозом. Комбінований лікарський препарат згідно з даним аспектом винаходу може бути у твердій або рідкій формі. Кожну з активованих-потенційованих форм антитіл, що міститься в лікарському препараті, готують з вихідної молекулярної форми антитіла за допомогою процесу, прийнятого у гомеопатичній практиці. Вихідні антитіла можуть бути моноклональними або поліклональними антитілами, підготовленими згідно з відомими процесами, наприклад, як описано в літературі: Імунологічні методи, Г. Фрімель, M., "Медицина", 1987, с. 9-33; "Hum. Antibodies. Monoclonal and recombinant antibodies 30 years after", Laffly E., Sodoyer R. - 2005 - Vol. 14. - N 1-2. P.33-55, що включаються до цього документу шляхом посилання. Моноклональні антитіла можна отримати, наприклад, за допомогою гибрідомної технології. Вихідний етап процесу включає імунізацію на основі принципів, раніше розроблених в ході приготування поліклональної антисироватки. Наступні етапи роботи включають виробництво гібридних клітин, що генерують клони антитіл з ідентичною специфічністю. Їхня відокремлена ізоляція здійснюється за допомогою тих же методів, що й при приготуванні поліклональних антисироваток. Поліклональні антитіла можна отримати шляхом активної імунізації тварин. Для цього придатним тваринам (наприклад, кроликам) вводять серію ін’єкцій відповідного антигену: протеїну S-100 або гамма-інтерферону. Імунна система тварин виробляє відповідні антитіла, що збираються у тварин у відомий спосіб. Ця процедура дає можливість приготувати моноспецифічної сироватки, насиченої антитілами. При бажанні, сироватку, що містіть антитіла, можна очистити, наприклад, за допомогою аффінної хроматографії, фракціонування шляхом випадання солей, або іонообмінної хроматографії. Отримана очищена, насичена антитілами сироватка може використовуватися в якості вихідного матеріалу для приготування активованої потенційованої форми антитіл. Концентрація, якій віддається перевага, отриманого вихідного розчину антитіла у розчиннику, за можливості, воді або суміші води з етиловим спиртом, варіюється приблизно від 0,5 до 5,0 мг/мл. Процедурою приготування кожного компоненту, якій віддається перевага, є використання суміші з 3 водно-спиртових розведень первинного матричного розчину антитіл, розведених у 12 30 50 100 , 100 та 100 разів, відповідно, що еквівалентно сотенним гомеопатичним розведенням 12 30 200 C12, C30 та C50, або розведених у 100 , 100 та 100 разів, відповідно, що еквівалентно сотенним гомеопатичним розведенням C12, C30 та C200. Для приготування твердої лікарської форми твердий носій обробляють необхідним розведенням, отриманим за допомогою гомеопатичного процесу. Для отримання стандартної лікарської форми комбінації винаходу, масу-носій збагачують кожним з розведень. Обидва порядки насичення є придатними для приготування бажаної комбінованої лікарської форми. У варіанті, якому віддається перевага, вихідним матеріалом для приготування активованої потенційованої форми, що містить комбінацію винаходу, є поліклональне антитіло, отримане у тварини, до відповідного антигену, а саме, гамма-інтерферон або протеїн S-100. Для отримання активованої потенційованої форми поліклональних антитіл до гаммаінтерферону відповідний антиген можна вводити як імуноген лабораторним тваринам, за можливості, кроликам. Поліклональні антитіла до гамма-інтерферону можна отримати за допомогою цілої гамма-інтерферону з наступної послідовності: 6 UA 112751 C2 7 UA 112751 C2 8 UA 112751 C2 9 UA 112751 C2 5 10 15 20 25 30 Типову процедуру приготування вихідних поліклональних антитіл до гамма-інтерерону людини можна описати наступним чином: за 7-9 днів до забору крові кроликам роблять 1-3 внутрішньовенні ін’єкції для підвищення рівня поліклональних антитіл в кровотоці. Після імунізації беруть зразки крові для виявлення рівня антитіл. Як правило, максимальний рівень імунної реакції розчинного антигену досягається через 40-60 днів після першої ін’єкції. Після завершення першого циклу імунізації кролики проходять 30-денний період реабілітації, після чого проводиться повторна імунізація за допомогою 1-3 внутрішньовенних ін’єкцій. Для отримання антисироватки, що містить необхідні антитіла, забирають кров імунізованих кроликів та поміщають до 50-мл пробірки для центрифуги. Згустки продукту, що утворюються на стінках пробірки, видаляють дерев’яним шпателем, а до згустку в центрі пробірки поміщають паличку. Після цього кров ставлять до холодильника на 1 ніч при температурі приблизно 40 °C. Наступного дня згусток на шпателі видаляють та центрифугують залишкову рідину протягом 10 хвилин при 13000 об./хв. Надосадкова рідина і є необхідною антисироваткою. Отримана антисироватка, як правило, має жовтий колір. До антисироватки додають 20% NaN3 (вагова концентрація) до отримання остаточної концентрації 0.02% та перед використанням зберігають у замороженому стані при температурі 20 °C (або без додавання NaN3 - при температурі -70 °C). Для відокремлення потрібних антитіл до гамма-інтерферону від антисироватки придатною є наступна послідовність поглинання на твердій фазі: 10 мл антисироватки кролика піддають двократному розведенню 0.15 M NaCl, після чого додають 6.26 г Na2SO4, перемішують та культивують приблизно протягом 12-16 годин при температурі 4 °C. Осад видаляють шляхом центрифугування, розчиняють у 10 мл фосфатного буферу та піддають діалізу проти того ж буферу протягом 1 ночі при кімнатній температурі. Після видалення осаду шляхом центрифугування розчин поміщають на колонку з ДЕАЕ-целюлозою, врівноваженою фосфатним буфером. Фракцію антитіла визначають шляхом вимірювання оптичної щільності елюату при 280 нм. Ізольовані неочищені антитіла очищають за допомогою методу афінної хроматографії шляхом приєднання отриманих антитіл до ендотеліальної NO-синтази, розміщеної на нерозчинній матриці середовища для хроматографії, подальшим елююванням концентрованими водно-сольовими розчинами. 10 UA 112751 C2 5 10 15 20 25 30 35 Отриманий буферний розчин використовується як вихідний розчин для процесу гомеопатичного розведення, що застосовується для приготування активованої потенційованої форми антитіл. Концентрація, якій віддається перевага, вихідного матричного розчину антигеночищених поліклональних антитіл кролика до гамма-інтерферону складає 0.5 - 5.0 мг/мл, за можливості, 2.0 - 3.0 мг/мл. Мозкоспецифічний протеїн S-100, що експресується нейронами та гліальними клітинами (астроцитами та олігодендрогліоцитами), безпосередньо або через взаємодію з іншими протеїнами, виконує у ЦНС ряд функцій, спрямованих на підтримку нормального функціонування мозку, включаючи вплив на процеси навчання та пам’яті, ріст та життєздатність нейронів, регулювання метаболічних процесів у нейронних тканинах тощо. Для приготування активованої потенційованої форми антитіл антисироватку до мозкоспецифічного протеїну S-100 можна видалити з тканини головного мозку та піддати обробці наступним чином: - тканину головного мозку бика, заморожену у рідкому азоті, перетворюють на порошок за допомогою спеціального подрібнювача; - протеїни екстрагують у співвідношенні 1:3 (маса/об’єм) за допомогою екстрагуючого буферу з гомогенізацією; - гомогенат нагрівають протягом 10 хв. при температурі 60 °C, потім охолоджують до 4 °C на льодяній бані; - термолабільні протеїни видаляють шляхом центрифугування; - фракціонування сульфатом амонію здійснюють поетапно, з подальшим видаленням осаджених протеїнів; - фракцію, що містить протеїн S-100, преципітують за допомогою 100% насиченого сульфату амонію, що здійснюється шляхом зниження рівня pH до 4.0; необхідну фракцію збирають шляхом центрифугування; - преципітат розчиняють у мінімальному об’ємі буферу, що містить ЕДТА та меркаптоетанол, преципітат піддають діалізу деіонізованою водою та ліофілізують; - після фракціонування кислотних протеїнів здійснюється хроматографія на іонообмінному середовищі - ДЕАЕ-целюлозі DE-52, а потім ДЕАЕ-сефадексі A-50; - зібрані та діалізовані фракції, що містять S-100 протеїн, розділяють відповідно до молекулярної маси шляхом гель-фільтрації на сефадексі G-100; - очищений протеїн S-100 піддають діалізу та ліофілізують. Молекулярна маса очищеного мозкоспецифічного протеїну S-100 - 21000 D. Поліклональні антитіла до протеїну S-100 можна також отримати за допомогою методики, подібної тій, що описана для антитіл до гамма-інтерферону, з використанням допоміжної речовини. Цілу молекулу протеїну S-100 можна застосувати як імуноген (антиген) для імунізації кроликів. 11 UA 112751 C2 5 10 15 20 25 30 35 Для отримання антисироватки готують мозкоспецифічний S-100 протеїн або суміш протеїну S-100 (антигенів) в поєднанні з етильованим бичачим сироватковим альбуміном в якості речовини-носія з повним ад'ювантом Фрейнда та додають довиділеного мозкоспецифічного протеїну S-100, що підшкірно вводиться піддослідній тварині (кролику) в область спини в об'ємі 1-2 мл. Антисироватка може мати титр 1:500-1:1000. Активовану потенційовану форму кожного компоненту комбінації можна готувати з вихідного розчину шляхом гомеопатичної потенціації, за можливості – за методом пропорційного зниження концентрації шляхом серії розведень 1 частини кожного попереднього розчину (починаючи з вихідного розчину) у 9 частинах (для десяткових розведень) або у 99 частинах (для сотенних розведень), або у 999 частинах (для тисячних розведень - атенюація M) нейтрального розчинника, починаючи з концентрації вихідного розчину антитіла у розчиннику, за можливості, воді або суміші води з етиловим спиртом, в діапазоні приблизно від 0.5 до 5.0 мг/мл, в поєднанні з зовнішнім впливом. За можливості, зовнішній вплив має включати багаторазові вертикальні струшування (динамізацію) кожного розведення. За можливості, слід використовувати окремі контейнери для кожного подальшого розведення до необхідного рівня активності або фактору розведення. Цей метод є загальноприйнятим в гомеопатичній практиці Див., наприклад, В. Швабе "Гомеопатичні лікарські засоби", M., 1967, с. 14-29, що включається до цього документу шляхом посилання з заявленою метою. Наприклад, для приготування 12 сотенних розведень (що позначаються як C12), одну частину вихідного матричного розчину антитіл до гамма-інтерферону з концентрацією 3.0 мг/мл розводять у 99 частинах нейтрального водного або водно-спиртового розчинника (за можливості, 15 % етилового спирту), та потім вертикально струшують багато разів (10 та більше) для приготування 1-го сотенного розведення (позначається як C1). 2-ге сотенне розведення (C2) готують з 1-го сотенного розведення C1. Цю процедуру повторюють 11 разів для приготування 12-го сотенного розведення C12. Таким чином, 12-те сотенне розведення C12 представляє собою розчин, отриманий шляхом 12 послідовних розведень однієї частини вихідного матричного розчину антитіл до мозкоспецифічного протеїну S-100 з концентрацією 3.0 мг/мл у 99 частинах нейтрального розчинника у різних контейнерах, що еквівалентно сотенному гомеопатичному розведенню C12. Аналогічні процедури з відповідним фактором розведення проводять для отримання розведень C30, C50 та C200. Проміжні розведення для перевірки активністі можна випробувати на необхідній біологічній моделі. Активованими-потенційованими формами, яким віддається перевага, для обох антитіл, що є комбінацією винаходу, є суміш розведень C12, C30 та C200 або розведень C12, C30 та C50. При використанні суміші різних 12 UA 112751 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гомеопатичних розведень (перш за все, сотенних) активної речовини в якості біологічно активного компоненту, кожен компонент препарату (наприклад, C12, C30, C50, C200) готують окремо відповідно до вищезазначеної процедури, доки не буде отримане передостаннє розведення (наприклад, до C11, C29, та C199 відповідно), та потім одну частину кожного компоненту додають до одного контейнеру на основі суміші препарату та змішують з необхідною кількістю розчинника (наприклад з 97 частинами для сотенних розведень). Можливе використання активної речовини у формі суміші інших різних розчинів згідно з гомеопатичною технологією, наприклад, десяткових та/або сотенних (D20, C30, C100 або C12, C30, C50 або C12, C30, C200 тощо). Їх ефективність визначається експериментальним методом, шляхом випробування розведення на придатній біологічній моделі, наприклад, на моделях, описаних у прикладах нижче. Зовнішня обробка у ході потенціації та зниження концентрації також може здійснюватися шляхом ультразвукового, електромагнітного або будь-якого іншого фізичного впливу, прийнятого у гомеопатичній практиці. За можливості, комбінований лікарський препарат за цим винаходом може бути у формі рідини або у твердій стандартній лікарській формі. Рідкою формою лікарського препарату, якій віддається перевага, є суміш, за можливості, у співвідношенні 1:1, активованої потенційованої форми антитіл до гамма-інтерферону та активованої потенційованої форми антитіл до протеїну S-100. Рідким носієм, якому віддається перевага, є вода або суміш води з етиловим спиртом. Тверду стандартну лікарську форму лікарського препарату за цим винаходом можна приготувати шляхом просочування твердого носія, прийнятного у фармацевтичній практиці, сумішшю активованої потенційованої форми водних або водно-спиртових розчинів активних компонентів, змішаних, за можливості, у співвідношенні 1:1. Як варіант, носій може збагачуватися послідовно з кожним відповідним розведенням. Обидві порядки насичення є прийнятними. За можливості, лікарський препарат у твердій стандартній лікарській формі готується з гранул прийнятного у фармацевтичній практиці носія, що був попередньо насичений водними або водно-спиртовими розведеннями активованої потенційованої форми антитіл до гаммаінтерферону та активованої потенційованої форми антитіл до протеїну S-100. Тверда лікарська форма може бути в будь-якому вигляді, відомому у фармацевтичній практиці, включаючи таблетки, капсули, льодяники тощо. В якості неактивних фармацевтичних інгредієнтів можна використовувати глюкозу, цукрозу, мальтозу, крохмаль, ізомальтозу, ізомальт та інші моно-, оліго- та полісахаріди, що використовуються при виробництві лікарських засобів, а також технологічні суміші вищезазначених неактивних фармацевтичних інгредієнтів з іншими допоміжними речовинами, прийнятними у фармацевтичній практиці, наприклад, ізомальтом, кросповідоном, натрію цикламатом, натрію сахарином, безводною лимонною кислотою тощо), включаючи ковзаючи речовини, розпушувачі, зв'язуючі речовини та барвники. Носіями, яким віддається перевага, є лактоза та ізомальт. Фармацевтична лікарська форма може додатково включати стандартні фармацевтичні допоміжні речовини, наприклад, мікрокристалічну целюлозу, магнію стеарат та лимонну кислоту. Для приготування твердої форми для перорального застосування 100-300-мкм гранули лактози збагачують водними або водно-спиртовими розчинами активованої потенційованої форми антитіл до гістаміну, активованої потенційованої форми антитіл до гамма-інтерферону та активованої потенційованої форми антитіл до протеїну S-100 у співвідношенні 1 кг розчину антитіл на 5 або 10 кг лактози (1:5-1:10). Для здійснення насичення гранули лактози піддають насичувальній іррігації на псевдозрідженому шарі на відповідній установці (наприклад, "Hüttlin Pilotlab" виробництва Hüttlin GmbH) з подальшим висушуванням потоком нагрітого повітря при температурі нижче 40˚С. Передбачену кількість висушених гранул (10-34 масових частин), насичених активованою-потенційованою формою антитіл поміщають до мішалки та перемішують з 25-45 масових частин "ненасиченої" чистої лактози (яка використовується з метою зниження витрат, спрощення та прискорення технологічного процесу без зменшення терапевтичної ефективності), разом з 0.1-1 масових частин магнію стеарату та 3-10 масових частин мікрокристалічної целюлози. Отриману таблеточну масу однорідно перемішують та таблетують методом прямого сухого пресування (наприклад, на таблеточному пресі Korsch-XL 400) для утворення 150-500-мг круглих таблеток, за можливості, 300-мг. Після таблетування отримують таблетки по 300 мг, які насичують водно-спиртовим розчином (3.0-6.0 мг/табл.) комбінації активованої потенційованої форми антитіл до гамма-інтерферону та активованої потенційованої форми антитіл до протеїну S-100. Кожен компонент комбінації, що використовують для просочування, є в формі суміші сотенних гомеопатичних розведень C12, C30, та C50 або суміші сотенних гомеопатичних розведень C12, C30 та C200. В той час як винахід не обмежується вважається, що активована потенційована форма, описана у цьому документі, не містить молекулярної форми антитіла у кількості, достатній для 13 UA 112751 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 забезпечення біологічної активності, яку приписують такій молекулярній формі. Біологічна активнісь комбінованого засобу (комбінованого лікарського препарату) за цим винаходом достатньо повно продемонстрована у прикладах, що додаються. Крім того, даний винахід представляє метод суттєвої затримки виникнення симптомів розсіяного склерозу, а саме, метод, що включає введення комбінованого лікарського препарату, що містить a) активовану потенційовану форму антитіла до гамма-інтерферону та b) активовану потенційовану форму антитіла до протеїну S-100. Крім того, даний винахід представляє метод зниження імовірності випадків рецидиву у пацієнтів, що страждають на розсіяний склероз, шляхом введення комбінованого лікарського препарату, що містить a) активовану потенційовану форму антитіла до гамма-інтерферону та b) активовану потенційовану форму антитіла до протеїну S-100. За можливості, з метою лікування, комбінацію за даним винаходом вводять від 1 до 4 разів на добу, за можливості двічі на добу, по 1 або дві комбіновані стандартні лікарські форми при кожному прийомі. Винахід додатково ілюструється наведеними нижче прикладами, що не є обмежувальними. ПРИКЛАДИ Приклад 1 В ході цього дослідження використовувались самки пацюків лінії Вістар (200-220 г). У них викликали EAE шляхом одноразового культивування енцефалітогенної суміші на основі 100 мХ гомогенату гомологічного спинного мозку, 0.2 мл CFA (вміст знищених мікобактерій – 5 мг/мл) та 0.2 мл фізіологічного розвину одній тварині. EGS вводили підшкірно (в основу хвоста вздовж хвостової вени) під анестезією ефіром в кількості 0.4 мл (по 0.2 мл справа та зліва) (Абдурасулова, I.Н та співавт., 2004; Житухін Ю.Л. та співавт., 2008; Серебряна, Н.Б. та співавт., 2010). Наступні препарати вводились внутрішньошлунково 2 рази на добу з 7годинними інтервалами протягом 30 днів, починаючи з дня активізації EAE: (a) Наднизька доза антитіл до протеїну S-100 (далі у тексті - "ННД абс. до протеїну S-100") (n=10, 2.5 мл/кг/д); (b) наднизька доза антитіл до гамма-інтерферону (далі у тексті -“ННД абс. до інтерферону-гамма") (n=10, 2.5 мл/кг/д); (c) комбінація ННД абс. до протеїну S-100 та ННД абс. до інтерферону-гамма (далі у тексті -“комбінований препарат") (n=10, 5 мл/кг/д) та (d) дистильована вода (контроль; n=10, 5мл/кг/д). В якості еталонного препарату використовувався імуномодулятор Копаксон® (Teva, Ізраїль), який вводили внутрішньом'язово у дозуванні 4 мг/кг, з 2-го по 25-й день після активізації EAE. Результати показані на мал. 2-5. Клінічні симптоми експериментального аутоімунного енцефаломієліта (EAE) оцінювали кожен день протягом 30 днів, починаючи з дня активізації експериментального аутоімунного енцефаломієліта (EAE). Огляд кожного пацюка здійснювався безпосередньо до введення досліджуваних препаратів. У випадку швидкого прогресування захворювання клінічні симптоми оцінювали двічі на добу. Тяжкість неврологічних аномалій оцінювали у балах: наявність мязової слабкості, тремор (0.5 бали); резистентний парез (1 бал); параліч (1.5 бали). Клінічний індекс (CI) розраховувався як сума симптомів по 4 кінцівках. Крім того, CI позначався як нуль, якщо видимі клінічні ознаки неврологічних аномалій були відсутні, та позначався як 6 у випадку смерті тварини. Максимальне значення CI реєструвалось кожного дня. Сукупний індекс по кожному пацюку, що розраховувався як сума окремих CI впродовж всього періоду захворювання (30 днів) також реєструвався. 30-денний період захворювання розділили на наступні фази: латентна фаза (1-10 днів); фаза клінічних проявів (11-18 днів); та фаза одужання (19-30 днів). З метою оцінки ефективності досліджуваних препаратів у моделі експериментального аутоімунного енцефаломієліта (EAE) наступні параметри аналізувались у кожній досліджуваній групі: 1) час початку захворювання (дні); 2) зміни середньої тяжкості захворювання з часом (CI, бали); 3) середня тяжкість захворювання на різних фазах (CI, бали) 4) загальна кількість рецидивів, повернення симптомів захворювання (%). ННД абс. до протеїну S-100 затримували початок проявів клінічних симптомів періодів захворювання, як в порівнянні з негативним контролем (p0.05). Початок захворювання в двох групах, що отримували ННД абс. до інтерферону-гамма, та у групі, що отримувала Копаксон, не відрізнявся від контролю (див. мал. 2). Водночас, у тварин, яким вводився комбінований препарат, спостерігалась тенденція до скорочення періоду виникнення клінічних ознак розсіяного склерозу в порівнянні з контролем. Слід зазначити, що були встановлені статистично значимі різниці у часі початку захворювання між групою, що отримувала ННД абс. до протеїну S-100, та групою, що отримувала комбінований препарат. Процент тварин з тяжким ходом захворювання (>3 бали) також була нижчою у групі, що отримувала ННД абс. до протеїну S-100. У групах, що отримували комбінований препарат, 14 UA 112751 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 процент тварин з тяжким ходом захворювання був вищим, ніж в інших групах в усі періоди захворювання (див. мал. 3). В зв'язку з тим, що у різних фазах розвитку розсіяного склерозу активувались різні механізми патогенезу EAE, здійснювався аналіз впливу препаратів на тяжкість захворювання у латентному періоді, у фазі розвитку клінічних ознак та у фазі одужання. Введення ННД абс. до протеїну S-100 значною мірою сприяло зменшенню середніх балів прояву клінічних ознак захворювання у фазі клінічних проявів та у фазі одужання, в той час як Копаксон та ННД абс. до інтерферону-гамма істотно знижували тяжкість клінічних симптомів лише в останній фазі. Комбінований препарат, в порівнянні з контролем та групами, що отримували тільки ННД абс. до інтерферону-гамма або тільки ННД абс. до протеїну S-100, достовірно збільшував середні бали впливу на тварин по відношенню до появи клінічних ознак на стадії захворювання та одужання (див. мал. 4). Слід зазначити, що у частини тварин після повного зникнення клінічних ознак захворювання відзначався стан, дещо подібний до рецидиву, тобто повернення клінічних проявів EAE. У групі, що отримувала ННД абс. до протеїну S-100, незважаючи на сприятливий вплив препарату на клінічний хід EAE (пізніший період початку захворювання, менша тяжкість прояву клінічних ознак), відзначалась більша кількість тварин (25 %) з рецидивами. Водночас, у групі, що отримувала комбінований препарат, що характеризувалась раннім початком захворювання та більш значними проявами патологічного процесу, рецидивів у жодної тварини не було. (див. мал. 5). Висновки: У моделі експериментального аутоімунного енцефаломієліту (EAE) ННД абс. до протеїну S-100 здійснювали сприятливий вплив на хід захворювання. ННД абс. до протеїну S-100 зменшували клінічний ознаки захворювання при його настанні, а також тяжкість симптомів. ННД абс. до інтерферону-гамма та порівняльний препарат Копаксон – не здійснювали впливу на хід захворювання в обраній 30 експериментальній моделі розсіяного склерозу, тобто при використанні цих речовин обсяг клінічних ознак періодів захворювання та тяжкість симптомів не відрізнялись від контролю (дистильованої води). Прояв впливу препаратів залежав від стадії розвитку EAE (латентна фаза, фаза появи клінічних ознак, фаза одужання). Вплив комбінованого препарату відрізнявся від впливу компонентів, а саме, окремо ННД абс. до протеїну S-100 або ННД абс. до інтерферону-гамма. Застосування комбінованого препарату обумовило посилення імунної реакції. Комбінований препарат обумовив більш ранній початок захворювання, збільшення кількості хворих тварин та посилення тяжкості захворювання. У 25 % тварин у групі, що отримувала ННД абс. до протеїну S-100, та 15 % тварин у групі, що отримувала ННД абс. до інтерферону-гамма, виникли рецидиви впродовж періоду дослідження (30 днів). Водночас, у жодної тварини у групі, що отримувала комбінований препарат, рецидиви не спостерігались. Найтиповішим ходом розсіяного склерозу є зворотноремітуючий підтип, що характеризується непередбачуваними нападами (рецидивами), за якими йдуть періоди відносної ремісії без нових ознак активності захворювання. Першочерговими цілями терапії розсіяного склерозу є зменшення нейронального пошкодження при гострих нападах та відновлення функцій після нападів, а також профілактика нових нападів, що можуть призвести до втрати дієздатності. ННД абс. до протеїну S-100 окремо були здатні покращити клінічні симптоми EAE під час всіх фаз моделі захворювання, що робить їх потенційно корисними для контролю нападів розсіяного склерозу. Комбінація ННД абс. до протеїну S-100 + ННД абс. до інтерферону-гамма повністю попереджала повернення клінічних симптомів EAE та, таким чином, може використовуватись у терапії розсіяного склерозу у людей для профілактики рецидивів. Таким чином, комбінація ННД абс. до протеїну S-100 + ННД абс. до інтерферону-гамма є багатообіцяючим препаратом для лікування розсіяного склерозу, який, як вважається, завдяки посиленню імунної реакції на піку розвитку захворювання, може сприяти більш ефективній реабілітації та профілактиці рецидивів. Приклад 2 31 15 UA 112751 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Рецептор сигма-1 (σ1) є внутрішньоклітинним рецептором, що локалізується в клітинах центральної нервової системи, клітинах більшості периферійних тканин та клітинах імунного компоненту. Вважається, що цей рецептор шляхом контролю гомеостазу внутрішньоклітинного кальцію, регулює внутрішньоклітинні сигнали, призводячи до активації відповідних факторів транскрипції та транскрипції всієї родини генів. Рецептор сигма-1 приймає участь у патогенезі різних захворювань, включаючи інфекційні та нейроденегеративні стани. У цьому відношенні препарати, що впливають на цей рецептор та ефективність взаємодії лігандів з цим рецептором, можуть вважатись ефективними препаратами для лікування нейроінфекційних та нейродегенеративних захворювань. Вплив комбінованого препарату, до складу якого входять наднизькі дози антитіл до протеїну S-100 (суміш гомеопатичних розведень C12+C30+C50) та наднизькі дози антитіл до інтерферону-гамма (суміш гомеопатичних розведень C12+C30+C50) у співвідношенні 1:1, а також компонентів складу (наднизькі дози антитіл до протеїну S-100 (суміш гомеопатичних розведень C12+C30+C50) (ННД абс. до протеїну S-100) та наднизькі дози антитіл до інтерферону-гамма (суміш гомеопатичних розведень C12+C30+C50) (ННД абс. до інтерферону-гамма)), аналізувався in 3 vitro при зв'язуванні стандартного ліганду [ H]пентазоцину з рекомбінантним рецептором σ1 людини та оцінювався з застосуванням радіолігандного методу. Потенційована дистильована вода (суміш гомеопатичних розведень C12+C30+C50) (потенційована вода) використовувалась в якості контролю. 20 мкл комбінованого препарату або 10 мкл ННД абс. до протеїну S-100 або ННД абс. до інтерферону-гамма додавали до інкубаційного середовища. Таким чином, кількість ННД абс. до протеїну S-100 та ННД абс. до інтерферону-гамма перенесена до тестової лунки під час випробування комбінованого препарату, була ідентичною кількості ННД абс. до протеїну S-100 та ННД абс. до інтерферону-гамма, що тестувалися як монопрепарати, що дало можливість порівняти ефективність комбінованого препарату і його окремих компонентів, що складають комплексний препарат. Потенційовану воду додавали до інкубаційного середовища у кількості 20 мкл та 10 мкл. Далі ввели 160 мкл (приблизно 200 мкг протеїну) гомогенату мембран клітинної лінії Jurkat (лінія лейкемічних Т-лімфоцитів людини), та насамкінець додали 20 мкл міченого тритієм 3 радіоліганду [ H]пентазоцину (15 нм). 32 З метою вимірювання неспецифічного зв'язування, 20 мкл немаркірованого ліганду галоперідолу (10 мкм) перенесли до інкубаційного середовища замість препаратів або потенційованої води. Радіоактивність вимірювали за допомогою сцінтилометру (Topcount, Packard) та суміші для сцинтіляції (Microscint 0, Packard) після культивування протягом 120 хвилин при температурі 22 °C у 50 мM Тріс-HCl буферу (pH=7.4) та фільтрації з використанням скловолоконних фільтрів (GF/B, Packard). Специфічне зв'язування (під час випробування або контролю) розраховували як різницю між загальним (під час випробування або контролю) та неспецифічним зв'язуванням. Результати (при вимірюванні ковалентного зв'язування) представлені як процентне специфічного зв'язування у контролі (в якості контролю застосовувалась дистильована вода) (див. Таблицю 4). Таблиця 4 50 Вплив досліджуваних препаратів та потенційованої води на зв'язування стандартного 3 радіоліганду [ H]пентазоцину з рекомбінантним рецептором сигма-1 людини % пригнічення Кількість, зв'язування Досліджувана група % специфічного зв'язування радіолігандів введена в лунку радіолігандів у у контролі контролі 1-й тест Комбінований препарат 20 мкл 2-й тест 44.2 46.2 16 Середній показник 45.2 54.8 UA 112751 C2 ННД абс. до протеїну S-100 ННД абс. до інтерферону-гамма Потенційована вода Потенційована вода 5 10 15 20 25 10 мкл 70.9 62.9 66.9 33.1 10 мкл 158.9 149.8 154.3 -54.3 20 мкл 98.1 75.8 86.9 13.1 10 мкл 140.1 106.2 123.2 -23.2 % специфічного зв'язування у контролі = (специфічне зв'язування під час випробування/ специфічне зв'язування у контролі)* 100 %; % пригнічення специфічного зв'язування у контролі = 100 % - (специфічне зв'язування під час випробування/специфічне зв'язування у контролі) * 100 %). Пригнічення більше 50 % вказує на існування значного впливу на зв'язування. Пригнічення від 25 % до 50 % підтверджує вплив від незначного до середнього. Пригнічення менш ніж 25 % вважається незначним по відношенню до впливу на зв'язування та є в межах вихідних порогових значень. Висновок: 33 Комбінований препарат більш ефективно пригнічує зв'язування стандартного радіоліганду 3 [ H]пентазоцину з рекомбінантним рецептором сигма-1 людини, ніж його окремі компоненти (ННД абс. до протеїну S-100 або ННД абс. до інтерферону-гамма). ННД абс. до протеїну S-100, перенесені до тестової лунки в об'ємі 10 мкл, 3 пригнічують зв'язування стандартного ліганду [ H]пентазоцину з рекомбінантним рецептором сигма-1 людини, але інтенсивність цього ефекту є меншою, ніж при застосуванні комбінованого препарату. ННД абс. до інтерферону-гамма, перенесені до тестової лунки в об'ємі 10 мкл, не впливали 3 на зв'язування стандартного ліганду [ H]пентазоцину з рекомбінантним рецептором сигма-1 людини. Потенційована вода, перенесена до тестової лунки в об'ємі 10 мкл або 20 мкл, не впливала 3 на зв'язування стандартного ліганду [ H]пентазоцину з рекомбінантним рецептором сигма-1 людини. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 30 35 40 45 50 1. Комбінований лікарський препарат для використання у терапії нейродегенеративних захворювань, що містить суміш розчинів гомеопатично потенційованих форм а) антитіла до гамма-інтерферону у суміші трьох гомеопатичних розведень С12, С30 та С 200 або С12, С30 та С50, та b) антитіла до протеїну S-100 у суміші трьох гомеопатичних розведень С12, С30 та С 200 або С12, С30 та С50. 2. Комбінований лікарський препарат згідно з пунктом формули 1, який відрізняється тим, що антитіла в активованій потенційованій формі до гамма-інтерферону є антитілами до цілого гамма-інтерферону, який має послідовність SEQ ID NO: 1 або за SEQ ID NO: 2. 3. Комбінований лікарський препарат згідно з пунктом формули 1, який відрізняється тим, що антитіла в активованій потенційованій формі до гамма-інтерферону є антитілами до частини гамма-інтерферону, що має послідовності, вибрані з групи, яка складається з SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 та SEQ ID NO: 13. 4. Комбінований лікарський препарат згідно з пунктом формули 1, який відрізняється тим, що антитіла в активованій потенційованій формі до протеїну S-100 є антитілами до цілого бичачого протеїну S-100. 5. Комбінований лікарський препарат згідно з пунктом формули 1, який відрізняється тим, що антитіла в активованій потенційованій формі до протеїну S-100 є антитілами до цілого протеїну, який має послідовність S-100 із SEQ ID NO: 14. 6. Комбінований лікарський препарат згідно з пунктом формули 1, який відрізняється тим, що антитіла в активованій потенційованій формі до протеїну S-100 є антитілами до цілого протеїну, який має послідовність S-100 із SEQ ID NO: 17. 7. Комбінований лікарський препарат згідно з пунктом формули 1, який відрізняється тим, що антитіла в активованій потенційованій формі до гамма-інтерферону представлені у формі суміші гомеопатичних розведень С12, С30 та С50, імпрегнованих на твердому носії, та антитіла 17 UA 112751 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 в активованій потенційованій формі до протеїну S-100 представлені у формі суміші гомеопатичних розведень С12, С30 та С50, в подальшому імпрегнованих на твердому носії. 8. Комбінований лікарський препарат згідно з пунктом формули 1, де антитіла в активованій потенційованій формі до гамма-інтерферону представлені у формі суміші гомеопатичних розведень С12, С30 та С200, імпрегнованих на твердому носії, та антитіла в активованій потенційованій формі до протеїну S-100 представлені у формі суміші гомеопатичних розведень С12, С30 та С200, в подальшому імпрегнованих на твердому носії. 9. Комбінований лікарський препарат згідно з пунктом формули 1, який відрізняється тим, що антитіла в активованій потенційованій формі до протеїну S-100 представлені у формі суміші гомеопатичних розведень С12, С30 та С50, імпрегнованих на твердому носії, та антитіла в активованій потенційованій формі до гамма-інтерферону представлені у формі суміші гомеопатичних розведень С12, С30 та С50, в подальшому імпрегнованих на твердому носії. 10. Комбінований лікарський препарат згідно з пунктом формули 1, який відрізняється тим, що антитіла в активованій потенційованій формі до протеїну S-100 представлені у формі суміші гомеопатичних розведень С12, С30 та С200, імпрегнованих на твердому носії, та антитіла в активованій потенційованій формі до гамма-інтерферону представлені у формі суміші гомеопатичних розведень С12, С30 та С200, в подальшому імпрегнованих на твердому носії. 11. Комбінований лікарський препарат згідно з пунктом формули 1, який відрізняється тим, що антитіла в активованій потенційованій формі до гамма-інтерферону є моноклональними, поліклональними чи природними антитілами. 12. Комбінований лікарський препарат згідно з пунктом формули 11, який відрізняється тим, що антитіла в активованій потенційованій формі до гамма-інтерферону є поліклональними антитілами. 13. Комбінований лікарський препарат згідно з пунктом формули 1, який відрізняється тим, що антитіла в активованій потенційованій формі до гамма-інтерферону готують шляхом послідовних сотенних розведень у поєднанні зі струшуванням кожного розведення. 14. Комбінований лікарський препарат згідно з пунктом формули 1, який відрізняється тим, що антитіла в активованій потенційованій формі до протеїну S-100 є моноклональними, поліклональними чи природними антитілами. 15. Комбінований лікарський препарат згідно з пунктом формули 14, який відрізняється тим, що антитіла в активованій потенційованій формі до протеїну S-100 є поліклональними антитілами. 16. Комбінований лікарський препарат згідно з пунктом формули 1, який відрізняється тим, що антитіла в активованій потенційованій формі до протеїну S-100 готують шляхом послідовних сотенних розведень у поєднанні зі струшуванням кожного розведення. 17. Метод лікування нейродегенеративного захворювання, причому вказаний метод передбачає що відповідному пацієнту одночасно вводять суміш розчинів гомеопатично потенційованих форм а) антитіла до гамма-інтерферону у суміші трьох гомеопатичних розведень С12, С30 та С200 або С12, С30 та С50, та b) антитіла до протеїну S-100 у суміші трьох гомеопатичних розведень С12, С30 та С 200 або С12, С30 та С50. 18. Метод згідно з пунктом формули 17, який відрізняється тим, що зазначене нейродегенеративне захворювання є розсіяним склерозом. 19. Метод згідно з пунктами формули 17 або 18, який відрізняється тим, що зазначені антитіла в активованій потенційованій формі до гамма-інтерферону та зазначені антитіла в активованій потенційованій формі до протеїну S-100 вводять у вигляді комбінованого лікарського препарату. 20. Метод зниження частоти виникнення рецидивів у пацієнтів, що страждають на розсіяний склероз, який відрізняється тим, що вводять комбінований лікарський препарат згідно з пунктом формули 1. 21. Метод згідно з пунктом формули 19, який відрізняється тим, що вводять комбінований лікарський препарат в 1-2 стандартних лікарських формах, причому кожну лікарську форму вводять від 1 до 4 разів на добу. 22. Метод згідно з пунктом формули 19, який відрізняється тим, що вводять комбінований лікарський препарат в 1-2 стандартних лікарських формах, причому кожну лікарську форму вводять двічі на добу. 23. Лікарський препарат для застосування у терапії пацієнтів, що страждають на розсіяний склероз, причому зазначений препарат отримують за допомогою поєднання розчинів гомеопатично потенційованих форм а) антитіла до гамма-інтерферону у суміші трьох гомеопатичних розведень С12, С30 та С200 або С12, С30 та С50, та b) антитіла до протеїну S100 у суміші трьох гомеопатичних розведень С12, С30 та С200 або С12, С30 та С50, кожну з яких готують шляхом послідовних багаторазових розведень та багаторазових струшувань кожного отриманого розчину згідно з гомеопатичною технологією та потім або комбінуючи 18 UA 112751 C2 5 10 потенційовані розчини шляхом їх змішування, або, як варіант, імпрегнуванням носія зазначеним комбінованим розчином або розчинами окремо. 24. Метод лікування нейроінфекції, що асоційована з пошкодженням або руйнуванням нервових клітин, який відрізняється тим, що вказаний метод передбачає одночасне введення відповідному пацієнту розчинів гомеопатично потенційованих форм а) антитіла до гаммаінтерферону у суміші трьох гомеопатичних розведень С12, С30 та С200 або С12, С30 та С50, та b) антитіла до протеїну S-100 у суміші трьох гомеопатичних розведень С12, С30 та С200 або С12, С30 та С50. 25. Метод згідно з пунктом формули 24, який відрізняється тим, що зазначені антитіла в активованій потенційованій формі до гамма-інтерферону та зазначені антитіла в активованій потенційованій формі до протеїну S-100 вводять у вигляді комбінованого лікарського препарату. 19 UA 112751 C2 20 UA 112751 C2 21 UA 112751 C2 22 UA 112751 C2 23 UA 112751 C2 24 UA 112751 C2 25 UA 112751 C2 26 UA 112751 C2 27 UA 112751 C2 28