Похідне інсуліну, фармацевтична композиція для лікування діабету та спосіб лікування діабету

1 Производное инсулина, имеющее следующую последовательность A-Chain s — s Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-lle-cys-Ser1 2 3 4 5 6 ] В Э 10 11 12 S B~chain s Xaa-Val-Xaa-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val1 2 3 * 5 б 7 8 9 10 11 12 A-Chain (coned.) 20 Leu-Tyr-Gln-Lau-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaa 13 14 IS 16 17 18 19 1 21 (SEQ ID N0:1) в-Chain (contd.) Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 B-Chain (contd.) Phe-Tyr-Thr~Pro-Lys~Xaa 25 26 27 28 29 3 D (SEQ ID N0:2) в которой Хаа в положениях А21 и ВЗ являются, независимо, любым аминокислотным остатком, который может быть кодирован генетическим кодом, за исключением Lys, Arg и Cys, Хаа в положении В1 является Phe или удалена, Хаа в положении ВЗО является (а) любым аминокислотным остатком, который может быть кодиро ван генетическим кодом, за исключением Lys, Arg и Cys, и в этом случае s-аминогруппа LysB 9 имеет липофильный заместитель или (б) удалена, и в этом случае s-аминогруппа LysB 9 имеет липофильный заместитель, и любые его комплексы с Zn 2+ , при условии, что, когда Хаа в положении ВЗО является Thr или Ala, Хаа в положении А21 и ВЗ оба являются Asn, и Хаа в положении В1 является Phe, производное инсулина представляет собой Zn 2 + комплекс 2 Производное инсулина по п 1, отличающееся тем, что Хаа в положениях А21 и ВЗ являются, независимо, любым аминокислотным остатком, который может быть кодирован генетическим кодом, за исключением Lys, Arg и Cys, Хаа в положении В1 является Phe или удалена, Хаа в положении ВЗО удалена или является любым аминокислотным остатком, который может быть кодирован генетическим кодом, за исключением Lys, Arg и Cys, и s-аминогруппа LysB29 имеет липофильный заместитель, который включает, по крайней мере, 6 атомов углерода 3 Производное инсулина по п 2, отличающееся тем, что Хаа в положении ВЗО удалена 4 Производное инсулина по п 2, отличающееся тем, что Хаа в положении ВЗО представляет собой Asp, Glu или Thr 5 Производное инсулина по п 2, отличающееся тем, что липофильным заместителем, связанным с s-аминогруппой LysB29, является ацильная группа, полученная из карбоновой кислоты, содержащая от 6 до 24 атомов углерода 6 Производное инсулина по п 5, отличающееся тем, что ацильная группа, которая может быть разветвленной, включает основную цепь, состоящую из 8-24 атомов углерода 7 Производное инсулина по п 5, отличающееся тем, что ацильная группа является ацильной группой жирной кислоты, содержащей от 6 до 24 атомов углерода 8 Производное инсулина по п 5, отличающееся тем, что ацильная группа является ацильной группой линейной, ненасыщенной карбоновой кислоты, имеющей от 6 до 24 атомов углерода 9 Производное инсулина по п 5, отличающееся тем, что ацильную группу выбирают из группы, О го Ю 45321 включающей додекановую кислоту, тридекановую кислоту и тетрад ека но вую кислоту 10 Производное инсулина по п 1, отличающееся тем, что Хаа в положении А21 представляет собой Ala, Gin, Gly илиЭег 11 Производное инсулина по п 1, отличающееся тем, что Хаа в положении ВЗ представляет собой Asp, Gin или Thr 12 Производное инсулина по п 1, отличающееся тем, что Хаа в положении ВЗ удалена 13 Производное инсулина по п 2, отличающееся тем, что оно представляет собой N -деканоил дез(ВЗО) человеческий инсулин 14 Производное инсулина по п 2, отличающееся 2+ тем, что оно представляет собой любой Zn комплекс N sB29 -деканоил дез(ВЗО) человеческого инсулина 15 Производное инсулина по п 2, отличающееся тем, что оно представляет собой Zn 2 + комплекс N s B 2 9 -деканоил дез(ВЗО) человеческого инсулина, содержащий 2, 3 или 4 иона Zn 2 + на гексамер инсулина 16 Производное инсулина по п 2, отличающееся тем, что оно представляет собой N (литохолоил-глутамил) дез(ВЗО) человеческий инсулин Данное изобретение относится к новым производным человеческого инсулина, которые растворимы и имеют пролонгированный профиль действия, к новому способу получения таких производных, к фармацевтическим композициям, их содержащим, и к использованию таких производных инсулина при лечении диабета Многих пациентов, больных диабетом, лечат многократными ежедневными инъекциями инсулина по схеме, включающей одну или две ежедневные инъекции пролонгированного инсулина, которые покрывают базальную потребность, дополняемую инъекциями ударной дозы быстродействующего инсулина, который покрывает потребность, связанную с приемом пищи Композиции пролонгированного инсулина хорошо известны в данной области техники Так, один основной тип пролонгированных инсулиновых композиций включает инъецируемые водные суспензии кристаллического инсулина или аморфного инсулина В этих композициях, обычно используемыми соединениями инсулина, являются протамиІЧ-инсулин, цинІЧ-инсулин или протамиІЧцинІЧ-инсулин Существуют определенные недостатки, связанныес использованием инсулиновых суспензий Так, для того чтобы осуществить точное дозирование, инсулиновые частицы должны быть гомогенно суспендированы путем осторожного встряхивания, прежде чем определенный объем суспензии будет отбираться из пузырька или удаляться из картриджа Кроме того, чтобы избежать образования вздутия или коагуляции, при хране 17 Производное инсулина по п 2, отличающееся 2+ тем, что оно представляет собой любой Zn комплекс N - (литохолоил-глутамил) дез(ВЗО) человеческого инсулина 18 Производное инсулина по п 2, отличающееся 2+ тем, что оно представляет собой Zn комплекс N - (литохолоил-глутамил) дез(ВЗО) человеческого инсулина, содержащий 2, 3 или 4 иона 2+ Zn на гексамер инсулина 19 Фармацевтическая композиция для лечения диабета у пациента, который нуждается в таком лечении, включающая производное инсулина в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, отличающаяся тем, что в качестве производного инсулина она содержит терапевтически эффективное количество производного инсулина по п 1 20 Способ лечения диабета у пациента, который нуждается в таком лечении, включающий введение пациенту производного инсулина в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, отличающийся тем, что в качестве производного инсулина вводят терапевтически эффективное количество производного инсулина по п 1 нии инсулиновых суспензии, температура должна поддерживаться в более узких пределах, чем для растворов инсулина Хотя ранее полагали, что протамины неиммуногенны, теперь оказалось, что протамины могут быть иммуногенными для человека, и что их использование для медицинских целей может привести к образованию антител (Samuel et al , Studies on the immunogenecity of protammes in humans and experimental animals by means of a microcomphment fixation test, Clm Exp Immunol 33 pp 252-260(1978)) Кроме того, существует доказательство того, что протамининсулиновый комплекс сам по себе иммуногенен (Kurtz et al , Circulating IgG antibody to protamme in patiens treated with protamin-insulms, Diabetologia, 25, pp 322 - 324 (1983)) Поэтому, некоторым пациентам следует избегать использования пролонгированных композиций инсулина Другим типом пролонгированных инсулиновых композиций являются растворы, имеющие значение рН ниже физиологического рН, при котором инсулин может осаждаться из-за повышения значения рН, когда раствор инъецируют Недостаток этих растворов заключается в том, что распределение частиц по размеру осадка, образуемого в ткани при инъекции, и поэтому хронометраж медикамента, зависит от притока крови к месту инъекции и других параметров в некоторой степени непредсказуемым способом WO 91/12817 (Novo Nordisk A S ) раскрывает пролонгированные, растворимые инсулиновые композиции, включающие комплексы инсулина с 45321 кобальтом (III) Пролонгирование этих комплексов тель, имеют пролонгированный профиль действия промежуточно и биодоступность понижена и являются растворимыми при физиологических значениях рН Человеческий инсулин имеет три первичные аминогруппы N-концевая группа А-цепи и В-цепи Таким образом, в самом широком аспекте, на29 и s-аминогруппа Lys Известно несколько простоящее изобретение относится к инсулиновому изводных инсулина, в которых одна или несколько производному, имеющему следующую последоваэтих групп замещены Так, Пат США № 3 528 960 тельность (EL Lilly) относится к N-карбоксиароил инсулинам, в которых одна, две или три первичные аминогруппы молекулы инсулина имеют карбоксиароильную группу В частности, не раскрываются гВ29 М -замещенные инсулины Согласно Пат Великобритании № 1 492 997 (Nat Res Dev Corp), обнаружено, что инсулин с sB29 карбамильным замещением при N имеет улучшенный профиль гипогликемического действия В выложенной заявке на Пат Японии № 1254699 (Kodama Co , Ltd) раскрывается инсулин, в котором жирная кислота связана с аминогруппой PheB1 или с s-аминогруппой Lys B29 или с обеими этими группами Цель получения производных инсулина заключается в получении фармакологически приемлемого, стабильного препарата инсулина Инсулины, которые в ВЗО положении имеют аминогруппу, имеющую, по крайней мере, пять углеродных атомов, которая необязательно может быть кодирована триплетом нуклеотидов, описаны в выложенной заявке на Пат Японии № 57-067548 (Shionogi) Заявляются инсулиновые аналоги, подлежащие использованию при лечении сахарного диабета, в частности, пациентов, которые инсулинорезистентны вследствие генерации антител бычьего или свиного инсулина Под термином "производное инсулина", используемом здесь, понимают соединение, имеющее молекулярную структуру, аналогичную молекулярной структуре человеческого инсулина, включая дисульфидные мостики между Cys A7 и CysB7 и между CysA2° и Cys B19 и внутренний диA6 A11 сульфидный мостик между Cys и Cys и которое имеет активность инсулина Однако, все же существует потребность в пролонгированных инъецируемых инсулиновых композициях, которые представляли бы растворы и которые содержали инсулины, которые остаются в растворе после инъекции и обладают минимальными воспалительными и иммуногенными свойствами Одна из целей настоящего изобретения заключается в разработке производных человеческого инсулина, с пролонгированным профилем действия, которые растворимы при физиологических значениях рН Другая цель настоящего изобретения заключается в разработке фармацевтической композиции, включающей производные человеческого инсулина согласно данному изобретению Следующей целью настоящего изобретения является разработка способа получения производных человеческого инсулина Сущность изобретения Неожиданно, оказалось, что некоторые производные человеческого инсулина, в которых sаминогруппа Lys B29 имеет липофильный замести в которой Хаа в положении А21 и ВЗ, независимо, представляет собой любой аминокислотный остаток, который может быть кодирован генетическим кодом, за исключением Lys, Arg и Cys, Хаа в положении В1 является Phe или удален, Хаа в положении ВЗО является (a) не-кодируемой, липофильной аминокислотой, имеющей от 10 до 24 углеродных атомов, и в этом случае ацильная группа карбоновой кислоты с вплоть до 5 углеродных атомов связана с sаминогруппой LysB29, (b) любым аминокислотным остатком, который может быть кодирован генетическим кодом, за исключением Lys, Arg и Cys, и в этом случае sаминогруппа Lys B29 имеет липофильный заместитель или (c) удален, и в этом случае s -аминогруппа Lys имеет липофильный заместитель, и любым его Zn 2 + комплексам, при условии, что когда Хаа в положении ВЗО является Thr или Ala, Хаа в положениях А21 и ВЗ оба являются Asn, и Хаа в положении В1 является Phe, тогда инсулиновое производное представляет собой Zn 2 + комплекс В предпочтительном варианте воплощения, изобретение относится к производному человеческого инсулина, в котором ВЗО аминокислотный остаток удален или представляет собой любой аминокислотный остаток, который может быть кодирован генетическим кодом, за исключением Lys, Arg и Cys, A21 и ВЗ аминокислотные остатки, независимо, являются любыми аминокислотными остатками, которые могут быть кодированы генетическим кодом, за исключением Lys, Arg и Cys, PheB1 может быть удален, s-аминогруппа Lys 29 имеет липофильный заместитель, который включает, по крайней мере, 6 углеродных атомов, и 2-4 8 7 45321 2+ Zn ионов могут быть связаны с каждым гексаменеразветвленной (цепь), насыщенней, алифатиром инсулина с учетом того, что когда ВЗО являетческой а-аминокислотой, имеющей от 10 до 24 ся Thr или Ala и А21 и ВЗ оба являются Asn, и углеродных атомов B1 2+ Phe не удален, тогда 2-4 Zn ионов связаны с В другом предпочтительном варианте воплокаждым гексамером инсулинового производного щения, изобретение относится к производному В другом предпочтительном варианте воплоинсулина, в котором ВЗО аминокислота является щения, изобретение относится к производному D- или L-Ns-flOfleKaHonnnH3HHOM инсулина, в котором ВЗО аминокислотный остаток В другом предпочтительном варианте воплоудален или является любым аминокислотным щения, изобретение относится к производному остатком, который может быть кодирован генетиинсулина, в котором ВЗО аминокислота является ческим кодом, за исключением Lys, Arg и Cys, A21 а-аминодекановой кислотой и ВЗ аминокислотные остатки, независимо, являВ другом предпочтительном варианте воплоются любыми аминокислотными остатками, котощения, изобретение относится к производному рые могут быть кодированы генетическим кодом, инсулина, в котором ВЗО аминокислота является за исключением Lys, Arg и Cys, с учетом того, что а-аминоундекановой кислотой если ВЗО аминокислотный остаток является Ala В другом предпочтительном варианте воплоили Thr, то тогда, по крайней мере, один из остатB1 щения, изобретение относится к производному ков А21 и ВЗ отличен от Asn, Phe может быть инсулина, в котором ВЗО аминокислота является удален, и а-аминододекановой кислотой B29 s-аминогруппа Lys имеет липофильный заВ другом предпочтительном варианте вопломеститель, который включает, по крайней мере, 6 щения, изобретение относится к производному углеродных атомов инсулина, в котором ВЗО аминокислота является В другом варианте воплощения изобретения, а-аминотридекановой кислотой изобретение относится к производному человечеВ другом Предпочтительном варианте воского инсулина, в котором ВЗО аминокислотный площения, изобретение относится к производному остаток -удален или является любым аминокисинсулина, в котором ВЗО аминокислота является лотным остатком, который может быть кодирован а-аминотетрадекановой кислотой генетическим кодом, за исключением Lys, Arg и В другом предпочтительном варианте воплоCys, A21 и ВЗ аминокислотные остатки, независищения, изобретение относится к производному мо, являются любыми аминокислотными остаткаинсулина, в котором ВЗО аминокислота является ми, которые могут быть кодированы генетическим а-аминопентадекановой кислотой кодом, за исключением Lys, Arg и Cys, В другом предпочтительном варианте воплоPhe B1 может быть удален, s-аминогруппа щения, изобретение относится к производному B29 Lys имеет липофильный заместитель, который инсулина, в котором ВЗО аминокислота является включает, по крайней мере, 6 углеродных атомов, а-аминогексадекановой кислотой 2+ и 2 - 4 Zn ионов могут быть связаны с каждым В другом предпочтительном варианте воплогексамером инсулина щения, изобретение относится к производному В другом предпочтительном варианте воплоинсулина, в котором ВЗО аминокислота является щения, изобретение относится к производному а-аминокислотой человеческого инсулина, в котором ВЗО аминокисВ другом предпочтительном варианте воплолотный остаток удален щения, изобретение относится к производному В другом предпочтительном варианте воплоинсулина, в котором А21 аминокислотный остаток щения, изобретение относится к производному является Ala человеческого инсулина, в котором ВЗО аминокисВ другом предпочтительном варианте воплолотный остаток является Asp щения, изобретение относится к производному В другом предпочтительном варианте воплоинсулина, в котором А21 аминокислотный остаток щения, изобретение относится к производному является Gin человеческого инсулина, в котором ВЗО аминокисВ другом предпочтительном варианте воплолотный остаток Glu щения, изобретение относится к производному В другом предпочтительном варианте воплоинсулина, в котором А21 аминокислотный остаток щения, изобретение относится к производному является Gly человеческого инсулина, в котором ВЗО аминокисВ другом предпочтительном варианте воплолотный остаток Thr щения, изобретение относится к производному В другом предпочтительном варианте воплоинсулина, в котором А21 аминокислотный остаток щения, изобретение относится к производному является Ser человеческого инсулина, в котором ВЗО аминокисВ другом предпочтительном варианте воплолотный остаток является липофильной аминокисщения, изобретение относится к производному лотой, имеющей, по крайней мере, 10 углеродных инсулина, в котором ВЗ аминокислотный остаток атомов В другом предпочтительном варианте является Asp воплощения, изобретение относится к производВ другом предпочтительном варианте воплоному инсулина, в котором ВЗО аминокислота явщения, изобретение относится к производному ляется липофильной а-аминокислотой, имеющей инсулина, в котором ВЗ аминокислотный остаток от 10 до 24 углеродных атомов является Gin В другом предпочтительном варианте воплоВ другом предпочтительном варианте воплощения, изобретение относится к производному щения, изобретение относится к производному инсулина, в котором ВЗО аминокислота является 45321 10 инсулина, в котором ВЗ аминокислотный остаток человеческого инсулина, в котором каждый гекса2+ является Thr мер инсулина связывает 3 Zn иона В другом предпочтительном варианте воплоВ другом предпочтительном варианте воплощения, изобретение относится к производному щения, изобретение относится к производному B29 инсулина, в котором s-аминогруппа Lys имеет человеческого инсулина, в котором каждый гекса2+ липофильный заместитель, который является мер инсулина связывает 4 Zn иона ацильной группой, соответствующей карбоновой В другом предпочтительном варианте воплокислоте, имеющей, по крайней мере, 6 углеродных щения, изобретение относится к использованию атомов производного человеческого инсулина согласно изобретению для получения лекарственного преВ другом предпочтительном варианте воплопарата для лечения диабета щения, изобретение относится к производному B29 В другом предпочтительном варианте воплоинсулина, в котором s-аминогруппа Lys имеет щения, изобретение относится к фармацевтичелипофильный заместитель, который является ской композиции для лечения диабета у пациенацильной группой, разветвленной или неразветвтов, в случае необходимости такого лечения, ленной, которая соответствует карбоновой кисловключающей терапевтически эффективное колите, имеющей углеродную цепь из 8 - 24 атомов чество производного человеческого инсулина соуглерода гласно изобретению вместе с фармацевтически В другом предпочтительном варианте воплоприемлемым носителем щения, изобретение относится к производному B29 В другом предпочтительном варианте воплоинсулина, в котором s-аминогруппа Lys имеет щения, изобретение относится к фармацевтичелипофильный заместитель, который является ской композиции для лечения диабета у пациенацильной группой, соответствующей жирной китов, в случае необходимости такого лечения, слоте, имеющей, по крайней мере, 6 углеродных включающей терапевтически эффективное колиатомов чество производного человеческого инсулина соВ другом предпочтительном варианте воплогласно изобретению, в смеси с инсулином или щения, изобретение относится к производному аналогом инсулина, который имеет быстрое начаинсулина, в котором s-аминогруппа Lys B29 имеет ло действия, вместе с фармацевтически приемлипофильный заместитель, который является лемым носителем ацильной группой, соответствующей линейной, В другом предпочтительном варианте воплонасыщенной карбоновой кислоте, имеющей 6 - 24 щения, изобретение относится к фармацевтичеатомов углерода ской композиции, включающей производное челоВ другом предпочтительном варианте вопловеческого инсулина согласно изобретению, щения, изобретение относится к производному которое растворимо при физиологических значеинсулина, в котором s-аминогруппа Lys B29 имеет ниях рН липофильный заместитель, который является В другом предпочтительном варианте воплоацильной группой, соответствующей линейной, щения, изобретение относится к фармацевтиченасыщенной карбоновой кислоте, имеющей 8 - 1 2 ской композиции, включающей производное челоатомов углерода веческого инсулина согласно изобретению, В другом предпочтительном варианте воплокоторое растворимо при рН значениях в интерващения, изобретение относится к производному ле от около 6,5 до около 8,5 инсулина, в котором s-аминогруппа Lys B29 имеет В другом предпочтительном варианте воплолипофильный заместитель, который является щения, изобретение относится к пролонгированацильной группой, соответствующей линейной, ной фармацевтической композиции, включающей насыщенной карбоновой кислоте, имеющей 10 производное человеческого инсулина согласно 16 атомов углерода изобретению В другом предпочтительном варианте воплоВ другом предпочтительном варианте воплощения, изобретение относится к производному B29 щения, изобретение относится к фармацевтичеинсулина, в котором s-аминогруппа Lys имеет ской композиции, которая представляет собой липофильный заместитель, который представляет раствор, содержащий от около 120нмол/мл до собой олигооксиэтиленовую группу, содержащую около 1200нмол/мл, предпочтительно около вплоть до 10, предпочтительно вплоть до 5, окси600нмол/мл производного человеческого инсуэтиленовых звеньев лина согласно изобретению В другом предпочтительном варианте воплоВ другом предпочтительном варианте воплощения, изобретение относится к производному щения, изобретение относится к способу лечения инсулина, в котором s-аминогруппа Lys B29 имеет диабета у пациентов в случае необходимости талипофильный заместитель, который представляет кого лечения, включающему введение пациенту собой олигооксипропиленовую группу, содержатерапевтически эффективного количества произщую вплоть до 10, предпочтительно вплоть до 5, водного инсулина согласно изобретению вместе с оксипропиленовых звеньев фармацевтически приемлемым носителем В другом предпочтительном варианте воплоВ другом предпочтительном варианте воплощения, изобретение относится к производному щения, изобретение относится к способу лечения человеческого инсулина, в котором каждый гексадиабета у пациентов, в случае необходимости мер инсулина связывает 2 Zn 2 + иона такого лечения, включающему введение пациенту В другом предпочтительном варианте воплотерапевтически эффективного количества произщения, изобретение относится к производному водного инсулина согласно этому изобретению, в 11 R9Q Д91 N s -деканоил G l y 1 инсулин, R9Q дез (ВЗО) человеческий N s -додеканол G l y 1 дез (ВЗО) человеческий инсулин N s B 2 -тридеканоил G l / 2 1 Gln B 3 дез (ВЗО) человеческий инсулин, Ы г В 2 9 -тетрадеканоил G l / 2 1 Gln B 3 дез (ВЗО) человеческий инсулин, Ы г В 2 9 -деканол G l / 2 1 Gln B 3 дез (ВЗО) человеческий инсулин, Ы г В 2 9 -додеканол G l / 2 1 Gln B 3 дез (ВЗО) человеческий инсулин, |\| гВ29 -тридеканоил А1а А21 дез (ВЗО) человеческий инсулин, |\|гВ29-тетрад еканои л А1а А21 дез (ВЗО) человеческий инсулин, Д91 s N -деканоил Ala инсулин, R9Q дез (ВЗО) человеческий Д91 N s -додеканол Ala дез (ВЗО) человеческий инсулин N s B 2 -тридеканоил Ala A 2 1 Gln B 3 дез (ВЗО) человеческий инсулин, Ы г В 2 9 -тетрадеканоил Ala A 2 1 Gln B 3 дез (ВЗО) человеческий инсулин, Ы г В 2 9 -деканоил Ala A 2 1 Gln B 3 дез (ВЗО) человеческий инсулин, Ы г В 2 9 -додеканоил Ala A 2 1 Gln B 3 дез (ВЗО) человеческий инсулин,, R9Q R^. N s -тридеканоил Gin ский инсулин, R9Q дез (ВЗО) человечеR^. N s -тетрадеканоил Gin ский ИНСуЛИНІ R9Q дез (ВЗО) человече R^. N s -деканоил Gin дез (ВЗО) человеческий Д91 инсулин, -тридеканоил G l y 1 человеческий инсуR9Q R^. Д91 N s -додеканоил Gin дез (ВЗО) человеческий 1 инсулин -тетрад еканои л G l y человеческий ин по Д91 G l y 1 человеческий инсулин, Ns лин, Ns сулин, R9Q Ns -деканоил Д91 Gly1 человеческий инсу R9Q Ns -додеканоил лин, R9Q Ы г В 2 9 -тетрад еканои л Gln B 3 человеческий инсулин, В29 -деканоил G l / 1 2 1 Gln B 3 человеческий инсулин, Ы г В 2 9 -додеканоил G l / 1 2 1 Gln человеческий инсулин, лин, Ns Ns сулин, R9Q R9Q А?1 А?1 -тридеканоил Ala R9Q человеческий A 91 -тетрад еканои л Ala Q инсу человеческий ин А91 sE -деканоил Ala человеческий инсулин, N А91 sE Q -додеканоил Ala человеческий инсулин, N А91 R^ sE Q -тридеканоил Ala человеческий N Gin инсулин, Ы г В 2 9 -тетрад еканои л А1а А21 Gln B 3 человеческий инсулин, Ы г В 2 9 -деканоил Ala A 2 1 Gln B 3 человеческий инсулин, Ы г В 2 9 -додеканоил Ala A 2 1 Gln B 3 человеческий инсулин, e— -тридеканоил Gin человеческий инсуN Д91 R9Q 12 45321 смеси с инсулином или аналогом инсулина, который имеет быстрое начало действия, вместе с фармацевтически приемлемым носителем Примерами предпочтительных производных человеческого инсулина, согласно настоящему изобретению, в которых отсутствуют связанные Z n 2 + ионы, являются следующие NsB29-TpH деканоил дез (ВЗО) человеческий инсулин, Ы г В 2 9 -тетрадеканоил дез (ВЗО) человеческий инсулин, Ы г В 2 9 -деканоил дез (ВЗО) человеческий инсулин, Ы г В 2 9 -додеканол дез (ВЗО) человеческий инсулин, |\| гВ29 -тридеканоил G l / 2 1 дез (ВЗО) человеческий инсулин, |\|гВ29-тетрад еканои л G l / 2 1 дез (ВЗО) человеческий инсулин, Д91 N s -тридеканоил G l y 1 инсулин, R^ Gin человеческий лин, 3 лин, -тетрад еканои л Gln B 3 человеческий инсу э -деканоил Gln B 3 человеческий инсулин, -додеканоил Gln B 3 человеческий инсулин, 9 -тридеканоил Glu B 3 ° человеческий инсуэ лин, 9 -тетрад еканои л Glu B 3 ° человеческий, ин сулин, 9 B3 N s E -деканоил Glu ° человеческий инсулин, sE 9 -додеканоил Glu B 3 ° человеческий инсуN лин, isE 9 -тридеканоил Gl/* 2 1 Glu B 3 ° человеческий инсулин, 3 -тетрад еканои л Gl/* 2 1 Glu B 3 ° человеческий инсулин, Ы г В 2 9 -деканоил G l / 1 2 1 Glu B 3 ° человеческий инсулин, Ы г В 2 9 -додеканоил G l / 1 2 1 Glu B 3 ° человеческий инсулин, N s B 2 9 -TpHдеканоил G l / 1 2 1 Gln B 3 Glu B 3 ° человеческий инсулин, Ы г В 2 9 -тетрадеканоил G l / 2 1 Gln B 3 Glu B 3 ° человеческий инсулин, 2 1 Gln B 3 Glu B 3 ° человечеЫг -деканоил G l / ский инсулин, Ы г В 2 9 -додеканоил G l / 2 1 Gln B 3 Glu B 3 ° человеческий инсулин, Glu человеческий N s -тридеканоил Ala инсулин, А21 Glu B 3 ° человечеЫ г В 2 9 -тетрад еканои л Ala ский инсулин, N s D -деканоил Ala M Z I Glu человеческий инсулин, A21 М г В 2 9 -додеканоил Ala Glu человеческий инсулин, N s B 2 9 -TpHдеканоил AlaA 2 1 Gln Glu B 3 ° человеческий инсулин, A21 Ы г В 2 9 -тетрадеканоил Ala Gln B 3 Glu B 3 ° человеческий инсулин, В29 A21 Ы г В 2 9 -деканоил Ala A 2 1 Gln B 3 Glu B 3 ° человеческий инсулин, Ы г В 2 9 -додеканоил Ala A 2 1 Gln B 3 Glu B 3 ° человече 13 скии инсулин, sB29 B3 B3 N -TpHдеканоил Gln Glu ° человеческий инсулин sB2 B3 B3 N -тетрадеканоил Gln Glu ° человеческий инсулин, гВ29 B3 B3 Ы -деканоил Gln Glu ° человеческий инсулин, гВ29 B3 B3 Ы -додеканоил Gln Glu ° человеческий инсулин, Примерами предпочтительных производных человеческого инсулина согласно данному изо2+ бретению, в которых два Zn иона связаны с гексамером инсулина, являются следующие sB29 (N -TpHдеканоил дез (ВЗО) человеческий ин2+ сулин)б, 2 Zn , s поп (N -тетрадеканоил дез (ВЗО) человеческий инсулин)б, 2 Zn +, R9Q (Ns -деканоил дез (ВЗО) человеческий инсулин)б, 2 Zn 2+ , (ЫгВ29-додеканоил дез (ВЗО) человеческий инсулин)б, 2 Zn 2+ , (1ЧгВ29-тридеканоил G l / 2 1 дез (ВЗО) человеческий инсулин)б, 2Zn 2 + , (N s B 2 -тетрадеканоил G l / 2 1 дез (ВЗО) человеческий инсулин)б, 2Zn 2 + , R9Q Д91 (Ns -деканоил Gly 1 дез (ВЗО) человеческий инсулин)б, 2 Zn +, (N -додеканоил G l / 2 1 дез (ВЗО) человеческий инсулин)б, 2Zn 2 + , (NeB2-тридеканоил G l / 2 1 Gln B3 дез (ВЗО) человеческий инсулин)б, 2Zn 2 + , (ЫгВ29-тетрадеканоил G l / 2 1 Gln B3 дез (ВЗО) человеческий инсулин)б, 2Zn 2 + , (ЫгВ29-деканоил G l / 2 1 Gln B3 дез (ВЗО) человеческий инсулин)б, 2 Zn +, (ЫгВ29-додеканоил G l / 2 1 Gln B3 дез (ВЗО) человеческий инсулин)б, 2 Zn +, (|\|гВ29-тридеканоил А1аА21 дез (ВЗО) человеческий инсулин)б, 2Zn 2 + , (N s B 2 -тетрадеканоил А1аА21 дез (ВЗО) человеческий инсулин)б, 2Zn 2 + , R9Q Д91 (Ns -деканоил Ala дез (ВЗО) человеческий 2+ инсулин)б, 2 Zn , (N -додеканоил А1аА21 дез (ВЗО) человеческий инсулин)б, 2Zn 2 + , (NeB2-тридеканоил Ala A21 Gln B3 дез (ВЗО) человеческий инсулин)б, 2Zn 2 + , (ЫгВ29-тетрадеканоил Ala A21 Gln B3 дез (ВЗО) человеческий инсулин)б, 2Zn 2 + , (ЫгВ29-деканоил Ala A21 Gln B3 дез (ВЗО) человеческий инсулин)б, 2Zn 2 + , (ЫгВ29-додеканоил Ala A21 Gln B3 дез (ВЗО) человеческий инсулин)б, 2Zn 2 + , (NsB29-Tpnдеканоил Gln B3 дез (ВЗО) человеческий инсулин)б, 2Zn 2 + , (N s B 2 -тетрадеканоил Gln B3 дез (ВЗО) человеческий инсулин)б, 2Zn 2 + , (ЫгВ29-деканоил Gln B3 дез (ВЗО) человеческий инсулин)б, 2 Zn 2+ , (N sB 9-додеканоил Gln B3 дез (ВЗО) человеческий инсулин)б, 2Zn 2 + , R9Q (N s 14 45321 -тридеканоил человеческий инсулин)є, 2 (ЫгВ29-тетрад еканои л человеческий инсулин)є, -, 2+ (N s -деканоил человеческий инсулин)є, 2 Zn , гВ29 (Ы -додеканоил человеческий инсулин)є, 2 Zn , SB29 121 (N -TDHдеканоил Gl/ человеческий инсу+ лин)б, 2 Zn , sB29 121 (N -TeTpafl еканои л Gl/ человеческий ин+ сулин)б, 2 Zn" , s 29 121 (N -деканоил Gl/ человеческий инсулин)є, 2Zn4 гВ29 121 (М -додеканоил Gl/ человеческий инсу+ лин)б, 2 Zn , sB29 121 B3 (N -TpHдеканоил Gl/ Gln человеческий + инсулин)б, 2 Zn , sB 21 B3 (N -тетрадеканоил G l / Gln человеческий инсулин)б, 2 Zn +, (N s B 2 -деканоил G l ^ 2 1 Gln B3 человеческий инсулин)б, 2 Zn" , (Ns 29-додеканоил Gl/ 1 2 1 Gln B3 человеческий инсулин)б, 2 Zn +, (N sB 9-тридеканоил А1аА21 человеческий инсулин)б, 2 Zn +, R9Q А91 (Ns -тетрадеканоил Ala сулин)б, 2 Zn"+, (Ns s R9Q R9Q А?1 -деканоил Ala человеческий ин человеческий инсулин)є, А91 (N -додеканоил Ala человеческий инсулин)б, 2 Zn +, (NsB29-Tpnдеканоил Ala A21 Gln B3 человеческий инсулин)б, 2 Zn +, (N sB 9-тетрад еканои л Ala A21 Gln B3 человеческий инсулин)б, 2 Zn +, (N s B 2 -деканоил Ala A21 Gln B3 человеческий инсулин)б, 2 Zn"+, (Ns 29-додеканоил Ala A21 Gln B3 человеческий инсулин)б, 2 Zn +, (N sB 9-тридеканоил Gln B3 человеческий инсулин)б, 2 Zn +, (NsB29-TeTpafl еканои л Gln B3 человеческий инсулин)б, 2 Zn"+, (Ns 29-деканоил Gln B3 человеческий инсулин)є, 2Zn4 (МгВ29-додеканоил Gln B3 человеческий инсулин)б, 2 Zn +, (NSB29-TDHдеканоил GluB3° человеческий инсу+ лин)б, 2 Zn , sB29 (N -TeTpafl еканои л GluB3° человеческий инсулин)б, 2 Zn"+, (ЫгВ29-деканоил GluB3° человеческий инсулин)б, 2 Zn 2+ , (ЫгВ29-додеканоил GluB3° человеческий инсулин)б, 2 Zn 2+ , (NsB29-TpHдеканоил Gl/ 1 2 1 GluB3° человеческий инсулин)б, 2 Zn +, (N sB -тетрадеканоил G l / 2 1 GluB3° человеческий инсулин)є, 2 Zn +, (N s B 2 -деканоил G l ^ 2 1 GluB3° человеческий инсулин)б, 2 Zn" , (ЫгВ29-додеканоил Gl/ 1 2 1 GluB3° человеческий инсулин)б, 2 Zn +, (N sB -тридеканоил G l / 2 1 Gln B3 GluB3° человеческий инсулин)б, 2 Zn +, (ЫгВ29-тетрадеканоил G l / 2 1 Gln B3 GluB3° чело 45321 15 2+ веческий инсулин^, 2Zn , гВ29 21 B3 B3 (Ы -деканоил G l / Gln Glu ° человече2+ ский инсулин^, 2Zn , sB2 21 B3 B3 (N -додеканоил G l / Gln Glu ° челове2+ ческий инсулин)б, 2Zn , s Д91 PTQ R^fl (N -тридеканоил Ala Glu человеческий 2+ инсулин^, 2 Zn , sB A21 B3 (N -тетрадеканоил Ala Glu ° человече2+ ский инсулин^, 2Zn , роп Д91 s (N -деканоил Ala 2+ сулин)є, 2 Zn , s R^fl Glu Д91 PTQ человеческий инR^fl (N -додеканоил Ala Glu человеческий 2+ инсулин^, 2 Zn , sB A21 B3 B3 (N -тридеканоил Ala Gln Glu ° челове2+ ческий инсулин)б, 2Zn , (ЫгВ29-тетрадеканоил + Ala A21 Gln B3 GluB3° человеческий инсулин)б, 2Zn 2 + , (ЫгВ29-деканоил Ala A21 Gln B3 GluB3° человеческий инсулин)б, 2Zn 2 + , (Ы'-додеканоил Ala A21 Gln B3 GluB3° человеческий инсулин)б, 2Zn 2 + , (Ns -тридеканоил Gin Glu человеческий инсулин)б, 2 Zn 2+ , R9Q R^. (Ns -тетрад еканои л Gin ский инсулин)б, 2Zn 2 + , роп R9Q человече R^fl po (Ns -деканоил Gin сулин)є, 2 Zn 2+ , R^.n Glu Glu R^. человеческий инR^,f~] (Ns -додеканоил Gin Glu человеческий инсулин)б, 2 Zn 2+ , Примерами предпочтительных производных человеческого инсулина согласно данному изобретению, в которых три Zn 2 + иона связаны с гексамером инсулина, являются следующие (NsB29-TpHдеканоил дез (ВЗО) человеческий инсулин)б, 3 Zn 2+ , роп (Ns -тетрад еканои л дез (ВЗО) человеческий инсулин)б, 3 Zn +, s R9Q (N -деканоил дез (ВЗО) человеческий инсулин)б, 3 Zn 2+ , (ЫгВ29-додеканоил дез (ВЗО) человеческий инсулин)б, 3 Zn 2+ , гВ29 21 (ІЧ -тридеканоил G l / дез (ВЗО) человече2+ ский инсулин)б, 3Zn , (N s B 2 -тетрад еканои л G l / 2 1 дез (ВЗО) человеческий инсулин)б, 3Zn 2 + , R9Q Д91 (Ns -деканоил Gly 1 дез (ВЗО) человеческий инсулин)б, 3 Zn 2+ , (N -додеканоил G l / 2 1 дез (ВЗО) человеческий инсулин)б, 3Zn 2 + , (Ы'-тридеканоил G l / 2 1 Gln B3 дез (ВЗО) человеческий инсулин)б, 3Zn 2 + , (ЫгВ29-тетрадеканоил G l / 2 1 Gln B3 дез (ВЗО) человеческий инсулин)б, 3Zn 2 + , (ЫгВ29-деканоил G l / 2 1 Gln B3 дез (ВЗО) человеческий инсулин)б, 3 Zn +, (ЫгВ29-додеканоил G l / 2 1 Gln B3 дез (ВЗО) человеческий инсулин)б, 3 Zn +, (|\|гВ29-тридеканоил А1аА21 дез (ВЗО) человеческий инсулин)б, 3Zn 2 + , (N s B 2 -тетрад еканои л А1аА21 дез (ВЗО) человеческий инсулин)б, 3Zn 2 + , R9Q Д91 (Ns -деканоил Ala дез (ВЗО) человеческий инсулин)б, 3 Zn 2+ , (N sB -додеканоил А1аА21 дез (ВЗО) человече 16 ский инсулин)б, 3 Zn , sB2 A21 B3 (N -тридеканоил Ala Gln дез (ВЗО) чело+ веческий инсулин)б, 3 Zn , гВ29 A21 B3 (|\| -тетрадеканоил Ala Gln дез (ВЗО) че+ ловеческий инсулин)б, 3 Zn , гВ29 A21 B3 (|\| -деканоил Ala Gln дез (ВЗО) челове+ ческий инсулин)б, 3 Zn , гВ29 A21 B3 (|\| -додеканоил Ala Gln дез (ВЗО)чело+ веческий инсулин)б, 3 Zn , sB29 B3 (N -Tpnдеканоил Gln дез (ВЗО) человече+ ский инсулин)б, 3 Zn , sB2 B3 (N -тетрадеканоил Gln дез (ВЗО) челове+ ческий инсулин)б, 3 Zn , гВ29 B3 (Ы -деканоил Gln дез (ВЗО) человеческий + инсулин)б, 3 Zn , sB 9 B3 (N -додеканоил Gln дез (ВЗО) человече+ ский инсулин)б, 3 Zn , (N s B 2 -тридеканоил человеческий инсулин)є, З Zn 2+ , (ЫгВ29-тетрад еканои л человеческий инсулин)є, (ЫгВ29-деканоил человеческий инсулин)є, З Zn , (ЫгВ29-додеканоил человеческий инсулин)є, З 2+ -, 2+ Zn , (NSB29-TDHдеканоил Gl/* 21 человеческий инсулин)б, 3 Zn +, (NsB29-TeTpafl еканои л Gl/ 1 2 1 человеческий инсулин)б, 3 Zn"+, (N sB29 -fl еканои л Gl/ 1 2 1 человеческий инсулин)є, 3ZnV, (МгВ29-додеканоил Gl/ 1 2 1 человеческий инсулин)б, 3 Zn +, (NsB29-Tpnдеканоил Gl/* 21 Gln B3 человеческий инсулин)б, 3 Zn +, (N sB -тетрадеканоил G l / 2 1 Gln B3 человеческий инсулин)б, 3 Zn +, (N s B 2 -деканоил Gl/ 1 2 1 Gln B3 человеческий инсулин)б, 3 Zn"+, Gln B3 человеческий (ЫгВ29-додеканоил + инсулин)б, 3 Zn , RvQ A?1 (Ns -тридеканоил Ala лин)б, 3 Zn +, R9Q человеческий инсуА91 (Ns -тетрадеканоил Ala + сулин)б, 3 Zn" , роп (Ns 3ZnV, человеческий ин А91 -деканоил Ala человеческий инсулин)є, R9Q А91 (Ns -додеканоил Ala лин)б, 3 Zn +, R9Q человеческий инсуА?1 R4 (Ns -тридеканоил Ala инсулин)б, 3 Zn +, RvQ Gin A91 (Ns -тетрадеканоил Ala ский инсулин)б, 3 Zn +, R?4 A91 (Ns -деканоил Ala сулин)б, 3 Zn"+, poq человеческий R4 Gin человече R^ Gin A91 человеческий инR^ (Ns -додеканоил Ala Gin человеческий инсулин)б, 3 Zn +, (N sB 9-тридеканоил Gln B3 человеческий инсулин)б, 3 Zn +, (NsB29-TeTpafl еканои л Gln B3 человеческий инсулин)б, 3 Zn"+, (ЫгВ29-деканоил Gln B3 человеческий инсулин)є, 3ZnV, (ЫгВ29-додеканоил Gln B3 человеческий инсу 17 лин)б, 3 Zn 2+ , (Ns -тридеканоил Glu лин)б, 3 Zn +, R9Q человеческий ин R^fl Glu R9Q человеческий инсу R^fi (Ns -додеканоил Glu лин)б, 3 Zn 2+ , ROQ человеческий инсуR^fl ROQ (Ns -тетрадеканоил Glu сулин)б, 3 Zn +, (Ns -деканоил лин)б, 3 Zn +, 45321 человеческий инсуД91 R^fl (Ns -тридеканоил Gly 1 Glu человеческий инсулинк 3 Zn 2+ , (N s B -тетрадеканоил G l / 2 1 Glu B30 человеческий инсулин^, 3Zn 2 + , R9Q Д91 R^,i~] Д91 R^fl (Ns роп -додеканоил Gly 1 Glu человеческий s 1 (N человеческий ининсулинк-деканоил Gly Glu 3 Zn , 2+ сулин)є, 3-тридеканоил G l / 2 1 Gln B3 GluB3° челове(N s B Zn , ческий инсулинк 3Zn 2 + , (ЫгВ29-тетрадеканоил Gl/* 21 Gln B3 GluB3° человеческий инсулин)б, 3Zn 2 + , (ЫгВ29-деканоил G l / 2 1 Gln B3 GluB3° человеческий инсулинк 3Zn 2 + , (N s B 2 -додеканоил Gl/* 21 Gln B3 GluB3° человеческий инсулинк 3Zn 2 + , s R9Q Д91 R^.n (N -тридеканоил Ala Glu человеческий инсулинк 3 Zn 2+ , (N s B -тетрадеканоил Ala A21 GluB3° человеческий инсулинк 3Zn 2 + , (N s B 2 -деканоил Ala A21 GluB3° человеческий инсулинк 3 Zn 2+ , (ЫгВ29-додеканоил Ala A21 GluB3° человеческий инсулинк 3 Zn 2+ , (N s B -тридеканоил Ala A21 Gln B3 GluB3° человеческий инсулинк 3Zn 2 + , (ЫгВ29-тетрадеканоил Ala A21 Gln B3 GluB3° человеческий инсулинк 3Zn 2 + , (ЫгВ29-деканоил Ala A21 Gln B3 GluB3° человеческий инсулинк 3Zn 2 + , (NeB2-додеканоил Ala A21 Gln B3 GluB3° человеческий инсулин)б, 3Zn 2 + , (NsB29-Tpnдеканоил Gln B3 GluB3° человеческий инсулинк 3 Zn 2+ , (N s B 9-тетрадеканоил Gln B3 GluB3° человеческий инсулинк 3Zn 2 + , (N s B 2 -деканоил Gln B3 GluB3° человеческий инсулин)є, 3 Zn 2+ , (ЫгВ29-додеканоил Gln B3 GluB3° человеческий инсулин)б, 3 Zn 2+ , Примерами предпочтительных производных человеческого инсулина согласно данному изобретению, в которых четыре Zn 2 + иона связаны с Примерами предпочтительных производных человеческого инсулина согласно данному изобретению, в которых четыре Zn 2 + иона связаны с гексамером инсулина, являются следующие (NsB29-TpHдеканоил дез (ВЗО) человеческий инсулинк 4 Zn 2+ , роп (Ns -тетрадеканоил дез (ВЗО) человеческий инсулинк 4 Zn +, R9Q (Ns -деканоил дез (ВЗО) человеческий инсул и н к 4 Zn 2+ , (ЫгВ29-додеканоил дез (ВЗО) человеческий инсулинк 4 Zn 2+ , 18 (ІЧгВ29-тридеканоил G l / 2 1 дез (ВЗО) человеческий инсулинк 4 Zn +, (Ns -тетрадеканоил G l / 2 1 дез (ВЗО) человеческий инсулин)б, 4 Zn +, (ЫгВ29-деканоил Gl/* 21 дез (ВЗО) человеческий инсулинк 4 Zn +, (N -додеканоил G l / 2 1 дез (ВЗО) человеческий инсулинк 4 Zn +, (NeB2-тридеканоил G l / 2 1 Gln B3 дез (ВЗО) человеческий инсулин)б, 4 Zn +, (|\|гВ29-тетрадеканоил G l / 2 1 Gln B3 дез (ВЗО) человеческий инсулин)б, 4 Zn +, (|\|гВ29-деканоил G l / 2 1 Gln B3 дез (ВЗО) человеческий инсулин)б, 4 Zn +, (|\|гВ29-додеканоил G l / 2 1 Gln B3 дез (ВЗО) челоV+ веческий инсулинк 4 Zn , (Ns -тридеканоил Ala ский инсулинк 4 Zn +, дез (ВЗО) человече ROO (Ns -тетрадеканоил Ala ческий инсулинк 4 Zn +, R9Q дез (ВЗО) челове А91 (Ns -деканоил Ala инсулинк 4 Zn +, ROO дез (ВЗО) человеческий Д91 (Ns -додеканоил Ala ский инсулинк 4 Zn +, отгі Д91 дез (ВЗО) человечеДО-1 R'J (ІЧеВ29-тридеканоил Ala A21 Gln B3 дез (ВЗО) человеческий инсулин)б, 4 Zn + , (|\|гВ29-тетрадеканоил Ala A21 Gln B3 дез (ВЗО) человеческий инсулинк 4 Zn +, (|\|гВ29-деканоил Ala A21 Gln B3 дез (ВЗО) человеческий инсулинк 4 Zn +, (|\|гВ29-додеканоил Ala A21 Gln B3 дез (ВЗО) человеческий инсулинк 4 Zn +, (NsB29-TpHдеканоил Gln B3 дез (ВЗО) человеческий инсулинк 4 Zn +, (N s B 2 -тетрадеканоил Gln B3 дез (ВЗО) человеческий инсулинк 4 Zn +, (ЫгВ29-деканоил Gln B3 дез (ВЗО) человеческий инсулин)б, 4 Zn +, (N s B 9-додеканоил Gln B3 дез (ВЗО) человеческий инсулинк 4 Zn +, (N s B 2 -тридеканоил человеческий инсулинк 4 2+ Zn , (ЫгВ29-тетрадеканоил человеческий инсулинк л -г 2+ 4Zn , (ЫгВ29-деканоил человеческий инсулин)є, 4 Zn , (ЫгВ29-додеканоил человеческий инсулинк 4 2+ Zn , (NSB29-TDHдеканоил Gl/ 1 2 1 человеческий инсул и н к 4 Zn +, ([\|гВ29.Тетрадеканоил Gl/ 1 2 1 человеческий инсулин)б, 4 Zn"+, (ЫгВ29-деканоил Gl/ 1 2 1 человеческий инсулинк 4ZnV, (ЫгВ29-додеканоил Gl/ 1 2 1 человеческий инсул и н к 4 Zn 2+ , (NsB29-TpHдеканоил Gl/ 1 2 1 Gln B3 человеческий инсулин)б, 4 Zn +, (N s B -тетрадеканоил G l / 2 1 Gln B3 человеческий инсулин)б, 4 Zn +, (N s B 2 -деканоил G l ^ 2 1 Gln B3 человеческий инсулин)б, 4 Zn" , (ЫгВ29-додеканоил Gl/ 1 2 1 Gln B3 человеческий инсулинк 4 Zn +, 19 45321 R9Q (N -тридеканоил Ala + лин)є, 4 Zn , s R9Q человеческий инсуД91 (N -тетрад еканои л Ala + сулин)б, 4 Zn , (N s s R9Q человеческий ин человеческий инсулин)є, Д91 (N -додеканоил Ala человеческий инсу2+ лин)б, 4 Zn , В29 A21 B3 (№ -тридеканоил Ala Gln человеческий 2+ инсулин)б, 4 Zn , s RvQ Д91 R^. (N -тетрад еканои л Ala Gin человече2+ ский инсулин)б, 4Zn , sB2 A21 B3 (N -деканоил Ala Gln человеческий ин2+ сулин)б, 4 Zn , В29 A21 B3 (№ -додеканоил Ala Gln человеческий 2+ инсулин)б, 4 Zn , (N sB 9-тридеканоил Gln B3 человеческий инсуинлин)б, 4 Zn +, (№В29-тетрад еканои л Gln B3 человеческий сулин)б, 4 Zn +, (N sB29 -fl еканои л Gln B3 человеческий инсулин)є, (№В29-додеканоил Gln B3 человеческий инсулин)б, 4 Zn 2+ , (NSB29-TDHдеканоил GluB3° человеческий инсулин)б, 4 Zn +, (NsB29-TeTpafl еканои л GluB3° человеческий инсулин)б, 4 Zn +, (Ns 29-деканоил GluB3° человеческий инсулин)б, 4 Zn 2+ , (№В29-додеканоил GluB3° человеческий инсулин)б, 4 Zn +, (NsB29-Tpnдеканоил Gl/* 21 GluB3° человеческий инсулин)б, 4 Zn 2+ , (N sB -тетрадеканоил G l / 2 1 GluB3° человеческий инсулин)б, 4Zn 2 + , (N s B 2 -деканоил Gl/* 21 GluB3° человеческий инсулин)б, 4 Zn 2+ , (Ns 29-додеканоил Gl/ 1 2 1 GluB3° человеческий инсулин)б, 4 Zn 2+ , sB 21 B3 B3 (N -тридеканоил + G l / Gln Glu ° челове2+ ческий инсулин)б, 4Zn , sB29 21 B3 B3 (N -TeTpafleKaHonn G l / Gln Glu ° человеческий инсулин)б, 4Zn 2 + , sB29 21 B3 B3 (N -fleKaHonn G l / Gln Glu ° человече2+ ский инсулин)б, 4Zn , ( ^ - д о д е к а н о и л G l / 2 1 Gln B3 GluB3° человеческий инсулин)б, 4Zn 2 + , (NsB29-Tpnдеканоил Ala A21 GluB3° человеческий инсулин)б, 4 Zn 2+ , (N sB -тетрадеканоил Ala A21 GluB3° человеческий инсулин)б, 4Zn 2 + , (N s B 2 -деканоил Ala A21 GluB3° человеческий инсулин)б, 4 Zn 2+ , (Ns 29-додеканоил Ala A21 GluB3° человеческий инсулин)б, 4 Zn 2+ , (N sB -тридеканоил+AlaA21 Gln B3 GluB3° человеческий инсулин)б, 4Zn 2 + , (NsB29-TeTpafleKaHonn Ala A21 Gln B3 GluB3° человеческий инсулин)б, 4Zn 2 + , (№В29-деканоил Ala A21 Gln B3 GluB3° человеческий инсулин)б, 4Zn 2 + , (NsB29-flOfleKaHonn Ala A21 Gln B3 GluB3° человеческий инсулин)б, 4Zn 2 + , R^. R^.n s (N -тридеканоил Gin 2+ инсулин)б, 4 Zn , s RvQ Glu R^. (N -тетрад еканои л Gin 2+ ский инсулин)б, 4Zn , роп Д91 -деканоил Ala R9Q 20 R9Q Д91 s s R9Q s R^.n Glu человече R^fl po (N -деканоил Gin 2+ сулин)є, 4 Zn , человеческий Glu человеческий ин R^. R^.n (N -додеканоил Gin Glu человеческий 2+ инсулин)б, 4 Zn , Краткое описание рисунков Настоящее изобретение более подробно иллюстрируется следующими рисунками Фиг 1 иллюстрирует конструкцию плазмиды рЕА5 3 2, Фиг 2 иллюстрирует плазмиду рЕА108, и Фиг 3 иллюстрирует плазмиду рЕА113 Терминология Три буквы кодов и одна буква кодов для аминокислотных остатков, используемых здесь, являются такими как установлено в In Biol Chem 243, р 3558(1968) В ДНК последовательностях, А - аденин, С - цитозин, G- - гуанин и Т - тимин Используют следующие акронимы ДМСО (DMSO) для диметилсульфоксида, ДМФ (DMF) для диметилформамида, БОК (Вое) для трет-бутоксикарбонила, ОФ-ЖХВР (RP-HPLC) для жидкостной хроматографии высокого разрешения с обращенной фазой, X-OSU представляет собой N-гидроксисукцинимид эфир, X - ацильная группа, и ТФК (TFA) для трифторуксусной кислоты Получение липофильных производных инсулина Предлагаемые производные инсулина могут быть получены так, как описано ниже 1 Инсулиновые производные, с аминокислотным остатком в положении ВЗО, который может быть кодирован генетическим кодом, например, треонин (человеческий инсулин) или (свиной инсулин) 1 1 Исходя из человечьего инсулина Человеческий инсулин обрабатывают Восреагентом (например, ди-третбутилдикарбонатом) с образованием (А1.В1)диВос человеческого инсулина, т е человеческого инсулина, в котором N-концевые концы обеих цепей защищены Вос-группой После необязательной очистки, например, с помощью ЖХВР, вводят ацильную группу в sаминогруппу LysB29, подвергая продукт взаимодействию с N-гидроксисукцинимид эфиром формулы X-OSU, в котором X есть ацильная группа, которую вводят На конечной стадии, для удаления Вос-групп используют ТФК, и продукт, NsB29-X человеческий инсулин, выделяют 1 2 Исходя из одноцепочечного предшественника инсулина Одноцепочечный предшественник инсулина, удлиненный в положении В1 удлинением (Ext), которое связано с В1 при помощи аргининового остатка и в котором мостик от ВЗО к А1 представляет собой аргининовый остаток, т е , соединение общей формулы Ext-Arg-B(1-30)-Arg-A(1-21), может быть использован в качестве исходного вещества При ацилировании этого исходного вещества N-гидроксисукцинимид эфиром общей формулы X-OSU, в котором X есть ацильная группа, вводят 21 45321 22 B29 Некоторые экспериментальные данные по ацильную группу X в s-аминогруппу Lys и в NsB29 N модифицированным инсулином даны в Табконцевую аминогруппу предшественника При облице 1 работке этого ацилированного предшественника sB29 формулы (N -X), X-Ext-Arg-B(1-30)-Arg-A(1-21) Липофильность производного инсулина относительно человеческого инсулина, к о т н , измеряют трипсином в смеси воды и подходящего смешина Lichrosorb ОФ18 (5мкм, 250 х 4мм) ЖХВР ковающегося с водой органического растворителя, лонке при изократическом элюировании при 40°С, например, ДМФ (DMF), ДМСО (DMSO) или низший sB29 используя смеси А) 0,1 М натрий фосфатного буспирт, получают интермедиат формулы (N -X), 31 фера, рН 7,3, содержащего 10% ацетонитрила, и Arg инсулин Обработка этого интермедиата В) 50% ацетонитрила в воде, в качестве элюентов карбоксипептидазой В дает требуемый продукт, sB29 Элюирование контролируют путем последующего (N -X) инсулин УФ поглощения элюата при 214нм Мертвое вре2 Производные инсулина без аминокислотномя, to, определяют путем инъецирования 0,1 мМ го остатка в положении ВЗО, т е , дез (ВЗО) инсунитрата натрия Время удерживания для человелины ческого инсулина, t4en, доводят, по крайней мере, 2 1 Исходя из человеческого инсулина или до 2 to, варьируя отношение между растворами А свиного инсулина И В Котн - Олроизв - to) / О^ел - to) При обработке карбоксипептидазой А в аммоСтепень пролонгирования гипогликемического нийном буфере, человеческий инсулин и свиной действия (понижение уровня глюкозы в крови) инсулин оба дают дез (ВЗО) инсулин После неизучают на кроликах Каждое производное инсуобязательной очистки, дез (ВЗО) инсулин обрабалина испытывают с помощью подкожной инъекции тывают Вос-реагентом (например, ди-трет12нмол их каждому из шести кроликов в испытабутилкарбонатом) с образованием (А1,В1)-диВос нии на замедление раз в день Отбор проб крови дез (ВЗО) инсулина, т е дез (ВЗО) инсулина, в кона анализ содержания глюкозы проводят до инътором N-концевые концы обеих цепей защищены екции и через 1, 2, 4 и 6 часов после инъекции Вос-группой После необязательной очистки, наНайденные значения глюкозы выражают как пропример, с помощью ЖХВР, вводят ацильную групцент от исходных значений Индекс замедления, B29 пу в s-аминогруппу Lys , подвергая продукт который рассчитывают из значений содержания взаимодействию с N-гидроксисукцинимид эфиром глюкозы в крови, представляет собой градуироформулы X-OSU, в котором X есть ацильная групванный Индекс замедления (пролонгации), смотри па, которую вводят На конечной стадии, для удар 211 Markussen et al , Protein Engineering, 1 ления Вос-групп используют ТФК, и продукт, (1987) 205-213 Кривая градуирована так, чтобы (NsB29-X) дез (ВЗО) инсулин, выделяют значение 100 соответствовало бычьему ультра2 2 Исходя из одноцепочечного предшественленте инсулину и значение 0 соответствовало ника человеческого инсулина инсулину Актрапид (ActrapidR) (Novo Nordisk A/S, Одноцепочечный предшественник человече2880 Bagsvaerd, Denmark) ского инсулина, который удлиняют в положении Производные инсулина, представленные в В1 удлинением (Ext), которое связано с В1 при таблице 1, вводят в растворах, содержащих 3 Zn 2 + помощи аргининового остатка и которое имеет на гексамер инсулина, за исключением производмостик от ВЗО к А1, может быть полезным исходных, специально оговоренных как несодержащих ным веществом Предпочтительно, мостик предZn ставляет собой пептид формулы Yn-Arg, где Yn Для сильно пролонгированных аналогов моявляется кодируемой аминокислотой, за исключедель кролика является неадекватной, поскольку нием лизина и аргинина, и есть нуль или целое уменьшение уровня глюкозы в крови от начальночисло между 1 и 35 Когда п>1, У-и могут обознаго слишком мало для того, чтобы установить инчать различные аминокислоты Предпочтительдекс замедления (пролонгирования) ными примерами мостика от ВЗО А1 являются Пролонгирование таких аналогов лучше хаAlaAlaArg, SerAspAspAlaArg и Arg (European Patent рактеризовать путем исчезновения дозы у свиней № 163529) Обработка такого предшественника Тбо% представляет собой время, когда 50% А14 Туг общей формулы Ext-Arg-B(1 -30)-Yn-Arg-A(1 -21) (1251) аналога исчезнет от места инъекции, измелизил эндопептидазой, например, Achromobaxter ряемого с помощью внешнего у-счетчика (Ribel, U lyticus протеазой, дает Ext-Arg-B(1-29)-Thr-Yn-ArgEt al , The Pig as a Model for Subcutaneous AbsorpА(1-21) дез (ВЗО) инсулин Ацилирование этого tion in Man In M Serrano-Rios and P J Lefebre интермедиата N-гидроксисукцинимид эфиром об(Eds) Diabetes 1985, Proceedings of the 12th Conщей формулы X-OSU, в котором X есть ацильная gress of the International Diabetes Federation, Maгруппа, вводит ацильную группу X в s-аминогруппу drid, Spam, 1985 (Excerpta Medica, Amsterdam LysB29, и в N-концевую аминогруппу А-цепи и В(1986)891-96) цепи с получением (NsB29-X) X-Ext-Arg-B(1-29) XВ Таблице 2 представлены Tso% значения ряThr-Yn-Arg-A(1-21) дез (ВЗО) инсулин Обработка да очень пролонгированных инсулиновых аналоэтого интермедиата трипсином в смеси воды подгов Аналоги вводили растворах, содержащий 3 ходящего органического растворителя, например, Zn 2 + на гексамер инсулина ДМФ (DMF) ДМСО (DMSO) или низший спирт, дает требуемое производное, (NsB29-X) дез (ВЗО) человеческий инсулин Данные по N s B 2 9 модифицированным инсулинам Таблица 1 Производное инсулина*1 Относительная липофильность ІЧєЬі!У-бензоил инсулин [\|гВ^у.фен ил ацетил инсулин (Znсвободный) ІЧ^^-циклогексилацетил инсулин ІЧ^^-циклогексилпропионил инсупин ІЧ^^-циклогексилвалероил инсулин ІЧ^^-октанол инсулин ІЧ^^-деканоил, дез (ВЗО) инсулин ІЧ^^-деканоил инсулин ІЧ^^-ундеканоил, дез (ВЗО) инсупин ІЧ^^-лауроил, дез (ВЗО) инсулин ІЧ^^-миристоил инсулин ІЧ^^-холоил инсулин ІчР^-дезоксихолоил инсулин (Znсвободный) ІЧ^^-литохолоил инсулин (Znсвободный) [\|гВ^у_4-бензоил-фенилаланил инсулин МгЬ2У-3,5-дииодотирозил инсулин [чр^-Ьтироксил инсулин Глюкоза в крови, % от исИндекс пролонгиходного рования 1ч 2ч 4ч 6ч 1,14 1,28 55,4 58,9 88,8 90,1 10 1,90 53,1 49,6 66,9 81,1 28 3,29 55,5 47,6 61,5 73,0 39 9,87 3,97 11,0 12,3 65,0 57,1 74,3 73,3 58,3 54,8 65,0 59,4 65,7 69,0 60,9 64,9 71,0 78,9 64,1 68,0 49 33 65 60 19,7 88,1 80,0 72,1 72,1 80 37,0 113 7,64 91,4 98,5 58,2 90,0 92,0 53,2 84,2 83,9 69,0 83,9 84,5 88,5 78 97 20 24,4 76,5 65,2 77,4 87,4 35 51,6 98,3 92,3 100,5 93,4 115 2,51 53,9 58,7 74,4 89,0 14 1,07 8,0 53,9 48,3 60,8 82,1 27 Таблица 2 Производное человеческого инсулина бООмкМ, 3 Zn^/гексамер, фенол 0,3%, глицерин 1,6% рН7,5 N s b 2 y деканоил дез (ВЗО) инсулин N s b 2 y ундеканоил дез (ВЗО) инсулин N s b 2 y лауроил дез (ВЗО) инсулин ІЧ^^тридеканоил дез (ВЗО) инсулин N s b 2 y миристоил дез (ВЗО) инсулин N s b 2 y пальмитоил дез (ВЗО) инсулин N s b 2 y сукцинимидомиристиновая кислота инсулин N s b 2 y миристоил инсулин Человеческий NPH Растворимость Растворимость всех N s B 2 9 модифицированных инсулинов, представленных в Таблице 1, которые содержат 3 Zn 2 + иона на гексамер инсулина, превышает 600нмол/мл в нейтральном (рН 7,5), водном, фармацевтическом составе, который дополнительно содержит 0,3% фенола в качестве консерванта, и 1,6% глицерина для достижения изотоничности 600нмол/мл является концентрацией человеческого инсулина, установленной в 100(М Е )/мл композиций, обычно используемых в клинических условиях S-B29 аминогруппа может быть компонентом амидной связи, сульфонамидной связи, карбамидом, тиокарбамидом, или карбаматом Липофильный заместитель, который несет S-B29 аминогруппа, может быть алкильной группой Фармацевтические композиции, содержащие Относительная гидрофоб- Подкожное исчезновение у ность свиней Котн 11,0 19,7 37 65 113 346 10,5 113 Т5о%, часы 5,6 6,9 10,1 12,9 13,8 12,4 13,6 11,9 10 производное человеческого инсулина согласно настоящему изобретению, могут быть введены пациентам парентерально, при необходимости такого лечения Парентеральное введение может быть осуществлено путем подкожной, внутримышечной или внутривенной инъекции с помощью шприца, произвольно с помощью шприца, подобного ручке Альтернативно, парентеральное введение может быть осуществлено при помощи инфузионного насоса Дополнительный выбор представляет собой композиция, которая может быть порошком или жидкостью для введения производного человеческого инсулина в форме назального аэрозоля Инъецируемые композиции человеческого инсулина данного изобретения можно получить, используя обычные методы фармацевтической индустрии, которая включает растворение и 25 45321 26 смешение ингредиентов, как целесообразно, с фат изомеразный ген (РОТ) для цели селекции получением требуемого продукта плазмиды и стабилизации Плазмида, содержащая РОТ-ген, доступна из депонированного Е Так, согласно одной методике, производное Coli штамма (АТСС 39685) Кроме того, плазмичеловеческого инсулина растворяют в количестды содержат S cerevisiae триозе фосфат изомеве воды, которое несколько меньше, чем конечразный промотор и терминатор (Ртрі и Ттрі) Они ный объем композиции, которую следует полуидентичны рМТ742 (Egel-Mitam, М , et al , Gene чить Добавляют изотонический агент, 73 (1988) 113-120) (смотри фиг 1), за исключениконсервант и буфер, как требуется, и доводят ем области, определяемой ECoR1-Xpa1 сайтами значение рН раствора - если необходимо - исрестрикции, окружающими кодирующую область пользуя кислоту, например, хлористоводородную сигнал /лидер/продукт кислоту, или основание, например, водный гидроксид натрия, при необходимости Наконец, Синтетические ДН^фрагменты синтезируют объем раствора доводят водой, получая требуена автоматическом синтезаторе ДНК (Applied мую концентрацию ингредиентов Biosystems модель 380А), используя фосфорамидитную химию и коммерчески доступные реаПримерами изотонических агентов являются генты (Beaucage, S L и Caruthers, М Н Tetraheхлорид натрия, манцит и глицерин dron Letters 22 (1981) 1859-1869) Примерами консервантов являются фенол, м-крезол, метил N-гидроксибензоат и бензилоВсе другие используемые способы и веществый спирт ва общеизвестны в данной области (смотри например, Sambrook, J , Fntsch, E F , Mamatis, T , Примерами подходящих буферов являются Molecular Cloning A Labontal Manual, Cold Spring ацетат натрия и фосфат натрия Harbor Laboratory Press, New York, 1989) Композицию для назального введения производного инсулина согласно данному изобретеАналитические методы нию можно, например, получить, как описано в Молекулярные массы полученных инсулинов Евр Пат №272097 (Novo Nordisk A/S) получены с помощью МС (MS) (массспектроскопии), либо с помощью метода ПДМС Композиции инсулина данного изобретения (PDMS) (масс-спектроскопия с помощью плазможно использовать при лечении диабета Уроменной десорбции) используя Bio-Ion 20 установвень оптимальной дозы для любого пациента ку (Bio-Ion Nordic AB, Uppsala, Sweden) или с побудет зависеть от ряда факторов, включая эфмощью ESMS (электро-распылительная массфективность применяемого конкретного произспектроскопия), используя API 111 Biomolecular водного человеческого инсулина, возраст, вес Mass Analyzer (Perkm-Elmer Science Instruments, тела, физическую активность, и диету пациента, Thornhill, Canada) от возможной комбинаций с другими лекарственными средствами, и тяжести случая диабета Пример 1 Рекомендуется, чтобы суточная доза производСинтез предшественника Ala A21 Asp B3 челоного человеческого инсулина данного изобретевеческого инсулина из дрожжевого штамма ния для каждого индивидуального пациента опуЕА002, используя L aC212spx3 сигнал/лидер ределялась специалистами данной области Синтезированы следующие олигонуклеотехники аналогичным путем, также как это делатиды ется для известных инсулиновых композиций Где целесообразно, производные человеческого инсулина данного изобретения могут быть использованы в смеси с другими типами инсулина, например, человеческого инсулина или свиного инсулина, или аналоги инсулина с более быстрым началом действия Примеры таких инсулиновых аналогов описаны, например, в заявках на Европейский патент, имеющих публикацию №№ ЕР 214826 (Novo Nordisk A/S), ЕР 375437 (Novo Nordisk A/S) и ЕР 383472 (Eh Lilly & Co) Данное изобретение более подробно иллюстрируется нижеследующими примерами, которые, однако, не следует рассматривать как ограничивающие объем его защиты Признаки, раскрытые в вышеприведенном описании и в нижеследующих примерах, как раздельно, так и в любом их сочетании, могут служить материалом для реализации изобретения в его разных формах Примеры Плазмиды и ДНК вещество Все плазмиды экспрессии представляют сРОТ тип Такие плазмиды описаны в заявке на ЕР патент № 171 142 и отличаются тем, что содержат Schizosaccharomyces pombe триозе фос Следующую Полимеразную Цепную Реакцию (PCR, ПЦР) проводят, используя Gene Amp PCR набор реагентов (Perkm Elmer, 761 Mam Avewalk, CT 06859, USA), согласно инструкциям производителя Во всех случаях, PCR смесь покрывают слоем ЮОмкл минерального масла (Sigma Chemical Co , St Louis, МО, USA) 2,5мкл олигонуклеотида #98 (2,5пмол) 2,5мкл олигонуклеотида #128 (2,5пмол) Юмкл 10Х PCR буфера 16мкл dNTP смеси 0,5мкл Taq фермента 58,5мкл воды Проводят один цикл 94°С в течение 45сек, 49°С в течение 1 мин , 72°С в течение 2мин Впоследствии, 5мкл олигонуклеотидов #16 и #126 добавляют и проводят 15 циклов 94°С в 27 45321 28 течение 45сек , 45°С в течение 1мин , 72°С в теальфа 1 (смотри SEQ LO NOS 17, 18 и 19) Векчение 1,5мин PCR смесь нагружают на 2,5% тор pKFN1627 показан на Фиг 1 агарозный гель и подвергают электрофорезу, рЕА5 3 расщепляют эндонуклеазами рестиспользуя стандартную технику (Sambrook, et al, рикции EcoRI и xbal изолируют образующийся Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory ДНК фрагмент длиной 412ор Дрожжевой вектор Press, 1989) Полученный фрагмент ДНК выреэкспрессии pKFN1627 расщепляют эндонуклеазают из агарозного геля и выделяют, используя зами рестрикции Ncol и xbal и с Ncol и EcoRI и Gene Clean набор (Вю 101 Inc , РО BOX 2284, La изолируют ДНК фрагмент длиной 9273Ьр из перJolla, CA 92038, USA) согласно инструкциям прового переваривания, и изолируют ДНК фрагмент изводителя Очищенный PCR ДНК фрагмент длиной 1644Ьр из второго переваривания Затем растворяют в Юмкл воды и буфера для эндонукEcoRI/Xbal фрагмент длиной 412Ьр лигируют с леазной рестрикции и расщепляют эндонуклеадвумя другими фрагментами, то есть Ncol/Xbal зами рестрикции Ncol и Xbal согласно стандартфрагмент длиной 9273Ьр и Ncol/EcoRI фрагмент ным техникам, проводимым на 2,5% агарозном длиной 1644Ьр, используя стандартные метогеле, и очищают, используя указанный Gene дики Clean набор Смесь лигирования трансформируют в Е coli как описано выше Плазмиду из образующейся Плазмида рАК188 состоит из ДНК последоЕ coli изолируют, используя стандартные метовательности длиной 412Ьр, включающей дики, и проверяют с помощью соответствующих EcoR1/Ncol фрагмент, кодирующий синтетичеэндонуклеаз рестрикции, т е EcoRI, xbal, Ncol, ский дрожжевой сигнал/лидер ген LaC212spx3 Нра I Как установлено с помощью анализа ДНК (описанный в Примере 3 WO 89/02463), за котопоследовательности (используя секвеназный рым следует синтетический Ncol/Xbal фрагмент, набор, как описано производителем, U S Bioкодирующий инсулиновый предшественник М15, chemical), отобранная плазмида содержит пракоторый имеет SerAspAspAlaLys мостик, связывильную последовательность ДНК предшественвающий В29 и А1 аминокислотные остатки ника Asp B3 человеческого инсулина и подлежит (смотри SEQ Ю №№ 14, 15 и 16), включенные в включению после ДНК, кодирующей LaC212spx3 EcoR1/Xbal фрагмент вектора (фагмида) сигнал/лидер ДНК Плазмиду обозначают pB1UESCR1PT 11sk (+/-) (Stratagene, USA) рЕА5 3 2 и она показана на Фиг 1 ДНК последоПлазмида рАК188 представлена на Фиг 1 вательность, кодирующая комплекс LaC212spx3 Плазмиду рАК188 также расщепляют эндосигнал/лидер/предшественник Ala A21 Asp B3 челонуклеазами рестрикции Ncol и Xbal и фрагмент веческого инсулина и его аминокислотная послевектора длиной 3139Ьр выделяют Два ДНК довательность, являются SEQ ID NOS 20, 21 и фрагмента лигируют вместе, используя Т4 ДНК 22 Плазмиду рЕА5 3 2 трансформируют в лигазу и стандартные условия (Sambrook, et al, S cerevisiae штамм МТ663, как описано в заявке Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory на ЕП, имеющей публикацию № 214826, и полуPress, 1989) Смесь лигирования трансформирученный штамм обозначают уЕА002 ют в компетентный Е coli штамм (R-, М+) с последующей селекцией на устойчивость к ампициллину Плазмиды изолируют из образовавшихся Е coli колоний, используя стандартную ДНК минипрепаративную технику (Sambrook, et al , Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), проверяя соответствующими эндонуклеазами рестрикции, т е EcoR1, Ncol, Xbal и Hpal Как показано с помощью ДНК секвенирования (Sequenase, U S Biochemical Corp), отобранная плазмида содержит правиль ную последовательность предшественника Ala , Asp человеческого инсулина, и ее обозначают рЕА5 3 Плазмида pKFN1627 представляет собой Е coli - S cerevisiae шаттл-вектор, идентичный плазмиде pKFN1003, описанный в ЕП № 375718, за исключением короткой ДНК последовательности против хода транскрипции от уникального Xbal сайта В pKFN1003, эта последовательность представляет собой фрагмент длиной 178Ьр, кодирующий синтетический апротининовый ген, слитый в рамке считывания (fused in-frame) с сигнал/лидер последовательностью дрожжевого спаривающего фактора альфа 1 В pKFN1627, соответствующая последовательность длиной 184Ьр кодирует инсулиновый предшественник М15 (Glu , GluB28) (те В(1-29, Glu B1 , GluB28)serAspAspAlaLys-A(1-21), слитый в рамке с последовательностью спаривающего фактора Пример 2 Синтез предшественника Ala A21 ThrB3 человеческого инсулина из дрожжевого штамма уЕА005, используя LaC212spx3 сигнал/лидер Синтезированы следующие олигонуклеотиды ДНК, кодирующую предшественник Ala ThrB3 человеческого инсулина, конструируют тем же самым способом, как описано для ДНК, кодирующей предшественник Ala A21 Asp B3 человеческого инсулина в Примере 1 ДНК последовательность, кодирующая комплекс LaC212spx3 сигнал/лидер/ предшественник Ala A21 ThrB3 человеческого инсулина и его аминокислотная последовательность, являются SEQ ID NOS 23, 24 и 25 Плазмида рЕА8 1 1 , как показано, содержит требуемую последовательность, трансформированную в S cerevisiae штамм МТ663, как описано в Примере 1 и полученный штамм обозначают 29 45321 yEA005 Синтезированы Пример 3 тиды 21 B3 Синтез предшественника Gl/* Asp человеческого инсулина из дрожжевого штамма уЕА007, используя LaC2125spx3 сигнал/лидер Синтезированы следующие олигонуклеотиды ДНК, кодирующую предшественник Asp человеческого инсулина, конструируют тем же самым способом, как описано для ДНК, кодирующей предшественник Ala A21 Asp B3 человеческого инсулина в Примере 1 ДНК последовательность, кодирующая комплекс LaC212spx3 сигнал/лидер/ предшественник Gl/* 21 Asp B3 человеческого инсулина и его аминокислотная последовательность, являются SEQ ID NOS 26, 27 и 28 Плазмида рЕА1 5 6 , как показано, содержит требуемую последовательность, трансформированную в S cerevisiae штамм МТ663, как описано в Примере 1 и полученный штамм обозначают уЕА007 Пример 4 Синтез предшественника Gl/* 21 ThrB3 человеческого инсулина из дрожжевого штамма уЕАООб, используя LaC212spx3 сигнал/лидер Синтезированы следующие олигонуклеотиды ДНК, кодирующую предшественник Тпг вз человеческого инсулина, конструируют тем же самым способом, как описано для ДНК, кодирующей предшественник А1аА21 и Asp B3 человеческого инсулина в Примере 1 ДНК последовательность, кодирующая комплекс LaC212spx3 сигнал/лидер/ предшественник Gl/* 21 ThrB3 человеческого инсулина и его аминокислотную последовательность, являются SEQ ID NOS 29, 30 и 31 Плазмида рЕА4 4 1 1 , как показано, содержит требуемую последовательность, трансформированную в в S cerevisiae штамм МТ663, как описано в Примере 1 и полученный штамм обозначают уЕАООб Пример 5 Синтез одноцепочечного предшественника Arg B1 Arg B31 человеческого инсулина, имеющего N-концевое удлинение (GluGluAlaGluAlaGluAlaArg) из дрожжевого штамма уЕА113, используя альфа фактор лидер 30 следующие олигонуклео Следующую Полимеразную Цепную Реакцию (PCR, ПЦР) проводят, используя Gene Amp PCR набор реагентов (Perkm Elmer, 761 Mam Avemalk, CT 06859, USA), согласно инструкциям производителя Во всех случаях, PCR смесь покрывают слоем ЮОмкл минерального масла (Sigma Chemical Co, St Louis, МО, USA) Плазмида рАК220 (которая идентична рАК188) состоит из ДНК последовательности длиной 412Ьр, кодирующей синтетический дрожжевой сигнал/лидер LaC212spx3 (описанный в Примере 3 WO 89/02463), за которым следует инсулиновый предшественник М15 (смотри SEQ ID NOS 14, 15 и 16), вставленный в вектор (фагмида) pBIUESCRIPT 11sk (+/-) (Stratagene, USA) 5мкл олигонуклеотида#220 (ЮОпмол) 5мкл олигонуклеотида#263 (ЮОпмол) Юмкл 10Х PCR буфера Юмкл dNTP смеси 0,5мкл Taq фермента 0,5мкл рАК220 плазмиды (идентичная рАК188) в качестве матрицы (0,2мкгДНК) 63мкл воды В общем осуществляют 16 циклов, причем каждый цикл включает 1 минуту при 95°С, 1 минуту при 40°С, и 2 минуты при 72°С Затем PCR смесь нагружают на 2% агарозныи гель и подвергают электрофорезу, используя стандартные техники Полученный фрагмент ДНК вырезают из агарозного геля и изолируют, используя Gene Clean набор (Вю 101 Inc , РО BOX 2284, La Jolla, СА 92038, USA) согласно инструкциям производителя Очищенный PCR ДНК фрагмент растворяют в Юмкл воды и буфера для эндонуклеазнои рестрикции и расщепляют эндонуклеазами рестрикции Hindi 11 и Xbal согласно стандартным техникам Hindi 11 /Xbal ДНК фрагмент, используя указанный Gene Clean набор Плазмида рАК406 состоит из ДНК последовательности длиной 520Ьр, включающей EcoRI/Hind111 фрагмент, полученный из рМТбЗб (описанный в WO 90/10075), кодирующий дрожжевой альфа фактор лидер и часть инсулинового предшественника, лигированный с Hindi 11/xbal фрагментом из рАК188, кодирующим остатком инсулинового предшественника М15 (смотри SEQ ID NOS 32, 33 и 34), вставленной в вектор сРОТ Вектор рАК406 показан на Фиг 2 Плазмида рАК233 состоит из ДНК последовательности длиной 412ор, кодирующей синтетический дрожжевой сигнал/лидер LaC212spx3 (описанный в Примере 3 WO 89/02463), за которой следует ген инсулинового предшественника B(1-29)-GluLysArg-A(1-21) (A21-Gly) (смотри SEQ 31 ID NOS 35, 36 и 37), вставленной в вектор сРОТ Плазмида рАК233 показана на Фиг 2 Плазмиду рАК233 расщепляют эндонуклеазами рестрикции Ncol и Xbal и фрагмент вектора длиной 9273Ьр изолируют Плазмиду рАК406 расщепляют эндонуклеазами рестрикции Ncol и Hindi 11 и фрагмент вектора длиной 2012Ьр изолируют Эти два ДНК фрагмента лигируют вместе с Hindi 11/xbal PCR фрагментом, используя Т4 ДНК лигазу и стандартные условия Затем смесь лигирования трансформируют в компетентный Е coli штамм (R-, М+) с последующей селекцией на устойчивость к ампициллину Плазмиды изолируют из полученных колоний, используя стандартную ДНК минипрепаративную технику и проверяют с помощью соответствующих эндонуклеаз рестрикции, т е EcoRI, xbal, Ncol и Hindi 11 Отобранная плазмида, как показано с помощью анализов по секвенированию последовательностей ДНК, содержит правильную последовательность для ДНК одноцепочечного предшественника АВ31 человеческого инсулина, и которая подлежит включению после ДНК, кодирующей S cerevisiae альфа фактор ДНК Плазмиду обозначают рЕА108 и она показана на Фиг 2 ДНК последовательность, кодирующая комплекс альфа фактор лидер/одноцепочечного предшественника Агд вз человеческого инсулина и его аминокислотная последовательность, являются SEQ ID NOS 38, 39 и 40 Плазмиду рЕА108 трансформируют в S cerevisiae штамм МТ663 как описано в Примере 1 и полученный штамм обозначают уЕА108 Следующую Полимеразную Цепную Реакцию (PCR, ПЦР) проводят, используя Gene Amp PCR набор реагентов (Perkm Elmer, 761 Mam Avemalk, CT 06859, USA), согласно инструкциям производителя Во всех случаях, PCR смесь покрывают слоем ЮОмкл минерального масла (Sigma Chemical Co , St Louis, МО, USA) 5мкл олигонуклеотида#220 (ЮОпмол) 5мкл олигонуклеотида#307 (ЮОпмол) Юмкл 10Х PCR буфера 16мкл dNTP смеси 0,5мкл Taq фермента 0,2мкл рЕА108 плазмиды в качестве матрицы (0,1мкгДНК) 63мкл воды В общем осуществляют 16 циклов, причем каждый цикл включает 1 минуту при 95°С, 1 минуту при 40°С, и 2 минуты при 72°С Затем PCR смесь нагружают на 2% агарозный гель и подвергают электрофорезу, используя стандартные техники Полученный фрагмент ДНК вырезают из агарозного геля и изолируют, используя Gene Clean набор (Вю 101 Inc, РО BOX 2284, La Jolla, CA 92038, USA) согласно инструкциям производителя Очищенный PCR ДНК фрагмент растворяют в Юмкл воды и буфера для эндонуклеазной рестрикции и расщепляют эндонуклеазами рестрикции Ncol и Xbal, согласно стандартным методикам Ncol/xbal ДНК фрагмент очищают, используя указанный Gene Clean набор Плазмида рАК401 состоит из ДНК последовательности длиной 523Ьр, включающей 45321 32 EcoRI/Ncol фрагмент, полученный из рМТбЗб (описанный в WO 90/10075) (сконструированный путем введения Ncol сайта на З'-конце альфа лидера с помощью сайт направленного мутагенеза), кодирующий альфа фактор лидер, с последующим Rcol/Xbal фрагментом из рАК188, кодирующим инсулиновый предшественник М15 (смотри SEQ ID NOS 41, 42 и 43), вставленная в вектор (фагмида) pBIUESCPIPT 11 sk (+/-) (Stratagene, USA) Плазмида рАК401 показана на Фиг 3 Плазмиду рАК401 расщепляют эндонуклеазами рестрикции Ncol и Xbal и фрагмент вектора длиной 3254Ьр изолируют и лигируют вместе с Ncol/Xbal PCR фрагментом Затем смесь лигирования трансформируют в компетентный Е coli штамм и плазмиды изолируют из полученных Е coli колоний, используя стандартную ДНК минипрепаративную технику и проверяют помощью соответствующих эндонуклеаз рестрикции, т е EcoRI, Xbal, Ncol Отобранную плазмиду, обозначенную р113А (показанную на Фиг 3), расщепляют EcoRI и xbal и фрагмент длиной 535Ьр изолируют Плазмиду рАК233 расщепляют эндонуклеазами рестрикции Ncol и Xbal, и EcoRI/Ncol и фрагменты длиной 9273 и 1644Ьр изолируют Эти два ДНК фрагмента лигируют вместе с EcoRI/Xbal фрагментом из р113А, используя Т4 ДНК лигазу и стандартные условия Затем смесь лигирования трансформируют в компетентный Е coli штамм (R-, М+) с последующей селекцией на устойчивость к ампициллину Плазмиды изолируют из полученных Е coli колоний, используя стандартную ДНК минипрепаративную технику и проверяют с помощью соответствующих эндонуклеаз рестрикции, т е EcoRI, xbal, Ncol и Hindi 11 Отобранная плазмида, как показано с помощью анализов по секвенированию последовательностей ДНК, содержит правильную последовательность ДНК одноцепочечного предшественника Arg B31 человеческого инсулина с Nконцевым удлинением GluGluAlaGluAlaGluAlaArg и которая подлежит включению после ДНК, кодирующей S cerevisiae альфа фактор ДНК Плазмиду обозначают рЕА113 и она показана на Фиг 3 ДНК последовательность, кодирующая (комплекс) альфа фактор лидер/одноцепочечного предшественника Arg B1 ArgB31 человеческого инсулина, имеющего N-концевое удлинение (GluGluAlaGluAlaGluAlaArg), и его аминокислотную последовательность, являются SEQ ID NOS 44, 45 и 46 Плазмиду рЕА113 трансформируют в S cerevisiae штамм МТ663 как описано в Примере 1 и полученный штамм обозначают уЕА113 Пример 6 Синтез одноцепочечного предшественника Arg B1 Arg B31 человеческого инсулина, имеющего N-концевое удлинение (GluGluAlaGluAlaGluAlaArg) из дрожжевого штамма уЕА136, используя альфа фактор лидер Синтезированы следующие олигонуклеотиды 33 45321 34 2+ Следующие ПЦР (PCR) осуществляют, ислин)б, 3 Zn пользуя Gene Amp PCR набор реагентов 400мг (А1, В1)-диВос человеческого инсулина растворяют в 2мл ДМСО (DMSO) К раствору 5мкл олигонуклеотида#220 (ЮОпмол) добавляют 748мкл смеси N-метилморфолина и 5мкл олигонуклеотида#389 (ЮОпмол) ДМСО (1 9, об/об) Реакцию проводят при 15°С и Юмкл 10Х PCR буфера инициируют путем добавления 14,6мг N16мкл dNTP смеси гидроксисукцинимид эфира бензойной кислоты, 0,5мкл Taq фермента растворенного в 132мкл ДМФ Реакцию останав2мкл рЕА113 плазмиды в качестве матрицы ливают через 2 часа путем добавления 100мл (0,5мкгДНК) ацетона, Осажденное вещество отделяют цен63мкл воды трифугированием и сушат в вакууме Собирают В общем осуществляют 12 циклов, причем 343мг вещества каждый цикл включает 1 минуту при 95°С, 1 минуту при 37°С, и 2 минуты при 72°С Вое защищающие группы элиминируют пуВ1 тем добавления 4мл ТФК Растворенное вещестДНК, кодирующую альфа фактор лидер/Агд 3 во инкубируют в течение 30 минут и затем осажArg одноцепочечный предшественник человедают путем добавления 50мл ацетона Осадок ческого инсулина, имеющий N-концевое удлинеотделяют центрифугированием и сушат в вакууние (GluGluAlaGluAlaGluAlaGluArg), конструируют ме тем же самым способом, как описано для ДНК кодирующей альфа фактор лидер/Arg 1 Агд вз №В29-бензоил человеческий инсулин очищаодноцепочечный предшественник человеческого ют с помощью ЖХВР с обращенной фазой, как инсулина, имеющий N-концевое удлинение описано в Примере 7 Получают 230мг вещества (GluGluAlaGluAlaGluAlaArg) в примере 5 ПлазПерекристаллизацией из 15% водного этанола, миду обозначают рЕА136 ДНК последовательсодержащего 6мМ Zn 2 + и 50мМ цитрата при рН B1 ность, кодирующая альфа фактор лидер/ Arg 5,5 получают кристаллы названного соединения, Arg B31 одноцепочечный предшественник человекоторые выделяют с помощью центрифугироваческого инсулина, имеющий N-концевое удлинения и сушат в вакууме Выход 190мг ние (GluGluAlaGluAlaGluAIGIuaArg), и его аминоМолекулярная масса, установленная с покислотная последовательность, являются SEQ Ю мощью МС 5911,теория 5911 NOS 47, 48 и 49 Плазмиду рЕА136 трансформиПример 9 руют в S cerevisiae штамм МТ663 как описано в поп Примере 1 и полученный штамм обозначают Синтез (Ns -литохолоил человеческий инуЕА136 сулин)б, 3 Zn + 400мг (А1, В1)-диВос человеческого инсулиПример 7 на растворяют в 2мл ДМСО (DMSO) К раствору Синтез (А1, В1)-диВос человеческого инсудобавляют 748мкл смеси N-метилморфолина и лина ДМСО (1 9, об/об) Реакцию проводят при 15°С и 5г свободного от цинка человеческого инсуинициируют путем добавления 31,94мг Nлина растворяют в 41,3мл ДМСО К раствору гидроксисукцинимид эфира литохолевой кислодобавляют 3,090мл уксусной кислоты Реакцию ты, растворенного в ЗООмкл ДМФ проводят при комнатной температуре и иницииРеакцию останавливают через 2 часа путем руют добавлением 565мг ди-трет-бутил пирокардобавления 100мл ацетона Осажденное вещебоната, растворенного в 5,650мл ДМСО Реакство отделяют центрифугированием и сушат в цию продолжается в течение 5 1/2 часов и затем вакууме Собирают 331мг вещества останавливают добавлением 250мл этаноламиВое защищающие группы элиминируют пуна Продукт осаждают добавлением 1500мл ацетем добавления 4мл ТФК Растворенное вещесттона Осадок отделяют центрифугированием и во инкубируют в течение 30 минут и затем осажсушат в вакууме Получают 6,85г вещества дают путем добавления 50мл ацетона Осадок (А1, В1)-диВос инсулин очищают с помощью отделяют центрифугированием и сушат в вакууЖХВР с обращенной фазой следующим образом ме Выход 376мг Неочищенный продукт растворяют в 100мл 25% №В29-литохолоил человеческий инсулин очиэтанола в воде, доводят рН до 3,0 с помощью щают с помощью ЖХВР с обращенной фазой, HCI и вводят в колонку (5см диаметром, 30см как описано в Примере 7 Получают 67мг вещевысотой), наполненную частицами октадецилдиства при чистоте 94% Перекристаллизацией из метилсилил-замещенного диоксида кремния 15% водного этанола, содержащего 6мМ Zn 2 + и (средний размер частиц 15мкм, размер пор ЮОА) 50мМ цитрата при рН 5,5 получают кристаллы и уравновешенную элюирующим буфером названного соединения, которые выделяют с Элюирование проводят, используя смеси этанопомощью центрифугирования и сушат в вакууме ла и 1мМ водного HCI, 0,ЗМ KCI при потоке 2л/ч Выход 49 мг Инсулин элюируют путем увеличения содержаМолекулярная масса, установленная с пония этанола от 30% до 45% Соответствующую мощью МС 6160, теория, 6166 фракцию разбавляют 20% этанолом и осаждают Пример 10 при рН 4,8 Осажденное вещество выделяют Синтез (Ns -деканоил человеческий инсуцентрифугированием и сушат в вакууме Таким лин)б, 3 Zn 2 + образом получают 1,701 г (А1, В1)-диВос челове400мг (А1, В1)-диВос человеческого инсулического инсулина при чистоте 94,5% на растворяют в 2мл ДМСО (DMSO) К раствору Пример 8 добавляют 748мкл смеси N-метилморфолина и Синтез (Ns -бензоил человеческий инсуДМСО (1 9, об/об) Реакцию проводят при 15°С и 35 45321 36 инициируют путем добавления 18,0мг NдиВос-дез (ВЗО) человеческий инсулин очищают гидроксисукцинимид эфира декановой кислоты, с помощью ЖХВР с обращенной фазой, как опирастворенного в 132мкл ДМФ Реакцию останавсано в Примере 7 ливают через 60 минут и продукт осаждают пуПример 13 поп s тем добавления 100мл ацетона Осажденное Синтез N -деканоил дез (ВЗО) человечевещество отделяют центрифугированием и суский инсулин шат в вакууме Собирают 420мг промежуточного 400мг (А1, В1)-диВос-дез (ВЗО) человеческопродукта го инсулина используют в качестве исходного Вое защищающие группы элиминируют пувещества для синтеза деканоил дез (ВЗО) челотем добавления 4мл ТФК Растворенное веществеческого инсулина, следуя методике, описанной во инкубируют в течение 30 минут и затем пров Примере 10 Неочищенный продукт осаждают дукт осаждают путем добавления 50мл ацетона ацетоном, сушат в вакууме и снимают защиту, Осадок отделяют центрифугированием и сушат в используя ТФК Полученный продукт осаждают sB29 вакууме Выход неочищенного продукта составацетоном и сушат в вакууме Затем N ляет 420мг Неочищенный продукт очищают с деканоил дез (ВЗО) человеческий инсулин очипомощью ЖХВР с обращенной фазой, как описащают с помощью ЖХВР с обращенной фазой, но в примере 7 Получают 254мг названного прокак описано в Примере 10 дукта Чистота составляет 96,1% ПерекристалМолекулярная масса, установленная с полизацией из 15% водного этанола, содержащего мощью МС 5866, теория 5861 2+ 6мМ Zn и 50мМ цитрата при рН 5,5 получают Пример 14 кристаллы названного соединения, которые выпоп Синтез Ns -додеканоил дез (ВЗО) человечеделяют с помощью центрифугирования и сушат в ского инсулина вакууме Выход составляет 217мг а Иммобилизация A lyticus протеазы Молекулярная масса, установленная с по13мг A lyticus протеазы, растворенной в 5мл мощью МС 5962, теория 5962 водного 0,2М НаНСОз буфере, рН 9,4, смешиваПример 11 ют с 4мл осажденного геля MimZeakR Medium, Синтез дез (ВЗО) человеческого инсулина который был промыт тем же самым буфером Синтез дез (ВЗО) человеческого инсулина (MimZeak представляет собой Сефарозу CL 6B, проводят как описано Markussen (Methods in diaактивированную дивинилсульфоном, получаеbetes research, Vol 1, Laboratory methods, part B, мую от Kem Entec, Copenhagen) Гель выдержи404-410 Ed J Lamer and S Phol, John Wiley & вают в суспензии при осторожном перемешиваSons, 1984) 5г человеческого инсулина раствонии в течение 24 часов при комнатной ряют в 500мл воды, в то время как значение рН температуре Затем, гель отделяют фильтрацираствора поддерживают при 2,6 путем добавлеей, промывают водой и суспендируют в 20мл 1М ния 0,5М серной кислоты Впоследствии, инсулиэтаноламинового буфера, рН 9,4, и выдерживают на высаливают путем добавления ЮОг сульфата в суспензии в течение 24 часов при комнатной аммония и осадок отделяют центрифугированитемпературе Наконец, гель промывают водой, а ем Осадок растворяют в 800мл 0,1М гидрокарзатем 0,1 М уксусной кислотой и хранят при 4°С боната аммония и значение рН раствора доводят Активность фермента в фильтрате составляла до 8,4 с помощью 1М аммиака 13% активности фермента в исходном растворе, 50мг бычьей карбоксипептидазы А суспендичто указывает на то, что выход реакции иммобируют в 25мл воды и отделяют центрифугировализации составляет около 87% нием Кристаллы суспендируют в 25мл воды и b Иммобилизация свиного трипсина добавляют 1М аммиак до тех пор пока не полуСвиной трипсин иммобилизуют на MimZeakR чат прозрачный раствор при конечном рН 10 Low до степени замещения 1мг на мл геля, исРаствор карбоксипептидазы добавляют к раствопользуя условия, описанные выше для иммобиру инсулина и проводят реакцию в течение 24 лизации А часов В качестве консерванта во время реакции с Синтез Glu(GluAla)3Arg-B(1-29), ThrArg-A(1добавляют несколько капель толуола 21) инсулина, используя иммобилизованную Через 24 часа дез (ВЗО) человеческий инсуA lyticus протеазу лин кристаллизуют путем постепенного добавлеК 200мг предшественника Glu(GluAla)sArgния 80г хлорида натрия при перемешивании расВ(1-29), ThrArg-A(1-21) одноцепочечного человетвора Затем значение рН доводят до 8,3 и ческого инсулина, растворенного в 20мл 0,1 М проводят кристаллизацию в течение 20 часов ІЧаНСОз буфере, рН 9,0, добавляют 4мл геля, при осторожном перемешивании Кристаллы отнесущего иммобилизованную A lyticus протеазу деляют на 1,2мкм фильтре, промывают 250мл После выдерживания геля в суспензии в реакциохлаждаемого льдом 2-пропанолом и, наконец, онной смеси в течение 6 часов при комнатной сушат в вакууме температуре, гидролиз заканчивают, получая Glu(GluAla)3Arg-B(1-29), ThrArg-A(1-21) человечеПример 12 ский инсулин (реакция прослеживается ЖХВР с Синтез (А1, В1)-диВос дез (ВЗО) человечеобращенной фазой) После гидролиза, гель удаского инсулина ляют фильтрацией К фильтрату добавляют 5мл Названное соединение синтезируют спосоэтанола и 15мкл 1М ZnCb и доводят рН до 5,0, бом, сходным со способом, описанным в Примеиспользуя HCI Осадок продукта формируется ре 7, используя в качестве исходного вещества при стоянии, на протяжении ночи при 4°С при дез (ВЗО) свиной инсулин Неочищенный продукт осторожном перемешивании Продукт отделяют осаждают ацетоном и сушат в вакууме (А1 ,В1) 37 45321 путем центрифугирования После одной промывки 1 мл охлаждаемого льдом 20% этанола и сушки в вакууме, выход составил 190мг d Синтез N"*1, N a B 1 , №В29-тридодеканоил Glu(GluAla)3ArgB(1-29), Thr-Arg-A(1-21) человеческого инсулина, используя N-гидроксисукцинимид эфир додекановой кислоты 190мг (ЗОмкмол) Glu(GluAla)3ArgB(1-29), ThrArg-A(1-21) инсулина растворяют в 1мл ДМСО и 1,05мл 0.572М раствора N,Nдиизопропилэтиламина в ДМФ Раствор охлаждают до 15°С и добавляют 36мг (120мкмол) Nгидроксисукцинимид эфира додекановой кислоты, растворенного в 0,6мл ДМСО Реакцию заканчивают в течение 24 часов Липофильное названное соединение не выделяют е Синтез №В29-додеканоил дез (ВЗО) инсулина Продукт предыдущейстадии d, содержащийся в приблизительно 2,65мл ДМСО/ДМФ/N.Nдиизопропилэтиламина, разбавляют 10,6мл 50мМ глицинового буфера, включающего 20% этанола, и рН доводят до 10 с помощью NaOH После стояния в течение 1 часа при комнатной температуре добавляют 1мл геля, несущего 1мг иммобилизованного трипсина на 1мл MimZeak геля Реакционную смесь осторожно перемешивают в течение 48 часов при комнатной температуре Для того, чтобы выделить требуемый продукт реакционную смесь подвергают хроматографированию на колонке ЖХВР с обращенной фазой (5см в диаметре, высотой 30см), наполненной частицами октадецилдиметилсилил-замещенного диоксида кремния (средний размер частицы 15мкм, размер пор ЮОА) Для элюирования используют 20мМ трис/НСІ буферы, доведенные до рН 7,7 и включающие повышающуюся концентрацию этанола от 40% до 44% (об/об), со скоростью 2000мл/ч Основной пик элюирования при около 43-4% этанола содержал название соединение Фракции, содержащие основной пик, объединяют, добавляют воду для уменьшения концентрации этанола до 20% (об/об), и рН доводят до 5,5 Раствор оставляют на ночь при -20°С, при этом продукт осаждается Осадок отделяют центрифугированием при -8°С и сушат в вакууме Выход названного соединения составляет 90мг Молекулярная масса, установленная с помощью МС 5892, теория 5890 Пример 15 поп Синтез Ns -(N-миристоил-а-глютамил) человеческого инсулина 500мг (А1,В1)-диВос человеческого инсулина растворяют в 2,5мл ДМСО и добавляют 428мкл этилдиизопропиламина, разбавленного 2,5мл ДМСО/ДМФ 1/1 (об/об) Температуру доводят до 15°С и добавляют 85мг N-MHpHCTOHn-Glu(OBnt) N-гидроксисукцинимид эфира, растворенного в 2,5мл ДМСО/ДМФ 1/1 (об/об) После ЗОмин реакционную смесь выливают в 60мл воды, рН доводят до 5 и осадок выделяют центрифугированием Осадок сушат в вакууме Высушенную реакционную смесь растворяют в 25мл ТФК, и раствор оставляют в течение 30 минут при комнат 38 ной температуре ТФК удаляют путем испарения в вакууме Гелеобразный остаток растворяют в 60мл воды и рН доводят до 11,2, используя концентрированный аммиак Названное соединение кристаллизуют из этого раствора путем доведения рН до 8,5, используя 6N HCI Продукт отделяют центрифугированием, один раз промывают 10мл воды, и сушат в вакууме Выход 356мг Чистота по данным ЖХВР 94% Продукт этого примера представляет собой человеческий инсулин, в котором s-аминогруппа Lys B29 имеет заместитель следующей структуры CH3(CH2)i2CONHCH(CH2CH2COOH)CO- Молекулярная масса, установленная с помощью МС 6146, теория 6148 Пример 16 поп Синтез Ns -ундеканоил дез (ВЗО) человеческого инсулина Названное соединение синтезируют аналоR9Q гично Ns -додеканоил дез (ВЗО) человеческому инсулину, как описано в Примере 14, используя N-гидроксисукцинимид эфир ундекановой кислоты вместо N-гидроксисукцинимид эфир додекановой кислоты Молекулярная масса, установленная с помощью МС 5876, теория 5876 Пример 17 поп Синтез Ns -тридеканоил дез (30) человеческого инсулина Названное соединение синтезируют аналоR9Q гично Ns -додеканоил дез (ВЗО) человеческому инсулину, как описано в Примере 14, используя N-гидроксисукцинимид эфир тридекановой кислоты вместо N-гидроксисукцинимид эфир додекановой кислоты Молекулярная масса, установленная с помощью МС 5899, теория 5904 Пример 18 Синтез Ns -миристоил дез (30) человеческого инсулина Названное соединение синтезируют аналогично №В29-додеканоил дез (ВЗО) человеческому инсулину, как описано в Примере 14, используя N-гидроксисукцинимид эфир миристиновой кислоты вместо N-гидроксисукцинимид эфир додекановой кислоты Молекулярная масса, установленная с помощью МС 5923, теория 5918 Пример 19 поп Синтез Ns -пальмитоил дез (30) человеческого инсулина Названное соединение синтезируют аналоR9Q гично Ns -додеканоил дез (ВЗО) человеческому инсулину, как описано в Примере 14, используя N-гидроксисукцинимид эфир пальмитиновой кислоты вместо N-гидроксисукцинимид эфир додекановой кислоты Молекулярная масса установленная с помощью МС 5944, теория 5946 Пример 20 роп Синтез Ns -субероил-О-тироксин человеческого инсулина а Получение ^(сукцинимидилсубероил)-Отироксина Дисукцинимидил суберат (1,0г, Pierce) растворяют в ДМФ (50мл), и добавляют D-тироксин (2,0г, Aldnch) при перемешивании при 20°С Тироксин медленно растворяется, и после 20 часов 39 45321 40 растворитель удаляют испарением в вакууме молекулярном сите) Добавляют сухой пиридин Маслянистый остаток кристаллизуют из 2(80мкл, Merck) и ди(І\І-сукцинимидил)карбонат пропанола, получая 0,6г N(1,8г, Fluka), и реакционную смесь перемешива(сукцинимидилсубероил)-О-тироксина, т пл 128ют в течение ночи при комнатной температуре 133°С Остаток после испарения очищают с помощью b Реакция (А1,В1)-диВос человеческого инфлеш хроматографии на силикагеле 60 (Merck), сулина с І\І-(сукцинимидилсубероил)-Ои рекристаллизуют из смеси 2тироксином пропанол/петролейный эфир (1/1) Выход мети(А1,В1)-диВос человеческий инсулин растволового эфира І\І-(сукцинимидилсукциноил)-аряют в сухом ДМФ (10мл) при добавлении триаминомиристиновой кислоты 0,1 Зг, т пл 64этиламина (20мкл) при комнатной температуре 66°С Затем, добавляют І\І-сукцинимидилсубероил)-Оb Взаимодействие (А1,В1)-диВос человечетироксин (80г) Реакцию контролируют с помоского инсулина с метиловым эфиром Nщью ЖХЗР с обращенной фазой, и когда реакция (сукцинимидилсукциноил)-а-аминомиристиновой завершается на около 90%, растворитель удакислоты ляют в вакууме К остатку после испарения, доРеакцию проводят как в Примере 20Ь , но исбавляют безводную трифторуксусную кислоту пользуя метиловый эфир N(5мл), и раствор выдерживают в течение 1 часа (сукцинимидилсукциноил)-а-аминомиристиновой при комнатной температуре После удаления кислоты (16мг) вместо Nтрифторуксусной кислоты в вакууме, остаток (сукцинимидилсубероил)-О-тироксина После растворяют в смеси 1М уксусной кислоты (5мл) и удаления трифторуксусной кислоты в вакууме, ацетонитрила (1,5мл), очищают при помощи преостаток после испарения обрабатывают 0,1 М паративной ЖХВР с обращенной фазой и обесгВ29 гидроксидом натрия при 0°С, омыляя метиловый соливают на PD-колонке Выход Ы -субероилэфир Когда омыление согласно контролю с поD-тироксин человеческого инсулина составляет мощью ЖХВР с обращенной фазой будет завер50мг шено, значение рН раствора доводят до 3, и расПродукт этого примера представляет собой твор лиофилизуют После очистки с помощью человеческий, инсулин, в котором s-аминогруппа препаративной ЖХВР с обращенной фазой и Lys B29 имеет заместитель следующей структуры обессоливания на PD-10 колонке, выход NsB29-(2Тирокс-СО(СЬІ2)бСО-, в котором Тирокс предсукциниламидо)миристиновая кислота человечеставляет тироксин, который связан с октандиоского инсулина составляет 39мг новой кислотной частью через амидную связь с Продукт этого примера представляет собой его а-аминогруппой Молекулярная масса, устачеловеческий инсулин, в котором s-аминогруппа новленная с помощью МС 6724, теория 6723 Lys B29 имеет заместитель следующей структуры Пример 21 CH3(CH2)iiCH(COOH)NHCOCH2CH2CO- Молекупоп лярная масса, установленная с помощью МС s Синтез N -(2-сукциниламидо)миристиновая 6130, теория 6133 кислота человеческого инсулина Пример 22 а Получение метилового эфира апоп аминомиристиновой кислоты, HCI Синтез N s -октилоксикарбонил человечеК метанолу (5мл, Merck) при -10°С, по каплям ского инсулина при энергичном перемешивании добавляют тиоСинтез проводят как в Примере 20Ь, но иснил хлорид (0,2мл, Aldnch) Затем, добавляют апользуя н-октилоксикарбонил Nаминомиристиновую кислоту (0,7г, полученную из гидроксисукцинимид (9мг, полученный из н-октил а-бромо кислоты путем взаимодействия с амхлороформиата (Aldnch) и Nмиаком Реакционную смесь перемешивают при гидроксисукцинимида), вместо Nкомнатной температуре в течение ночи, и затем (сукцинимидилсубероил)-О-тироксина Выход выпаривают досуха Неочищенный продукт (0,7г) МгВ29-октилоксикарбонил человеческого инсулина используют непосредственно в стадии b составил 86мг b Получение метилового эфира NПродукт этого примера представляет собой сукциноил-а-аминомиристиновой кислоты человеческий инсулин, в котором s-аминогруппа Метиловый эфир а-аминомиристиновой киLys B29 имеет заместитель следующей структуры слоты, HCI (0,7г) растворяют в хлороформе СН3(СН2)7ОСО(25мл, Merck) Добавляют триэтиламин (0,35мл, Молекулярная масса, установленная с поFluka), затем ангидрид янтарной кислоты (0,Зг, мощью МС 5960, теория 5964 Fluka) Реакционную смесь перемешивают при Пример 23 комнатной температуре в течение 2 часов, конСинтез NsB29-(2центрируют досуха, и остаток рекристаллизуют сукциниламидо)пальмитиновая кислота человеиз смеси этилацетат/петролейный эфир (1/1) ческого инсулина Выход 0,8г а Получение метилового эфира Nс Получение метилового эфира N(сукцинимидилсукциноил)-а(сукцинимидилсукциноил)-а-аминомиристиновой аминопальмитиновой кислоты кислоты Это соединение получают как описано в Метиловый эфир N-сукциноил-аПримере 21а -с , используя а-амино пальмитиноаминомиристиновой кислоты (0,8г) растворяют в вую кислоту вместо -амино миристиновой кисухом ДМФ (10мл, Merck, высушенный над 4А слоты 41 45321 42 b Взаимодействие (А1,В1)-диВос человечегидроксисукцинимидного эфира декановой кислоты Молекулярная масса, установленная с ского инсулина с метиловым эфиром Nпомощью МС 6536, теория 6538 (сукцинимидилсукциноил)-аПример 27 аминопальмитиновой кислоты поп s Реакцию проводят как в Примере 21 d , но исСинтез N -L-тироксил человеческого инсупользуя метиловый эфир Nлина (сукцинимидилсукциноил)-аСинтез проводят как в Примере 10, испольаминопальмитиновой кислоты вместо метиловозуя Boc-L-тироксин N-гидроксисукцинимидный го эфира г\І-(сукцинимидилсукциноил)-аэфир вместо N-гидроксисукцинимидного эфира sB29 аминомиристиновой кислоты, получая N -(2декановой кислоты Молекулярная масса, устасукциниламидо)пальмитиновая кислота человеновленная с помощью МС 6572, теория 6567 ческий инсулин Пример 28 Фармацевтическая композиция, включающая Продукт этого примера представляет собой В29 600нмол/мл № -деканоил дез (ВЗО) человечечеловеческий инсулин, в котором s-аминогруппа 2+ B29 ского инсулина, 1/3 Zn в растворе Lys имеет заместитель следующей структуры В29 № -деканоил дез (ВЗО) человеческий инсуCH3(CH2)i3CH(COOH)NHCOCH2CH2COлин (1,2мкмол) растворяют в воде (0,8мл) и знаПример 24 чение рН доводят до 7,5 путем добавления 0,2М Синтез Ns -(2-сукциниламидоэтилокси) гидроксида натрия Добавляют 0,01 М ацетата пальмитиновая кислота человеческого инсулина цинка (бОмкл) и раствор, содержащий 0,75% феа Получение метилового эфира Nнола и 4% глицерина (0,8мл) Значение рН рас(сукцинимидилсукциноил)-2-аминоэтилокси пальтвора доводят до 7,5, используя 0,2М гидроксида митиновой кислоты натрия и объем раствора доводят водой до 2мл Это соединение получают как описано в Полученный раствор стерилизуют фильтраПримере 21 а -с, используя 2-аминоэтилокси цией и асептически переносят в катридж или пупальмитиновую кислоту (синтезированную по зырек обычной методике, описанной R TenBrmk, J Org Пример 29 Chem 52 (1987) 418-422) вместо а-амино мириФармацевтическая композиция, включающая стиновой кислоты 600нмол/мл №В29-деканоил человеческого инсуb Взаимодействие (А1,В1)-диВос человечелина, 1/2 Zn 2 + в растворе ского инсулина с метиловым эфиром N1,2мкмол названного соединения растворяют (сукцинимидилсукциноил)-2в воде (0,8мл) и значение рН доводят до 7,5 пуаминоэтилоксипальмитиновой кислоты тем добавления 0,2М гидроксида натрия ДобавРеакцию проводят как в Примере 21 d , но исляют раствор, содержащий 0,75% фенола и пользуя метиловый эфир N1,75% хлорида натрия (0,8мл) Значение рН рас(сукцинимидилсукциноил)-2твора доводят до 7,5, используя 0,2М гидроксида аминоэтилоксипальмитиновой кислоты вместо натрия и объем раствора доводят водой до 2мл метилового эфира І\І-(сукцинимидилсукциноил)sB29 Полученный раствор стерилизуют фильтраа-аминомиристиновой кислоты, получая N -(2цией и асептически переносят в катридж или пусукциниламидоэтилокси) пальмитиновая кислота зырек человеческий инсулин Пример 30 Продукт этого примера представляет собой Фармацевтическая композиция, включающая человеческий инсулин, в котором s-аминогруппа В29 600нмол/мл № -литохолоил человеческого инLys B29 имеет заместитель следующей структуры сулина в растворе CH3(CH2)i3CH(COOH)NHCH2CH2OCOCH2CH2CO1,2мкмол названного соединения суспендиПример 25 руют в воде (0,8мл) и растворяют, доводя значеСинтез Ns -литохолоил-а-глутамил дез ние рН раствора до 8,5, используя 0,2М гидро(ВЗО) человеческого инсулина ксида натрия Затем к раствору добавляют 0,8мл Синтез проводят как в Примере 13, испольисходного для разведения раствора, содержащезуя a-N-гидроксисукцинимид эфир N-литохолоилго 0,75% крезола и 4% глицерина в воде Нако1-глутаминовой кислоты, у-трет-бутиловый эфир нец, значение рН снова доводят до 8,5, и объем вместо N-гидроксисукцинимидного эфира декараствора доводят водой до 2мл новой кислоты Полученный раствор стерилизуют фильтраПродукт этого примера представляет собой цией и асептически переносят в катридж или пудез (ВЗО) человеческий инсулин, в котором sзырек аминогруппа Lys B29 имеет заместитель следуюПеречень последовательностей щей структуры литохолоил(1) Общая информация NHCH(CH2CH2COOH)CO- Молекулярная масса, (і) Заявитель установленная с помощью МС 6194, теория (A) Название Hovo Nordisk A/S 6193 (B) Улица Novo Alle Пример 26 (C) Город DN-2880 Bagsvaerd s Синтез N -3,3',5,5'-тетраиодотироацетил (Е) Страна Дания человеческого инсулина (G) Телефон +45 44448888 Синтез проводят как в примере 10, используя (Н) Телефакс +45 44490555 N-гидроксисукцинимидный эфир 3,3',5,5'(I) Телекс 37173 тетраиодотироуксусной кислоты вместо N(м) Название изобретения Ацилированный 43 инсулин (їм) Число последовательностей 49 (IV) Адрес для переписки (A) Адресат Hovo Nordisk A/S Corporate Patents (B) Улица Hovo Alle (C) Город DN-2880 Bagsvaerd (E) Стана Дания (V) Читаемая компьютером форма (A) Тип накопителя Гибкий диск (B) Компьютер IBM PC совместимый (C) Операционная система PC-DOS/MS-DOS (D) Программное обеспечение Патентное издание #1 0, Версия #1 25 (VI) Данные текущей заявки (A) Номер заявки (B) Дата подачи (C) Классификация (VII) Данные приоритетной заявки (A) Номера заявок DK 1044/93 и US 08/190,829 (B) Даты подачи 09-сент-1993 и 02-февр1994 (VIM) Информация о патентной поверенном (А) Фамилия Jorgensen, Dan etal (C) Ссылочный регистрационный номер 3985 204-WO, DJ (їх) Телекоммуникационная информация (A) Телефон +45 44448888 (B) Телефакс +45 44493256 (2) Информация для SEQ ID NO 1 (і) Характеристики последовательности (A) Длина 21 аминокислота (B) Тип аминокислота (D) Топология линейная (и) Тип молекулы белок (xi) Описание последовательности SEQ ID N0 1 ik t 44 45321 Thr Ssr Z**ї ьІА -ІІ^И ILi 50 AAIATAMCG ATTAAAAGA ATG AQA TTT CCT TCA A7T ТП ACT &Ch GTT П А Met Arg Phe Pro Ser l i e Phe Thr A U ¥ a l Leu 1 5 10 160 GAT GAA ACU CCA CAA ATT CCG GCT GAA GCT DTC АТС GCT TAC TCA GAT Asp G I J T h r A U G i n H e Pru A U Glu A U V a l H e G l y T y r Ser А і з 30 35 «0 JOS 53 45321 54 (A) Длина 409 пар нуклеотидов (B) Тип нуклеиновая кислота (C) Число цепей одна (D) Топология линейная (и) Тип молекулы кДНК (їх) Признак (A) Название/ключ CDS (B) Положение 80 385 (xi) Описание последовательности SEQ Ю N0 35 (2) Информация для SEQ ID NO 33 (і) Характеристики последовательности (A) Длина 140 аминокислот (B) Тип аминокислота (D) Топология линейная (м) Тип молекулы белок (xi) Описание последовательности SEQ ID N0 33 Het кгэ Phe Pro Ser Пе Phe Thr A U Val Leu Pfie Ala Ala Ser Ser 1 5 10 Ї5 AU Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr 20 Thr Thr ulu Asp 25 GILJ Thr Ala Сіл ЗО Пе Pro Діа Glu Ala Vai Пе Gly Туг Ser Asp l e j Giu Ely Asp Phe 35 40 45 Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu 50 55 60 Phe l i e Asn Thr T h r 65 H e A l a Ser H e Ala A l a Lys G I J 61 U Gly 70 75 Val SQ Ser Leg Asp Lys ftrg Phe Val ftsn s i n His Leu Cys Gly SB* H I S Leu 85 SO 95 (2) Информация для SEQ ID NO 36 (i) Характеристики последовательности (A) Длина 102 аминокислоты (B) Тип аминокислота (D) Топология линейная (м) Тип молекулы белок (xi) Описание последовательности SEQ ID N0 36 ¥ a ! Giu A U Leu Т у г Leu Val Cys G i y G l u Arg E l y Phe Phe Т у г T h r 100 105 ПО Het Lys Ala Va5 Phe Leu Val Lej Ser Leu Па Gly Phe Cys Trp Ala 1 5 10 IS Pro Lys Ser Asp As? Ala Lys Gly He Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser US 120 125 Gin Pro Val Tbr Gly Asp Glu Ser Ser Val Glu He Pro Glu Glu Ser го 25 30 Па Cys Ser Lau Туг G)n Leu 61 u Asn Tyr Cys Asn 130 135 HO Leu l i e He Ala Glu Asn Thr Thr Leu AU Asn Val Ala Het Ala Lys 36 40 45 (2) Информация для SEQ ID NO 34 (i) Характеристики последовательности (A) Длина 523 пар нуклеотидов (B) Тип нуклеиновая кислота (C) Число цепей одна (D) Топология линейная (и) Тип молекулы ДНК (xi) Описание последовательности SEQ ID N0 34 TSGCTTMGu Ї А Ш Т С Т Т Л ТСААОТПЕТ TCTTCTMTG Г Л Е А Т А й Г Т АМЕТДГКТС 60 TTATATTTGC Т Ш Т П С Т Т ACKTSAAGa АЯ5ГТААА.« Г З А С Й С Ш і АТАДЕССТСК 120 TftGUAGGCGr MTCfiACGAG GTCAETTGTG ATGTTeTCTT CTACTTTGCC GTGITTAAGG 130 CtGSCTICGA CAGTAGCCAA TGASTCTMA ТСТІССССТЯ- АДССТАСМС GACAAAACGS 240 TAAAAGSITG TCGIGITTftT TGCCCAATAA CA.AATAITTA TGATEAIAAC GGTCGTAACG 3C0 СТТССССАТД GWACCTATT С Т С Ї Ш Ш ПЕОТТЙТОА ACACGCCAAG 3S0 ACCATTTCTT AGTGAACCAA CTTCGAAACA ТСДАССАЯЙС ACCSCTTTJT CCAMGAAGA ISTGAGGTTT ZZ3 CSGACTGCTG CGATICCCAT 4SQ ACCWTTBT TAC'JiCAIGA Д Ш Д С Д С А А GAAACATGGT (2) Информация для SEQ ID NO 35 (і) Характеристики последовательности Arg Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu A U Leu 50 Туг Leu Val Cys Gly 65 Arg Sly lie Vs! Glu 8S Leu Glu Asn Tyr Cys І00 E5 60 Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Glu Lys 70 75 30 Gin cys Cys Tfr Ser П е Cys Ser Leu Tyr Gin 90 95 Gly (2) Информация для SEQ ID NO 37 55 45321 56 Met Агэ Phe Pro Ser l i e Phe Thr діа Val Leu Phe A)a Ala Ser Ser I S 10 15 Ala Leu A U ftla Pro Val Asn Thr Thr Thr £1u Asp Giu Thr A U Gin 20 25 30 П е Pro Ala Giu Ala Vat H e Giy Туг Ser Asp Leu GIU GJy ftsp Phe 35 40 45 та Asp Yal Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu 1 50 55 63 5 «с Phe l i e Asn Thr Thr П е Ala Ser l i e A U Ala Lys Gin Elu Gly Val 65 70 73 80 Ser Met A U Lys Arg phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu 85 90 95 Val Glu Ala Leu Туг Leu Val Cys Gly Glu Дгд Gly Phe Phe Tyr Thr 100 IDS ПО Pro Lys Thr Arg Gly He Val Elu Gin Cys Cys Thr Ser He Cys Ser US 120 Ш Leu Туг Gin Leu Glu Asn Туг Cys Asn 130 135 (2) Информация для SEQ ID NO 38 (і) Характеристики последовательности (A) Длина 511 пар нуклеотидов (B) Тип нуклеиновая кислота (C) Число цепей одна (D) Топология линейная (м) Тип молекулы кДНК (їх) Признак (A) Название/ключ CDS (B) Положение 77 487 (xi) Описание последовательности SEQ ID N0 38 ^ Ш А э ttm fur in (2) Информация для SEQ ID NO 40 (i) Характеристики последовательности (A) Длина 511 пар нуклеотидов (B) Тип нуклеиновая кислота (C) Число цепей одна (D) Топология линейная (м) Тип молекулы ДНК (xi) Описание последовательности SEQ ID NO40 Лї* Гщ ТИ ' S 3 k% Ыч it, £&,£ & 1 І' ** nc 1|. S|i Cln її? Ж Ifi, (2) Информация для SEQ ID NO 39 (і) Характеристики последовательности (A) Длина 137 аминокислот (B) Тип аминокислота (D) Топология линейная (м) Тип молекулы белок (xi) Описание последовательности SEQ ID N0 39 (2) Информация для SEQ ID NO 41 (і) Характеристики последовательности (A) Длина 523 пар нуклеотидов (B) Тип нуклеиновая кислота (C) Число цепей одна (D) Топология линейная (м) Тип молекулы кДНК (їх) Признак (A) Название/ключ CDS (B) Положение 80 499 (xi) Описание последовательности SEQ ID N0 41 57 45321 1 1 U ^ 1 ! ^ 1 1 ^ ' i l l ; J3X.^ ^^іГ тле тес (2) Информация для SEQ ID NO 42 (і) Характеристики последовательности (A) Длина 140 аминокислот (B) Тип аминокислота (D) Топология линейная (м) Тип молекулы белок (xi) Описание последовательности SEQ Ю N0 42 (2) Информация для SEQ ID NO 43 (і) Характеристики последовательности (A) Длина 523 пар нуклеотидов (B) Тип нуклеиновая кислота (C) Число цепей одна (D) Топология линейная (м) Тип молекулы ДНК (xi) Описание последовательности SEQ ID N0 43 58 (2) Информация для SEQ ID NO 44 (i) Характеристики последовательности (A) Длина 535 пар нуклеотидов (B) Тип нуклеиновая кислота (C) Число цепей одна (D) Топология линейная (м) Тип молекулы кДНК (їх) Признак (A) Название/ключ CDS (B) Положение 77 511 (xi) Описание последовательности SEQ ID N0 44 Jf- її? ЇД (2) Информация для SEQ ID NO 45 (і) Характеристики последовательности (A) Длина 145 аминокислот (B) Тип аминокислота (D) Топология линейная (м) Тип молекулы белок (xi) Описание последовательности SEQ Ю N0 45 59 1 i! » f*j 60 45321 ^Vf *sSi iS-Uf flsT # | Г ASH H l j f « І Н s •? i f >. (2) Информация для SEQ ID NO 46 (і) Хараісгеристики последовательности (A) Длина 535 пар нуклеотидов (B) Тип нуклеиновая кислота (C) Число цепей одна (D) Топология линейная (и) Тип молекулы ДНК (xi) Описание последовательности SEQ ID N0 46 CTTAAGGTAA GTTCTTATCA АйТТТСПСТ T C T M I G T T T СДТДСІТААА GTATGTSnft GO T A T T T G C I M TTTTCTTACT CTAMGGWG TTAWAATGA CGTCAAftATA AGCGTCSTftG ISO GAGGCSTMT CGACGAGGTC AETTGTGATE T ГТСТА CTTTGCCGTG TTTAAGGCCG 1Є0 CTACAACGAC AAAACGGTAA 210 MGGTTGTCG TCTTTATTQC ССААЇААСДА АТАТТТАТЕД TGATAACGGT CGTAACGACG 300 ДІТТСТТСТТ CCCCATAGGT ACCGATTCTC TCTTCTTCGA CTTCGACTIC GATCIASGCA 3S0 ATTGGTTGTG AACACGCDAA GGGTGMCCA ACTTCGAAAC ATGAACCAAA CACCACTTTC «0 TCCAAAGAAG AIGTGAGGTT TCTCATCTCC АТАССААСТГ GTTACMCAT GAAGATASAC ISO AAGAAACATG GTTAACCTTT IGATGACGTT GATCTGCGTC GGGCGTCCGA GAICT S35 ACTTCGACAG T A G C C A A T G A S T C T A A A T C T I.-.CTAAAG (2) Информация для SEQ ID NO 47 (i) Характеристики последовательности (A) Длина 538 пар нуклеотидов (B) Тип нуклеиновая кислота (C) Число цепей одна (D) Топология линейная (м) Тип молекулы кДНК (їх) Признак (A) Название/ключ CDS (B) Положение 77 514 (xi) Описание последовательности SEQ ID N0 47 (2) Информация для SEQ ID NO 48 (і) Характеристики последовательности (A) Длина 146 аминокислот (B) Тип аминокислота (D) Топология линейная (м) Тип молекулы белок (xi) Описание последовательности SEQ ID N0 48 Het Arg PhE Pro Ser Пе Phe Thr Ala Va] leu Phe Ala Ala Ser Ser 1 5 10 15 Ala leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp 61 u Thr Ala Gin 20 25 30 H e Pro Ala Glu Ala Val He Ely Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe 35 SO 45 Asp Val A l a V a l Leu Pro Phe Ser Asn Ser T h r Asn Asn G l y L E U Leu SO 55 60 Phe H e Asn T h r T n r H e A l a Ser H e A l a A U Lys G l u G5u G l y Val GS 70 75 80 Ser Het A U Ш Arg Glu fit и Ala Glu Ala Glu Ala Glu ftrg Phe Val S5 90 95 Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Туг Leu Val 100 105 UO Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Gly H e Val US 120 125 Glu Gin Cys Cys Thr Ser He Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Ely Asn Tyr 130 135 140 Cys Asn 145 (2) Информация для SEQ ID NO 49 (i) Характеристики последовательности (A) Длина 538 пар нуклеотидов (B) Тип нуклеиновая кислота (C) Число цепей одна (D) Топология линейная (и) Тип молекулы ДНК (xi) Описание последовательности SEQ ID N0 49