Спосіб вироблення молочної кислоти

1. Спосіб вироблення молочної кислоти, що включає у себе: a) надання Кребтрі-негативного мікроорганізму, вибраного з групи, що складається з Kluyveromyces, Pichia та Hansenula, який проявляє інгібування споживання кисню при культивуванні в аеробних умовах через наявність високої концентрації глюкози та трансформацією хоча б одного екзогеназного гена, що кодує лактатдегідрогеназу; b) культивування Кребтрі-негативного мікроорганізму у першому культуральному середовищі, яке містить джерело вуглецю, включаючи глюкозу, та у перших аеробних умовах культивування, які стимулюють клітинне дихання, і c) подальше культивування Кребтрі-негативного мікроорганізму у культуральному середовищі, яке містить джерело вуглецю, включаючи глюкозу, у других анаеробних умовах культивування, що стимулюють вироблення молочної кислоти. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що другі умови культивування включають у себе інгібітор клітинного дихання. 3. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що вміст розчиненого кисню у першому культуральному середовищі складає принаймні 20 % відносно його кількості за насичених умов культивування у повітрі при атмосферному тиску. 2 (19) 1 3 77386 4 ному середовищі складає більше ніж 20 % відносвищі складає менше ніж 2,0 % відносно його кільно його кількості за насичених умов культивування кості за насичених умов культивування у повітрі у повітрі при атмосферному тиску та вміст розчипри атмосферному тиску. неного кисню у другому культуральному середо Винахід стосується способів і матеріалів, які застосовуються у виробництві органічних продуктів. У промисловості широке застосування знаходять такі органічні продукти, як молочна кислота. Органічні кислоти можуть використовуватися, наприклад, у синтезі пластмас та інших продуктів. Для задоволення зростаючих з кожним днем потреб в органічних продуктах ведеться безперервний пошук все більш ефективних і економічних способів їх вироблення. В одному з таких способів для одержання органічних продуктів використовуються бактерії. Відомо, що певні бактерії за певних умов ферментації можуть виробляти великі кількості органічних продуктів. Проте використання живих бактерій у якості фабрик обмежується здатністю цих бактерій рости в умовах нагромадження органічного продукту в живильному середовищі. Для подолання цього обмеження застосовувалися найрізноманітніші способи очищення продукту в процесі його синтезу. Крім того, робилися спроби застосовувати інші мікроорганізми, що не є бактеріями. Дійсно, Saccharomyces cerevisiae, відома своєю кислотостійкістю, була піддана генетичній модифікації у спробі застосування її для вироблення молочної кислоти. Зокрема, клітини S. cerevisiae модифікувалися шляхом піддавання їх дії бичачої лактатдегідрогеназної ДНК і дезінтегрування ендогенних піруватдекарбоксилазних генів (PDC1, PDC5 і PDC6). Хоча модифіковані клітини S. cerevisiae і виробляли молочну кислоту, ріст цих клітин був пригнічений, вказуючи на те, що як ріст клітин, так і вироблення молочної кислоти потребує поліпшення. В цілому даний винахід стосується способів і матеріалів для вироблення органічних продуктів. Зокрема, винаходом пропонуються дріжджові клітини, способи культивування дріжджових клітин, способи одержання дріжджових клітин, конструкцій нуклеїнових кислот, а також способи і матеріали для виготовлення різноманітних органічних продуктів. Винахід грунтується на тому виявленому авторами факті, що деякими мікроорганізмами (наприклад, бактеріальними або грибковими) можна керувати за допомогою генетичних засобів і надавати їм таким шляхом спроможності за певних умов культивування рости із найрізноманітніших вуглецевих джерел і давати найрізноманітнішу продукцію, у тому числі органічні продукти у промислових масштабах. Наприклад, запропоновані дріжджові клітини можуть рости і давати органічну продукцію при культивуванні їх в умовах низького рН і високої температури. Здатність до швидкого росту і високоефективного вироблення органічної продукції в умовах, наприклад, низького рН і високої температури є особливо корисною. Зокрема, здатність мікроорганізму переносити низький рН дозволяє уникнути необхідності підтримувати середовище з нейтральним рН, що може бути важким і дорогим при здійсненні промислових процесів. Крім того, способи і матеріали, що дозволяють одержувати потрібний органічний продукт із живильного середовища з низьким рН, можуть стати більш практичними й ефективними, ніж ті, що застосовуються для одержання того ж органічного продукту, але із живильного середовища, що має більш нейтральний рН. Наприклад, деякі органічні кислоти можуть преципітувати із розчину з рН, що падає нижче рівня рКа продукту, значно спрощуючи тим самим виробничий процес. Що ж до спроможності мікроорганізму витримувати високі температури, то вона, ця спроможність, дозволяє уникнути необхідності підтримувати низькотемпературні умови на стадіях росту мікроорганізму і вироблення продукту. Зрозуміло, що зменшення потреби у підтриманні низьких температур у резервуарах із живильним середовищем великої ємності дозволяє весь процес зробити більш ефективним і менш дорогим. Крім того, здатність мікроорганізму переносити як низькі рН, так і високі температури дає у розпорядження зручний спосіб запобігання забрудненню робочого середовища іншими, менш стійкими мікроорганізмами в промислових процесах. Слід зауважити, що суттєвою ознакою, що стосується здатності до промислового вироблення бажаного органічного продукту може бути питома продуктивність, за якої цей органічний продукт виробляється. Наприклад, забезпечення високої питомої продуктивності за допомогою описаних тут способів і матеріалів може дозволити мікроорганізму генерувати енергію, потрібну для культивування клітин у даних умовах культурного середовища - низького рН і високої температури. Генерування такої енергії може здійснюватися шляхом ферментації у практично анаеробних умовах, відмовляючись, таким чином, від генерування енергії респіраторним шляхом. Отримання потрібної енергії ферментаційним шляхом є особливо вигідним, коли процес вироблення органічного продукту не потребує респіраторного шляху, оскільки це дозволяє для одержання бажаного органічного продукту використовувати практично будьяке відповідне джерело вуглецю, що є у розпорядженні. Іншим підґрунтям для даного винаходу є те, що використання джерела вуглецю певними генетично регульованими мікроорганізмами може регулюватися і спрямовуватися переважним чином на вироблення чи то біомаси, чи то цільового органічного продукту. Взагалі кажучи, даним винаходом охоплюються два типи процесів культивування: в одному залучається культивування мікроорганізмів у специфічних умовах, де залежно 5 77386 6 від застосовуваного мікроорганізму і бажаного активністю. Така клітина може виробляти вуглевиходу стимулюється продукування біомаси, а в вод, наприклад, D-ксилозу як органічний продукт. іншому, за інших умов культивування, залежно Ще в одному варіанті здійснення винаходу клітакож від застосовуваного мікроорганізму і бажатина містить шість екзогенних молекул нуклеїнової ного виходу стимулюється продукування цільового кислоти, кожна з яких кодує свій поліпептид, що органічного продукту. Ясно, що можливість керувідрізняється від інших. Наприклад, перша з шести вати використанням джерела вуглецю у великомаекзогенних молекул нуклеїнової кислоти може косштабному промисловому виробничому процесі дувати перший поліпептид, що має 2,5робить останній більш гнучким і більш керованим, діоксовалератдегідрогеназну активність, друга ніж до сих пір. молекула може кодувати другий поліпептид, що Крім того, винахід базується на тому спостемає 5-дегідро-4-деокси-D-глюкаратдегідрогеназну реженні, що певними мікроорганізмами можна кеактивність, третя молекула може кодувати третій рувати генетичними засобами так, що майже все, поліпептид, що має глюкаратдегідратазну активякщо не цілком все, джерело вуглецю використоність, четверта молекула може кодувати четвервується для вироблення біомаси або бажаного тий поліпептид, що має альдегіддегідрогеназну органічного продукту. Зокрема винаходом пропоактивність, п'ята молекула може кодувати п'ятий нуються дріжджові клітини, модифіковані таким поліпептид, що має глюкуронолактонредуктазну чином, щоб інактивувати шляхи біосинтезу, які активність, і нарешті шоста молекула може кодувідхиляють використання джерела вуглецю від вати шостий поліпептид, що має Lвироблення біомаси або бажаного органічного гулонолактоноксидазну активність. Продуктом діяпродукту. Інактивація таких шляхів біосинтезу дає льності такої клітини може бути вітамін, напримікроорганізми, які можуть ефективно рости і виклад, L-аскорбат як органічний продукт. робляти бажаний продукт. Органічний продукт може містити більше трьох Взагалі предметом даного винаходу є дріжатомів вуглецю і може бути, наприклад, амінокисджові клітини, які містять екзогенну молекулу нуклотою. леїнової кислоти, яка кодує поліпептид з ферменВ іншому варіанті здійснення винаходу клітина тативною активністю в клітині. Ця нуклеїнова здатна на катаболічне перетворення пентозного кислота може бути включеною в геном клітини. джерела вуглецю, такого як рібоза, арабіноза, ксиФерментативна активність приводить до створенлоза і ліксоза. ня органічного продукту, який в деяких варіантах Можливий також варіант, в якому клітина має здійснення винаходу секретується з клітини. Ця знижену піруватдекарбоксилазну активність або клітина має негативний фенотип дикої яблуні і знижену алкогольдегідрогеназну активність. Клітивиробляє органічний продукт. Така клітина може на може навіть зовсім не мати піруватдекарбоксипоходити, наприклад, з роду Kluyveromyces, Pichia, лазної активності. Знижена піруватдекарбоксилазHansenula, Candida, Trichosporon або на активність може бути наслідком Yamadazyma. Органічним продуктом може бути, дезінтегрування генетичного локусу, який у норнаприклад, продукт ферментації, продукт переромальному стані має послідовність нуклеїнової кисбки пірувату, органічна кислота або карбоксилат, лоти, що кодує піруватдекарбоксилазу. В альтернаприклад, лактат. В одному з варіантів здійсненнативному випадку клітина може містити молекулу ня винаходу поліпептид може мати лактатдегідро«проти сенсу», наприклад, рібозиму, яка відповігеназну активність. Наприклад, екзогенна нуклеїдає послідовності ендогенної нуклеїнової кислоти, нова кислота може кодувати бактеріальну або де ця молекула знижує піруватдекарбоксилазну грибкову лактатдегідрогеназу, наприклад, грибкову активність. Клітина може також містити додаткову лактатдегідрогеназу К. lactis. молекулу екзогенної нуклеїнової кислоти, яка діє В іншому варіанті здійснення згадана клітина як плазміда-кілер. містить чотири екзогенні молекули нуклеїнової В іншому варіанті здійснення ферментативна кислоти, які кодують різні поліпептиди. Наприклад, активність поліпептиду, кодованого екзогенною перша з цих чотирьох екзогенних молекул нуклеїнуклеїновою кислотою, приводить до створення нової кислоти може кодувати перший поліпептид, органічного продукту шляхом споживання NADH. що має лактатдегідрогеназну активність, друга Можливий також варіант, в якому клітина вимолекула може кодувати другий поліпептид, що робляє принаймні 60г органічного продукту на комає СоА-трансферазну активність, третя може жні 100г споживаної глюкози за умов культивуванкодувати третій поліпептид, що має лактил-СоАня, які є оптимальними для вироблення дегідратазну активність, і нарешті четверта може органічного продукту. кодувати четвертий поліпептид, що має акрилілЗгідно з іншою ознакою даного винаходу проСоА-гідратазну активність. Карбоксилатним продупонується клітина, наприклад, дріжджова, яка місктом діяльності такої клітини може бути акрилат. В тить екзогенну молекулу нуклеїнової кислоти, котальтернативному варіанті перша з чотирьох екзора кодує поліпептид, що стимулює катаболічне генних молекул нуклеїнової кислоти може кодуваперетворення пентозного джерела вуглецю цією ти перший поліпептид з 2-дегідро-3-деокси-Dклітиною. Таким поліпептидом може бути, наприпентаноатальдолазною активністю, друга молекуклад, ксилозоредуктаза, ксилітолдегідрогеназа або ла може кодувати другий поліпептид з ксилонатдексилулокіназа, а пентозним джерелом вуглецю гідратазною активністю, третя молекула може коможе бути, наприклад, рібоза, арабіноза, ксилоза і дувати третій поліпептид з ксилонолактоназною ліксоза. Клітина може також піддавати катаболічактивністю і четверта молекула може кодувати ному перетворенню гексозу і, якщо потрібно, водчетвертий поліпептид з D-ксилозодегідрогеназною ночас катаболічно перетворювати гексозу і пенто 7 77386 8 зу. Гексозним джерелом вуглецю може бути, наний продукт секретується клітинами. Даний спосіб приклад, алоза, альтроза, глюкоза, маноза, гулоза, може давати клітини зі зниженою піруватдекарбокйодоза, фруктоза, галактоза і талоза. силазною активністю або зниженою алкогольдегіЗгідно з ще однією ознакою даний винахід дрогеназною активністю. Ця ферментативна актипропонує дріжджову клітину, що містить екзогенну вність може приводити до створення органічного молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпеппродукту шляхом споживання NADH. тид, що стимулює акумулювання ацетил-СоА в Клітини, одержані у ці способи, можуть виробцитоплазмі клітини. Таким поліпептидом може ляти принаймні близько 60г органічного продукту бути поліпептид з цитратліазною активністю або на кожні 100г споживаної глюкози, коли стадія кумітохондріальний мембранний поліпептид, що льтивування є оптимальною для вироблення цьостимулює проникність ацетил-СоА через мітохонго органічного продукту. Культурне середовище, дріальну мембрану. Клітина може мати знижену яке може бути рідким, може включати у себе інгібіпіруватдекарбоксилазну активність або знижену тор клітинного дихання такий, як антиміцин А, ціаалкогольдегідрогеназну активність. В альтернатинід або азид. Стадія культивування може включати вному випадку дріжджова клітина може не виробу себе вирощування клітин в аеробних умовах з ляти етанол і мати швидкість росту в етанол- і наступним приведенням цих клітин у контакт з інгіацетат-дефіцитних умовах культивування, яка є бітором клітинного дихання. більшою ніж швидкість росту, що спостерігається у В альтернативному варіанті здійснення винапорівняному етанол-дефіцитному продукуванню ходу стадія культивування включає у себе інкубудріжджовими клітинами. вання клітин в анаеробних умовах культивування. Згідно з ще однією ознакою даного винаходу Ще в одному варіанті здійснення стадія культивупропонується дріжджова клітина зі зниженою активання включає у себе вирощування клітин в аеровністю мітохондірального поліпептиду і негативбних умовах росту з наступним інкубуванням цих ним фенотипом дикої яблуні. Така клітина може клітин в анаеробних умовах культивування. Стадія бути, наприклад, із роду Kluyveromyces, Pichia, культивування може також включаючи у себе куHansenula, Candida, Trichosporon або льтивування клітин при температурі більше ніж Yamadazyma. У цієї клітини активність цілком відприблизно 35°С. сутня. Вона може містити дезінтегрований локус, В одному з варіантів здійснення винаходу куякий звичайно включає у себе нуклеїнокислотну льтурне середовище має величину органічного рН послідовність, що кодує мітохондріальний поліпепменше ніж приблизно 3,0 і/або величину неорганітид. Таким мітохондріальним поліпептидом може чного рН менше ніж приблизно 3,0. В іншому варібути фермент циклу Кребса. Крім того, ця клітина анті здійснення культурне середовище містить може акумулювати продукт циклу Кребса. Клітина пентозне джерело вуглецю, наприклад, рібозу, може включати у себе молекулу екзогенної нуклеарабінозу, ксилозу або ліксозу. Культурне середоїнової кислоти, що кодує поліпептид з ферментавище може також включати у себе гідролізат маїтивною активністю усередині клітини, причому ця сового волокна з величиною рН, наприклад, прибферментативна активність приводить до створенлизно від 2,0 до 6,5. ня органічного продукту таким чином, що ця клітиПредметом даного винаходу є також спосіб на виробляє цей органічний продукт. Органічним вироблення органічного продукту, який включає у себе: а) надання дріжджових клітин, що містять продуктом може бути, наприклад, цитрат, екзогенну молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує кетоглутарат, сукцинат, фумарат, малат і оксалоаполіпептид, котрий стимулює катаболічне перетцетат. Зазначеним поліпептидом може бути поліворення пентозного джерела вуглецю клітиною, пептид, що бере участь у катаболізмі лактату або причому згадана клітина має ферментативну акацетату. тивність, що приводить до створення згаданого Ще однією ознакою даного винаходу є спосіб органічного продукту; і b) культивування згаданих вироблення органічного продукту. Цей спосіб клітин у культурному середовищі так, що вироблявключає у себе надання дріжджових клітин, які ється органічний продукт. містять молекулу екзогенної нуклеїнової кислоти, Згідно з ще одним предметом даного винаходу що кодує поліпептид з ферментативною активніспропонується спосіб вироблення органічного протю усередині клітин, причому ця ферментативна дукту, який включає у себе: а) надання дріжджових активність приводить до створення органічного клітин, що містять екзогенну молекулу нуклеїнової продукту, а клітини мають негативний фенотип кислоти, яка кодує поліпептид, котрий стимулює дикої яблуні, і культивування клітин у культурному акумулювання ацетил-СоА в цитоплазмі клітини, середовищі так, що виробляється бажаний органіпричому згадана клітина має ферментативну акчний продукт. Згадані дріжджові клітини можуть тивність, що приводить до створення згаданого бути із роду Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, органічного продукту; і b) культивування клітин у Candida, Trichosporon або Yamadazyma. Згаданим культурному середовищі так, що виробляється органічним продуктом може бути продукт ферменорганічний продукт. тації, продукт переробки пірувату, органічний проПредметом даного винаходу є такожспосіб дукт, що містить більше трьох атомів вуглецю, вироблення органічного продукту, який включає у карбоксилат, вуглевод, амінокислота, вітамін або себе: а) надання дріжджових клітин зі зниженою ліпідний продукт. Органічним продуктом може бути активністю мітохондріального ферменту, причому також лактат, гліцерол, акрилат, ксилоза, аскорзниження активності приводить до акумулювання бат, цитрат, ізоцитрат, -кетоглютарат, сукцинілорганічного продукту; і b) культивування згаданих СоА, сукцинат, фумарат, малат або оксалоацетат. клітин у культурному середовищі так, що виробляУ деяких варіантах здійснення винаходу органіч 9 77386 10 ється органічний продукт. ендогенного ферменту чи ферментів потрібно Згідно з ще одним предметом даного винаходу зменшити в даній клітині для того, щоб надати пропонується спосіб культивування дріжджових можливість вироблення в ній кінцевого продукту; клітин негативного фенотипу дикої яблуні, який добавлення визначеного екзогенного ферменту чи включає у себе культивування клітин у культурноферментів в надану дріжджову клітину і зниження му середовищі, яке має величину органічного рН активності визначеного ендогенного ферменту чи менше, ніж приблизно 3,0, і/або величину неоргаферментів у наданій дріжджовій клітині так, щоб нічного рН менше, ніж приблизно 3,0. Стадія кульклітина виробляла кінцевий продукт за даних умов тивування може включати у себе культивування культивування. клітин при температурі більше, ніж приблизно Подальшим предметом даного винаходу є гід35°С. Культурне середовище може містити інгібіролізат маїсового волокна, який має величину рН тор клітинного дихання. Культурне середовище у межах приблизно від 2,0 до 6,5. Цей гідролізат може також містити пентозне джерело вуглецю. В може містити глюкозу, ксилозу й арабінозу. Гідроіншому варіанті здійснення винаходу культурне лізат може містити приблизно 40г/л глюкози, прибсередовище може містити гідролізат маїсового лизно 40г/л ксилози і приблизно 20г/л арабінози. В волокна. альтернативному варіанті гідролізат може містити Згідно з ще однією особливістю даного винаприблизно 38,7г/л глюкози, приблизно 39,1г/л ксиходу пропонується спосіб культивування дріжджолози, приблизно 20,7г/л арабінози і приблизно вих клітин негативного фенотипу дикої яблуні, 1,6г/л фурфуралу. який включає у себе культивування клітин у кульПредметом даного винаходу є також спосіб турному середовищі, яке містить гідролізат маїсоодержання органічного продукту, який включає у вого волокна. себе: а) культивування мікроорганізму в даних Згідно з ще однією особливістю даного винаумовах культури, де мікроорганізм має знижену ходу пропонується спосіб культивування дріжджоферментативну активність; ферментативною аквих клітин негативного фенотипу дикої яблуні, тивністю при цьому може бути піруватдекарбоксиякий включає у себе культивування клітин у кульлазна, алкогольдегідрогеназна, альдегіддегідрогетурному середовищі при температурі більше, ніж назна або ацетил-СоА-синтазна активність. приблизно 35°С, причому це культурне середовиМікроорганізм при цьому виказує швидкість росту ще має величину неорганічного рН менше, ніж за відсутності етанолу й ацетату принаймні прибприблизно 3,0. лизно 30% від тієї, що спостерігається у відповідЗгідно з ще однією особливістю даного винаного мікроорганізму, що не має такої зниженої феходу пропонується спосіб культивування дріжджорментативної активності; і b) зміну умов вих клітин негативного фенотипу дикої яблуні, культивування для стимулювання вироблення який включає у себе культивування клітин у кульорганічного продукту. турному середовищі при температурі більше, ніж Ще одним предметом даного винаходу є заприблизно 35°С, причому це культурне середовипропонований спосіб одержання органічного проще містить пентозне джерело вуглецю. дукту, який включає у себе: а) культивування мікЗгідно з ще однією особливістю даного винароорганізму в даних умовах культури, які ходу пропонується спосіб культивування дріжджостимулюють клітинне дихання, де мікроорганізм вих клітин негативного фенотипу дикої яблуні, має знижену ферментативну активність; ферменякий включає у себе культивування клітин у культативною активністю при цьому може бути піруватурному середовищі при температурі більше, ніж тдекарбоксилазна, алкогольдегідрогеназна, альдеприблизно 35°С, причому це культурне середовигіддегідрогеназна або ацетил-СоА-синтазна ще містить гідролізат маїсового волокна. активність, причому мікроорганізм виказуєшвидЗгідно з подальшою особливістю даного винакість росту за відсутності етанолу й ацетату приходу пропонується конструкція нуклеїнової кислонаймні приблизно 30% від тієї, що спостерігається ти, яка містить рекомбінантну послідовність і вибу відповідного мікроорганізму, що не має такої рану послідовність, причому рекомбінантна зниженої ферментативної активності; і b) зміну послідовність відповідає геномній послідовності умов культивування для зниження клітинного диклітини негативного фенотипу дикої яблуні, де хання, стимулюючи тим самим вироблення органігеномна послідовність кодує експресований клітичного продукту. ною фермент, а вибрана послідовність кодує феЯкщо не зазначено іншого, то всі застосовані рмент, що приводить до створення органічного тут науково-технічні терміни мають звичайні знапродукту усередині клітини. Вибрана послідовність чення, загальноприйняті у даній галузі і відомі фаможе знаходитися усередині рекомбінантної посхівцям, яких стосується даний винахід. Хоча в лідовності так, що ця вибрана послідовність на практичному здійсненні або у випробуваннях данокожному своєму кінці має рекомбінантну послідовго винаходу можуть застосовуватися подібні або ність. еквівалентні описаним тут способи і матеріали, Ще однією особливістю даного винаходу є завідповідні способи і матеріали описані нижче. Всі пропонований спосіб одержання рекомбінантної публікації, патентні заявки, патенти та інші згадані дріжджової клітини, який включає у себе: надання тут літературні джерела включені у даний опис дріжджової клітини негативного фенотипу дикої шляхом посилань в усій їхній повноті. У разі конфяблуні; вибирання кінцевого продукту; визначення ліктної ситуації даний опис призначений служити в того, який екзогенний фермент чи ферменти потякості базового документу для урегулювання рібно добавляти в клітину для вироблення кінцесправи. Крім того, описані тут матеріали, способи і вого продукту; визначення того, активність якого приклади мають* виключно ілюстративне, а не 11 77386 12 обмежувальне призначення. тися в широких межах практичного застосування. Інші ознаки і переваги даного винаходу будуть Наприклад, органічні продукти, вироблені описадокладно з'ясовані у подальшому опису й окресними тут дріжджовими клітинами, можуть викорислені у Формулі винаходу. товуватися в якості консервантів або добавок в Фіг.1. Схема, що ілюструє плазміду pHES. їжу, фармацевтичних і косметичних продуктів, а Фіг.2. Схема, що ілюструє плазміду pSEH. також для виготовлення пластмас та інших продуФіг.3. Схема, що ілюструє генерацію плазмід ктів. pCRII, які містять Lh-1dh або Pa-1dh. Для цілей даного винаходу органічним продукФіг.4. Схема, що ілюструє плазміди 1dh/pCRII. том є будь-яка сполука, що містить атом вуглецю. Фіг.5. Схема, що ілюструє генерацію плазмід Наприклад, органічними продуктами є карбоксилаpHES, які містять Lh-1dh або Pa-1dh. ти (наприклад, лактат, акрилат, цитрат, ізоцитрат, Фіг.6А. Схема, що ілюструє генерацію нокаут-кетоглютарат, сукцинат, фумарат, малат, оксафрагмента піруватдекрбоксилази (PDC). лоацетат), вуглеводи (наприклад, D-ксилоза), альФіг.6В. Схема, що ілюструє 5,5 kbp фрагмент, дітоли (наприклад, ксилітол, арабітол, рібітол), який оточує 1,7 kbp PDC1 К. marxianus. амінокислоти (наприклад, гліцин, триптофан, глюФіг.6С. Схема, що ілюструє делецію 400 pb тамат), ліпіди, ефіри, вітаміни (наприклад, Lгомологічної ділянки 5,5 kbp PDC і інсерцію гена аскорбат), поліолі (наприклад, гліцерол, 1,3стійкості до канаміцину. пропанедіол, еритритол), альдегіди, алкени, алкіни Фіг.6D. Схема, що ілюструє 4 kb ділянку, яка і кетони. Таким чином, органічний продукт може містить ген стійкості до канаміцину і оточує 2,3 kbp містити один, два, три, чотири, п'ять, шість, сім, PDC1. вісім, дев'ять, десять і більше атомів вуглецю. Крім Фіг.6Е. Схема, що ілюструє 7,5 kbp PDC1 К. того, органічні продукти можуть мати молекулярну Thermotolerans і навколишню ділянку. масу менше, ніж приблизно 1000 (наприклад, меФіг.6F. Схема, що ілюструє делецію 750 Ьр із нше ніж приблизно 900, 800, 700, 600, 500, 400, 1,7 kbp гена PDC1 і інсерцію гена стійкості до ка300, 200 або 100). Наприклад, D-ксилоза (С5Н10О5) наміцину. є органічним продуктом, молекулярна маса якого Фіг.7. Графік росту (оптична густина, OD) в часкладає 150. Органічні продукти можуть бути тасі (години) Kluyveromyces marxianus, вирощуваних кож продуктами ферментації. Використовуваний в умовах низького рН (рН 2,5) і високої температутут термін «продукт ферментації» стосується ри (40°С). будь-якої органічної сполуки, одержаної шляхом Фіг.8. Графік росту (оптична густина, OD) в чаферментації. У загальному випадку спосіб фермесі (години) К. marxianus, вирощуваних з глюкозою, нтації передбачає анаеробне ферментаційне пексилозою або арабінозою при температурі 30°С. ретворення органічних сполук таких, наприклад, як Фіг.9. Графік росту (оптична густина, OD) в чавуглеводи, на такі сполуки, як етиловий спирт, з сі (години) К. marxianus, вирощуваних з гідролізанакопиченням звільненої енергії у формі аденозитом маїсового волокна при температурі 30°С. нтрифосфату (АТФ). Таким чином, ферментація Фіг.10. Графік росту (оптична густина, OD) в відрізняється від клітинного дихання тим, що в часі (години) К. marxianus, вирощуваних при темякості акцепторів електронів тут використовуються пературі 30°С і зазначеному рН. органічні продукти, а не молекулярний кисень. У Фіг.11. Графік росту (оптична густина, OD) в якості прикладів продуктів ферментації можна начасі (години) К. marxianus, вирощуваних при темзвати, не обмежуючись лише ними, ацетат, етапературі 30°С і зазначеному рН за наявності 40 г нол, бутират і лактат. молочної кислоти. Органічними продуктами можуть бути також Фіг.12. Три графіки залежності вироблення біпродукти переробки пірувату. Використовуваний омаси (А), споживання глюкози (В) і вироблення тут термін «продукт переробки пірувату» стосуєтьетанолу (С) мікроорганізмами S. uvarum і К. ся будь-якої сполуки, синтезованої з пірувату не marxianus, культивованими на мінеральному себільш ніж за 15 ферментативних стадій. Ферменредовищі з 2% глюкози в аеробних умовах. тативною стадією є будь-яка хімічна реакція або Фіг.13. Три графіки залежності вироблення бісерія реакцій, каталізованих поліпептидом, що має омаси (А), споживання глюкози (В) і вироблення ферментативну активність. Використовуваний тут етанолу (С) мікроорганізмами S. uvarum і К. термін «поліпептид, що має ферментативну актиmarxianus, культивованими на мінеральному севність» стосується будь-якого поліпептиду, що редовищі з 2% глюкози в анаеробних умовах. каталізує хімічні реакції між іншими речовинами, Фіг.14. Плазмідна карта промоторного вектора залишаючись по завершенні реакції або реакцій PDC1. незруйнованим і незміненим. Ферментативний Даним винаходом пропонуються способи і маполіпептид, як правило, каталізує створення однотеріали, що стосуються вироблення органічних го і більше продуктів із одної і більше речовин. Такі продуктів. Зокрема, винаходом пропонуються дріполіпептиди можуть мати будь-який тип ферменжджові клітини, способи культивування дріжджотативної активності, включаючи, але не обмежуювих клітин, способи одержання дріжджових клітин, чись лише цим, ферментативну активність, зв'язаконструкції нуклеїнових кислот, способи і матеріану з такими ферментами, як аконітаза, ли для вироблення різноманітних органічних проізоцитратдегідрогеназа, кетоглутаратдегідрогенадуктів. за, сукцинаттіокіназа, сукцинатдегідрогеназа, фуЗапропоновані дріжджові клітини можуть викомараза, малатдегідрогеназа, цитратсинтаза, 2,5ристовуватися для вироблення органічних продукдіоксовалератдегідрогеназа, 5-дегідро-4-деокси-Dтів. Такі органічні продукти можуть використовуваглюкаратдегідрогеназа, глюкаратдегідратаза, аль 13 77386 14 дегіддегідрогеназа, глюкурунолактонредуктаза, Lлеїнової кислоти в цілому в природі не існує. Нагулонолактоноксидаза, 2-дегідро-3-деокси-Dприклад, молекула нуклеїнової кислоти, що міспентаноатальдолаза, ксилонатдегідратаза, ксилотить послідовність геномної ДНК у векторі експренолактоназа, D-ксилозодегідрогеназа, лактатдегісії, вважається молекулою нуклеїнової кислоти дрогеназа, СоА-трансфераза, лактил-СоАнеприродного походження і отже є екзогенною до дегідратаза або акриліл-СоА-гідратаза. клітини, в яку вона уведена, оскільки цієї молекули Слід зауважити, що поліпептид з даною фернуклеїнової кислоти в цілому (геномна ДНК + векментативною активністю може бути як природного, тор ДНК) в природі не існує. Таким чином, будьтак і неприродного походження. Поліпептидом який вектор, що автономно реплікує плазміду або природного походження є будь-який поліпептид, вірус (наприклад, ретровірус, аденовірус, або вірус що має амінокислотну послідовність, котра зустрігерпеса), якого в цілому в природі не існує, вважачається в природі, включаючи поліпептиди дикого ється молекулою нуклеїнової кислоти неприроднотипу і поліморфні поліпептиди. Поліпептиди приго походження. Звідси випливає, що фрагменти родного походження можуть одержуватися від геномної ДНК, продуковані полімеразнобудь-яких видів і, у тому числі, ссавців, грибкових і ланцюговою реакцією (PCR) або оброблянням бактеріальних видів. Поліпептидом неприродного ендонуклеазою рестрикції, а також кДНК, розгляпоходження може бути будь-який поліпептид, амідаються як молекули нуклеїнової кислоти непринокислотна послідовність якого в природі не зуродного походження, оскільки вони існують у форстрічається. Отже поліпептидом неприродного мі відокремлених молекул, які в природі не походження може бути мутована версія поліпепзустрічаються. Звідси також випливає, що будьтиду природного походження або поліпептид, одеяка молекула нуклеїнової кислоти, яка містить ржаний за методами генної інженерії. Наприклад, промоторну послідовність і послідовність, що кополіпептидом неприродного походження з цитратдує поліпептид, (наприклад, кДНК або геномну синтазною активністю може бути мутована версія ДНК) в структурі, яка в природі не зустрічається, природного поліпептиду з цитратсинтазною активрозглядається як молекула нуклеїнової кислоти ністю, в котрій залишилась принаймні деяка цитнеприродного походження. ратсинтазна активність. Поліпептид може бути Термін «ендогенний» стосується геномного мутований, наприклад, добавленнями, делеціями матеріалу, який не є екзогенним. У загальному і/або заміщеннями послідовностей. випадку ендогенний геномний матеріал створюОрганічний продукт не є продуктом переробки ється в організмі, тканині або клітині і не уводитьпірувату, якщо він синтезований із пірувату за ся, а також не модифікується за рекомбінантними більш ніж 15 ферментативних стадій. В число прометодами. Ендогенний геномний матеріал не дуктів переробки пірувату входять, не обмежуювключає у сферу свого визначення варіації прирочись лише ними, цитрат, а-кетоглутарат, сукцинат, дного походження. фумарат, малат, оксалоацетат, 2-дегідро-3Слід також зауважити, що молекула нуклеїнодеокси-D-ксилонат, D-ксилонат, D-ксилонолактон, вої кислоти природного походження може бути D-ксилоза, акрилат, ацетат, етанол, бутират і лакдля даної клітини екзогенною. Наприклад, ціла тат. хромосома, виділена із клітини людини X, вважаДля цілей даного винаходу карбоксилатні проється екзогенною молекулою нуклеїнової кислоти дукти, які можуть бути у «вільнокислотній» або по відношенню до клітини людини Y, якщо ця хро«сольовій» формі, одержують тут назви відповідно мосома уведена в клітину людини Y. до номенклатури сольових форм. Наприклад, моВикористовуваний тут термін «генетично молочна кислота тут зветься лактатом. Таким чином, дифікований» стосується організму, геном якого у даному випадку терміном «лактат» охоплюються був модифікований, наприклад, добавленням, заяк молочна кислота, так і лактат. міщенням або делецією генетичного матеріалу. Використовуваний тут термін «нуклеїнова кисСпособи добавлення або делеції генетичного малота» охоплює як РНК, так і ДНК, включаючи теріалу добре відомі і включають до свого числа, кДНК, геномну ДНК, синтетичну (наприклад, хімічале не обмежуючись лише ними, неспецифічний но синтезовану) ДНК. Нуклеїнова кислота може мутагенез, точкові мутації, включаючи інсерції, бути дволанцюговою або одноланцюговою. Одноделеції і заміщення, нокаут-методи і трансформуланцюгова нуклеїнова кислота може являти собою вання організму нуклеїнокислотною послідовністю ланцюг, що має сенс, або ланцюгом «проти сенза допомогою рекомбінантних методів, включаючи су». Крім того, нуклеїнова кислота може бути кільяк стабільні, так і перехідні трансформанти. Дріжцевою або лінійною. джові клітини можуть також піддавати катаболічВикористовуваним тут терміном «екзогенний» ним перетворенням крохмаль, як природним шлястосовно молекули нуклеїнової кислоти і конкретхом, так і через генетичну модифікацію, і можуть ної клітини визначається будь-яка молекула нукленавіть бути генетично модифіковані для катаболіїнової кислоти, що не походить із даної клітини за чного перетворення целюлози шляхом добавленприродних умов. Отже всі молекули нуклеїнових ня, наприклад, целюлази на грибковій основі. кислот неприродного походження вважаються ек1. Дріжджові клітини негативного фенотипу дизогенними до клітин, в які вони уведені. Слід закої яблуні уважити, що молекули нуклеїнових кислот неприВинаходом пропонуються різноманітні генетиродного походження можуть містити чно регульовані дріжджові клітини негативного нуклеїнокислотні послідовності або фрагменти фенотипу дикої яблуні. Такі рекомбінантні дріжнуклеїнокислотних послідовностей, які зустрічаджові клітини можуть застосовуватися у виробються в природі за умов, що даної молекули нукленні органічних продуктів. Наприклад, винаходом 15 77386 16 пропонується дріжджова клітина негативного фезавдяки наявності глюкози, у той час як дріжджова нотипу дикої яблуні, яка містить екзогенну молекуклітина негативного фенотипу дикої яблуні не вилу нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид з казує глюкозо-опосередкованого інгібування споферментативною активністю, котра приводить до живання кисню. У якості прикладів дріжджових створення органічного продукту. Такі дріжджові клітин, які звичайно відносяться до негативного клітини входять в об'єм даного винаходу з умови, фенотипу дикої яблуні, можна назвати, але не общо вони виробляють органічний продукт. Слід замежуючись лише ними, дріжджові клітини таких уважити, що вироблений органічний продукт може родів: Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Candida, секретуватися дріжджовою клітиною, уникаючи Trichosporon і Yamadazyma. необхідності розривання клітинної мембрани для Як згадувалося вище, винаходом пропонуєтьйого видобування. Типові дріжджові клітини за ся багато різних типів рекомбінантних дріжджових даним винаходом виробляють органічний продукт клітин, здатних виробляти велике різноманіття з виходом принаймні приблизно 40г (наприклад, органічних продуктів. Наприклад, дріжджова клітипринаймні 45, 50, 55, 65, 70, 75, 80, 85, 90 або 95г) на може містити екзогенну молекулу нуклеїнової органічного продукту на кожні 100г споживаної кислоти, що кодує поліпептид, з лактатдегідрогеглюкози при культивуванні в оптимальних для виназною активністю так, що виробляється лактат. У роблення продукту умовах. Для оцінки виходу якості прикладів таких поліпептидів можна назвапроцесу вироблення органічного продукту даною ти, але не обмежуючись лише ними, бичачу лактадріжджовою клітиною може бути застосований тдегідрогеназу, бактеріальну лактатдегідрогеназу і будь-який спосіб, див., наприклад, [Kiers et al., грибкову лактатдегідрогеназу, наприклад, грибкову Yeast, 14(5):459-469 (1998)]. Слід також зауважити, лактатдегідрогеназу К. lactis або К. thermotolerans. що ферментативна активність кодованого поліпеТут також поліпептиди, що володіють ферментаптиду може приводити до створення органічного тивною, наприклад, лактатдегідрогеназною активпродукту шляхом споживання NADH. Іншими слоністю, можуть бути як природного, так і неприродвами, вироблення даної органічної сполуки може ного походження. потребувати NADH у якості джерела енергії. ТерСлід зауважити, що описані тут дріжджові клімін «NAD» стосується кофакторів, що діють як тини можуть містити одну копію або багато копій носії електрону й водню в даних окисно-відновних (наприклад, приблизно 5, 10, 20, 35, 50, 75, 100 реакціях, у той час як термін «NADH» стосується або 150 копій) даної екзогенної молекули нуклеївідновленої форми NAD. У якості прикладів органової кислоти. Наприклад, дріжджова клітина може нічних продуктів, синтез яких потребує NADH, момістити 50 копій екзогенної молекули X нуклеїнової жна назвати, але не обмежуючись лише ними, кислоти. Слід зауважити також, що описані тут лактат, етанол, ацетат і акрилат. Як правило, дрідріжджові клітини можуть містити більш ніж одну жджові клітини згідно з даним винаходом піддають екзогенну молекулу нуклеїнової кислоти. Наприкатаболічному перетворенню пентозне джерело клад, дріжджова клітина може містити приблизно вуглецю, таке як пентоза. Однак, такі дріжджові 50 копій екзогенної молекули X нуклеїнової кислоклітини можуть також піддавати каталітичному ти, а також приблизно 75 копій екзогенної молекуперетворенню пентозне джерело вуглецю (наприли Υ нуклеїнової кислоти. У даному випадку молеклад, рібозу, арабінозу, ксилозу й ліксозу). Іншими кули нуклеїнових кислот двох різних типів можуть словами, дріжджова клітина за даним винаходом кодувати різні поліпептиди зі своєю власною ферможе використовувати пентозне джерело вуглецю ментативною активністю. Наприклад, дріжджова як природним шляхом, так і бути пристосованою клітина може містити чотири різні екзогенні молештучно для використання пентозного джерела кули нуклеїнової кислоти так, щоб вироблявся вуглецю. Наприклад, дріжджова клітина може бути акрилат. У даному прикладі така дріжджова клітинаділена екзогенною молекулою нуклеїнової кисна може містити першу екзогенну молекулу нуклелоти, що кодує ксилозоредуктазу, ксилитолдегідїнової кислоти, що кодує поліпептид з лактатдегідрогеназу і/або ксилулокіназу так, що ксилоза може рогеназною активністю, другу молекулу, що кодує піддаватися катаболічному перетворенню. Дріжполіпептид з СоА-трансферазною активністю, треджові клітини можуть також катаболічно перетвотю молекулу, що кодує поліпептид з лактил-СоАрювати крохмаль як природним шляхом, так і чедегідратазною активністю, і нарешті четверту морез генетичну модифікацію, і можуть бути навіть лекулу, що кодує поліпептид з акрил-СоАгенетично модифіковані для катаболічного перетгідратазною активністю. В іншому варіанті дріжворення целюлози шляхом добавлення, наприджова клітина може містити чотири різні екзогенні клад, целюлози на грибковій основі. молекули нуклеїнової кислоти так, щоб виробляДріжджовою клітиною негативного фенотипу лася D-ксилоза. Зокрема, така дріжджова клітина дикої яблуні є будь-яка дріжджова клітина, що не може містити першу екзогенну молекулу нуклеїновиказує ефекту дикої яблуні. Термін «негативний вої кислоти, що кодує поліпептид з 2-дегідро-3фенотип дикої яблуні» стосується організмів як деокси-D-пентаноатальдолазною активністю, друприродного походження, так і генетично модифігу молекулу, що кодує поліпептид з ксилонатдегідкованих. Коротко, ефект дикої яблуні полягає в ратазною активністю, третю молекулу, що кодує інгібуванні споживання кисню мікроорганізмом при поліпептид з ксилонолактоназною активністю і культивуванні його в аеробних умовах через наявчетверту молекулу, що кодує поліпептид з Dність високої концентрації глюкози (наприклад, 50г ксилозодегідрогеназною активністю. Можливий глюкози/літр). Іншими словами, дріжджова клітина також варіант, в якому дріжджова клітина містить позитивного фенотипу дикої яблуні продовжує шість різних екзогенних молекул нуклеїнової кисдавати бродіння незалежно від доступності кисню лоти так, щоб вироблявся вітамін L-аскорбат. Зок 17 77386 18 рема, така дріжджова клітина може містити першу може бути легко ідентифікована за допомогою екзогенну молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує загальновідомих способів, описаних, наприклад, в поліпептид з 2,5-діоксовалератдегідрогеназною [Ulbrich, Methods in Enzymology 18:109-115(1970)]. активністю, другу молекулу, що кодує поліпептид з 2. Дріжджові клітини позитивного і негативного 5-дегідро-4-деокси-D-глюкаратдегідрогеназною фенотипів дикої яблуні активністю, третю молекулу, що кодує поліпептид Винаходом також пропонуються різноманітні з глюкаратдегідратазною активністю, четверту генетично регульовані дріжджові клітини, які не молекулу, що кодує поліпептид з альдегіддегідропотребують наявності у них негативного фенотипу геназною активністю, п'яту молекулу, що кодує дикої яблуні. Іншими словами такі клітини можуть поліпептид з глюкуронолактонредуктазною активбути як позитивного, так і негативного фенотипів ністю, і шосту молекулу, що кодує поліпептид з Lдикої яблуні. Такі рекомбінантні дріжджові клітини гулонолактоноксидазною активністю. можуть застосовуватися у виробленні органічних Слід зауважити, що ферментативні поліпептипродуктів. Наприклад, винаходом пропонується ди можуть використовуватися таким чином, щоб дріжджова клітина, що містить екзогенну молекулу цільовий органічний продукт був оптично чистим нуклеїнової кислоти, котра кодує поліпептид, що (наприклад, приблизно 90, 95, 99% чистоти). Настимулює катаболічне перетворення цією клітиною приклад, поліпептид з (L)-лактатдегідрогеназною пентозного джерела вуглецю (наприклад, рібози, активністю може застосовуватися для вироблення арабінози, ксилози, ліксози). Зокрема, дріжджова (L)-лактату. клітина може мати екзогенну молекулу нуклеїнової Дріжджові клітини за даним винаходом можуть кислоти, котра кодує ксилозоредуктазу, ксилітолтакож мати знижену ферментативну, наприклад, дегідрогеназу і/або ксилулокіназу так, що ксилоза піруватдекарбоксилазну і/або алкогольдегідрогеможе катаболічно перетворюватися більш ефекназну активність. Термін «знижений», застосовутивним шляхом. Крім того, дріжджові клітини, здаваний тут по відношенню до клітини і даної фертні катаболічно перетворювати пентозне джерело ментативної активності, означає більш низький вуглецю, можуть також бути здатними катаболічно рівень ферментативної активності, ніж рівень, виперетворювати гексозне джерело вуглецю (наприміряний у порівняної дріжджової клітини того ж клад, алозу, альтрозу, глюкозу, манозу, гулозу, виду. Таким чином, дріжджова клітина з дефіцитом йодозу, галактозу й талозу) як послідовно, так і піруватдекарбоксилазної активності розглядається одночасно. Наприклад, дріжджова клітина може як така, що має знижену піруватдекарбоксилазну бути модифікована шляхом генної інженерії так, активність, оскільки більшість порівняних дріжджощо катаболічне перетворювання ксилози і глюкози вих клітин, якщо не всі вони, мають принаймні дебуде відбуватися одночасно. Слід зауважити, що яку піруватдекарбоксилазну активність. Такі знидріжджові клітини з підвищеною здатністю катабожені рівні ферментативної активності можуть бути лічно перетворювати пентозу можуть застосовуварезультатом знижених концентрацій ферменту, тися для модифікації дріжджових клітин, здатних зниженої питомої активності ферменту або того й виробляти органічні продукти із пентозних джерел іншого разом. Для одержання дріжджових клітин зі вуглецю. Ця властивість є особливо корисною, зниженою ферментативною активністю можуть оскільки такі пентозні джерела вуглецю, як ксилозастосовуватися найрізноманітніші способи. Наза, у загальному випадку є менш дорогими, ніж приклад, за допомогою генної інженерії дріжджова такі гексозні джерела вуглецю, як глюкоза. Серед клітина може бути наділена дезінтегрованим ферінших вуглецевих джерел, які можуть піддаватися менто-кодувальним локусом із застосуванням закатаболічному перетворенню, можна назвати, не гального мутагенезу або нокаут-методу, див., наобмежуючись лише ними, мелібіозу, сахарозу, приклад, [Methods in Yeast Genetics (1997 edition), фруктозу, рафінозу, стахіозу, крохмаль (наприAdams, Gottschling, Kaiser, and Sterns, Cold Spring клад, маїсовий крохмаль і пшеничний крохмаль) і Harbor Press (1998)]. Для зниження ферментативгідролізат (наприклад, гідролізат маїсового волокної активності може застосовуватися також спосіб на та інші целюлозні гідролізати). «проти сенсу». Наприклад, дріжджова клітина за Крім того, винаходом пропонується дріжджова методами генної інженерії може бути перетворена клітина, яка містить екзогенну молекулу нуклеїнотак, щоб містити кДНК, що кодує молекулу «проти вої кислоти, що кодує поліпептид, котрий стимусенсу», яка запобігає утворенню ферменту. Термін лює акумулювання ацетил-СоА в цитоплазмі клі«молекула проти сенсу» охоплює собою всі можтини. Наприклад, дріжджова клітина може мати ливі молекули нуклеїнових кислот, які містять посекзогенну молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує лідовності, що відповідають кодувальному ланцюполіпептид з цитратліазною активністю. В альтергу ендогенного поліпептиду. Молекула «проти нативному варіанті дріжджова клітина може мати сенсу» може також мати флангові (наприклад, екзогенну молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує регуляторні) послідовності. Отже молекулами мітохондріальний мембранний поліпептид, котрий «проти сенсу» можуть бути рібозими або олігонукстимулює ацетил-СоА-проникність крізь мітохондлеотиди «проти сенсу». Рібозима може мати будьріальну мембрану. Слід зауважити, що багато дріяку загальну структуру, у тому числі, шпилькоподіжджових клітин, котрим бракує здатності вироблябну, молотоподібну або сокироподібну структуру ти етанол, не можуть рости за відсутності етанолу за умови, що ця молекула розщеплює РНК. й ацетату. Як правило, дріжджова клітина не має Ідентифікація дріжджових клітин зі зниженою здатності виробляти етанол, коли їй тим чи іншим ферментативною активністю може здійснюватися чином бракує піруватдекарбоксилазної або алкоу будь-який спосіб. Наприклад, дріжджова клітина гольдегідрогеназної активності. Наприклад, дріжзі зниженою піруватдекарбоксилазною активністю джі позитивного фенотипу дикої яблуні (напри 19 77386 20 клад, Saccharomyces), у яких відсутня піруватде(тобто дріжджових клітин, що не мають здатності карбоксилазна активність, слабо ростуть за відсувиробляти етанол), які не містять екзогенної нуктності етанолу й ацетату. Таким чином, керування леїнової кислоти і, до того ж, культивувалися за такими дріжджами позитивного фенотипу дикої подібних умов (тобто без етанолу й ацетату). яблуні у напрямку зменшення продукування етаВинаходом також пропонується дріжджова клінолу з метою переспрямування використання пітина зі зниженою активністю поліпептиду. Такі дрірувату на інші органічні продукти (наприклад, лакжджові клітини можуть мати позитивний або негатат і акрилат) приводить до погіршення тивний фенотип дикої яблуні. Наприклад, характеристик росту за відсутності етанолу й ацедріжджова клітина за даним винаходом може мати тату, і особливо тому що дріжджі позитивного фезнижену активність поліпептиду плазмової мемнотипу дикої яблуні обмежують клітинне дихання брани (наприклад, переносника плазмової мемза наявності глюкози. Згідно з даним описом дріжбрани), цитоплазмового поліпептиду (наприклад, джові клітини, здатні стимулювати акумулювання піруватдекарбоксилази) і/або мітохондріального цитоплазмового ацетил-СоА, який певним чином поліпептиду (наприклад, піруватдегідрогенази). відрізняється від того, що базується на концентраТермін «переносник плазмової мембрани» стосуції цитоплазмового ацетату і ацетил-СоАється поліпептидів, які полегшують рух органічних синтазної активності, можуть рости за відсутності продуктів крізь плазмову мембрану. В якості прикетанолу й ацетату навіть, коли вони не є спроможладів таких поліпептидів можна назвати, без обними виробляти етанол. Слід зауважити, що дріжмеження, переносники карбонової кислоти, такі як джові клітини, здатні рости за відсутності етанолу JEN1 в S. cerevisiae (номер доступу U24155 в генй ацетату, не маючи при цьому спроможності вибанку (Genbank)). Термін «мітохондріальний поліробляти етанол, можуть переспрямовувати викопептид» стосується будь-якого поліпептиду, що ристання пірувати на вироблення інших, ніж етафункціонує в мітохондріях, включаючи без обменол, органічних продуктів. ження піруватдегідрогеназу, поліпептиди, що беДріжджі будь-якого типу можуть містити екзоруть участь в катаболізмі лактату або ацетил-СоА генну молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує (наприклад, поліпептид цитохрому b2) і ферменти поліпептид, що стимулює акумулювання ацетилциклу Кребса. До числа ферментів циклу Кребса СоА в цитоплазмі клітини. Наприклад, дріжджова належать аконітаза, ізоцитратдегідрогеназа, кетоклітина негативного або позитивного фенотипу глутаратдегідрогеназа, сукцинаттіокіназа, сукцинадикої яблуні може містити екзогенну молекулу нутдегідрогеназа, фумараза, малатдегідрогеназа і клеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, що стицитратсинтаза. Згідно з даним описом дріжджова мулює акумулювання ацетил-СоА в цитоплазмі клітина зі зниженою ферментативною активністю клітини. Як правило, такі дріжджові клітини можуть може повністю бути позбавленою даної ферменбути ідентифіковані (1) шляхом керування клітитативної активності. Слід зауважити, що термін ною, що містить екзогенну молекулу нуклеїнової «знижена», використовуваний по відношенню до кислоти, таким чином, щоб вона не мала піруватактивності дріжджової клітини і поліпептиду, стодекарбоксилазної або алкогольдегідрогеназної сується більш низького рівня активності, ніж той, активності, (2) шляхом визначення характеристик що спостерігається у порівняної дріжджової клітиросту клітини, культивованої за наявності титрани того ж виду за подібних умов. Таким чином, ційних кількостей інгібітора дихання (наприклад, дріжджова клітина, позбавлена даної транспортної антиміцину А, ціаніду або азиду), і (3) порівняння активності, вважається такою, що має знижену цих характеристик росту з тими, що спостерігатранспортну активність порівняно з клітиною, яка ються у порівняної дріжджової клітини, яка не місмає принаймні деяку транспортну активність. Такі тить екзогенної молекули нуклеїнової кислоти і яка знижені поліпептидні активності можуть бути ретакож була регульована на відсутність піруватдезультатом зниженої концентрації поліпептидів, карбоксилазної або алкогольдегідрогеназної актизниженої питомої активності поліпептиду або того вності. Дріжджові клітини, визначені в результаті й іншого разом. Для одержання дріжджової клітини такого порівняння як такі, що мають більш сприятзі зниженою поліпептидною активністю можуть ливі характеристики росту завдяки наявності екзозастосовуватися будь-які способи. Наприклад, генної молекули нуклеїнової кислоти, вважаються локус, який має нуклеїнокислотну послідовність, такими, що містять екзогенну молекулу нуклеїнощо кодує мітохондріальний поліпептид, може бути вої кислоти, яка кодує поліпептид, що стимулює інактивований, наприклад, шляхом загального акумулювання ацетил-СоА в цитоплазмі клітини. мутагенезу або за допомогою нокаут-методу. Дріжджові клітини, що містять екзогенну молеСлід зауважити, що дріжджові клітини зі зникулу нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, що женою активністю мітохондріального ферменту стимулює акумулювання ацетил-СоА в цитоплазмі можуть акумулювати продукти циклу Крeбса (наклітини, також можуть мати знижену ферментатиприклад, цитрат, ізоцитрат, -кетоглутарат, сукцивну активність, наприклад, знижену піруватдекарніл-СоА, сукцинат, фумарат, малат і оксалоацебоксилазну і/або алкогольдегідрогеназну активтат). Наприклад, дріжджові клітини зі зниженою ність. Наприклад, дріжджова клітина може не мати фумаразною активністю можуть акумулювати фуздатності виробляти етанол. Звичайно, такі дріжмарат. Крім того, дріжджова клітина може містити джові клітини мають швидкість росту за умов кульекзогенну молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує тивування без етанолу й ацетату, яка є вищою поліпептид з ферментативною активністю, яка (напрклад, приблизно 5, 10, 20, 35, 50, 75, 100, приводить до створення органічного продукту так, 150, 200% або більше), ніж швидкість росту, що що клітина виробляє органічний продукт. спостерігається у порівняних дріжджових клітин Слід зауважити, що деякі продукти циклу Кре 21 77386 22 бса не можуть проникати крізь мітохондріальну дріжджовій клітині К. marxianus. Дріжджові клітини, що містять плазміду-кілера, можуть бути легко мембрану (наприклад, -кетоглутарат і сукцинілідентифіковані за допомогою загальновідомих СоА). Отже зниження активності конкретних ферспособів, див., наприклад, [Gunge et al., J. ментів циклу Кребса буде приводити до акумулюBacteriol, 145(1):382-390 (1981); Gunge and Kitada, вання певних продуктів циклу Кребса в порожнині Eur. J. Epidemiol.,4:409-414 (1988) та Wesolowskiмітохондрій. У цих випадках дріжджові клітини зі Louvel et al., Nonconventional yeasts in зниженою активністю ферменту циклу Кребса моBiotechnology: Kluyveromyces lactis, ed. Klaus Wolf, жуть бути за методами генної інженерії модифікоSpringer verlag, Berlin, p.138-201 (1996)]. вані так, щоб містити одну і більше екзогенних Подібним чином будь-яка із запропонованих молекул нуклеїнової кислоти, кожна з яких буде тут дріжджових клітин може містити екзогенну мокодувати поліпептид зі своєю особливою ферменлекулу нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид з тативною активністю, а цільовий продукт циклу АТФ-азною активністю, модифікований так, що ця Кребса буде акумулюватися в цитоплазмі. Напридріжджова клітина стає більш толерантною до клад, зниження кетоглутаратдегідрогеназної актинавколишніх середовищ з низьким рН. Наприклад, вності буде мати результатом акумулювання дріжджова клітина може бути наділена АТФ-азою, кетоглутарату, що у свою чергу приведе до акумуяка ефективно підтримує низьку цитоплазмову лювання ізоцитрату. Альфа-кетоглутарат не може концентрацію протонів, коли міжклітинна концентпроникати крізь мітохондріальну мембрану, у той рація протонів є високою. Такі поліпептиди можуть час як ізоцитрат крізь неї проникати може. Таким бути модифіковані за допомогою генної інженерії чином, ізоцитрат може акумулюватися в цитоплатак, як описано в роботі [Morsomme et al., (EMBO змі клітини. Проте дріжджові клітини, які також місJ. 15:5513-5526 (1996)]. тять екзогенну молекулу нуклеїнової кислоти, що Слід зауважити, що будь-яка з описаних тут кодує поліпептид з ізоцитратдегідрогеназною акрекомбінантних дріжджових клітин може містити тивністю, і експресують цей функціональний полібудь-яку комбінацію бажаних генетичних регулюпептид в цитоплазмі, можуть виробляти цитоплазвань. Наприклад, дріжджова клітина позитивного мовий -кетоглутарат. Таким чином, зниження фенотипу дикої яблуні може містити екзогенну активності конкретних ферментів циклу Кребса з молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує поліпепнаданням екзогенних молекул нуклеїнової кислотид з цитратліазною активністю, а також екзогенну ти, що кодують ті ж самі (або різні) ферменти цикмолекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпеплу Кребса так, що вони можуть функціонувати в тид з ферментативною активністю, що приводить цитоплазмі, може мати результатом вироблення до створення органічного продукту. різноманітних продуктів циклу Кребса (або продук3. Підходящі організми тів, одержуваних переробкою продуктів циклу Для використання згідно з даним винаходом Кребса) в цитоплазмі. підходящими є найрізноманітніші організми. Крім Далі, винаходом пропонується дріжджова клітого, дріжджові мікроорганізми негативного і позитина зі зниженою активністю ферменту, який витивного фенотипів дикої яблуні, такі, як водить використання вуглецевого джерела з проSaccharomyces sp., включаючи S. cerevisiae і S. цесу вироблення біомаси або бажаного uvarum, Kluyveromyces, включаючи К. органічного продукту. Наприклад, ферменти гліцеthermotolerans, К. lactis і К. marxianus, Pichia, рольного або ацетоїнового шляхів можуть бути Hansenula, включаючи Η. polymorpha, Candidia, дезінтегровані так, що вуглецеве джерело в кульTrichosporon, Yamadazyma, включаючи У. stipitis, турному середовищі буде використовуватися пеабо Torulaspora pretoriensis, організми широкого реважно для вироблення біомаси або бажаного ряду мікробних видів можуть також служити в якоорганічного продукту. У якості прикладу ферменту сті хазяїнів для вироблення молочної кислоти. гліцерольного шляху можна назвати без обмеженНаприклад, такий організм, як Rhizopus oryzae, ня дигідроксіацетонфосфатредуктазу. У числі феприродний виробник молочної кислоти, може бути рментів ацетоїнового шляху входять, не обмежуюгенетично модифікований на кислотну толерантчись лише ними, -ацетолактатсинтаза і ність, підвищення виходу продукції і вироблення ацетолактатдекарбоксилаза. Тут також для зниоптично чистої молочної кислоти. Організми ження активності ферменту може бути застосоваAspergillus spp. відомі також своєю здатністю виний будь-який спосіб. робляти різноманітні органічні кислоти, наприклад, Крім того, будь-які запропоновані тут дріжджолимонну кислоту, і переносити низьку рН. Способи ві клітини можуть містити екзогенну молекулу нукгенетичної модифікації Aspergillus spp. для вироблеїнової кислоти, що діє як плазміда-кілер. Термін лення молочної кислоти добре відомі. Крім того, «плазміда-кілер» стосується молекули нуклеїнової грибки такі, як Rhizopus і Aspergillus spp., виробкислоти, що дає один з видів дріжджів зі здатністю ляють ферменти, котрі дозволяють їм розкладати нейтралізувати інші види дріжджів. Наприклад, крохмаль та інші полімерні вуглеводи на мономердріжджові клітини роду Kluyveromyces, що містять ні вуглеводи для застосування їх у якості вуглецеплазміду-кілера, можуть запобігати росту дріжджів вого джерела. роду Saccharomyces. Таким чином, дріжджові кліУ розрахунку на вироблення молочної кислоти тини, що мають плазміду-кілера, можуть викорисбули та можуть генетично модифіковані такі протовуватися для запобігання виникненню проблем каріоти, як Escherichia coli, Zymomonas mobilis і зі споживанням в промислових процесах. У додаBacillus spp. Мікроорганізми, які були ідентифікоток до цього дріжджовій клітині може бути наданий вані як Bacillus coagulans, є також природними будь-який тип плазміди-кілера. Наприклад, плазвиробниками молочної кислоти і можуть далі генеміда-кілер, виділена із К. lactis, може бути надана 23 77386 24 тично модифікуватися на поліпшення вироблення також із послідовностей бактеріофагів, послідовмолочної кислоти в умовах низького рН. ностей плазмід, послідовностей вірусів і под. У Крім того, екстремофільні організми родини разі використання РНК у якості джерела темплату Archea можуть переносити дуже низькі рН і високі для синтезу комплементарних ланцюгів ДНК може температури. Генетичні модифікації деяких видів з застосовуватися зворотна транскриптаза. цієї родини можуть давати штами для вироблення Далі, для ідентифікації й одержання молекули молочної кислоти. нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид з фер4. Генетичні аспекти ментативною активністю, можуть застосовуватися Молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує поліметоди гібридизації нуклеїнових кислот. У якості пептид з ферментативною активністю, можна ідензонда для ідентифікації подібної молекули нуклеїтифікувати й одержувати у будь-який спосіб. Нанової кислоти шляхом гібридизації за умов у діаприклад, для визначення того, чи має дана пазоні від помірних до жорстких можуть викориснуклеїнова кислота будь-яку гомологію послідовтовуватися будь-які молекули нуклеїнових кислот ностей з відомими ферментативними поліпептиабо їхні фрагменти, що кодують відомий фермендами, можуть застосовуватися стандартні методи тативний поліпептид. Такі подібні молекули нуклесеквенування нуклеїнових кислот і комп'ютерні їнових кислот можуть виділятися, піддаватися секпрограми, що транслюють нуклеїнокислотні послівенуванню і аналізуватися для визначення того, чи довності в амінокислотні послідовності на основі має кодований поліпептид ферментативну активгенетичного коду. Для порівняння різноманітних ність. послідовностей можуть застосовуватися програми Гібридизацію можна здійснювати шляхом Саупорівнювального аналізу послідовностей, напризерн- або Нозерн-аналізу для ідентифікації послідовності ДНК або РНК відповідно, що гібридизуклад, MEGALIGN (DNASTAR, Madison, WI, 1997). ється з зондом. Зонд можна позначити Крім того, молекули нуклеїнових кислот, що кодурадіоізотопом, наприклад, 32Р, ферментом, дигокють відомі ферментативні поліпептиди, можуть сигеніном або біотинілюванням. Аналіз ДНК або бути мутовані за допомогою загальновідомих споРНК можна проводити з електрофоретичним розсобів молекулярного клонування (наприклад, сайтділянням на агарозному або поліакриламідному спрямованого мутагенезу). До числа можливих гелі, перенесенням на нітроцелюлозну, нейлонову при цьому мутацій входять, але не обмежуючись або іншу підходящу мембрану і гібридизацією зі лише ними, делеції, інсерції, заміни основ, а також зондом за допомогою стандартних методів, добре різноманітні комбінації делецій, інсерцій і замін відомих фахівцям у даній галузі і описаним у розоснов. Крім того, для ідентифікації нуклеїнокислоділах 7.39-7.52 [Sambrook et al., (1989) Molecular тної послідовності, що кодує поліпептид з ферменCloning, second edition. Cold Spring harbor тативною активністю, можуть використовуватися Laboratory, Plainview, NY]. Зонд, як правило, має нуклеїнокислотні і амінокислотні бази даних (надовжину принаймні близько 20 нуклеотидів. Наприклад, GenBank ). При цьому в якості запиту приклад, зонд, що відповідає 20-нуклеотидній посдля пошуку у базі даних GenBank може бути вилідовності і кодує цитратліазу ссавця, може бути користана будь-яка амінокислотна послідовність, застосований для ідентифікації молекули нуклеїкотра має деяку гомологію з поліпептидом, що має нової кислоти, що кодує грибковий поліпептид із ферментативну активність, або будь-яка нуклеїноцитроліазною активністю. Застосовуватися можуть кислотна послідовність, що має певну гомологію з також зонди довжиною як більше, так і менше, ніж послідовністю, котра кодує поліпептид з фермен20 нуклеотидів. тативною активністю. Ідентифіковані таким чином Для введення екзогенної молекули нуклеїнової поліпептиди можуть бути проаналізовані для викислоти в клітини можуть застосовуватися будь-які значення того, чи виказують вони ферментативну підходящі способи. Фахівцям у даній галузі добре активність. відомі численні способи уведення нуклеїнової кисМолекули нуклеїнових кислот, що кодують далоти в дріжджові клітини. Серед них можна названий поліпептид з ферментативною активністю, ти, наприклад, трансформацію, електропорацію, можуть бути ідентифіковані й одержані за допомокон'югацію і злиття протопластів, див., наприклад, гою загальновідомих способів молекулярного кло[Ito et al., J. Bacterol. 153:163-168 (1983); Durrens et нування або хімічного синтезу нуклеїнових кислот, al., Curr. Genet. 18:7-12 (1990); Becker and включаючи PCR (полімеразно-ланцюгову реакцію). Guarente, Methods in Enzymology 194:182Терміном «PCR» тут називають спосіб, за допомо187(1991)]. гою якого цільову нуклеїнову кислоту ампліфікуСлід зауважити, що екзогенна молекула нуклеють так, як описано в патенті США №4,683,195, а їнової кислоти в дріжджовій клітині за даним винатакож описані тут подальші модифікації цього споходом може знаходитися у будь-якій відповідній собу. У загальному випадку для конструювання формі. Наприклад, вона може бути інтегрована в олігонуклеотидних праймерів, що є ідентичними геном клітини або витримуватися у стані епісоми. або подібними за послідовністю протилежним лаІншими словами, клітина за даним винаходом монцюгам потенційного темплату, що піддається же бути стабільним або перехідним трансформанампліфікуванню, використовуються дані про постом. Крім того, як зазначалося вище, запропонолідовності з кінців потрібної ділянки або за їх мевані дріжджові клітини можуть містити одну або жами. За допомогою PCR нуклеїнокислотна послічисленні копії (наприклад, приблизно 5, 10, 20, 35, довність може бути ампліфікована від РНК або 50, 75,100 або 150 копій) даної екзогенної молекуДНК. Наприклад, нуклеїнокислотна послідовність ли нуклеїнової кислоти. може бути виділена шляхом PCR-ампліфікації із Способи експресії амінокислотної послідовновсієї клітинної РНК, всієї геномної ДНК і кДНК, а 25 77386 26 сті із екзогенної молекули нуклеїнової кислоти донерування нокаут-організмів. Іншими словами, бре відомі фахівцям у даній галузі. В число таких послідовність рекомбінації може використовуватиспособів входить, наприклад, конструювання нукся для специфічного дезінтегрування локусу, що леїнової кислоти таким чином, щоб регуляторний містить нуклеїнокислотну послідовність, яка кодує елемент стимулював експресію послідовності нукданий фермент. Термін «вибрана послідовність» леїнової кислоти, що кодує поліпептид. Як правивключає у себе будь-яку нуклеїнокислотну посліло, регуляторними елементами є послідовності довність. Як правило, вибрана послідовність кодує ДНК, які регулюють експресію інших послідовносполіпептид з ферментативною активністю, що тей ДНК на рівні транскрипції. Отже регуляторниприводить до створення органічного продукту в ми елементами можуть бути, без обмеження, проклітині. Таким чином, конструкції нуклеїнових кисмотори, енхансери, тощо. Що стосується способів лот за даним винаходом можуть використовуватиекспресії поліпептиду із екзогенної молекули нукся для усунення активності ендогенного ферменту леїнової кислоти в дріжджах, то вони також добре і добавлення активності екзогенного ферменту в відомі фахівцям у даній галузі. Наприклад, добре одну стадію. У більшості випадків вибрана послівідомі конструкції нуклеїнових кислот, здатні ексдовність знаходиться в послідовності рекомбінації пресувати екзогенні поліпептиди в Kluyveromyces, таким чином, що вибрана послідовність закривадив., наприклад, [Патенти США №№ 4,859,596 і ється на кожному кінці даною послідовністю реко4,943,529]. мбінації. Як зазначалося вище, дріжджові клітини за 5. Вироблення органічного продукту і способи даним винаходом містять екзогенну молекули нуккультивування леїнової кислоти, яка, наприклад, кодує поліпепДаним способом пропонуються способи виротид з ферментативною активністю, що має реблення органічних продуктів за допомогою запрозультатом створення органічного продукту. Добре понованих дріжджових та інших мікробних клітин. відомі способи ідентифікації клітин, які містять Ці способи передбачають надання дріжджових екзогенну нуклеїнову кислоту. В число таких споклітин і культивування наданих дріжджових клітин собів входять, не обмежуючись лише ними, спосов культурному середовищі таким чином, щоб утвоби PCR і гібридизації нуклеїнових кислот, і серед рювався органічний продукт (наприклад, гліцерол, них Нозерн- і Саузерн-методи аналізу. У Деяких акрилат, ксилоза, аскорбат, лактат, цитрат, ізоцитвипадках для визначення того, чи містить дана рат, -кетоглютарат, сукциніл-СоА, сукцинат, фуклітина конкретну нуклеїнову кислоту, можуть замарат, малат і оксалоацетат. В цілому культурне стосовуватися методи імуногістохімії і біохімічні середовище і/або умови культивування можуть методи з виявленням експресії ферментативного бути поділені на дві категорії: ті, що стимулюють поліпептиду, кодованого даною молекулою нуклеклітинне дихання і/або вироблення біомаси, і ті, їнової кислоти. Наприклад, для визначення того, що знижують клітинне дихання. Як правило, кульчи містить дана дріжджова клітина цей кодований турне середовище і/або умови культивування, що фермент, може використовуватися антитіло, спестимулюють клітинне дихання, використовуються цифічне до даного кодованого ферменту. Далі, в ситуаціях, коли потребується швидкий ріст або для визначення того, чи містить дана клітина моколи вироблюваний органічний продукт не може лекулу нуклеїнової кислоти, що кодує ферментабути одержаний без клітинного дихання. В число тивний поліпептид, можуть застосовуватися біохітаких продуктів входять без обмеження продукти мічні методи з виявленням органічного продукту, циклу Кребса, тощо. З іншого боку, культурне севиробленого в результаті експресії даного фермередовище і/або умови культивування, що знижунтативного поліпептиду. Наприклад, виявлення ють клітинне дихання, використовуються в тих лактату після уведення екзогенної молекули нукситуаціях, коли швидкий ріст не потребується або леїнової кислоти, що кодує поліпептид з лактатдене є бажаним, або ж коли вироблюваний органічгідрогеназною активністю, в дріжджову клітину, яка ний продукт може бути одержаний без клітинного звичайно не експресує такий поліпептид, може дихання. В число таких продуктів входять лактат, означати, що ця дріжджова клітина не тільки місакрилат, ксилоза та інші. Використовуваний тут тить уведену екзогенну молекулу нуклеїнової кистермін «стимулювання клітинного дихання» або лоти, але також експресує кодований фермента«стимулювання вироблення біомаси» стосовно тивний поліпептид із цієї уведеної екзогенної умов культивування означає, що умови культивумолекули нуклеїнової кислоти. Фахівцям у даній вання клітин підтримуються такими, щоб джерело галузі добре відомі методи виявлення специфічної вуглецю в культурному середовищі метаболізуваферментативної активності або наявності даних лося переважно шляхом окисного дихання або для органічних продуктів. Наприклад, наявність лактавироблення біомаси. Використовуваний тут термін ту може бути визначена так, як описано в роботі «біомаса» означає суху масу організму. Викорис[Witte et al., J. Basic Microbiol. 29:707-716 (1989)]. товуваний тут термін «переважно метаболізоваВинаходом пропонується також конструкція ний для вироблення біомаси» означає, що на кожнуклеїнової кислоти, що містить послідовність рений грам витраченого (наприклад, принаймні 0,4, комбінації і вибрану послідовність. Використову0,45, 0,5 або 0,6 грами біомаси) джерела вуглецю ваний тут термін «послідовність рекомбінації» сто(у формі карбогідрату) виробляється принаймні сується будь-якої нуклеїнокислотної послідовності, 0,3г біомаси. У загальному випадку на кожний грам що відповідає геномній послідовності, яка знаходжерела вуглецю виробляється приблизно від 0,3 диться усередині клітини. Описані тут послідовнодо 0,6г біомаси. Способи визначення кількості біості рекомбінації можуть використовуватися для маси (сухої маси клітин) в культурі добре відомі у спрямування рекомбінаційних подій в процесі геданій галузі і включають у себе, наприклад, такі, 27 77386 28 що описані в [Postma et al., "Enzymic analysis of the межуючись лише ними, рН, температура і наявCrabtree effect in glucose-limited chemostat cultures ність певних джерел вуглецю (наприклад, глюкоof Saccharomyces cerevisiae", Appl. Environ. зи). Слід зауважити, що деякі культурні середовиMicrobiol., 53, 468-477 (1989); Kiers et al., ща і/або умови культивування, які стимулюють "Regulation of alcoholic fermentation in batch and клітинне дихання дріжджів одного виду, можуть chemostat cultures of Kluyveromyces lactis CBS зменшувати клітинне дихання дріжджів іншого ви2359", Yeast, 14,459-469 (1998)]. Добре відомі таду. Наприклад, наявність глюкози в культурному кож методи визначення кількості спожитого джесередовищі зменшує клітинне дихання дріжджових рела вуглецю, серед яких можна назвати, наприклітин позитивного фенотипу дикої яблуні, але при клад, методи HPLC (рідинної хроматографії цьому мало впливає або зовсім не впливає на клівисокої розрізнювальної спроможності). тинне дихання дріжджових клітин негативного феСлід зауважити, що ефективність використаннотипу дикої яблуні. ня джерела вуглецю може залежати від самого Керована зміна умов культивування у промисджерела вуглецю і використовуваного організму. ловому виробничому процесі може, згідно з вищеОтже у разі використання складного культурного викладеним, являти собою важливу стадію у досясередовища, яке включає у себе окрім карбогідрагненні оптимальних рівнів бажаного органічного тних також інші джерела вуглецю, кількість біомапродукту. Звичайно, дріжджова клітина згідно з си, вироблюваної на грам джерела вуглецю, все даним винаходом вирощується за умов культивуодно визначається лише як кількість біомаси, вивання, що стимулюють клітинне дихання у розрароблюваної на грам спожитого карбогідратного хунку на вироблення суттєвої клітинної густини. джерела вуглецю. Наприклад, дріжджові клітини можуть поміщуватиУ загальному випадку культурне середовище, ся в посудину для культивування і в достатку защо містить інгібітор клітинного дихання (наприбезпечуватися глюкозою і киснем. Звичайно, за клад, антиміцин А, ціанід, азид), може зменшувати умов, що стимулюють клітинне дихання, час дупліклітинне дихання, у той час як відсутність таких кації для запропонованих тут мікроорганізмів інгібіторів може клітинне дихання стимулювати. складає менше ніж приблизно 10 годин (наприПодібним чином анаеробні умови культивування клад, менше ніж приблизно 8, 5 або 3 години). Як можуть зменшувати клітинне дихання, у той час як тільки клітини досягають значної густини, умови аеробні умови культивування можуть клітинне дикультивування можуть бути змінені на такі, що хання стимулювати. Аеробними є такі умови, за знижують клітинне дихання таким чином, щоб вияких кисень уводиться або постачається природроблявся органічний продукт, який не потребує ним шляхом і служить у якості основи для респіраклітинного дихання. Наприклад, дріжджові клітини торного шляху процесу перетворення. Взагалі, можуть бути перенесені в посудину для культивутермін «аеробний» стосується умов культивуванвання і забезпечені у достатку глюкозою, але без ня, за яких культурне середовище витримується в кисню. У цьому випадку керована зміна умов кульпотоці повітря величиною принаймні 0,1 WM тивування з аеробних на анаеробні може привести (об'єм повітря/об'єм рідини/хвилина) (наприклад, до вироблення оптимальних кількостей бажаного більше ніж 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 WM). Якщо органічного продукту. В альтернативному варіанті замість повітря використовується інший газ, то культивування клітин може проводитися лише за номінальна величина WM встановлюється на ріумов, що стимулюють клітинне дихання так, що вень повітряного еквівалента, який визначається виробляється органічний продукт, який клітинне кількістю кисню в газі. В альтернативному варіанті дихання потребує. Слід зауважити, що клітинна культурне середовище може визначатися як «аемаса у посудині для культивування звичайно старобне», якщо вміст у ньому розчиненого кисню новить більше 2г/л (наприклад, більше ніж прибскладає принаймні 2% (наприклад, 5, 10, 20, 30, лизно 4, 6 або 8г/л). 40, 50, 60, 75, 80%) відносно його кількості за наВ процесі культивування температура може сичених умов культивування у повітрі під атмосскладати більше 35°С (наприклад, більше ніж приферним тиском. близно 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 або 45°С). Анаеробними є такі умови культивування, за Крім того, культурним середовищем може бути яких респіраторний процес перетворення умисне рідина. Культурне середовище, звичайно, містить або природним шляхом практично позбавляється джерело вуглецю. У загальному випадку джерело кисню, що приводить, наприклад, до вироблення вуглецю включає у себе сировинні матеріали, що такого відновленого продукту, як етанол. Взагалі, містять вуглеводи. Звичайно, живильне середоумови, за яких культурне середовище містить розвище містить також джерело азоту. У кращому чинений кисень (DO: dissolved oxygen) у кількості варіанті джерело азоту включає у себе комбінацію менше, ніж приблизно 2,0% (наприклад, менше ніж органічних і неорганічних азотовмісних сполук. приблизно 1,5, 1,0 або 0,5% або дорівнює приблиМожливий робочий режим з наповненням везно 0%), вважаються анаеробними. Подібним чиликої ферментаційної посудини культурним сереном умови, де WM (об'єм повітря/об'єм рідидовищем, в яке входять всі потрібні живильні рени/хвилина) є менше ніж приблизно 0,1 човини і всі вуглеводні у кількості, достатній як для (наприклад, менше ніж приблизно 0,05 або доріввироблення біомаси, так і для вироблення бажанонює приблизно 0), розглядаються як анаеробні. го продукту. Посудина може працювати в умовах, Під використовуваним тут по відношенню до WM де спочатку стимулюється вироблення біомаси, терміном «повітря» мається на увазі атмосферне наприклад, шляхом створення аеробних умов з повітря. До інших умов культивування, які можуть наступною зміною їх на анаеробні умови для вивпливати на клітинне дихання, належать, не оброблення бажаного продукту. 29 77386 30 В іншому робочому режимі може використовуінокуляції умови культивування регулюють таким ватися мала посудина для вироблення біомаси з чином, щоб джерело вуглецю використовувалося високим рівнем живильних речовин і достатньою переважно для вироблення біомаси. Наприклад, кількістю вуглеводу для продукування, наприклад, культурне середовище може бути відрегульоване 100г/л біомаси. Вміст цієї посудини після цього на величину рН приблизно 7,0, температуру прибможна перенести до більшої посудини з другим лизно 35°С і вміст розчиненого кисню, що створює культурним середовищем, яке містить меншу кільанаеробне середовище в усьому баку. Слід закість живильних речовин, наприклад, лише глюкоуважити, що бажаний органічний продукт може зу в якості джерела вуглецю або інше вуглеводне вироблятися на цій фазі продукування біомаси. По джерело вуглецю у воді. Ця посудина може прадосягненні достатньої кількості біомаси бульйон з цювати в анаеробних умовах для вироблення бамікроорганізмами може бути перенесений до дружаного органічного продукту. Ріст біомаси при гого баку. Другий бак може мати будь-які розміри, цьому зменшується завдяки зниженню рівня жиза потребою, - більше, менше, або таких самих вильних речовин і анаеробним умовам. розмірів, що й перший бак. Зазвичай, другий бак є У кращому варіанті здійснення винаходу жибільшим ніж перший у тому розрахунку, щоб до вильне середовище містить лише потрібні матерібульйону з першого баку можна було добавляти али з метою спрощення видобування цільового додаткове культурне середовище. Окрім цього, продукту. Використання аеробного росту дозволяє культурне середовище в другому баку може бути використовувати спрощене культурне середовище таким самим, що й в першому баку, або відрізняпорівняно з тим, що потребується при рості в анатися від нього. Наприклад, перший бак може місеробних умовах. Багато з описаних тут дріжджів тити середовище з ксилозою й арабінозою, а друможуть культивуватися в аеробних умовах у серегий - середовище з глюкозою. довищі, що складається лише із цукру, неорганічПісля перенесення культурного середовища у ного джерела азоту, слідів мінералів і деяких вітадругий бак умови культивування можуть бути відмінів. регульовані так, щоб джерело вуглецю використоПеред тим як в результаті ферментації чи інвувалося, головним чином, на вироблення органіших процесів в культурному середовищі добавлячного продукту, який поряд з іншими речовинами ється органічний продукт, це культурне середовиможе включати у себе продукти переробки піруваще, зазвичай, має рН у межах приблизно від 5,0 ту і двоокис вуглецю (СО2), але не містити біомаси до 7,0. Проте, як тільки в культурне середовище (тобто сухої маси клітин). Використовуване тут мікроорганізмом секретуються органічні продукти, словосполучення «виробляти, головним чином, такі як органічні кислоти, рН культурного середовибраний органічний продукт» або «вибраний вища отримує тенденцію до зменшення. Викориспродукт переробки пірувату» стосовно умов культовуваний тут термін «органічний рН» стосується тивування означає, що джерело вуглецю в культурН культурного середовища, який визначається рному середовищі піддається метаболічному пенаявними у середовищі органічними сполуками, ретворенню, як правило, шляхом ферментації якими є, наприклад, вуглеводи і, зокрема, молочна (хоча і не обов'язково) для створення принаймні кислота. Термін «неорганічний рН» стосується рН, 0,5г органічного продукту на грам спожитого джевідповідальними за який є неорганічні сполуки, рела вуглецю (наприклад, принаймні 0,6, 0,75 або таких, наприклад, як НСІ і H2SO4. Культурне сере0,8г органічного продукту). Способи визначення довище може мати величину органічного рН менкількостей виробленого органічного продукту і/або ше ніж приблизно 3,0 (наприклад, менше ніж приспожитого джерела вуглецю добре відомі і вклюблизно 2,9, 2,8, 2,7, 2,6, 2,5, 2,4, 2,3, 2,2, 2,1, 2,0, чають у себе, у тому числі, наприклад, HPLC. 1,9, 1,8, 1,7, 1,6 або 1,5) або величину неорганічЯк зазначалося вище, ефективність викорисного рН менше ніж приблизно 3,0 (наприклад, метання джерела вуглецю може варіювати залежно нше ніж приблизно 2,9, 2,8, 2,7, 2,6, 2,5, 2,4, 2,3, від використовуваних основи і організму. Отже, у 2,2, 2,1, 2,0, 1,9, 1,8, 1,7, 1,6 або 1,5). В процесі разі використання комплексного середовища роскультивування може використовуватися будь-яке ту, яке включає у себе інші, ніж вуглеводи, джереджерело вуглецю. Наприклад, використовуватися ла вуглецю (наприклад, амінокислоти), кількість може середовище, що містить пентозу (наприклад, вироблюваного органічного продукту або продукту рібозу, арабінозу, ксилозу і ліксозу). Крім того, мопереробки пірувату на грам спожитого джерела жна використовувати середовище, що містить гідвуглецю буде визначатися лише кількістю органічролізат маїсового волокна. Гідролізат маїсового ного продукту або продукту переробки пірувату, волокна може мати величину рН у межах від 2,0 виробленого на грам спожитого вуглеводного до 6,5. Зазвичай, гідролізат маїсового волокна джерела вуглецю. Краще, якщо на цій стадії виромістить глюкозу, ксилозу й арабінозу. Наприклад, бляється не більше ніж 0,3г біомаси на грам джевміст в ньому глюкози може складати приблизно рела вуглецю (наприклад, не більше ніж 0,2, 0,1 40г/л, ксилози - приблизно 40г/л і арабінози - приабо 0,05г біомаси). близно 20г/л. Культурне середовище може бути відрегульоУ великомасштабних промислових процесах ване, наприклад, на такий вміст розчиненого кисвикористовуватися може ціла низка способів. ню, щоб створювати анаеробне середовище в Один з них полягає в тому, що в бак великої ємноусьому баку, або щоб містити інгібітор клітинного сті (наприклад, 50, 100, 200 і більше галонів) з віддихання. Крім того, культурне середовище може повідним культурним середовищем, що містить, бути відрегульоване так, щоб підтримувати задану наприклад, гексозне і/або пентозне джерело вугвеличину рН (наприклад, кислотну, нейтральну лецю, інокулюють певний мікроорганізм. Після або основну). В альтернативному варіанті величи 31 77386 32 на рН середовища для культивування може також У загальному випадку, за анаеробних умов регулюватися періодично, без підтримання будьАТФ («клітинна валюта» за енергію) виробляється якого її конкретного рівня. Зазвичай, при виробшляхом фосфорилювання рівня субстрату. В реленні органічної кислоти величина рН культурного зультаті фосфорилювання рівня субстрату енергія середовища підтримується на рівні вище, ніж призвільнюється із хімічних зв'язків і накопичується, наймні 1,5 (наприклад, принаймні 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, головним чином, у формі АТФ. 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5 або 7,0). Далі, в процесі У якості утворення рівня субстрату може слукатаболічного перетворення мікроорганізмами жити перетворення глюкози на піруват шляхом наданих вуглецевих джерел температура в баку гліколізу: підвищується. Отже культурне середовище може Глюкоза=2Пірувати+2АТФ+2Н2. бути відрегульоване так, щоб підтримувати задану Піруват після цього може перетворюватися на температуру. Температура культурного середомолочну кислоту: вища може також регулюватися періодично без Піруват+2Н2=Лактат. підтримання заданого рівня. Зазвичай, у разі викоЧиста енергія, вироблена в результаті цих перистання теплочутливих мікроорганізмів темпераретворень, є еквівалентною 2 АТФ. тура культурного середовища підтримується на Далі піруват може бути підданий переробці у рівні менше ніж приблизно 35°С (наприклад, ментрикарбонокислотному (ТСА) циклі і генерувати ше ніж приблизно 34, 33, 32, 31 або 30°С), у той додаткову енергію і атоми водню: час як при використанні нечутливих до тепла мікПіруват+3Н2О=3СО2+АТФ+5Н2. роорганізмів температура середовища підтримуЧиста реакція глюкозного дихання має вигляд: ється меншою ніж 45°С (наприклад, менше ніж 44, Глюкоза+6Н2О=6СО2+4АТФ+12Н2. 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36 або 35°С). Слід зауваТаким чином, шляхом фосфорилювання рівня жити, що біомаса може вироблятися на цій фазі субстрату повне респіраційне перетворення глювироблення органічного продукту. Крім того, умови кози на СО2 дає чисту енергію, еквівалентну 4 АТФ культивування у другому баку можуть бути змінені і 24 атомам водню. один раз або змінюватися багатократно так, щоб У механізмі «електронного перенесення» окивиробляти не продукт, а біомасу, і навпаки. Наприсно-відновні потенціали сполук, що складають клад, умови культивування в другому баку можуть члени «ланцюга електронного перенесення», зрівбути анаеробними більшу частину часу з коротким новажуються так, що кожний член може відновлюімпульсним постачанням розчиненого кисню так, ватися відновленою формою попереднього члена. щоб періодично створювалися аеробні умови. Отже відновна сила, як і електрони, може прохоЗгідно з іншим способом умови культивування дити через ланцюг носійних молекул до кінцевого можуть змінюватися так, щоб підвищувати метаакцептора електронів, яким може бути кисень (О2), болічну енергію мікроорганізму, що культивується, нітрат (NO3) і фумарат. Добавлення кінцевого акнаприклад, шляхом добавлення кінцевого акцепцептора електронів, тобто кисню, нітрату або футора електронів. Використовуваний тут термін марату, в культурне середовище може дати мікро«метаболічна енергія» стосується енергії (виражеорганізму підвищену метаболічну енергію ної в АТФ), видобутої даним організмом із енерге(наприклад, збільшене вироблення АТФ за тої сатичного джерела (наприклад, вуглецевого). За тих мої кількості спожитого вуглецевого джерела). самих умов кількість метаболічної енергії, отримаНайкращим кінцевим акцептором електронів є ної організмом через метаболізм джерела вуглекисень. цю, є більшою ніж кількість енергії, отриманої від Якщо в якості кінцевого акцептора електронів того самого джерела вуглецю за інших умов. використовується кисень, то водень може бути Живі клітини є високоупорядкованими і повинперепущений через ланцюг електронного перенені забезпечувати в собі порядок для того, щоб висення і надати клітині додатково 1,5 АТФ на атом жити і рости. Для підтримання порядку усередині водню і 4 АТФ на атом кисню. У загальному випадорганізму в ньому кожної миті відбуваються тисячі ку кількість метаболічної енергії може визначатися різноманітних хімічних реакцій. Наприклад, клітишляхом вимірювання відношення кількості спожинам потрібна енергія для реакцій біосинтезу, натого кисню до кількості спожитої глюкози. В Табл.1 приклад, таких, як реакції полімеризації ДНК, РНК і наведені дані максимального і мінімального побілків, і для утворення метаболічних продуктів. ліпшення енергетичного виходу (молі АТФ на молі Клітинам потрібна також енергія для постачання в глюкози) при добавленні кисню в процесі виробклітини субстратів, утримання метаболітів, підтрилення в залежності від виходу продукту, який знимання відповідного тургорного тиску і внутрішньожується внаслідок втрати пірувату на ТСА-цикл (а го рН, а також для забезпечення рухомості. отже на дихання). Максимальне поліпшення у відОскільки енергія не може бути ні створена, ні сотках було одержане, припускаючи, що віднозруйнована, клітинам для підтримання порядку шення Р/О складає 3, у той час як мінімальне попотрібно уводити її із навколишнього середовища. ліпшення припускає величину Р/О=0,5. В Табл.2 Енергія із навколишнього середовища постачаєтьпоказана оцінена максимальна кількість кисню, ся у формі електромагнітного випромінювання або витраченого на моль спожитої глюкози. Добавленхімічної енергії. Енергія, отримана із навколишньоня кисню може стимулювати мінімальний ріст, що го середовища, використовується клітиною за одбуде ізолювати вуглець для біосинтезу, залишаюним з двох загальних біохімічних механізмів - фочи невелику його кількість для дихання (а отже для сфорилювання рівня субстрату і електронного використання кисню). переносу. 33 77386 34 ним постачати короткими імпульсами розчинений кисень. Краще, якщо «постачання короткими імпульсами розчиненого кисню» створює культурне Максимальне Мінімальне поВихід продукту середовище з концентрацією розчиненого кисню поліпшення ене- ліпшення енер(лактат/глюкоза, не більше 0,5 відсотка, а ще краще, якщо в межах ргетичного ви- гетичного вихог/г) приблизно від 0,1 до 0,5 відсотка. В альтернативходу, % ду, % ному варіанті швидкість росту або клітинне утри1,0 0% 0% мання мікроорганізмів в процесі анаеробної фер0,9 160% 35% ментації можуть бути прискорені добавленням 0,8 320% 70% інших кінцевих акцепторів електронів, якими є, 0,7 480% 105% наприклад, нітрат або фумарат. Кисень при цьому 0,6 640% 140% додається в кількостях, як раз достатніх для збі0,5 800% 175% льшення метаболічної енергії мікроорганізму за 0,4 960% 210% підтримання продуктивності на бажаному рівні. 0,3 1120% 245% При цьому повинні бути прийняті заходи щодо 0,2 1280% 280% уникнення надмірного зниження виходу. Цей ме0,1 1440% 315% тод може бути застосований також для того, щоб 0,0 1600% 350% поліпшити споживання залишкових цукрів і тим самим ще більше спростити процес відновлення. Таблиця 2 6. Способи очищення органічного продукту Для відділяння виробленого продукту можуть Вихід продукту (лакМоль кисню на моль застосовуватися будь-які підходящі способи. Натат/глюкоза, г/г) глюкози приклад, для видалення біомаси з живильного 1,0 0,0 бульйону можуть застосовуватися загальновідомі 0,9 0,6 способи розділяння, а для видобування органічно0,8 1,1 го продукту із живильного бульйону без мікроорга0,7 1,6 нізмів можуть застосовуватися загальновідомі 0,6 2,1 способи відокремлювання (наприклад, екстрагу0,5 2,6 вання, дистиляції й іонного обміну), див., наприклад, [Патент США №4,275,234, Патент США 0,4 3,1 №5,510,526, Патент США №5,831,122, Патент 0,3 3,6 США №5,641,406 і Міжнародна патентна заявка № 0,2 4,1 WO 93/00440. Крім того, цільовий органічний про0,1 4,6 дукт може відокремлюватися від живильного бу0,0 5,1 льйону як під час його вироблення, так і по закінченні стадії вироблення. Слід зауважити, що Таким чином, для поліпшення метаболічної умови культивування у другому баку можуть регуенергії мікроорганізмів у клітинній культурі в цю люватися таким чином, щоб процес відокремлюкультуру в якості кінцевого акцептора електронів вання поліпшити. Наприклад, рН і температуру в може добавлятися кисень. Тоді як максимальний другому баку можна відрегулювати таким чином, молярний вихід молочної кислоти із глюкози склащоб цільовий органічний продукт преципітував із дає 2молі лактату на моль глюкози, а молярний розчину, або приймав форму, більш підходящу вихід АТФ із глюкози складає 2молі АТФ на моль для відокремлювання. Зокрема, величина рН орглюкози, добавлення кисню в якості кінцевого акганічних кислот може сприяти преципітації із розцептора електронів дозволяє певну кількість піручину, коли рН бульйону є меншим за величину рКа вату скеровувати в лимонно-кислотний (ТСА) для органічної кислоти. Наприклад, умови культицикл, де він перетворюється на СО2 і енергію. Отвування при виробленні глутамінової кислоти може постачання кінцевого акцептора електронів жуть бути такими, що рН буде складати менше «підвищує метаболічну енергію» мікроорганізму. 2,19, тобто менше величини рКа для глутамінової Відведення пірувату в ТСА-цикл приводить до кислоти. Таким чином, регулювання рН, темперазниження кількості інших продуктів переробки пітури і вмісту живильного бульйону може полегшурувату (таких, як молочна кислота). Наприклад, вати відокремлювання органічного продукту. Крім 10% зниження виходу може привести до генерутого, можуть вибиратися генетично відрегульовані вання у 2,6 рази більшої кількості метаболічної для конкретного процесу дріжджі, а специфічні енергії для даного мікроорганізму, 20% зниження умови культивування можуть бути відрегульовані виходу може привести до генерування у 4,2 рази таким чином, щоб побічні продукти в живильному більшої кількості метаболічної енергії для даного бульйоні не перешкоджали видобуванню цільовомікроорганізму, а 50% зниження виходу може приго органічного продукту. вести до генерування 9-кратно більшої кількості Зрозуміло, що описані тут способи і матеріали метаболічної енергії для даного мікроорганізму. можуть бути пристосовані і використовуватися в Можна очікувати, що на більш пізніх стадіях процесах культивування будь-якого типу, включапроцесу, коли з'являються високі рівні метаболічючи без обмеження такі загальновідомі процеси, них продуктів, наприклад, молочної кислоти, клітияк «безперервна ферментація» і «періодична фена може потребувати більшої кількості метаболічрментація». Крім того, мікроорганізми, використоної енергії для підтримання функціонування. вувані у виробничому процесі, можуть піддаватися Таким чином, для мікроорганізмів в анаеробвідновленню і використовуватися знову у наступному культурному середовищі може стати потрібТаблиця 1 35 77386 36 них виробничих процесах. Наприклад, для вироббільше ніж приблизно 0,5 г/(г·година). Завдяки вилення бажаного органічного продукту одні й ті самі сокій питомій продуктивності процесів, здійснювамікроорганізми можуть використовуватися багато них згідно з даним винаходом, енергія, необхідна разів. Стосовно джерела вуглецю немає жодних для підтримання клітин, може одержуватися шляобмежень, і для вироблення як біомаси, так і бахом ферментації за практично анаеробних умов, жаного органічного продукту можуть використовуне звертаючись до аерації для генерування веливатися у якості джерела вуглецю, наприклад, алоких кількостей енергії респіраторним шляхом. Слід за, альтроза, глюкоза, маноза, гулоза, йодоза, зауважити, що практично анаеробні посудини аегалактоза, талоза, мелібіоза, сахароза, фруктоза, руються з витратою менше ніж приблизно 0,1 WM. рафіноза, стахіоза, рібоза, арабіноза, ксилоза, В деяких робочих ситуаціях аерація не потребуліксоза, крохмаль, наприклад, маїсовий крохмаль і ється. Крім того, вихід продукту (тобто грам оргапшеничний крохмаль, і гідролізати, якими є, нанічного продукту на грам спожитого джерела вугприклад, гідролізати маїсового волокна та інші лецю) у даному варіанті здійснення, як правило, целюлозні гідролізати. Крім того, живильне серестановить більше ніж приблизно 70% (мас.) і задовище також може бути будь-якого підходящого безпечується без добавлень таких вуглецевих типу. Наприклад, застосовувати можна стандартне джерел, як етанол і ацетат. У деяких випадках для культурне середовище (наприклад, дріжджове досягнення питомої продуктивності, достатньої мінімальне середовище і середовище YP (дріждля генерування енергії, потрібної для підтриманджовий екстракт 10г/л, лептонний бульйон 20г/л)), ня клітин, може бути потрібним, крім того, підсиа також такі середовища, як маїсова мерсеризалювати шлях процесу від глюкози до пірувату для ційна вода і маїсовий мерсеризаційний луг. забезпечення процесу вироблення бажаного проСуттєвою перевагою даного винаходу є те, що дукту необхідними ферментами. кращим мікроорганізмам і, зокрема, вирощуваним В іншому варіанті здійснення послідовний виза аеробних умов, може потребуватися мінімальна робничий процес може бути спроектований таким кількість культурного середовища. Анаеробне вичином, щоб можливістю стерилізувати була надіроблення, як правило, не потребує додаткових лена лише високоаерована посудина росту. Анаеживильних речовин, і, таким чином, кінцевий проробна культиваційна посудина працює при темпедукт може бути відокремлений від відносно чисторатурах, як правило, вище ніж приблизно 35°С го ферментаційного бульйону будь-яким відповід(наприклад, вище 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ним шляхом. Для відділяння органічних кислот від або 45°С). Мало які дріжджі дикого типу зможуть ферментаційних бульйонів може застосовуватися вижити і конкурувати з генетично модифікованими добре відома технологія екстрагування рідких редріжджами за таких температур, оскільки рН в човин рідинами і забезпечувати при цьому високий процесі вироблення продукту падає. Головною ступінь очищення. Але даний винахід дозволяє причиною цього є те, що вони не мають шляху застосовувати також більш прості, менш дорогі і підсиленої ферментації, який може генерувати менш енергоємні способи. потрібну для утримання клітин енергію. Крім того, В одному з варіантів здійснення даного винадріжджі можуть бути модифіковані так, щоб містиходу використовуються генетично модифіковані ти «плазміди-кілери», описані вище, які здатні задріжджі негативного фенотипу дикої яблуні у поспобігти виживанню дріжджів інших видів. лідовному процесі з «переключенням» метаболічВинаходом пропонуються також різноманітні ного шляху по досягненню критичної густини кліспособи культивування дріжджових клітин. Напритин, коли потребується різкий зріст питомої клад, дріжджова клітина негативного фенотипу продуктивності вироблення бажаного органічного дикої яблуні може культивуватися в живильному продукту. Для переключення метаболічного шляху середовищі як з величиною органічного рН менше процесу, як правило, використовується перенеприблизно 3,0, так і такого, що містить гідролізат сення біомаси із високоаерованої посудини у маїсового волокна. Серед інших способів культипрактично анаеробну посудину, що викликає кисвування дріжджових клітин можна назвати, наприневе голодування. Слід зауважити, що в якості клад, культивування дріжджових клітин негативноджерела вуглецю як у фазі росту, так у фазі вирого фенотипу дикої яблуні при температурі більше, блення продукту може використовуватися загальніж приблизно 35°С, у живильному середовищі, ний вуглевод (наприклад, глюкоза або ксилоза). яке або має величину неорганічного рН менше Для успішного здійснення даного варіанту викориприблизно 3,0 або містить пентозу чи гідролізат стання генетично модифікованих дріжджових клімаїсового волокна. тин негативного фенотипу дикої яблуні може стати Винаходом пропонується також спосіб одервирішальним фактором. Крім того, питома продукжання органічного продукту. Цей спосіб включає у тивність вироблення бажаного органічного продуксебе вирощування мікроорганізму в умовах культу також може бути визначальною у досягненні тивування і зміну цих умов культивування на такі, позитивного результату. Використовуваний тут що стимулюють вироблення органічного продукту. термін «питома продуктивність» окреслює кільВ даному способі мікроорганізм має знижену пірукість виробленого продукту і виражається в грамах ватдекарбоксилазну, алкогольдегідрогеназну, органічного продукту, виробленого із граму біомаальдегіддегідрогеназну і/або ацетил-СоА-синтазну си (сухої маси) за годину, тобто г/(г·година). Заактивність і виказує швидкість росту за відсутності звичай, питома продуктивність вироблення таких етанолу й ацетату, яка складає принаймні 30% органічних продуктів, як лактат і акрилат, стано(наприклад, приблизно 35, 40, 50, 75, 100, 150, вить більше ніж приблизно 0,1 г/(г·година), напри200% або більше) від тієї, що спостерігається у клад, більше ніж приблизно 0,2 г/(г·година) або відповідного мікроорганізму, який не має зниженої 37 77386 38 піруватдекарбоксилазної, алкогольдегідрогеназhelveticus і Pediococcus acidilactici ної, альдегіддегідрогеназної і/або ацетил-СоАІз вирощуваних протягом ночі культур синтазної активністі. Умови культивування, що Lactobacillus helveticus (Американська колекція стимулюють клітинне дихання, як правило, викотипових культур АТСС 10797) і Pediococcus ристовуються в тих ситуаціях, де потребується acidilactici (ATCC 25741 ) виділили геномну ДНК за швидкий ріст або де бажаний органічний продукт допомогою набору PUREGENE для відокремлюне може вироблятися без клітинного дихання, у вання геномних ДНК (Gentra systems, Minneapolis, той час як умови культивування, що знижують кліMN). Для виділення нуклеїнової кислоти, що кодує тинне дихання, використовуються в тих ситуаціях, лактатдегідрогеназу, із геномних ДНК L helveticus де швидкий ріст не потребується або де бажаний (Ih-ldh oligos) і P. acidilactici (pa-ldh oligos), були органічний продукт може вироблятися без клітинсконструйовані PCR-праймери. Ці праймери консного дихання. труювалися на основі генних послідовностей для Нижче наведені приклади, які ілюструють далактатдегідрогеназ у базах даних Genbank і мали ний винахід, не обмежуючи його об'єму, визначетакі послідовності: 5' Ih-ldh, 5'ною Формулою винаходу. CCGGGATCCATGGCAAGAGAGGAAAAACCTC-3' Приклади (SEQ. ID NO:3); 3' Ih-ldh, 5'Приклад 1. Рекомбінантна плазміда CCAAGATCTTTATTGACGAACCTTAACGCCAG-3' pHES/pSEH (SEQ. ID NO:4); 5' pa-ldh, 5'Описана в [Chien et al. (Proc. Nat'l Acad Sci., CCGGGATCCATGTCTAATATTCAAAATCATCAAAA 88(21):9578-9582 (1991)] плазміда pGAD424 у кільAG-3' (SEQ. ID NO:5); і 3' pa-ldh, S'кості 0,5мкг була перетравлена ферментом рестCCAAGATCTTTATTTGTCTTGTTTTTCAGCAAG-3' рикції Hindlll. Перетравлену суміш відділили за (SEQ. ID NO:6). Праймери були оптимізовані за допомогою гель-електрофорезу на 0,8% агароздопомогою програми Primer Designer від фірми ному гелі з використанням ТВЕ-буферу. Після цьоSci-ed software (Durham, NC). Разом із 100нМ го від гелю був очищений 5,9 kbp фрагмент, як праймерів використовувався 1мкМ геномної ДНК. описано в [Sambrook et al., Molecular Cloning, Для PCR-підсилювання лактатдегідрогеназної second edition. Cold Spring harbor Laboratory, (LDH) нуклеїнової кислоти використовувалася Plainview, NY (1989)]. Була розроблена комплемеДНК-полімераза Pfu (New England Biolabs) так, як нтарна пара 92 bp синтетичних олігомерів з чисописано в [Sambrook et al., Molecular Cloning, ленними сайтами розпізнавання ферменту рестsecond edition. Cold Spring harbor Laboratory, рикції. Перший з них був позначений fwd hes oligo і Plainview, NY (1989)]. мав таку послідовність: 5'Аналогічна методика використовувалася для CCCAAGCTTGAATTCCCCGGGGGATCCCTGCAG виділення нуклеїнової кислоти, що кодує LGGTACCACGCGTAGA лактатдегідрогеназу, із геномної ДНК таких мікроTCTACTAGTGCGGCCGCCTCGAGTCTAGAGGGC організмів, як Bacillus sp., наприклад, Bacillus CCAAGCTTGGG-3' (SEQ. ID NO:1). Другий був megaterium (ATCC 6458), Rhizopus oryzae (ATCC позначений comp hes oligo і мав таку послідов76275) або будь-якого іншого організму, що продуність: 5'кує лактат (включаючи такі мікроорганізми, як гриCCAAGCTTGGGCCCTCTAGACTCGAGGCGGCCG бки і бактерії, а також багатоклітинні організми, CACTAGTAGATCTAC якими є, наприклад, ссавці) або із тканини організGCGTGGTACCCTGCAGGGATCCCCCGGGGAATT му, що продукує лактат. Геномну ДНК виділяли із CAAGCTTGGG-3' (SEQ. ID NO:2). Ці два комплевирощуваної культури організму за допомогою ментарні олігомери в кількості 500нмолів були набору PUREGENE для відокремлювання геномпіддані відпалюванню один з одним шляхом кип'яних ДНК (Gentra systems, Minneapolis, MN). Були тіння протягом 10 хвилин з наступним поступовим сконструйовані відповідні PCR-праймери для видіохолодженням до кімнатної температури. Дволанлення нуклеїнової кислоти, що кодує лактатдегідцюгова 92 bр (пар основ) ДНК була перетравлена рогеназу, на основі LDH-генних послідовностей ферментом Hindlll і лігована з 5,9 kbp pGAD424, для цих видів, що є в базі даних Genbank. У загаперетравленим Hindlll. Ця суміш лігування була льному випадку разом із 100нМ відповідних прайвикористана для трансформування клітин DH10B мерів використовували 1мкМ геномної ДНК. Для Е. соlі (електромаксимальні клітини Life ампліфікації лактатдегідрогеназної (LDH) нуклеїTechnologies, Rockville, MD) шляхом електропоранової кислоти із відповідної геномної ДНК викорисції, як описано в [Sambrook et al., Molecular Cloning, товувалася ДНК-полімераза Pfu (New England second edition. Cold Spring harbor Laboratory, Biolabs) або будь-яка інша підходяща ДНКPlainview, NY (1989)]. Рекомбінантні клітини Е. соlі полімераза і метод PCR, описаний, наприклад, в були посіяні на планшети з бульйоном Luria[Sambrook et al., Molecular Cloning, second edition. Bertani, і клітини, що містили плазміду, були відібCold Spring harbor Laboratory, Plainview, NY (1989)]. рані за допомогою 100мкг/мл ампіцилінового антиВ альтернативному варіанті нуклеїнову кислобіотика. Плазмідна ДНК була відділена від ампіциту, що кодує лактатдегідрогеназу, виділяли із ліностійких клонів Е. соlі, в результаті чого були Kluyveromyces theromotolerans ATCC 52709, отримані дві плазміди pHES і pSEH (Фіг.1 і 2). Ці Trichoderma Reese/ATCC 13631, Torulaspora плазміди мали різні орієнтації синтетичного олігоpretohensis ATCC 36245 або із будь-якого іншого меру відносно алкогольдегідрогеназного промотоорганізму, що продукує лактатдегідрогеназу, за ра ADH1 на векторі. будь-якої з таких методик. Приклад 2. PCR-ампліфікація нуклеїнової кис1) Бібліотеку геномних кДНК із одного з цих орлоти, що кодує лактатдегідрогеназу із Lactobacillus ганізмів клонували в стандартний вектор експресії 39 77386 40 pUC19 Ε. coli за допомогою стандартного методу геномної ДНК. Для підсилення фрагментів L[Sambrook et al., (1989) Molecular cloning: a лактатдегідрогеназної (LDH) нуклеїнової кислоти laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor згідно з відомими PCR-методами, наприклад, опиLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]. Цією саними в [Sambrook et al., (Molecular Cloning, бібліотекою трансформували мутантний штам second edition, Cold Spring harbor Laboratory, NZN111 Ε. coli (Idh pfl) [Bunch et al., (1997) "The Plainview, NY (1989)], використовували ДНКIdhA gene encoding the fermentative lactate полімеразу Pfu (New England Biolabs) або будь-яку dehydrogenase of Escherichia coli," Microbiology, іншу підходящу ДНК-полімеразу. 143:187-95], і клітини вирощували в анаеробних Приклад 3. Клонування L helveticus і P. умовах у середовищі М9, доповненому казаміноacidilactici у вектор pCRII вою кислотою. Будь-яка Ε. coli, вирощувана в цих PCR-ампліфіковані LDH DNA-продукти були умовах, кодує або лактатдегідрогеназу чи є реверліговані з векторами pCRII (Фіг.3 і 4) за допомогою тантом Idh, або pfl. Позитиви (колонії, що утворюнабору для клонування ТА від фірми Invitrogen ються в цих анаеробних умовах росту) відбирають (Carlsbad, CA). Одержану суміш лігування викориза їхньою LDH-активністю за допомогою колористали для трансформування DH10B Е. соlі у спометричного аналізу специфічного до молочної соби, описані в [Sambrook et al., Molecular Cloning, кислоти м'якого агарового покриття (LASSO: lacticsecond edition. Cold Spring harbor Laboratory, acid specific soft-agar overlay), здатного розрізнюPlainview, NY (1989)]. Вектори pCRII із вищезазнавати (L)-LDH і (D)-LDH [Witte et al., J. Basic ченого набору дозволяли швидко клонувати PCRMicrobiol. 29:707-716 (1989)]. Після цього із клонів, продукти згідно з рекомендаціями виробника. Векякі за припущенням могли експресувати Lтори pCRII з LDH-генами із L Helveticus і P. лактатдегідрогеназу, виділяли і секвенували плазAcidilactici показані на Фіг.4. мідну ДНК. Приклад 4. Рекомбінантна плазміда pLh Idh2) K. thermotolerans ATCC 52709, Т. reesei HES/pPa Idh-HES з LDH генами із L helveticus і P. ATCC 13631 і Torulaspora pretoriensis ATCC 36245 Acidilactici у векторі pHES є еукаріотами, що продукують L-молочну кислоту Вектори pCRII, що містили LDH ген із L при культивуванні в анаеробних умовах [Witte et helveticus і P. acidilactici, були перетравлені відпоal., J. Basic Microbiol. 29:707-716 (1989)]. Таким відними ендонуклеазами рестрикції. Подібним чичином, згідно з даним способом принаймні один з ном такими самими ендонуклеазами рестрикції цих штамів вирощували в анаеробних умовах для був перетравлений вектор pHES. Після цього до індукування лактатдегідрогеназної ферментатив6,0 kbp вектора pHES була лігована 1 kbp вставка, ної активності. Далі, за допомогою стандартних що містила LDH із векторів pCRII, за допомогою способів одержували безклітинні екстракти, які ДНК-лігази Т4, як описано в [Sambrook et al., піддавали очищенню у відомі способи очищення Molecular Cloning, second edition. Cold Spring білка для відділення лактатдегідрогеназного ферharbor Laboratory, Plainview, NY (1989)]. Отриману менту. Підходящі для цього способи очищення таким чином суміш лігування використали для лактатдегідрогенази описані, наприклад, в [Kelly et трансформування DH10B (електромаксимальні al., (1978) "Affinity chromatography of bacterial клітини, Life Technologies, Rockville, MD) E. coli, і lactate dehydrogenases," Biochem J, 171(3):543-7]. були вибрані рекомбінантні клони для забезпеченПісля очищення білка його частково розщепили і ня стійкості до ампіциліну. ДНК, виділена із рекомпіддали секвенуванню для визначення амінокисбінантних клонів, була проаналізована на підтверлотної послідовності. Отриману амінокислотну дження векторів pLh Idh-HES і рРа Idh-HES (Фіг.5). послідовність далі використовували у конструюЦі вектори містять гени, що кодують LDH із L ванні дегенеративних праймерів для виділення helvecticus і P. acidilactici у векторі pHES під керугена, що кодує лактатдегідрогеназу із геномної ванням дріжджового алкогольдегідрогеназного ДНК. промотора (ADH1). Еукаріотична LDH, така, як виділена із К. Приклад 5. Клонування LDH-гена Bacillus sp.. thermotolerans, або Trichoderma reseei, або Rhizopus oryzae. К. thermotolerans,. Trichoderma Torulaspora pretoriensis, може функціонувати краreseei або Torulaspora pretonensis для експресії з ще (з погляду на транскрипційну ефективність, використанням генного промотора Saccharomyces трансляційну ефективність і/або білкову активPDC1 ність) в дріжджах K. marxianus порівняно з LDH із Поряд з тим, що для керування експресією лабактеріальних джерел, якими є, наприклад, ктатдегідрогеназного гена, клонованого в K. Bacillus або Lactobacillus. marxianus, можна використовувати лактатдегідро3) Використовуючи відомі послідовності еукагеназний промотор, що знаходиться в Rhizopus ріотичних лактатдегідрогеназних генів, отримувані oryzae, K. thermotolerans, Trichoderma reseei або із бази даних Genbank, конструювали дегенератиTorulaspora pretonensis, для керування експресією вні праймери для виділення гена для лактатдегідвиділеного лактатдегідрогеназного гена можна рогенази із геномної ДНК еукаріотів K. використовувати промотор PDC1 із Saccharomyces thermotolerans АТСС 52709, Т. reesei АТСС 13631 cerevisiae. Гліколітичні промотори із або Torulaspora pretoriensis ATCC 36245. Серед Saccharomyces cerevisiae з успіхом використовуLDH-генних послідовностей для конструювання валися для експресії генів в штамах Kluyveromyces дегенеративних праймерів використовували кон[Gellissen and Hollenberg, (1997) "Application of сервований сайт зв'язування NAD+ i консервоваyeasts in gene expression studies: a comparison of ний сайт зв'язування пірувату. Разом із Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha 100нмолями праймерів використовували 1мкМ and Kluyveromyces lactis - a review," Gene, 41 77386 42 190(l):87-97]. Реакцію проводили згідно з протоколами, описаТаким чином, промотор PDC1 із ними в [Sambrook et al., Molecular Cloning, second Saccharomyces cerevisiae отримують шляхом edition. Cold Spring harbor Laboratory, Plainview, NY конструювання відповідних олігомерних прайме(1989)]. На Фіг.6б показаний кінцевий лінійний рів, використовуючи геномну послідовність продукт з описаними гомологіями. Saccharomyces cerevisiae із бази Genbank. ПосліДля поліпшення подібності одержання негатидовність гена PDC1 і 1 Kb ділянки навколо гена вного штаму pdc K. marxianus були приготовані PDC1 підсилюють за допомогою методів PCR. додаткові конструкції. Для цього був виділений 5,5 Отримуваний в результаті 4 Kb фрагмент ДНК kbp фрагмент навколо 1,7 kbp PDC1-гена K. містить як промотор, так і термінатори, що керують marxianus (Фіг.6В) за допомогою методів PCR і експресією гена PDC1. Між промотором і термінагеномної «прогулянки» (Clonetech). Після цього 5,5 торами, що керують експресією гена PDC1, вклюkbp фрагмент за стандартними методами був клочають численні сайти ферментів рестрикції так, нований у вектор pCRII клонування із набору ТА щоб різноманітні LDH-гени могли вставлятися під (Invitrogen). За допомогою гідролізатів рестрикції контролем промотора PDC1 і термінаторів. 4 Kb [Sambrook] із 5,5 kbp фрагмента K. marxianus була фрагмент ДНК вставляють у відповідний вектор, видалена частина довжиною приблизно 370 bр яким є, наприклад, шатл-вектор із Saccharomyces поблизу середини 1,7 kbp ділянки PDC1 кодуванcerevisiae або Е. соlі на основі pUC19. Після цього ня. Видалений фрагмент мав таку послідовність: LDH-ген уводиться у вектор в одному з численних сайтів клонування під контролем промотора і термінаторів так, що експресія лактатдегідрогеназного гена контролюється промотором PDC1 і термінатором (Фіг.14). В альтернативному варіанті подібним чином для експресії клонованого LDHгена в K. marxianus можуть використовуватися інші гліколітичні промотори Saccharomyces, наприклад, такі, що керують експресією гліцеральдегід-3Далі, із вектора pPIC9K (Invitrogen) за допомофосфатдегідрогеназних або фосфогліцераткіназгою стандартного метода рестрикції, див. них генів Saccharomyces cerevisiae. [Sambrook et al.] був виділений ген стійкості до Приклад 6. Ампліфікація лінійних фрагментів канаміцину і його промотор і клонований у сайт в гомологічної ДНК для генних розривів піруватде5,5 kbp, із якого був видалений вищезазначений карбоксилази фрагмент. Ген pPIC9K (Invitrogen) стійкості до каБув сконструйований 82 bр олігомерний прайнаміцину і його промотор були вставлені так, що мер (5'kmPDC1Ko), який містив 51 bр, ідентичних вставлена ділянка мала таку послідовність: 5'-кінцю піруватдекарбоксилази (PDC) із K. marxianus і 30 bр, ідентичних 5'-кінцю промотора ADH1 із векторів pHES. Праймер 5'kmPDC1Ko мав таку послідовність: 5'TAAACAGTACAATCGCAAAGAAAAGCTCCACACC CA AACCAAATAATTGCAATGCAACTTCTTTTCTTTTTT TTTСТТТТСТ-3' (SEQ. ID NO:7). Послідовність для PDC-генів із дріжджів (K. marxianus або Y. stipitis або Н. polymorpha) була отримана із зазначеної послідовності від бази Genbank. Подібним чином був сконструйований зворотний 79 bр олігомер (3'kmPDC1Ko) так, що 54 bр його були ідентичними 3'-кінцю PDC-гена, а 22 bр - 3'-кінцю термінатора ADH1. Олігомер 3'kmPDC1Ko мав таку послідовність: 5'TTATAAAATCATTAAAATCCAAAATCGTAATTTATC TCTTTATCCTCTCCCTCTCTACAT GCCGGTAGAGGTGTGGTCA-3' (SEQ. ID NO:8). Були сконструйовані праймери для ампліфікації лінійного фрагмента ДНК із плазмід pLhldh-HES і pPaldh-HES таким чином, що цей фрагмент містив повний лактатдегідрогеназний ген разом із промотором ADH1 і термінатором (Фіг.6). PCRампліфікований продукт також мав кінці, гомологічні послідовностям із: PDC1 K. marxianus; PDC1 і PDC2 Yamadazyma stipitis; PDC1 і PDC2 Hansenula polymorpha. Реакція ампліфікації була проведена з використанням ДНК-полімерази Pfu (New England Biolabs; Beverly, MA). В цій реакції разом з 5 одиницями полімерази і 100нмолями олігомерів викоОтримана в результаті конструкція містила ген ристовувалися 100нг pLhldh-HES або pPaldh-HES. 43 77386 44 стійкості G418, оточений приблизно 5 kbp pdcїї центрифугуванню @4K, 4 хвилини, видаляли ділянки, як показано на Фіг.6С. Була приготована супернатант; с) планшет промивали 1мл холодним подібна конструкція ДНК, яка містила внутрішній ЕВ (ЕВ = електропораційний буфер: 10мМ Trisген G418, оточений 2,3 kbp PDC1 К. marxianus у HCI, рН 7,5; 270мМ сахароза; 1мМ MgCI2); d) ресувекторі pCRII, як показано на Фіг.6D. спендували в 1мл IB (IB = інкубаційний буфер: Приклад 7. Використання лінійного фрагмента YPD; 25мМ DTT; 20мМ Hepes, pH 8,0); e) струшуДНК для розірвання ендогенної PDC кодувальної вали (@ 800об/хв, 30°С протягом 30 хвилин на послідовності й одночасної інсерції LDH кодувальприладі Eppendorf Thermomixer; f) піддали ної послідовності центрифугуванню, промивали один раз ЕВ, ресусОписаний в Прикладі 5 лінійний фрагмент пендували в 400мкл ЕВ; g) додавали 3мкг фрагДНК, створений за методом PCR, використовуваментної ДНК (у воді 10мМ Tris-CI, pH 8,5), інкубули у трансформуванні K. marxianus, Yamadazyma вали на льоду протягом 30 хвилин; h) переносили stipitis і Hansenula polymorpha. У трансформуванні в 0,4см електропораційну кювету; режим імпульсвикористовувався протокол, описаний в публікації ної обробки на приладі Bio-Rad Gene Pulser: [Wesolowski-Louvel et al., Nonconventional yeasts in 1000В, 1000Ом, 50мкФ; стала часу після імпульсу: Biotechnology: Kluyveromyces lactis, ed. Klaus Wolf, приблизно 20мс; і) переносили до 3мл пробірки Springer verlag, Berlin, p.138-201 (1996)]. Коротко, Мортона-Клозюра (Morton Closure), інкубували без методика полягала в тому, що 5мл вирощуваної струшування при 30°С протягом 1 години; додавапротягом ночі культури після центрифуги промили ли 400мкл рідкого YPAD-середовища (YPAD: 10г електропораційним буфером (10нМ Tris-HCI, дріжджового екстракту, 20г пептону, 20г глюкози, 270нМ сахарози, 1нМ МgСІ2, рН 7,5). Промиті клі100мг аденінгемісульфату, об'єм 1л, без регулютини піддали інкубуванню протягом 30 хвилин при вання рН), струшували @ 800об/хв, 30°С протягом 30°С в інкубаційному буфері (дріжджовий екстракт 1 години в приладі Eppendorf Thermomixer; дода5г/л, лептонний бульйон 10г/л, глюкоза 10г/л, 25нМ вали 400мкл рідкого YPAD і регенерували протяDTT, 20нМ HEPES, рН 8,0). По закінченні інкубугом 4-6 годин; j) піддавали центрифугуванню у вання клітини знову промили і ресуспендували в мікровідцентровій пробірці @ 4К, 4 хвилини, вида4мкл інкубаційного буферу. До цих клітин додали ляли супернатант, ресуспендували в 400мкл 1Μ 20нг ДНК, і клітини піддали імпульсній обробці на сорбітолу; k) висівали на 200мкг/мл С418приладі Bio-Rad Gene Pulser у режимі 1800 вольт, селективні планшети; і І) інкубували при 30°С про1000Ом, 25мкФ у 0,4см кюветі. тягом 3-5 днів. Клітини висіяли на звичайні YPD (дріжджовий Колонії піддавали скринінгу спочатку другою екстракт 10г/л, лептонний бульйон 20г/л, глюкоза корекцією покриття на 300мкг/мл G418. Геномну 20г/л, агар 15%) планшети, і колонії залишили на ДНК відокремлювали від вторинного дріжджового регенерацію протягом 72 годин. Кожний із цих петчу за стандартною методикою геномного препланшетів з колоніями реплікували на свіжих YPDпарування [Sambrook]. Далі їх піддавали PCRпаншетах та інкубували протягом 48 годин. Далі скринінгу на 1) наявність фрагмента канаміцину, колонії покрили шаром 6,5% м'якого агару (0,5% використовуючи підходящі праймери й умови агар у 300мМ Tris-HCI, 187мМ глютамат, рН 8,3). [Sambrook], і 2) відсутність розірваної pdc-ділянки, До покритих планшетів додали суміш для забарввикористовуючи підходящі праймери і PCR-умови. лення (3,2мл 1% агару, 1,6мл 120мМ Tris, 75мМ Колонії, які були-позитивні по маркеру селекції і глютамат, рН 8,3, 0,4мл 2мг/мл феназинметосунегативні по ділянці розриву pdc, піддавали кульльфату, 7 одиниць глутаматпіруваттрансамінази і тивуванню і аналізували за допомогою HPLC на 7 одиниць L(+)-лактатдегідрогенази із м'яза свині). фізіологію. Геномну ДНК із цих штамів аналізували Дріжджі забарвлювалися у блакитні вінця високої за методом Саузерн-гібридизації. L(+)-форми протягом 10-120 хвилин. Цей метод є Приклад 8. Характеристики росту клітин подібним методу, запропонованому в роботі 1. Низький рН і висока температура [Subden et al., Canadian J. Microbiol., 28:883-886 Вирощувані протягом ночі культури K. (1982)] і модифікованому Бітом [Witte et al., (J. marxianus були інокульовані в 50мл дріджового Basic Microbiol. 29:707-716 (1989)]. Колонії відібрамінімального середовища згідно з [Kiers et al., ли, а відокремлені від колоній ДНК піддали PCRYeast, 14(5):459-469 (1998)]. У якості джерела вуганалізу і секвенували для виявлення розірваних лецю використовували 100г/л глюкози. Вирощувапіруватдекарбоксилазних генів. ні протягом ночі культури витримувались при 40°С В іншому варіанті здійснення клони, описані в і були інокульовані в середовище, яке також виПрикладі 6 і показані на Фіг.6с і 6d, піддали травтримувалося при 40°С. Добавлення інокулянту ленню двома ферментами рестрикції [Sambrook et привело до зміни рН середовища від 5,5 до 2,5. al.], отримавши приблизно 3мкг фрагментної ДНК, Протягом експерименту рН залишався на рівні 2,5. що містила гомологічну PDC-ділянку, усередину Концентрацію глюкози вимірювали за допомогою послідовності якої був уставлений ген стійкості до YSI-мембрани, а оптичну густину (OD: optical канаміцину. Цим фрагментом за відомими метоdensity) - за допомогою спектрофотометра. дами, наприклад електропорації, трансформували Глюкоза була використана протягом 72 годин, К. marxianus з розірванням його pdc. засвідчуючи те, що метаболічна активність протяУ загальному випадку електропорацію здійсгом цього часу культивування виникає в умовах нювали таким чином: а) вирощували культуру мікнизького рН і високої температури (Фіг.7). Крім роорганізму в YPAD протягом ночі (приблизно 15 того, в період між 48 і 72 годинами біомаса трохи годин) в об'ємі 20мл; b) переносили 500мкл цієї зменшилася, вказуючи на те, що катаболізм клітин культури до мікровідцентрової пробірки, піддавали випереджав анаболізм (Фіг.7). 45 77386 46 2. Пентозні джерела вуглецю з яких містила 50мл дріжджового YPD-середовища Вирощувані протягом ночі культури K. (дріжджовий екстракт 10г/л, лептонний бульйон marxianus були інокульовані у три 50мл колби, що 20г/л, глюкоза 20г/л), а також 40г/л молочної кисмістили дріжджове мінімальне середовище згідно лоти. Добавлення молочної кислоти зробило рН з [Kiers et al., Yeast, 14(5):459-469 (1998)]. В усіх 2,8. Величину рН у трьох колбах відрегулювали до трьох колбах містилися різні джерела вуглецю: в зазначеного рівня за допомогою NaOH. У процесі першій колбі містилася 10% глюкоза, в другій культивування температура підтримувалася на 10% D-ксилоза, а в третій 10% L-арабіноза. Колби рівні 30°С, і періодично проводилися вимірювання інкубувалися при 30°С за періодичних вимірювань оптичної густини. В кожній колбі спостерігався оптичної густини. процес росту культур (Фіг.11). Через 40 годин вихід біомаси дріжджових куПриклад 9. Рекомбінантні клітини, здатні прольтур з глюкозою і ксилозою був однаковий, а у дукувати акриліл-СоА дріжджової культури з арабінозою - менший Організм (наприклад, Ε coli), не спроможний (Фіг.8). Аналіз росту цих дріжджових культур вивикористовувати акрилат у якості джерела вуглеявив наявність у ньому початкового запізнення. цю, трансформували бібліотекою геномних ДНК Так, дріжджі, культивовані з арабінозою, мали поClostridium propionicum. Геномну бібліотеку С. чаткове запізнення тривалістю в декілька годин, у propionicum створили за допомогою плазміди той час як у дріжджів, культивованих з ксилозою pHES так, що вона експресувала 10 kbp фрагменвоно виявилося значно більш виразним (Фіг.8). ти геному С. propionicum. Трансформовану Е. соlі Наявність такого запізнення свідчить про те, що висівали на селективне середовище, яке в якості дріжджові клітини потребують певного часу для джерела вуглецю містило лише акрилову кислоту. адаптації до ксилозних і арабінозних вуглецевих Росли при цьому лише ті клітини, які були спромоджерел. Очевидно, цей час потребується для індужні асимілювати акрилат. Акрилат, зазвичай, асикування синтезу поліпептидів, що за нормальних мілюється шляхом ферментоопосередкованої умов не експресуються. конверсії його на лактат. Лактат, у свою чергу, мо3. Гідролізат маїсового волокна при низькоже конвертуватися на піруват і використовуватися му рН клітинами в циклі Кребса. Культивовані протягом ночі культури K. У разі вибору трансформованих Ε. coli із геноmarxianus були інокульовані у колби, що містили мної бібліотеки виділяли плазміду ДНК, і вставледріжджове мінімальне середовище згідно з [Kiers ний фрагмент піддавали секвенуванню. Секвеноet al., Yeast, 14(5):459-469 (1998)]. В усіх колбах у ваний фрагмент сканували по відкритих рамках якості джерела вуглецю містився 30% гідролізат зчитування для визначення кодувальної послідовмаїсового волокна. Гідролізат був приготований за ності для ферментів, залучених у конверсію між допомогою реакції маїсового волокна з 1,2% сірлактатом і акрилатом (наприклад, лактоїл-СоАчаною кислотою при температурі 145°С протягом дегідрогеназою і СоА-трансферазами). 25 хвилин. Під час реакції геміцелюлоза розпадаВиділені клони, що містили кодувальну послілася на мономерні продукти - арабінозу, ксилозу і довність для цих ферментів, уводили у дріжджові глюкозу. Високотемпературні умови реакції викликлітини, описані в Прикладі 6, які містили лактаткали деструкцію деякої кількості арабінози і ксилодегідрогеназу і не мали піруватдекарбоксилазної зи у фурфурал, а деякої кількості глюкози - у гідроактивності. Рекомбінантні дріжджові клітини, що ксиметилфурфурал. HPLC аналіз гідролізату містили уведену нуклеїнову кислоту, вибирали за показав наявність у ньому 38,7г/л глюкози, 39,1г/л допомогою G418 (300г/л). Після відокремлення ксилози, 20,7г/л арабінози і 1,6г/л фурфуралу. Крім рекомбінантні дріжджові клітини вирощувалися в того, гідролізат мав рН 1,51. Перед культивуванаеробних умовах на глюкозі з подальшим перекням дріжджів рН гідролізату маїсового волокна був люченням умов на анаеробні. Після цього живильвідрегульований на рівень 3,0. В процесі культивуний бульйон збирали і аналізували на акрилат за вання періодично проводилися вимірювання оптистандартною HPLC-методикою, як описано в чної густини. [Danner et al., Biotechnological production of acrylic Культивовані з гідролізатом маїсового волокна acid from biomass. In: Applied Biochemistry and дріжджові клітини були здатні генерувати біомасу Biotechnology, Vol.70-72 (1998)]. (Фіг.9). Приклад 10. Рекомбінантні клітини, здатні 4. Варіювання рН продукувати аскорбат Вектори експресії модифікуВирощувані протягом ночі культури K. вали за допомогою генної інженерії таким чином, marxianus були інокульовані у чотири колби, кожна щоб експресувалися такі поліпептиди: 2,5з яких містила 50мл дріжджового YPD-середовища діоксовалератдегідрогеназа, 5-дегідро-4-деокси-D(дріжджовий екстракт 10г/л, лептонний бульйон глюкаратдегідратаза, глюкаратдегідратаза, альде20г/л, глюкоза 20г/л). Величини рН середовищ в гіддегідратаза, глюкоронлактонредуктаза і Lусіх колбах були різними і регулювалися за допоглюонолактоноксидаза. Нуклеїнокислотні послідомогою НСІ. У процесі культивування температура вності, що кодують ці поліпептиди, виділяли із різпідтримувалася на рівні 30°С, і крім того періодичноманітних мікроорганізмів. Модифіковані вектори но вимірювалася оптична густина. В кожній колбі експресії трансформували в дріжджові клітини спостерігався процес росту (Фіг.10). шляхом електропорації. Трансформовані дріж5. Культурні середовища з молочною кислоджові клітини аналізували для визначення того, чи тою і різними рН продукують вони L-аскорбат. Вирощувані протягом ночі культури К. Приклад 11. Рекомбінантні клітини, здатні виmarxianus були інокульовані у чотири колби, кожна робляти D-ксилозу 47 77386 48 Вектори експресії за допомогою методів генної робних умовах без розкладання альдегіду на ацеінженерії модифікували таким чином, щоб експретат альдегіддегідрогеназою. Крім того, якщо такі сувалися такі поліпептиди: 2-дегідро-3-деокси-Dдріжджові клітини не мають піруватдекарбоксилапентаноатальдолаза, ксилонатдегідратаза, ксилозної або альдегіддегідрогеназної активності, вони нолактоназа і D-ксилозодегідрогеназа. Нуклеїноповинні постачати ацетат для біосинтезу шляхом кислотні послідовності, що кодують ці поліпептиди, циклу Кребса. виділяли із Pseudomonas sp. Модифіковані вектоПриклад 14. Рекомбінантні клітини, які не мори експресії трансформували в дріжджові клітини жуть використовувати лактат у якості джерела шляхом електропорації. Трансформовані дріжвуглецю джові клітини аналізували для визначення того, чи Дріжджові клітини модифікували таким чином, продукують вони D-ксилозу або інші сполуки пенщоб знизити активність транспортера карбонової тозного джерела вуглецю. кислоти, подібного до поліпептиду JEN 1 S. Приклад 12. Рекомбінантні клітини, здатні виcerevisiae. Такі дріжджові клітини мають знижену робляти цитрат На основі нуклеїнокислотної посздатність переносити лактат, а отже використовулідовності аконітази S. cerevisiae (AcO1, номер ють його з меншою ефективністю. Активність традоступу М33131 в базі Genbank) були сконструйонспортера карбонової кислоти в дріжджових клітивані PCR-праймери. Ці праймери використовували нах знижували шляхом дезінтегрування локусу, що для клонування нуклеїнової кислоти, що кодує містить кодувальну послідовність для цього поліаконітазу із Kluyveromyces, Yamadazyma або пептиду. По-перше, використовуючи дегенеративні Hansenula. Після секвенування були створені ліпраймери, сконструйовані на основі доступної понійні конструкції, як описано в Прикладі 5, які були слідовності для JEN 1 (номер доступу U24155 в використані для дезінтегрування нуклеїнової кисбазі Genbank), із клітини-хазяїна виділили гомолог лоти, що кодує аконітазу, в дріжджових клітинах. У поліпептиду JEN 1. Виділену із клітини-хазяїна якості маркера селекції використовувався антибіонуклеїнову кислоту піддали секвенуванню. Дезінтик G418 замість продукування лактату, як описатегрування кодувальної послідовності для цього но в Прикладі 5. В якості нуклеїнової кислоти, що поліпептиду здійснювали за методикою, описаною забезпечувала стійкість до антибіотика G418, слув Прикладі 11. Лінійні фрагменти генерували шляжив неоміциновий/канаміциновий ген. Цей ген хом кодування ділянок, гомологічних послідовності одержували із вектора рРІС9К (Invitrogen) і вставJEN 1, а також усього гена стійкості до G418. Таляли у вектор pHES. Дріжджові клітини трансфоркий лінійний фрагмент інтегрували у геномну посмували PCR-генерованими лінійними фрагменталідовність JEN 1, викликаючи дезінтегрування дами, модифікованими так, щоб мати кінці, ної активності. Клітини, які не мали активності гомологічні АсО1, як описано вище. Був сконструтранспортера карбонової кислоти, ідентифікували йований лінійний фрагмент для кодування гена за їхньою нездатністю переносити карбонову кисстійкості до G418. Стійкими до антибіотика були лоту, а отже за їхньою нездатністю рости при кулише ті клітини, які мали інтегрований лінійний льтивуванні на лактаті. фрагмент у місці знаходження нуклеїнової кислоКрім того, клітини модифікували таким чином, ти, що кодує аконітазу. Ці клітини аналізували на щоб знизити активність функціонального еквівалепідхожу інтеграцію за допомогою PCR. Дріжджові нта цитохромного поліпептиду b2 S. cerevisiae. клітини, одержані у цей спосіб, мали частково фуЦитохромний поліпептид b2 дає можливість клітинкціональний ТСА-цикл і, таким чином, могли винам S. cerevisiae піддавати метаболічному перетробляти цитрат у надлишковій кількості. Цей цитворенню лактат в мітохондріях. Для цього передурат переносився крізь мітохондріальну мембрану в сім сконструювали дегенеративні праймери із живильний бульйон. Крім того, ці дріжджові клітини цитохромної послідовності b2 Saccharomyces (нобули наділені екзогенною молекулою нуклеїнової мер доступу Z46729 в базі Genbank). Ізольований кислоти, що кодує такий фермент, як АТФклон піддали секвенуванню. За допомогою метоцитратліазу таким чином, що вони каталізували дів, описаних в [Eds. Alison et al., in «Methods in конверсію акумульованого цитрату на оксалоацеYeast Genetics», Cold Spring Harbor Press (1997)], тат (див. Приклад 13). проводили дезінтегрування дріжджового хазяїна, Приклад 13. Рекомбінантні клітини, здатні ексгомологічного цитохрому b2. Ця рекомбінантна пресувати цитратліазу в цитозолі дріжджова клітина є нездатною використовувати Дріжджові клітини позитивного фенотипу дикої лактат у якості джерела вуглецю. яблуні трансформували плазмідою pHES з нуклеїПриклад 15. Вироблення лактату у великих кінокислотною послідовністю, що кодує поліпептид з лькостях АТФ-цитратліазною активністю. Цю нуклеїнову Були приготовані і вироблені численні варіанкислоту виділяють із Е. coli, Klebsiella рпеитопіае ти клітин К. marxianus зі зниженою PDC(номер доступу Х79817 в базі Genbank) або інших активністю. Ці варіанти модифікували таким чиопублікованих джерел. Трансформовані дріжджові ном, щоб вони містили різні кількості копій екзоклітини аналізували на їх здатність використовувагенної молекули нуклеїнової кислоти, що кодує ти цукри для вироблення великих кількостей ліпідполіпептид з LDH-активністю. LDH-поліпептид них накопичень. Дріжджові клітини також аналізуодержували із різноманітних джерел. Клітини тавали на предмет того, чи виявляли вони АТФких варіантів можуть мати різні питомі продуктивцитратліазну активність, як описано в [Holdsworth ності для молочної кислоти при 40°С. et al., J. Gen. Microbiol., 134:2907-2915 (1998)]. ДріУсі варіанти вирощувалися в посудині в аерожджові клітини, що мають АТФ-цитратліазну актибних умовах з потоком повітря 1,5 WM і 30% вмісвність, здатні постачати цитозольний ацетат в аетом розчиненого кисню для одержання клітинної 49 77386 50 густини приблизно 60г/л сухої маси. По досягненні посудину, або підкислювали, наприклад, сірчаною достатньої густини постачання повітря припиняли, кислотою й очищували. і умови в культиваційній посудині переключалися Приклад 17. Порівняння аеробного виробленна анаеробні. Основу не добавляли. Варіанти з ня організмів негативного (K. marxianus) і позитивнайвищою питомою продуктивністю в анаеробній ного (S. uvarum) фенотипів дикої яблуні фазі можуть бути виявлені не тільки за здатністю Організми негативного (K. marxianus) і позитибільш швидкого вироблення молочної кислоти, вного (S. uvarum) фенотипів дикої яблуні вирощуале також за здатністю досягати більш високої вали кожний в аеробному й анаеробному ферменконцентрації за нижчої рН, ніж варіанти з нижчою таційних реакторах періодичної дії. Культивування питомою продуктивністю. Вихід продукту на глюкопродукту по партіях здійснювали при температурі зі у фазі вироблення продукту може перевищувати 30°С в лабораторних ферментаторах робочим 90%. об'ємом 1,5л. Величину рН в посудинах підтримуБуло вибрано декілька варіантів, які культивували на рівні 5,0±0,1 шляхом автоматичного добавалися у ті самі способи, за винятком того, що повлення 2М/л-1 гідроксиду калію (КОН). Ферментатік повітря був знижений до 0,1 WM, але не виклютор обдували повітрям (аеробні культури) або чений повністю. За цих умов кінцевий рН в азотом (анаеробні культури) з витратою газу культиваційній посудині може бути нижчим, а кон0,8л/хв.-1 і перемішували зі швидкістю 800об/хв. центрація лактату може бути вищою, ніж при кульКонцентрацію розчиненого кисню постійно контротивуванні без доступу повітря. Вихід продукту на лювали за допомогою кисневого електроду (фірма глюкозі може знижуватися, але залишатися на Ingold, тип 34 100 3002). В аеробних культурах рівні приблизно 90%. У повторному експерименті, концентрація розчиненого кисню підтримувалася де потік повітря був збільшений до 0,5 WM, вихід на рівні вище 60%. Через відповідні інтервали часу продукту на глюкозі знизився до рівня менше 80%. відбирали 10мл зразки для визначення сухої маси Приклад 16. Вироблення великих кількостей і концентрацій метаболітів. У якості сполук, потріблактату з серією послідовних ферментацій них для синтезу жирних кислот, в анаеробні кульУ процесі з серією послідовних ферментацій у тури добавляли Tween-80 і ергостерол. якості інокуляту використовували культуру клітин У період експоненційного росту як суха маса і K. marxianus, які не мали PDC-активності, але маоптична густина OD660 дріжджових культур, так і ли LDH-активність. Кожну стадію ферментації концентрація глюкози й етанолу в супернатанті здійснювали у поступово збільшуваних посудинах, визначалися з відповідними інтервалами часу. кожну з яких стерилізували безпосередньо перед Питому продуктивність вироблення етанолу використанням. Крім того, у кожну посудину пода(qethanoI, ммоль/г/година) обчислювали за такою вали потік повітря 1,5 WM, а їхній вміст перемішуформулою, використовуючи лінійно-регресійний вали для підтримання в ньому постійної концентаналіз: рації розчиненого кисню на рівні вище 10%. Остання посудина мала ємність 6000л. ТемпераdE qethanol max туру в посудинах підтримували на рівні 45°С для dCx збільшення виживаності генетично модифікованих клітин K. marxianus порівняно з дріжджами дикого де dE/dt (швидкість зростання концентрації типу та іншими мікроорганізмами. Кожну посудину етанолу в культурі, ммоль/л/година) і dCx/dt (швизаправляли стандартним культурним середовидкість зростання концентрації біомаси, г/л/година) щем, розрахованим на оптимальне вирощування. обчислювалися шляхом диференціювання графіВміст останньої посудини з густиною клітин ків концентрації етанолу і концентрації біомаси в 100г клітин/л (сухої маси) переносили до оброблезалежності від часу max/година. Максимальна пиного перед тим паром реактора ємністю 300000л. тома продуктивність на глюкозі оцінювалася по Для добавлення найкраще використовувати клітиекспоненційній частині графіку залежності Сх від ни, одержані від фільтрації у попередніх виробничасу. Для обчислення питомої швидкості спожичих процесах. Густина клітин в реакторі складала вання глюкози (qglucose, ммоль/г/година) dE заміню6 г клітин на літр (сухої маси). Глюкозу добавляли вали на dG (кількість глюкози, спожитої за годину). до рівня 80г/л. В посудині підтримували анаеробні В аеробних партіях культур питома швидкість умови з температурою 42°С і періодом вирощуросту штамів Kluyveromyces і Saccharomyces на вання 25 годин. Питома продуктивність складала глюкозі складала відповідно 0,4/год. і 0,28/год. більше 0,5г лактату/(грам біомаси за годину) майВисока концентрація глюкози і зумовлена цим виже до кінця процесу, коли продуктивність починасока питома швидкість росту культури ла падати. Як тільки продуктивність починала паSaccharomyces давали високі швидкості аеробної дати, клітини видаляли і зберігали для повторного спиртової ферментації (Табл.3, Фіг.1). Питома використання. Кінцева концентрація лактату склашвидкість споживання глюкози штамом дала 75г/л, а рН дорівнював 2,8. Після видалення Saccharomyces була приблизно в 2 рази вищою, біомаси розчин концентрували шляхом випаровуніж у штаму Kluyveromyces внаслідок інтенсивної вання до 50% концентрації лактату. Вільну кислоту спиртової ферментації. З точки зору енергетики (близько 86% від загального лактату) видаляли спиртова ферментація є для клітин менш ефектишляхом рідинного екстрагування в органічне севним шляхом генерування АТФ. Вихід біомаси на редовище, звідки її знову екстрагували за більш глюкозі у Kluyveromyces складав 0,38г/г, а у високої температури у воду. Рафінад, який містив Saccharomyces uvarum 0,14г/г. Вихід етанолу на сіль лактату, очищали і спрямовували для повторглюкозі був нульовим у штаму Kluyveromyces неганого використання в якості буферу в культиваційну 51 77386 52 тивного фенотипу дикої яблуні і складав зитивного фенотипу дикої яблуні. 1,83ммоль/ммоль у Saccharomyces - культурі поТаблиця 3 Максимальна питома швидкість росту, питомі швидкості вироблення етанолу і споживання глюкози (q, ммоль/г біомаси/година), вихід біомаси (г/г), вихід продукту (ммоль/ммоль) і регенерування вуглецю (%) (обчислене тільки для анаеробних культур) на стадії експоненційного росту в партіях культур Saccharomyces uvarum і Kluyveromyces marxianus на мінеральному середовищі з умістом глюкози 2% (маса/об'єм) K. marxianus max /год qglucose qethanoI Yp/s Υx/s Регенер. С аеробні 0,38 5,8 0 0 0,38 S. uvaruw анаеробні 0,09 7,6 9,9 1,30 0,07 84,6 В анаеробних партіях культур питома швидкість росту і вихід біомаси в обох штамах були дуже низькими порівняно з тими, що спостерігалися в аеробних умовах (Табл.3, Фіг.1 і 2). У штамів Kluyveromyces і Saccharomyces вихід біомаси складав відповідно 0,07 і 0,09г/г. Обидва штами показали високу питому швидкість спиртової ферментації в анаеробних умовах. Це було підтверджене даними вироблення СО2. Таким чином, даний Приклад свідчить про те, що аеробне вироблення біомаси є значно більш швидким, ніж анаеробне, і що вихід біомаси за аеробних умов культивування є вищим в організмів негативного фенотипу дикої яблуні (оскільки в організмів позитивного фенотипу має місце деяка спиртова ферментація при використанні глюкози). Цей Приклад також показує, що продукт ферментації (у даному випадку - етанол) виробляється з однаковою швидкістю обома організмами - негативного і позитивного фенотипів дикої яблуні - в анаеробних умовах. Таким чином, анаеробна стадія росту забезпечує високий вихід біомаси, а наступна за нею анаеробна стадія ферментації постачає метаболічну енергію в процес створення аеробні 0,28 10,9 20 1,83 0,14 анаеробні 0,12 7,2 9,7 1,35 0,09 73,3 продукту, а не в процес росту культури. Отже процес, в якому вироблення продукту відділене від росту культури, забезпечує більшу технологічну гнучкість і кращий контроль виходу продукції. Приклад 18. Поліпшене вироблення лактату в штамі-хазяїні, який в природних умовах виробляє L-молочну кислоту: ампліфікація лінійних фрагментів гомологічної ДНК для дезінтегрування піруватдекарбоксилазних генів Дріжджі Kluyveromyces thermotolerans (K. thermotolerans) є природним виробником Lмолочної кислоти [Kurtzman and Fell, (1998) "The Yeasts, A Taxonomic Study" pp.240-241; Elsevier Science B.V.; Amsterdam, The Netherlands]. K. thermotolerans мають створюваний природним шляхом лактатдегідрогеназний (Idh) ген, котрий дозволяє виробляти L-молочну кислоту. Кількість молочної кислоти, вироблюваної за анаеробних умов, складає приблизно 4% г/г використовуваної глюкози, у той час як решта глюкози, головним чином, конвертується в етанол (42,5% г/г спожитої глюкози), гліцерол (3% г/г спожитої глюкози) і ацетат (0,3% г/г спожитої глюкози). Таблиця 4 Результати анаеробної ферментації при використанні K. thermotolerans, починаючи з 100г/л глюкози в середовищах YPAD (збагачені середовища) Час Глюкоза Молочна Ацетат Гліцерол Етанол 0 12 36 54 78 98 92,937 79,603 38,618 11,662 1,539 0,286 0 0,476 2,135 3,525 4,322 4,365 0 0 0 0,2 0,209 0,307 0 0,41 2,011 2,789 3,213 3,24 0,025 3,345 25,642 41,522 42,5 42,5 За допомогою консенсусних праймерів, сконструйованих із послідовності, виведеної шляхом порівняння генних послідовностей із K. marxianus і K. lactis була виділена 600 bр ділянка PDC1 із K. thermotolerans. Фрагмент PDC1 був підданий секвенуванню [Sanger] і використаний для виділення Молочна YSI 0,06 0,6 2,08 3,34 3,88 3,74 7,5 kbp фрагмента навколо pdd K. thermotolerans (Фіг.6Е) за допомогою методів PCR і геномної «прогулянки» (Clonetech). Далі 7,5 kbp фрагмент був клонований у вектор клонування pCRII набору ТА (Invitrogen). Частина довжиною приблизно 730 bр поблизу середини кодувальної ділянки PDC1 53 77386 54 була видалена із 7,5 kbp фрагмента K. ДНК, що містив гомологічну PDC-ділянку і вставthermotolerans. Частина pdc1 K. thermotolerans, лений в середину послідовності ген стійкості до видалена шляхом рестрикційного травлення канаміцину. Для дезінтегрування PDC K. [Sambrook], містила таку послідовність: thermotolerans, остання була трансформована цим фрагментом за допомогою одного із відомих методів -електропорацією. Метод електропорації полягав у тому, що: а) в об'ємі 20мл протягом ночі (приблизно 15 годин) вирощували культуру в YPAD-середовищі; b) 500мкл культури перенесли до мікровідцентрової пробірки, піддали центрифугуванню @4K, 4 хвилини, видалили супернатант; с) промили 1мл холодним ЕВ (ЕВ = електропораційний буфер: 10мМ Tris-HCI, pH 7,5; 270мМ сахароза; 1мМ MgCI2); d) ресуспендували в 1мл IB (IB=інкубаційний буфер: YPD; 25мМ DTT; 20мМ Hepes, pH 8,0); є) струшували @ 800об/хв, 30°С протягом 30 хвилин на приладі Eppendorf Thermomixer; f) піддали центрифугуванню, промивали один раз ЕВ, ресуспендували в 400мкл ЕВ; g) Далі, перетравленнями рестрикції із вектора добавили 3мкг фрагментної ДНК (у воді 10мМ TrispPIC9K (Invitrogen) був виділений ген, що кодує CI, pH 8,5), інкубували на льоду протягом 30 хвистійкість до канаміцину,включаючи його промотолин; h) перенесли до 0,4см електропораційну кюрю Ген був клонований у сайт в 7,5 kbp, із якого вету; режим імпульсної обробки на приладі Bioбув видалений 730 bp фрагмент. Ген стійкості до Rad Gene Pulser: 1000В, 1000Ом, 50мкФ; стала канаміцину і його промотор із pPIC9K (Invitrogen) часу після імпульсу: приблизно 20мс; і) перенесли мав таку послідовність: до 3мл пробірки Мортона-Клозюра (Morton Closure), інкубували без струшування при 30°С протягом 1 години; j) додали 400мкл рідкого YPADсередовища (YPAD: 10г дріжджового екстракту, 20г пептону, 20г глюкози, 100мг аденінгемісульфату, об'єм 1л, без регулювання рН), струшували @ 800об/хв, 30°С протягом 1 години в термоміксері Eppendorf Thermomixer; k) додали 400мкл рідкого YPAD і регенерували протягом 4-6 годин; І) піддали центрифугуванню у мікровідцентровій пробірці @ 4k, 4 хвилини, видалили супернатант, ресуспендували в 400мкл 1Μ сорбітолу і висіяли на 100мкг/мл 6418-селективні планшети; і m) інкубували при температурі 30°С протягом трьох-п'яти днів. Колонії піддали скринінгу спочатку другим покриттям на культиваційний планшет, що містив 200мкг/л G418. Із вторинної дріжджової партії видалили геномну ДНК за допомогою стандартного методу геномного препарування [Sambrook]. Далі видалений геномний продукт піддали PCRскринінгу на 1) наявність фрагмента канаміцину за допомогою відповідних праймерів і умов [Sambrook] і 2) відсутність дезінтегрованої PDCділянки за допомогою відповідних праймерів і умов PCR. Колонії, позитивні по маркеру селекції і негативні по ділянках дезінтегрування PDC, були піддані культивуванню для подальших обстежень, наприклад, геномних ДНК із цих штамів за допомогою Саузерн-гібридизаційного аналізу. Зрозуміло, що поданий вище докладний опис винаходу має на меті лише його ілюстрацію і жодКінцева конструкція включала у себе ген ною мірою не обмежує його об'єму, визначеного (G418) стійкості до канаміцину, оточений приблизнаведеною нижче Формулою винаходу, яка охопно 6,8 kbp PDC-ділянкою, як показано на Фіг.6f. лює також інші його ознаки, переваги і модифікації. Зображена на Фіг.6F конструкція була перетравлена двома ферментами рестрикції [Sambrook] з виходом приблизно 3 мікрограмів фрагмента 55 77386 56 57 77386 58 59 77386 60