Спосіб одержання рослини пшениці зі збільшеним вмістом білка в зерні

Реферат: Винахід належить до способу одержання рослини пшениці з високим вмістом білка, що включає введення в геном рослини пшениці принаймні однієї копії гена пшениці AHASL1A S653N в його нативний локус AHASL1A, причому ген кодує білок AHASL1A, що містить аспарагін замість серину в положенні, що відповідає положенню амінокислоти 653 в Arabidopsis thaliana AHAS, вирощування рослини пшениці або нащадка рослини, що включає ген AHASL1A S653N, для одержання зерна, визначення вмісту білка в зерні, продукованому рослиною пшениці або нащадком рослини, та відбір рослини пшениці або нащадка рослини, що продукує зерно, що має підвищений рівень білка, у порівнянні з зерном, продукованим рослиною пшениці, що не має зазначеного гена пшениці AHASL1A S653N. UA 98768 C2 (12) UA 98768 C2 UA 98768 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Цей винахід має відношення до галузі сільського господарства, особливо до нових способів створення і використання рослин пшениці зі збільшеним вмістом білка в зерні. Вміст білка в зерні пшениці є важливим для удосконалення харчової цінності і також є головним чинником, що впливає при випічці хліба (Dick & Youngs (1988) "Evaluation of durum wheat, semolina, and pasta in the United States, " In: Durum wheat: Chemistry and technology, AACC, St. Paul, MN, pp. 237-248; Finney і ін. (1987) "Quality of hard, soft, and durum wheats". In E.G. Heyne (ed.) Wheat and wheat imnpovement, Agron. Monogr. 13, 2 nd ed. ASA, CSSA, and SSSA, Madison, WI, pp. 677-748; Khan і ін. (2000) Crop Sci. 40: 518-524). Це є також важливої особливістю для виробників через високу ціну на пшеницю з високим вмістом білка в зерні (Olmos і ін. (2003) Theor. Appl. Genet. 107:1243-1251). Для бридинга високого вмісту білка в зерні було прикладено багато зусиль, але просування цих методів було повільним через складність генетики, що контролюється характерними рисами і взаємодією з навколишнім середовищем. Шляхом випробувань було ідентифіковано декілька QTLs для вмісту білка в зерні (Turner, і ін. (2004) J. Cereal Set 40:51-60; Joppa і ін. (1997) Crop Sci. 37: 1586-158; Perretant і ін. (2000) Theor. Appl. Genet. 100:1167-1175; Prasad і ін. (1999) Theor. Appl. Genet. 99:341-345; Groos і ін. (2003) Theor. Appl. Genet. 106:1032-1040; Groos і ін. (2004) J. Cereal Sci. 40:93-100; Shewry і ін. (1997) J. Sci. Food Agric. 73:397-406). Удосконалення вмісту білка в зерні на 1-2 % було розглянуто як істотне збільшення в межах даного класу або типу пшениці (Tokatilidis і ін. (2004) Field Crops Res. 86:33-42; Olmos і ін. (2003) Theor. Appl. Genet. 107: 1243-1251; Mesfin і ін. (2000) Euphytica 116: 237-242). Вміст білка в зерні відбувається під впливом умов навколишнього середовища, таких як родючість ґрунту, температура, азотне харчування, кількість атмосферних опадів або температура (Bhullar & Jenner (1985) Aust. J. Plant Physiol 12: 363-375; Wardlaw& Wrigely (1994) Aust. J. Plant Physiol. 21:695-703; Daniel & Triboi (2000) J. Cereal Sci. 32: 45-56; Metho і ін. (1999) J. Sci. Food Agric. 79:1823-1831). Дослідженнями також було показано, що є негативний ефект високого вмісту білка, що виявляється на врожаї (Сох і ін. (1985) Crop Sci. 25:430-435; Day і ін. (1985) J. Plant Nutrition 8:555-566); однак інші пропонують, що є можливим зробити пшеницю, для якої властиві обидві характеристики (Day і ін. (1985) У. Plant Nutrition 8:555-566; Johnson і ін. (1978). "Breeding progress for protein and lysine in wheat, " In: Proceedings of the Fifth International Wheat Genetics Symposium, New Delhi, India, pp. 825-835). Звичайно, наявність єдиного генетичного фактора або близько зв'язаних факторів, що стосуються білка зерна, забезпечило б істотні переваги, що могли б поліпшити і випічку хліба і харчову цінність зерна, особливо, якщо фактор або близько зв'язані фактори, враховують швидку і рентабельну селекцію. Представлений винахід забезпечує способи, що призначені для того, щоб створити рослини пшениці, що продукують зерно зі збільшеним вмістом білка в зерні. Винахід заснований на несподіваному відкритті, що стосується того, що рослини пшениці, що включають у їхніх геномах принаймні одну копію гена AHASL1А, що кодує білок AHASL1A, що включає заміну серину на аспарагін у положенні амінокислоти 579 у Triticum aestivum AHASL1A білку. Ця заміна амінокислоти також згадана тут як заміна S653N, тому що є відповідна заміна серину на аспарагін у положенні амінокислоти 653 у Arabidopsis thaliana AHASL1 білку. Способи відповідно до представленого винаходу включають переміщення принаймні однієї копії гена AHASL1A пшениці, що кодує білок AHASL1А, що включає заміну S653N у рослину. Такий ген може бути введений способами, такими як, наприклад, взаємне запилення, мутагенез, і трансформація. Способи відповідно до представленого винаходу можуть далі включати вирощування рослини пшениці або нащадка цієї рослини, що включає ген AHASL1A S653N, для того, щоб зробити зерно і визначити вміст білка в зерні, продукованому рослиною пшениці або нащадком рослини. Способи можуть додатково включати відбір рослин, що включають ген пшениці AHASLA1 S653N, наприклад, застосовуючи ефективну кількість AHAS-інгібуючих гербіцидів на рослину і/або на ґрунт або інший субстрат, на якому рослина росте або буде вирощена. Представлений винахід далі стосується рослини пшениці, органів рослини, рослинних тканин, і клітин рослин, а також білка зерна, що вміщується у високих кількостях, у харчових продуктах, що призначені для людини і тварин і отримані з зерна, що є високовміщуючим білок, продукованого рослинами пшениці відповідно до представленого винаходу. Способи використання зерна, що є високовміщуючим білок, відповідно до винаходу, для того, щоб зробити продовольчі продукти для людей і тварин, також розкриті даним винаходом. Фігура 1 є графічним представленням результатів, отриманих шляхом in vitro досліджень, для того, щоб визначити інгібування по типу зворотного зв'язку активності AHAS валіну і лейцину, використовуючи екстракти ферменту, що приготовлені з рослин пшениці BW 255-2 і які є контрольованими лініями BW 255. Лінія BW 255-2 є гомозиготною аллеллю для AHASL1A S653N. BW 255 є гомозиготою дикого типу в гені AHASL1A і є батьківською лінією, що була мутагенізована для того, щоб зробити лінію ВW 255-2. 1 UA 98768 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Представлений винахід забезпечує способи, призначені для створення і використання рослин пшениці, що включають зерно зі збільшеним вмістом білка в зерні. Винахід включає введення в рослину пшениці принаймні однієї копії гена пшениці AHASL1A, що кодує білок AHASL1 А, що включає заміну S653N у рослині. Такий ген може бути введений способами, такими як, наприклад, взаємне запилення, мутагенез, і трансформація. Способи відповідно до представленого винаходу можуть далі включати вирощування рослини пшениці або нащадка цієї рослини, що включає ген AHASL1A S653N, для того щоб зробити зерно з підвищеним вмістом білка в зерні, продукованому рослиною пшениці або нащадком рослини. Рослини пшениці, продуковані способами відповідно до даного винаходу включають підвищений вміст білка в зерні, у порівнянні з рослинами пшениці, що відчувають недостатній вміст білка в зерні пшениці, у яких відсутній ген AHASL1A S653N. Способи відповідно до даного винаходу знаходять використання в розвитку нових культурних сортів рослини пшениці зі збільшеним вмістом білка в зерні. У порівнянні з існуючими в даний час способами, способи відповідно до представленого винаходу значно зменшують зусилля, що прикладаються для розмноження, і які потрібні для того, щоб одержувати високий вміст білка в пшениці, тому що способи відповідно до представленого винаходу передбачають об'єктивну перевагу вибору через високі характеристики білка пшениці, що зв'язано з легко селектованими характеристиками стійкості до гербіцидів. Крім того, селектовані молекулярні маркери відомі в даній галузі техніки для гена пшениці AHASL1A S653N і таким чином, можуть зробити допомогу при селектованих підходах вирощування пшениці зі збільшеним вмістом білка в зерні. Див. U.S. Pat. App. Pub. No. 2005 / 0208506, що включено в даний опис як посилання. На додаток до переваг, забезпечених селективністю вибору високої характеристики білка, збільшення вмісту білка в зерні не корельовано з втратою у врожаї зерна. Таким чином, способи відповідно до представленого винаходу, забезпечують рослини пшениці, що продукують зерно зі збільшеним вмістом білка, і ці рослини можуть бути використані для того, щоб збільшити кількість білка в зерні, продукованому на акр у порівнянні з подібними рослинами дикого типу. Зрештою, висока характеристика білка відповідно до даного винаходу може бути об'єднана з існуючим зерном зародкової плазми, що уже високо по вмісту білка в зерні, для того, щоб розвити лінії пшениці з ще більш високим вмістом білка в зерні. Представлений винахід забезпечує високобілкові рослини пшениці і поліпшене зерно щодо білка, що продуковано цими рослинами. Таке поліпшене зерно щодо білка знаходить використання в безлічі харчових продуктів і продуктів, аналогічних харчовим, для споживання тварин і людини. Зокрема зерно, продуковане рослинами пшениці відповідно до винаходу, знаходить використання у виробництві поліпшеного щодо вмісту білка борошна з пшениці, особливо для використання у випічці хліба. Таким чином, винахід забезпечує способи, що призначені для того, щоб вони забезпечували борошно з високим вмістом білка, що включає розмелювання зерна, що продуковане рослинами високо білкової пшениці відповідно до даного винаходу. Високобілкові рослини пшениці винаходу також володіють підвищеною стійкістю до гербіцидів у порівнянні з рослиною пшениці дикого типу. Зокрема високобілкові рослини пшениці винаходу мають підвищену стійкість принаймні до одного гербіциду, що впливає на активність ферменту AHAS у порівнянні з рослиною пшениці дикого типу. Високобілкові рослини пшениці винаходу включають принаймні одну копію гена пшениці AHASL1 S653N або полінуклеотид. Такий білок пшениці AHASL1A включає аспарагін у положенні амінокислоти 579 або еквівалентному положенні. У дикому типі білок AHASL1A серин знайдений у положенні 579. Тому що відповідне положення у відомому білку AHASL1 Arabidopsis thaliana є амінокислотою 653, ген AHASL1A, що кодує білок AHASL1A, що включає серин 579 як аспарагінову заміну, згадується як ген AHASL1A S653N, для того, щоб дати можливість для конформації встановленої номенклатури послідовностей AHASL для рослин. Представлений винахід забезпечує способи, що забезпечують одержання таких рослин пшениці, що включають зерно зі збільшеним вмістом білка в зерні. В одному з утілень такі способи включають введення в рослину пшениці принаймні однієї копії гена AHASL1A пшениці, що кодує білок AHASL1A, що включає заміну S653N у рослині шляхом мутагенезу, особливо мутагенезом гена AHASL1А ендогенної пшениці, для того щоб зробити ген пшениці AHASL1A S653. Будь-який спосіб мутагенезу, відомий у даній галузі техніки, може використовуватися для того, щоб зробити високобілкові рослини пшениці відповідно до даного винаходу. Такі способи мутагенезу можуть включати, наприклад, використання будь-якої або більшої кількості наступних мутагенів: радіація, така як рентгенівське випромінювання, гама - промені (наприклад, кобальт 60 або цезій 137), нейтрони, (наприклад, продукт ядерного розподілу ураном 235 в атомному реакторі), бета радіація (наприклад, випромінювана від радіоізотопів, таких як фосфор 32 або вуглець 14), і ультрафіолетова радіація (переважно від 2500 до 2 UA 98768 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 2900 нм), і хімічні мутагени, такі як етил метансульфонат (ЕМ), основні аналоги (наприклад, 5 бромзаміщені урацили), зв'язані склади (наприклад, 8-етоксикофеїн), антибіотики (наприклад, стрептонигрин), алкілюючі агенти (наприклад, сірчана гіркота, азотна гіркота, епоксиди, етиленаміни, сульфати, сульфонати, сульфони, лактони), азид, гідроксиламін, азотиста кислота, або акридин. Рослини пшениці, що включають ген AHASL1A S653N пшениці, можуть також бути зроблені при використанні способів культивування тканини, для того, щоб вибрати для клітин рослини, що включають мутації стійкості до гербіциду, селектовані для рослин, що включають ген AHASL1A S653N, і відновлені з них рослини. Див., наприклад, американський патент U.S. Patent Nos. 5,773,702, обоє з яких тут включені у всій їхній повноті як посилання. Подальші деталі розмноження шляхом мутації можуть бути знайдені в "Principals of Cultivar Development" Fehr, 1993 Macmillan Publishing Company, розкриття якого включено тут як посилання. В одному зі своїх утілень представлений винахід забезпечує високобілкові рослини пшениці, що включають один, два, три, чотири, або більше копій ген AHASL1A S653N пшениці або полінуклеотид. Наприклад, пшениця з високим вмістом білка може включати одну або дві копії гена AHASL1A S653N у батьківській пшениці в місці розташування AHASL1A і може додатково або альтернативно включати один, два, три, або більше копій полінуклеотида AHASL1A S653N, що є операбельним, зв'язаним з батьківською пшеницею, у якої промотором є AHASL1A або інший промотор, що є здатним до експресії в рослині, особливо для зерна, такий як, наприклад, кращий для насіння промотор або кращий для ембріона промотор. Представлений винахід забезпечує дані способи для того, щоб вони дали можливість бути реалізованим рослинам пшениці, що включають зерно зі збільшеним вмістом білка в зерні. У втіленні винаходу способи включають трансформацію клітин рослини з конструкцією такого полінуклеотида, що включає операбельну послідовність нуклеотида, що зв'язана з промотором, що веде експресію в клітці рослини, і регенерацію трансформованої рослини з трансформованих клітин рослини. Послідовність нуклеотида кодує білок пшениці AHASL1A, що включає аспарагін у положенні амінокислоти 579 або в еквівалентному положенні. Нуклеотидні послідовності, що кодують пшеницю білки AHASL і рослини пшениці, що включають ген пшениці AHASL1A S653N, були раніше розкриті. Див., WO 2004 / 106529 і U.S. Patent Application Publication Nos. 2004 / 0237134 2004 / 0244080, 2005 / 0044597, 2006 / 0010514, і 2006 / 0095992; усі з яких у даному описі включені як посилання. В інших утіленнях способи включають звичайне розмноження рослини, що включає взаємне запилення рослини пшениці, що включає принаймні одну копію гена пшениці AHASL1A S653N з іншою рослиною пшениці, і можуть далі включати відбір нащадків рослин (F 1 або F 2), що включають ознаки стійкості до гербіциду вихідної рослини, що включає ген AHASL1A S653N. Способи можуть включати довільне самозапилення рослин F1 і мимовільний відбір наступних нащадків рослин (F2), для того щоб зробити лінії пшениці, що є гомозиготами для AHASL1A S653N. Якщо бажано, способи можуть далі включати самозапилення одного або більш наступних поколінь (тобто, F 2, F 3, F 4, і т.д.) і відбір наступних нащадків рослин (тобто, F 3, F 4, F 5, і т.д.), це - гомозиготи для AHASL1A S653N. Якщо явно не заявлено або інакше не є очевидним у контексті використання, термін "нащадки", у тім значенні, у якому використовується тут, не є обмеженим безпосередніми нащадками рослини, а включає також нащадків від наступних поколінь. Способи відповідно до даного винаходу включають використання рослин пшениці, що включають принаймні один ген пшениці AHASL1A S653N. Такі рослини пшениці включають, але не є обмеженими наступними рослинами: рослина пшениці, депонованої в Американській Колекції Типів Культур, Manassas, Вірджинія 20110-2209 США 15 січня 2002, що доступна під депозитарним номером РТА - 3955, що доступна під депозитарним номером РТА - 4113, депонованої в Американській Колекції Типів Культур, Manassas, Вірджинія 20110-2209 США 19 березня 2002; і яка доступна під депозитарним номером РТА - 4257, депонованої в Американській Колекції Типів Культур, Manassas, Вірджинія 20110-2209 США 28 травня 2002; мутант, рекомбінантний ген, або генетично сконструйоване похідне рослини пшениці під депозитарним номером РТА - Патент АТСС 3955, РТА 4113, і / або РТА 4257; будь-які нащадки рослини під депозитарним номером РТА - Патент АТСС 3955, РТА 4113, і / або РТА 4257; і рослина пшениці, що є нащадком будь-якої або більшої кількості цих рослин. Переважно, такий мутант, рекомбінантний ген, або генетично сконструйовані похідні кожного з рослин пшениці, що маються під депозитарним номером РТА - Патент АТСС 3955, РТА 4113, і РТА 4257, і нащадок зазначеного, включають особливості стійкості до гербіциду рослини пшениці, що мається під депозитарним номером РТА - Патент АТСС 3955, РТА 4113, або РТА 4257. Рослини пшениці, що маються під депозитарним номером РТА - Патент АТСС 3955, РТА 4113, і РТА 4257, і 3 UA 98768 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 похідні і нащадки цього, описані в U.S. Patent Application Publication Nos. 2004 / 0237134, 2004 / 0244080, і 2006 / 0095992; усі з яких тут включені як посилання. Депозит принаймні 2500 насінь для кожної з ліній пшениці, що маються під депозитарним номером РТА - Патент АТСС 3955, РТА 4113, і РТА 4257, є доступним з Американської Колекції Типів Культур, Mansassas, Вірджинія 20110 США 3 січня 2002, 4 березня 2002, і 3 січня 2002, відповідно. Кожний з цих депозитів був збережений на термін принаймні 30 років і після принаймні 5 років після того, як буде отриманий новий запит про стан зразка депозиту АТСС. Ці депозити будуть підтримані відповідно до Будапештської Угоди щодо Міжнародного визнання Депозиту Мікроорганізмів з Метою Патентної Процедури. Додатково, ці депозити задовольняють усі вимоги 37 C.F.R. §§ 1.801-1.809, включаючи ознаку забезпечення життєздатності зразка. У тім значенні, як використано тут, якщо не позначено інакше або очевидно від контексту, термін "рослина" включає, але не є обмеженим, клітини рослини, протопласти рослини, культури тканини клітин рослини, з яких рослини можуть бути відновлені, калуси з рослин, клампуси рослини, клітини рослини, що є не зруйнованими на рослинах, або частинах рослин таких як, наприклад, ембріони, пилок, яйцеклітини, сім'ядолі, листи, стебла, квіти, лулки, петіли, фрукти, корені, закінчення кореня, пильовики, і т.п. Крім того, тут також мається на увазі, що насіння також є рослиною. Термін "рослина пшениці з високим вмістом білка" призначений для того, щоб означати, що рослина пшениці, зроблена способами, розкритими тут, є зробленою або здатною до врожаю зерна з рівнями вмісту білка в зерні, що збільшені щодо рівня подібної рослини пшениці, що не включає в його геномі принаймні одну копію гена пшениці AHASL1A S653N відповідно до даного винаходу. У переважному утіленні винаходу високобілкові рослини пшениці - рослини пшениці Triticum aestivum. Зерно, продуковане рослинами пшениці з високим вмістом білка винаходу, згадане тут як "зерно з високим вмістом білка." "Якість високого вмісту білка" відповідно до даного винаходу є високим вмістом білка в зерні й отримано в результаті присутності гена пшениці AHASL1А S653N або полінуклеотида відповідно до даного винаходу в геномі рослини пшениці. Такий ген AHASL1A S653N включає ген AHASL1A S653N з будь-якого різновиду пшениці, що володіє геномом, що включає, але не є обмеженим, Triticum aestivum L., T. monococcum L., T. turgidum L. (включаючи, але не є обмеженим subsp. carthlicum, durum, dicoccoides, dicoccum, polonicum, і turanicurn), і Т. spelta L. Представлений винахід забезпечує високобілкові рослини пшениці, що продукують зерно зі збільшеним вмістом білка в зерні. Як правило, вміст білка в зерні визначений як відсоток від ваги зрілого, сухого зерна. Загалом, вміст білка в зерні, продукованому рослинами пшениці відповідно до даного винаходу, є принаймні приблизно на 4, 5, 6, або на 7 % вище чому подібні контрольні рослини пшениці, що не включають принаймні одну копію гена пшениці AHASL1A S653N. Переважно, вміст білка в зерні, продукованому рослинами пшениці відповідно до даного винаходу, є принаймні приблизно на 8, на 9, на 10, або на 11 % вище чому подібні контрольні рослини пшениці. У більш кращому варіанті, вміст білка в зерні, продукованому рослинами пшениці відповідно до даного винаходу, є принаймні приблизно на 12, на 13, на 14, або на 15 % вище чим подібні контрольні рослини пшениці. Ще в більш кращому варіанті, вміст білка в зерні, продукованому рослинами пшениці відповідно до даного винаходу, є принаймні приблизно на 15, на 16, на 17, або на 18 % вище чому подібні контрольні рослини пшениці. Ще в більш кращому варіанті, вміст білка в зерні, продукованому рослинами пшениці відповідно до даного винаходу, є принаймні приблизно на 19, на 20, на 21, або на 22 % вище чому подібні контрольні рослини пшениці. У найбільш кращому варіанті, вміст білка в зерні, продукованому рослинами пшениці відповідно до даного винаходу, принаймні приблизно на 23 % вище чому подібні контрольні рослини пшениці. Представлений винахід не залежить ні від яких специфічних способів для того, щоб визначити вміст білка в зерні або інші компоненти зерна, такі як вологовміст і рівні окремих амінокислот. Будь-які способи, що є відомими в даній галузі техніки, можуть бути використані для того, щоб визначити вміст білка в зерні, вологість і окремі амінокислоти. Див., наприклад, Methods of Analysis of AOAC International (2005), 18th Ed., AOAC International, Gaithersburg, MD, USA, Official Methods 990.03 (сирий білок), 930.15 (вологість), і 982.30 (амінокислоти / відношення ефективності білка); тут включений як посилання. У тім значенні, як використано тут, "похідне" рослини або "похідне рослини пшениці" є рослиною пшениці, що є нащадком або клоном рослини пшениці з високим вмістом білка відповідно до даного винаходу і включає принаймні одну копію гена пшениці AHASL1A S653N, що був успадкований від рослини пшениці з високим вмістом білка і є також рослиною пшениці з 4 UA 98768 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 високим вмістом білка, як визначено тут, якщо не позначено інакше або очевидно з контексту. Такі похідні або похідні рослини пшениці включають нащадків рослини пшениці з високим вмістом білка, що є призначеними для полового і / або неполового відтворення і таким чином, включають і нетрансгенні і трансгенні рослини пшениці. Представлений винахід спрямований на високобілкові рослини пшениці, що є толерантними до гербіциду або стійкими до гербіциду рослинами пшениці. "Толерантною до гербіциду" або "стійкою до гербіциду" рослиною в даному описі означає, що рослина є толерантного або стійкою, принаймні до одного гербіциду на рівні, що звичайно знищував би, або інгібував би ріст для нормальної рослини або рослини дикого типу. Високобілкові рослини пшениці винаходу включають толерантний до гербіциду або стійкий до гербіциду білок AHASL, особливо AHASL1A S653N. "Толерантним до гербіциду білком AHASL" або "стійким до гербіциду білком AHASL", є такий білок AHASL, що виявляє активність AHAS вище щодо активності AHAS дикого типу білок AHASL, коли він знаходиться в присутності принаймні одного гербіциду, що, як відомо, впливає на активність AHAS і при такій концентрації або такому рівні гербіциду, що повинний як відомо, призупинити активність AHAS дикого типу білка AHASL. Крім того, активність AHAS такого толерантного до гербіциду або стійкого до гербіциду білка AHASL може бути згадана тут як "толерантна до гербіциду" або "стійка до гербіциду" активність AHAS. Для термінології, відповідно до даного винаходу терміни, "толерантні до гербіциду" і "стійкі до гербіциду", використані в якості взаємозамінних і призначені, для того щоб мати еквівалентне значення й еквівалентну галузь. Точно так само терміни "толерантність гербіциду" і "стійкість гербіциду" використані в якості взаємозамінних і призначені для того, щоб мати еквівалентне значення й еквівалентну галузь значень. Аналогічно, термін "імідазолінон стійкі" і "імідазолінон стійкість" використані в якості взаємозамінних і призначені для того, щоб бути еквівалентного значення й еквівалентної галузі значень як "імідазолінон толерантні" терміни і "імідазолінон толерантність", відповідно. Винахід охоплює використання полінуклеотидів стійкої до гербіциду пшениці AHASL і білки стійкої до гербіциду пшениці AHASL, особливо гени пшениці AHASL1A S653N або полінуклеотиди і білки пшениці AHASL1A S653N. "Стійким до гербіциду полінуклеотидом AHASL" являється полінуклеотид, що кодує білок, що включає стійку до гербіциду активність AHAS. "Стійким до гербіциду білком AHASL" є білок або поліпептид, що включає стійку до гербіциду активність AHAS. Далі, зазначене включає те, що толерантний до гербіциду або стійкий до гербіциду білок AHASL може бути введений у рослину, для того, щоб перетворювати рослину або нащадка цієї рослини за допомогою нуклеотидної послідовності, що кодує толерантний до гербіциду або стійкий до гербіциду білок AHASL. Такі толерантні до гербіциду або стійкі до гербіциду білки AHASL закодовані толерантними до гербіциду або стійкими до гербіциду полінуклеотидами AHASL. Альтернативно, толерантний до гербіциду або стійкий до гербіциду білок AHASL може виявитися в рослині в результаті природної або викликаної мутації в ендогенному гені AHASL у геномі рослини або предку зазначеного. Представлений винахід забезпечує високобілкові рослини пшениці і рослинні тканини, клітини рослини і зерно зазначеного, котрі включають толерантність принаймні до одного гербіциду, особливо гербіциду, що впливає на активність ферменту AHAS, більш докладно імідазоліноновому або сульфонілсечовиновому гербіцидам. Переважна кількість або концентрація гербіциду - "ефективна кількість" або "ефективна концентрація." "Ефективною кількістю" і "ефективної ейконцентрація" є такі кількість і концентрація, що, відповідно, є достатніми для того, щоб знищити або інгібувати ріст подібного, дикого типу, рослини, рослинної тканини, клітин рослини, мікроспори, або клітин хазяїна, але це вказує на те, що кількість не строго знищує або інгібує як ріст стійких до гербіциду рослин, рослинних тканин, клітин рослини, мікроспор, і клітин відповідно до даного винаходу. Як правило, ефективна кількість гербіциду - кількість, що звичайно використовується в системах сільськогосподарського виробництва, для того, щоб знищити шкідливі бур'яни. Така кількість відома таким зі звичайних знань у даній галузі техніки, або може бути легко визначено, використовуючи способи, відомі в даній галузі техніки. Крім того, це відомо, що ефективна кількість гербіциду в системі сільськогосподарського виробництва могла б бути істотно різною, чим ефективна кількість гербіциду для системи культури рослин, таких як, наприклад, система культури мікроспори, описана нижче в Прикладі 1. Гербіциди відповідно до даного винаходу - ті, котрі впливають на активність ферменту AHAS таким чином, щоб активність AHAS була зменшена в присутності гербіциду. Такі гербіциди можуть також згаданий тут як "AHAS-інгібуючі гербіциди" або просто "інгібітори AHAS." У тім значенні, як використано тут, "AHAS - інгібуючий гербіцид" або "інгібітор AHAS" не призначений 5 UA 98768 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 для того, щоб бути обмеженим єдиним гербіцидом, що впливає на активність ферменту AHAS. Таким чином, якщо інакше не зазначено або очевидно з контексту, "AHAS - інгібуючий гербіцид" або "інгібітор AHAS" може бути одним гербіцидом або сумішшю з двох, трьох, чотирьох, або більшої кількості гербіцидів, кожний з яких впливає на активність ферменту AHAS, "Однорідна рослина пшениці дикого типу" є рослиною пшениці, що відчуває недолік у високому вмісті білка в зерні і якостях опору до гербіциду, що розкриті тут. Використання терміна "дикий тип", тому, не призначений для того, щоб мати на увазі, що рослина, рослинна тканина, клітка рослини, або інша клітка хазяїна відчувають недолік у рекомбінантній ДНК у своєму геномі, і / або не володіють особливостями стійкості до гербіциду, що відрізняються від розкритих тут. Рослини відповідно до даного винаходу включають і нетрансгенні рослини і трансгенні рослини. "Нетрансгенною рослиною" є рослина, що не має рекомбінантної ДНК у її геномі. "Трансгенною рослиною" є та рослина, що включає рекомбінантну ДНК у її геномі. Така трансгенна рослина може бути зроблена шляхом уведення рекомбінантної ДНК у геном рослини. Коли така рекомбінантна ДНК включена в геном трансгенної рослини, нащадки рослини можуть також включати рекомбінантну ДНК. Нащадки рослини, що включають принаймні частину рекомбінантної ДНК принаймні одного нащадка трансгенної рослина, є також трансгенною рослиною. Представлений винахід включає рослини пшениці, що включають білки AHASL1A із заміною амінокислоти в положенні амінокислоти 579, що є відомим у межах збереженого регіону пшениці білком AHASL1A. Див., табл. 4 нижче. Такі з відомих навичок включають те, що такі положення амінокислоти можуть змінитися в залежності від того, чи додані амінокислоти до них або вилучені з них, наприклад, N-термінальний кінець послідовності амінокислот. Таким чином, винахід включає пшеницю з білком AHASL1A із замінами амінокислотних позицій у зазначеному положенні або еквівалентному положенні (наприклад, "положення амінокислоти 579 або еквівалентне положення"). "Еквівалентним положенням" є визначене положення для того, щоб означати таке положення, що є в межах тієї ж самої збереженої ділянки як експліковане положення амінокислоти. Див., табл. 4 нижче. Тому що положення, що еквівалентно амінокислоті 579 із пшениці білка AHASL1A - амінокислота 653 з білка Arabidopsis thaliana AHASL1, пшениця, у якої білок AHASL1A є із серином як заміну аспарагіна в положенні амінокислоти 579, також згадано тут як білок пшениці AHASL1A S653N, для того, щоб уніфікувати добре зрозумілу специфіку в даній галузі, згідно даному винаходові, що засновано на послідовності амінокислот білка Arabidopsis thaliana AHASL1. Точно так само ген або полінуклеотид, що кодує білок пшениці AHASL1A S653N, згаданий тут як ген пшениці AHASL1A S653N або полінуклеотид пшениці AHASL1A S653N. Представлений винахід орієнтований на високобілкові рослини пшениці, що включають збільшену толерантність або стійкість принаймні до одного гербіциду, що впливає на активність ферменту AHAS. Такі AHAS-інгібуючі гербіциди включають імідазолінонові гербіциди, сульфонілсечовинові гербіциди, триазолпіримідинові гербіциди, піримідинілоксибензойні гербіциди, сульфоніл-аміно-карбоніл-триазолінові гербіциди, або суміш зазначених гербіцидів. Переважно, AHAS - інгібуючий гербіцид - імідазоліноновий гербіцид. Для того, щоб бути відповідними даному винаходові імідазолінонові гербіциди включають, але не є обмеженими, PURSUIT ® (імазефапир), CADRE ® (імазапик), RAPTOR ® (імазамокс), SCEPTER ® (імазаквин), ASSERT ® (імазефабенз), ARSENAL ® (імазапир), похідні одного з вище згаданих гербіцидів, і суміші двох або більше з вище згаданих гербіцидів, наприклад, імазапир / імазамокс (ODYSSEY ®). Більш конкретно, імідазоліноновий гербіцид може бути обраний з, але не є обмеженим, наступної групи, 2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-нікотинова кислота, [2-(4 ізопропіламін)-4-] [метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-3-хінолінокарбонова] кислота, [5-етил-2-(4 ізопропіламін-] 4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-мул)-нікотинова кислота, 2-(4ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-5-(метоксиметил)-нікотинова кислота, [2-(4-ізопропіл4-метил-5-оксо-2-]імідазолін-2-іл)-5-метилнікотинова кислота, і суміш метилу [6-(4-ізопропіл-4-] метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-m-толуату і метилу [2-(4-ізопропіл-4-метил-5-] оксо-2-імідазолін2-іл)-р-толуату. Використання 5-етил-2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-нікотинової кислоти і [2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-] іл)-5-(метоксиметил)-нікотинової кислоти є кращим. Використання [2-(4-ізопропіл-4] метил-3-оксо-2-імідазолін-2-іл)-5-(метоксиметил)нікотинової кислоти є особливо кращим. Гербіциди сульфонілсечовини включають, але не є обмеженими, хлорсульфурон, метсульфурон метил, сульфометурон метил, хлоримурон етил, трифенсульфурон метил, трибенурон метил, бензсульфурон метил, нікосульфурон, етаметсульфурон метил, ринсульфурон, трифлусульфурон метил, тріасульфурон, примісульфурон метил, циносульфурон, амідосульфурон, флузасульфурон, імазосульфурон, 6 UA 98768 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 піразосульфурон етил, галосульфурон, азимсульфурон, циклосульфурон, етоксисульфурон, флазасульфурон, флюпирсульфурон метил, форамсульфурон, іодосульфурон, оксасульфурон, мезосульфурон, просульфурон, сульфосульфурон, трифлохусульфурон, тритосульфурон, похідні одного з вищезгаданих гербіцидів, і суміші двох або більше з вищезгаданих гербіцидів. Триазолпіримідинові гербіциди винаходу включають, але не є обмеженими, хлорансулам, диклосулам, хлорасулам, флуметсулам, метосулам, і пенокссулам. Піримідинілоксибензойні гербіциди винаходу включають, але не є обмеженими, биспірабак, пиритіобак, пириминобак, пирибензоксим і пирифталід. Сульфоніл-аміно-карбоніл-триазолінові гербіциди включають, але не є обмеженими, флукарбазон і пропоксикарбазон. Є відомим те, що піримідиніл оксибензойні гербіциди близько зв'язані з піримідиніл бензоатними гербіцидами й узагальнені за назвою останньої назви Американським Суспільством Науки про Бур'яни. Відповідно, гербіциди відповідно до даного винаходу далі включають піримідиніл бензоатні гербіциди. включаючи, але не будучи обмеженими, піримідиніл оксибензойні гербіциди, описані вище. Представлений винахід забезпечує способи для того, щоб вони дали можливість одержати рослину пшениці з високим вмістом білка, що включає введення в геном рослини пшениці принаймні однієї копії гена пшениці AHASL1A S653N, для того, щоб одержати рослину пшениці з високим вмістом білка. В одному зі своїх утілень винаходу принаймні одна копія гена пшениці AHASL1A S653N введена в рослину пшениці, перетворюючи при цьому рослину пшениці конструкцією полінуклеотида, що включає операбельний промотор, що зв'язаний з послідовність полінуклеотида пшениці AHASL1A S653N відповідно до винаходу. Способи включають уведення конструкта полінуклеотида винаходу принаймні в одну клітину рослини і регенерацію трансформованої рослини відтіля. Способи далі включають використання промотору, що здатний до експресії прояву гена в клітці рослини. Переважно, такий промотор промотор, що забезпечує експресію в зерні пшениці, що розвивається, особливо протягом того часу, коли, як відомо, відбувається синтез білка. Серед таких промоторів, наприклад, конститутивні промотори і переважно промотори для насіння. Рослина пшениці, зроблена цим способом, включає збільшену активність AHAS, особливо толерантну до гербіциду активність AHAS, і збільшений вміст білка в зерні в той час, коли в порівнянні з подібною неперетвореною рослиною пшениці, цього не спостерігається. Використання терміна "конструкт полінуклеотида" тут не є таким, що обмежує представлений винахід включенням конструкцій полінуклеотида в ДНК. Для таких зі звичайних знань у даній галузі техніки визнано, що полінуклеотидні конструкти, особливо полінуклеотиди й олігонукдеотиди, що складаються з рибонуклеотидів і комбінацій рибонуклеотидів і дезоксирибонуклеотидів, можуть також використовуватися в способах, розкритих у даному описі. Таким чином, конструкт полінуклеотида відповідно до даного винаходу охоплює всі конструкти полінуклеотида, що можуть використовуватися в способах відповідно до даного винаходу для того, щоб перетворювати рослини, що при цьому включають, але не є обмеженими ті, котрі складаються з дезоксирибонуклеотидів, рибонуклеотидів, і комбінацій них. Такі дезоксирибонуклеотиди і рибонуклеотиди включають і природні молекули і синтетичні їхні аналоги. Конструкти полінуклеотида винаходу також охоплюють усі форми конструкцій полінуклеотида, при цьому включаючи, але не будучи обмеженими, одно ланцюгові форми, двох - ланцюгові форми, шпильки, структури стебла-і-петлі, і т.п. Крім того, це є зрозумілим зі знань даної галузі техніки, що кожні нуклеотидні послідовності, розкриті в даному описі також, охоплюють комплементарні цієї представленої нуклеотидної послідовності. Далі, є відомим те, що для експресії полінуклеотидів винаходу для рослини, полінуклеотид типово операбельно зв'язаний із промотором, що здатний до експресії гена в рослині, що становить інтерес. Способи відповідно до представленого винаходу не залежать від специфічного промотору. Способи охоплюють використання будь-якого промотору, що відомий у даній галузі техніки, і це дає можливість реалізації експресії гена в рослині, що становить інтерес. У визначених утіленнях, способи відповідно до даного винаходу включають трансформовані рослини пшениці з полінуклеотидами пшениці AHASL1A S653N, що забезпечені в касетах експресії для експресії в рослинах пшениці. Касета буде включати 5' і 3' регулюючі послідовності операбельно зв'язані з полінуклеотидом пшениці AHASL1A S653N. "Операбельно зв'язаний" є функціонально зв'язаним між промотором і другою послідовністю, при цьому послідовність промотору ініціює і медиює транскрипцію послідовності ДНК, що відповідає другої послідовності. Загалом, операбельно зв'язані засоби, що зв'язують послідовності нуклеїнової кислоти є суміжними і, коли необхідно, використовуються для того, щоб приєднатися до двох ділянок білка, що кодують, суміжним у тій же самій рамці зчитування. Касета може додатково 7 UA 98768 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 містити принаймні один додатковий ген, для того, щоб бути котрансформованою в організм. Альтернативно, додатковий ген (- и) може бути реалізований на мультиплетних касетах експресії. Такій касеті експресії надаються безліч сайтів рестрикції для вставки полінуклеотида пшениці AHASL1A S653N, для того щоб бути під транскрипційним регулюванням регулюючих ділянок. Касета експресії може додатково містити селектовані маркерні гени. Касета експресії буде включати в 5'-3' ділянки транскрипції, транскрипційну і трансляційну ділянки ініціювання (тобто, промотор), полінуклеотид пшениці AHASL1A S653N даного винаходу, і транскрипційну і трансляційну ділянку термінації (тобто, регіон термінації), функціональний для рослин. Промотор може бути нативним або аналогічним, або чужорідним або гетерологічним щодо рослини хазяїна і / або відносно полінуклеотида пшениці AHASL1A S653N. Додатково, промотор може бути природною послідовністю або альтернативно синтетичною послідовністю. При цьому промотор є "чужорідним" або "гетерологічним" хазяїнові рослини, і це означає, що промотор не існує в рідній рослині, у якому представлений промотор. Ті випадки, коли промотор є "чужорідним" або "гетерологічним" відносно полінуклеотида пшениці AHASL1A S653N, означають те, що промотор є не природним нативним промотором відносно операбельного, що зв'язує, полінуклеотидом пшениці AHASL1A S653N. У тім значенні, як використано в даному описі, химерний ген включає послідовність, що кодує, операбельно зв'язану з ділянкою ініціювання транскрипції, що є гетерологічною щодо послідовності, що кодує. У той час, коли може бути переважно експресовані полінуклеотиди пшениці AHASL1A S653N, при використанні гетерологічних промоторів, нативні послідовності промотору також можуть використовуватися. Такі конструкти змінили б рівні експресії білка пшениці AHASL1A S653N у клітці рослини або рослин. Таким чином, може бути змінений фенотип клітин рослини або рослини. Регіон термінації може бути нативною транскрипційною ділянкою ініціювання регіону, може бути нативним операбельним, зв'язаним із пшеницею AHASL1A S653N полінуклеотидом, може бути нативним щодо рослини хазяїна, або може бути отриманий з іншого джерела (тобто, чужорідний або гетерологічний промотор, полінуклеотид пшениці AHASL1A S653N, що представляє інтерес, рослина хазяїн, або будь-якої комбінації цього). Зручні регіони термінації доступні з Ті-плазміди A. tumefaciens, такі як октопин синтазні ділянки і нопалін синтазні ділянки термінації. Див. також Guerineau і ін. (1991) Моl Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:611-674; Sanfacon і ін. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen і ін. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe і ін. (1990) Gene 91:151-158; Ballas і ін. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; and Joshi і ін. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639. Як передбачено, ген (и) може бути оптимізований для збільшеної експресії в трансформованій рослині. Таким чином, гени можуть бути синтезовані, використовуючи кращі для рослини кодони для поліпшеної експресії. Див., наприклад, Campbell and Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11 як обговорення кращого для хазяїна використання кодона. Способи є доступними в даній галузі техніки для того, щоб синтезувати кращі для рослини гени. Див., наприклад, U.S. Patent Nos. 5,380,831, and 5,436,391, and Murray і in. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, у даному описі включений як посилання. Додаткові модифікації послідовності, як відомо, збільшують експресію гена в клітці хазяїні. Вони включають усунення послідовностей, що кодують підроблені поліаденильовані сигнали, сигнали сайта екзон - інтронного сплайсинга, повторення, що є подібними транспозоновим, і інші також добре охарактеризовані послідовності, що можуть бути небажаними для прояву гена. Вміст G-C послідовності може бути адаптоване до середнього числа рівнів для даного клітинного хазяїна, як обчислено у відношенні відомих генів, експресованих у клітці хазяїна. Коли це є можливим, послідовність може бути змінена для того, щоб уникнути зазначеної шпильки вторинних м РКН структур. Нуклеотидні послідовності енхансерного гена можуть бути використані для того, щоб збільшити прояв гена, у векторах експресії рослини. Вони включають інтрони кукурудзи Adh І, інтроновий ген (Callis і ін. Genes and Development 1:1183-1200, 1987), і лидерні послідовності, (W-послідовність) з вірусу тютюнової мозаїки (TMV), з вірусу кукурудзи, зараженої хлорозом і вірусу люцернової мозаїки (Gallie і ін. Nucleic Acid Res. 15:8693-8711, 1987 and Skuzeski і ін. Plant Mol. Biol. 15:65-79, 1990). Перший інтрон 1-стиснутого локусу кукурудзи, як показано, збільшив експресію генів у химерних генних конструкціях. U.S. Pat. Nos. 5,424,412 і 5,593,874 розкривають використання визначених інтронов у конструкціях для експресії гена, і Gallie і ін. (Plant Physiol. 106:929-939, 1994) також показали, що інтрони корисні для регулювання прояву гена в тканинах на визначених основах. Щоб далі збільшити або оптимізувати низький прояв 8 UA 98768 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гена субодиниці AHAS, вектори експресії рослини відповідно до винаходу можуть також містити послідовності ДНК, що містять зв'язані з матрицею регіони (МАРС). Клітини рослини, перетворені за допомогою таких модифікованих систем експресії, як наслідок, можуть показати надекспресію або конститутивну експресію нуклеотидної послідовності згідно даного винаходу. Касети експресії можуть додатково містити лидерні 5' послідовності в конструюй касети експресії. Такі лiдерні послідовності можуть діяти таким чином, щоб збільшити трансляцію. Лідерні транслянти відомі в даній галузі техніки і включають: лідерні послідовності пікорнавірусів, наприклад, лідерна послідовність EMCV (Encephalomyocarditis 5' ділянок, що не кодують, ) (-Elroy Stein і ін. (1989) Рrос. Natl, Acad. Sci. USA 86:6126-6130); лідерна послідовність потивірусів, наприклад, лідерна послідовність TEV (вірус гравірування тютюну) (Gallie і ін. (1995) Gene 165(2):233-238), лідерна послідовність MDMV (вірус карликової мозаїки кукурудзи) (Virology 154:9-20), і важкого ланцюга єднального білка людського імуноглобуліну (Ві) (Macejak і ін. (1991) Nature 353:90-94); нетрансльована лідерна послідовність поверхні білка м РКН вірусу мозаїки люцерни (РНК AMV 4) (Jobling і ін. (1987) Nature 325:622-625); лідерна послідовність вірусу мозаїки тютюну (TMV) (Gallie і ін. (1989) in Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, New York), pp. 237-256); і лідерна послідовність вірусу кукурудзи, що ушкоджена плямистим хлорозом (MCMV)) (Lommel і ін. (1991) Virology 81:382-385). Див. також, Della-Сіорра і ін. (1987) Plant Physio І. 84:965-968. Інші способи, відомі для того, щоб збільшувати трансляцію, можуть також бути використані, наприклад, інтрони, і т.п. У підготовці касети експресії різними фрагментами ДНК можна керувати, для того, щоб передбачити послідовності ДНК належної орієнтації і, як наслідок, у належній рамці зчитування. Зрештою, можуть бути застосовані адаптери або лінкери для того, щоб приєднати до фрагментів ДНК, або можуть бути використані інші маніпуляції для того, щоб передбачити зручні сайти рестрикції, видалення зайвої ДНК, видалення сайтів рестрикції, або подібне. З цією метою, можуть бути використані мутагенез in vitro, відновлення праймера, рестрикція, віджиг, перезаміни, наприклад, трансзиції і трансверсії. Багато які з промоторів можуть використовуватися в практиці даного винаходу. Промотори можуть бути обрані на підставі одержання бажаного результату. Нуклеїнові кислоти можуть бути об'єднані з конститутивними, специфічними для тканин, або іншими промоторами для експресії в рослинах. Серед таких конститутивних промоторів, наприклад, відомий коровий промотор Rsyn 7 і інших конститутивних промоторів, розкритий у WO 99 / 43838 і U.S. Patent No. 6,072,050; коровий промотор 35 CaMV (Odell і ін. (1985) Nature 313:810-812); рисовий актин (McElroy і ін. (1990) Plant Cell 2:163-171); убихітин (Christensen і ін. (1989) Plant Моl. Biol. 12:619632 and Christensen і ін. (1992) Plant Моl. Віоl. 18:675-689); pEMU (Last і ін. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten і ін. (1984) EMBOJ. 3:2723-2730); ALS промотор (U.S. Patent No. 5,659,026), і т.п. Інші конститутивні промотори описані в, наприклад, U.S. Patent Nos. 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; 5,608,142; and 6,177,611. Можуть бути використані специфічні для тканин промотори, для того, щоб бути призначеними для збільшеної експресії AHASL1 у межах специфічної рослинної тканини. Такі кращі специфічні для тканин промотори включають., але не є обмеженими, кращі для листів промотори, кращі для коренів промотори, кращі промотори для насіння, і кращі для стебла промотори. Кращі специфічні для тканин промотори включають Yamamoto і ін. (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kawamata і ін. (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803; Hansen і ін. (1997) Моl. Gen Genet. 254(3):337-343; Russell і ін. (1997) Transgenic Res. 6(2): 157-168; Rinehart і ін. (1996) Plant Physiol. 112(3): 1331-1341; Van Camp і ін. (1996) Plant Physiol. 112(2):525-535;CanevasciniMH. (1996) Plant Physiol. 112(2):513-524; Yamamoto і ін. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozco і ін. (1993) Plant Mol. Biol. 23(6):1129-1138; Matsuoka і ін. (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590; і Guevara-Garcia і ін. (1993) Plant J. 4(3):495-505. Такі промотори можуть бути модифіковані, у разі потреби, для ослаблення експресії. В одному зі своїх утілень нуклеїнові кислоти, що представляють інтерес, є специфічними для експресії в хлоропластах. З цього погляду, там, що де представляє інтерес, нуклеїнова кислота безпосередньо не вставлена в хлоропласт, касета експресії буде додатково містити послідовність, що призначається для хлоропласта, що включає послідовність нуклеотида, що кодує пептид транспорту хлоропласта, для того, щоб направити генний продукт, що представляє інтерес, у хлоропласти. Такі транспортні пептиди відомі в даній галузі техніки. Щодо послідовностей, що призначаються для хлоропласта, існують "операбельно зв'язані" засоби, що представляють послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує транспортний пептид (тобто, послідовність, що призначена для хлоропласта), вони зв'язані з полінуклеотидом пшениці AHASL1A S653N таким чином, що ці дві послідовності є суміжними в тій же самій рамці 9 UA 98768 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зчитування. Див., наприклад, Von Heijne і ін. (1991) Plant Моl. Biol. Rep. 9:104-126; Clark і ін. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa і ін. (1987) Plant Physiol 84:965-968; Romer і ін. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; and Shah і ін. (1986) Science 233:478481. У той час як білки AHASL1 винаходу включають батьківський транспортний пептид, будьякий транспортний пептид хлоропласта, відомий у даній галузі техніки, може бути прив'язаний до послідовності амінокислот зрілого білка AHASL1 А відповідно до винаходу й операбельно з'єднаний з послідовністю, що призначається для хлоропласта, до 5'-кінців нуклеотидної послідовності, що кодує зрілий білок AHASL1A згідно представленого винаходу. Послідовності, що націлені на хлоропласт, є відомими в даній галузі техніки і включають малу субодиницю хлоропласт рібулозо-1,5-бісфосфат карбоксилазу (Rubisco) (de Castro Silva Filho і ін. (1996) Plant Моl. Biol. 30:769-780; Schnell і ін. (1991) J. Biol. Chem. 266(5):3335-3342); 5(енолпірувіл) шикімат-3-фосфат синтазу (EPSPS) (Archer і ін. (1990) У. Bioenerg. Biomemb. 22(6):789-810); триптофан синтазу ((Zhao і ін. (1995) J. Biol. Chem. 270(11):6081-6087); пластоціанин (Lawrence і ін. (1997) J. Biol. Chem. 272(33):20357-20363); хлоризмат синтазу (Schmidt і ін. (1993) J. Biol. Chem. 268(36):27447-27457); і єднальний білок хлорофілу, що утворюється на світлі, a/b (LHBP) (LHBP) (Lamppa і ін. (1988) J. Biol. Chem. 263:14996-14999). Див. так само Von Heijne і ін. (1991) Plant Моl. Biol. Rep. 9:104-126; Clark і ін. (1989) J Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa і ін. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer і ін. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; and Shah і ін. (1986) Science 233:478-481. Способи, призначені для того, щоб перетворювати хлоропласти, відомі в даній галузі техніки. Див., наприклад, Svab і ін. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab and Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab and Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606. Спосіб полягає в тім, що застосовують доставку за допомогою бомбардувальних часток ДНК, що містять селектований маркер і призначається для тієї ДНК, яку будуть вводити в геном пластиди через відповідну рекомбінацію. Додатково, пластидна трансформація може бути досягнута шляхом трансактивації латентного перенесеного в пластиду трансгена, щодо переважної тихорєцької експресії закодованої в ядрі і пластидної орієнтованої РНК полімерази. Про таку систему повідомили McBride і ін. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305. Нуклеїнові кислоти, що становлять інтерес, що буде виявлений до хлоропласта, можуть бути оптимізовані для експресії в хлоропласті, для того, щоб складати розходження у використанні кодона між ядром рослини і його органелами. З цього погляду, нуклеїнові кислоти, що становлять інтерес, можуть бути синтезовані, використовуючи кращі для хлоропласта кодони. Див., наприклад, U.S. Patent No. 5,380,831, у даному описі включений як посилання. Як розкрито в даному описі, винахід реалізує способи для того, щоб вони давали можливість робити високобілкові рослини пшениці, що мають стійкість до інгібування AHAS-гербіцидом. Рослини пшениці включають у їхній геномах принаймні одну копію гена пшениці AHASL1A S653N. Такий ген може бути ендогенним геном або трансгенним, як розкрито в даному описі. Додатково, у визначених утіленнях, ген AHASL1A S653N пшениці може бути отриманий за допомогою будь-якої комбінації послідовностей полінуклеотида, що становить інтерес, включаючи інші стійкі до гербіциду гени AHASL1, для того, щоб створити рослини пшениці з бажаним фенотипом. Наприклад, полінуклеотиди, відповідно до даного винаходу, можуть бути сполучені з будь-якими іншими полінуклеотидами, що кодують поліпептиди, що мають пестицидну і / або інсектицидну активність, такі як, наприклад, білки токсинів Bacillus thuringiensis (описані U.S. Patent Nos. 5,366,892; 5,747,450; 5,737,514; 5,723,756; 5,593,881; і Geiser і ін. (1986) Gene 48:109). Зроблені комбінації можуть також включати багаторазові копії кожного з полінуклеотидів, що становить інтерес. Касети експресії винаходу можуть містити маркерний ген для селекції перетворених клітин. Селектовані маркерні гени, включаючи такі і відповідно до даного винаходу, використовуються для селекції перетворених клітин або тканин. Маркерні гени включають, але не є обмеженими, гени, що кодують антибіотичну стійкість, такі як ті, котрі кодують неоміцин фосфотрансцеразу II (НЕО) і гідроміцин фосфотрансцеразу (НРТ), так само як гени, що забезпечують стійкість для гербіцидних складів, таких як амоній глуфозинат, бромоксиніл, імідазолінони, і 2, 4дихлорфеноксиацетат (2, 4-D). Див. загалом, Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech, 3:506-511; Christopherson і ін. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6314-6318; Yao і ін. (1992) Cell 71:63-72; Reznikoff (1992) Моl. Microbiol. 6:2419-2422; Barkley і ін. (1980) in The Ореrоn, pp. 177-220; Hu і ін. (1987) Cell 48:555-566; Brown і ін. (1987) Cell 49:603-612; Figge і ін. (1988) Cell 52:713-722; Deuschle і ін. (1989) Proc. Natl. Acad. Асі. USA 86:5400-5404; Fuerst і ін. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2549-2553; Deuschle і ін. (1990) Science 248:480-483; Gossen (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Reines і ін. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1917-1921; Labow і ін. (1990) Моl. Cell. Вiol. 10:3343-3356; Zambretti і ін. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3952-3956; 10 UA 98768 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Bairn і ін. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5072-5076; Wyborski і ін. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4647-4653; Hillenand-Wissman (1989) Topics Моl. Struc. Biol. 10:143-162; Degenkolb і ін. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591-1595; Kleinschnidt і ін. (1988) Biochemistry 27:1094-1104; Bonin (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Gossen і ін. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551; Oliva і ін. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919; Hlavka і ін. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlin); Gill і ін. (1988) Nature 334:721-724. Такі розкриття в даному описі включені як посилання. Вищезгаданий список селектованих маркерних генів представлений не для того, щоб обмежувати. Будь-який селектований маркерний ген може використовуватися в існуючому винаході. Конструкти полінуклеотида і касети експресії, що включають полінуклеотиди пшениці AHASL1A S653N, можуть використовуватися у векторах, для того щоб перетворити рослини пшениці. Полінуклеотиди пшениці AHASL1A S653N можуть бути використані в одних тільки векторах або в комбінації з послідовністю нуклеотида, що кодує малу субодиницю AHAS (AHASS) ферменту в асоціації з інгібуванням гербіциду в рослинах. Див., U.S. Patent No. 6,348,643; який у даному описі включений як посилання. Винахід також має відношення до способів, що призначені для того, щоб створити трансгенну рослину пшениці, що дає як продукт врожай зерна зі збільшеним вмістом білка, і яке є стійким до гербіцидів, включаючи при цьому трансформацію рослини за допомогою конструкта полінуклеотида, що включає операбельний промотор, що зв'язаний з полінуклеотидом пшениці AHASL1A S653N і забезпечує експресію в рослині. Винахід також має відношення до нетрансгенних рослин пшениці, трансгенних рослинам пшениці, зробленими способами згідно даного винаходу, а так само нащадків і до інших поколінь таких нетрансгенних і трансгенних рослин пшениці, для яких розширені рослинні представники, а також збільшена стійкість до гербіцидів, що впливають на активність ферменту AHAS, особливо імідазолінон і сульфоніл сечовинові гербіциди, і так само, продукують зерно зі збільшеним вмістом білка. Високобілкові рослини пшениці відповідно до даного винаходу можуть включати в їхній геномах, на додаток до принаймні однієї копії гена пшениці AHASL1A S653N, один або більш додаткових полінуклеотидів AHASL. Нуклеотидні послідовності, що кодують толерантні до гербіциду білки AHASL і толерантні до гербіциду рослини, що включають ендогенний ген, що кодує толерантний до гербіциду білок AHASL, включають полінуклеотиди рослини відповідно до даного винаходу і ті, котрі відомі в даній галузі техніки. Див., наприклад, U.S. Patent Nos. 5,013,659, 5,731,180, 5,767,361, 5,545,822, 5,736,629, 5,773,703, 5,773,704, 5,952,553 і 6,274,796; усі з яких у даному описі включені як посилання. Численні вектори трансформації рослин і способи, призначені для того, щоб перетворити рослини є доступними з літератури. Див., наприклад, An, G. і ін. (1986) Plant Pysiol, 81:301-305; Fry, J., і ін. (1987) Plant Cell Rep. 6:321-325; Block, M. (1988) Theor. Appl Genet.76:767-774; Cousins, і ін. (1991) Aust. J. Plant Physiol. 18:481-494; Chee, P.P. and Slightom, J.L. (1992) Gene 118:255-260; Christou, і ін. (1992) Trends. Biotechnol. 10:239-246; D'Halluin, і ін. (1992) Bio/Technol. 10:309-314; Dhir, і ін. (1992) Plant Physiol. 99:81-88; Casas і ін. (1993) Proc. Nat. Acad Sci. USA 90:11212-11216; Christou, P. (1993) In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant; 29P: 119-124; Davies, і ін. (1993) Plant Cell Rep. 12:180-183; Dong, J.A. and Mchughen, A. (1993) Plant Sci. 91:139-148; Franklin, С.I. and Trieu, T.N. (1993) Plant. Physiol. 102:167; Golovkin, і ін. (1993) Plant Sci. 90:41-52; Guo Chin Sci. Bull. 38:2072-2078; Asano, і ін. (1994) Plant Cell Rep. 13; Ayeres N.M. and Park, W.D. (1994) Crit. Rev. Plant. Sci. 13:219-239; Barcelo, і ін. (1994) Plant. J. 5:583-592; Becker, і ін. (1994) Plant. J. 5:299-307; Borkowska і ін. (1994) Aсta. Physiol Plant. 16:225-230; Christou, P. (1994) Agro. Food. Ind. Hi Tech. 5: 17-27; Eapen і ін. (1994) Plant Cell Rep. 13:582-586; Hartman, і ін. (1994) BioTechnology 12: 919923; Ritala, і ін. (1994) Plant. Моl. Вiol. 24:317-325; and Wan, Y.С. and Lemaux, P.G. (1994) Plant Physiol. 104:3748. Способи відповідно до представленого винаходу включають уведення конструкта полінуклеотида в рослину. "Уведення конструкта полінуклеотида" є необхідним для того, щоб дозволяти представленій рослині одержати конструкцію полінуклеотида в такому виді, що конструкція одержує доступ до пула всіх клітин рослини. Способи відповідно до представленого винаходу не залежать від специфічного способу для того, щоб увести конструкцію полінуклеотида в рослину, тільки лише конструкція полінуклеотида одержує доступ до пула принаймні однієї з клітин рослини. Способи, призначені для того, щоб увести конструкт полінуклеотида в рослини, відомі в даній галузі техніки включаючи, але не будучи обмеженими перерахованими далі, такими, як способи стабільної трансформації, способи транзитної трансформації, а також вірус - опосередковані способи. 11 UA 98768 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 "Стабільною трансформацією" є те, що конструкція полінуклеотида, введена в рослину, інтегрується в геном рослини і здатна до того, щоб бути успадкованим нащадками цієї рослини. "Транзитною трансформацією" є, що конструкція полінуклеотида, введена в рослину, не інтегрується в геном рослини. Для трансформації рослин і клітин рослини, полінуклеотиди пшениці AHASL1A S653N уставлені за допомогою стандартних способів у будь-який вектор, відомий у даній галузі техніки, що є підходящим для експресії послідовностей нуклеотида в клітці рослини або клітках рослин. Вибір вектора залежить переважно від техніки трансформації і цільових видів рослин, що будуть трансформовані. У втіленні винаходу полінуклеотид пшениці AHASL1A S653N є операбельним, зв'язаним із промотором рослини, що відомий експресією високого рівня в клітці рослини, і ця конструкція далі введена в таку рослину, що є сприйнятливою до імідазолінонового гербіциду і трансформованої рослини, з якого це відновлено. Трансформована рослина є толерантною до збільшення рівня імідазолінонового гербіциду, що знищив би або значно пошкодив би нетрансформовану рослину. Цей спосіб може бути застосований до будь-яких видів рослин; однак, ті випадки є самими переважними, коли рослина відноситься до хлібних злаків, особливо хлібних злаків, що типово вирощуються в присутності принаймні одного гербіциду, особливо імідазолінонового гербіциду. Методологія, призначена для того, щоб сконструювати касети експресії рослини і ввести чужорідні нуклеїнові кислоти в рослини, є загальновідомою в даній галузі техніки і була раніше описана. Наприклад, чужорідна ДНК може бути введена в рослини, використовуючи пухлиноіндуковані (Ті) вектори плазміди. Інші способи, використовувані для доставки чужорідної ДНК, включають використання трансформації PEG - медійованого протопласта, електропорацію, мікроін'єкції часток, і біолістику або пряме бомбардування мікрочастинками ДНК. Такі способи відомі в даній галузі техніки. (U.S. Pat. No. 5,405,765 to Vasil і ін.; Bilang і ін. (1991) Gene 100: 247-250; Scheid і ін., (1991) Моl. Gen. Genet., 228: 104-112; Guerche і ін., (1987) Plant Science 52: 111-116; Neuhause / in., (1987) Theor. Appl Genet. 75: 30-36; Klein і ін., (1987) Nature 327: 70-73; Howell і ін., (1980) Science 208:1265; Horsch і ін., (1985) Science 227: 1229-1231; DeBlock і ін., (1989) Plant Physiology 91: 694-701; Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds.) Academic Press, Inc. (1988) and Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds.) Academic Press, Inc. (1989). Спосіб трансформації залежить від клітин рослини, що буде трансформовано, стабільності використовуваних векторів, рівня експресії генних продуктів і інших параметрів. Інші підходящі способи введення послідовностей нуклеотида в клітини рослини і наступної вставки в геном рослини включають мікроін'єкцію, як описано в Crossway і ін. (1986) Biotechniques 4:320-334, електропорацію, як описано Riggs і ін. (1986) Рrос. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606, Agrobacterium - опосередковану трансформацію, як описано в Townsend і ін., U.S. Patent No. 5,563,055, Zhao і ін., U.S. Patent No. 5,981,840, пряму генну передачу, як це описано в Paszkowski і ін. (1984) EMBO J. 3:2717-2722, і балістичне прискорення часток, так як це описано, наприклад, у Sanford і ін., U.S. Patent No. 4,945,050; Tomes і ін., U.S. Patent No. 5,879,918; Tomes і ін., U.S. Patent No. 5,886,244; Bidney і ін., U.S. Patent No. 5,932,782; Tomes і ін. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment, " in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlin); McCabe і ін. (1988) Biotechnology 6:923-926); and Lecl transformation (WO 00/28058). Also see, Weissinger і ін. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford і ін. (1987) Paniculate Science and Technology 5:27-37 (onion); Christou і ін. (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (soybean); McCabe і ін. (1988) Bio/Technology 6:923-926 (soybean); Finer and McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175-182 (soybean); Singh і ін. (1998) Theor Appl. Genet. 96:319-324 (soybean); Datta і ін. (1990) Biotechnology 8:736-740 (rice); Klein і ін. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305-4309 (maize); Klein і ін. (1988) Biotechnology 6:559-563 (maize); Tomes, U.S. Patent No. 5,240,855; Buising і ін., U.S. Patent Nos. 5,322,783 and 5,324,646; Tomes і ін. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment, " in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg (Springer-Verlag, Berlin) (maize); Klein і ін. (1988) Plant Physiol. 91:440-444 (maize); Fromm і ін. (1990) Biotechnology 8:833-839 (maize); Hooykaas-Van Slogteren і ін. (1984) Nature (London) 311:763-764; Bowen і ін., U.S. Patent No. 5,736,369 (cereals); Bytebier і ін. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5345-5349 (Liliaceae); De Wet і ін. (1985) in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman і ін. (Longman, New York), pp. 197-209 (pollen); Kaeppler і ін. (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 and Kaeppler і ін. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (whisker-mediated transformation); D'Halluin і ін. (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (electroporation); Li і ін. (1993) Plant Cell Reports 12:250-255 and Christou and Ford (1995) Annals of 12 UA 98768 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Botany 75:407-413 (rice); Osjoda і ін. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (maize via Agrobacterium tumefaciens); усі з яких у даному описі включені як посилання. Полінуклеотиди пшениці AHASL1A S653, відповідно до винаходу, можуть бути введені в рослини, зв'язуючи з рослинним вірусом або з вірусними нуклеїновими кислотами. Загалом, такі способи включають злиття конструкта полінуклеотида згідно винаходу, у межах вірусної ДНК або молекули РНК. Є відомим те, що полінуклеотид пшениці AHASL1A S653 може бути спочатку синтезований як частина вірусного поліпептиду, що пізніше може бути оброблений протеолітичними ферментами в природних умовах або в пробірці і одержати бажаний рекомбінантний білок. Далі, є відомим те, що промотори винаходу також охоплюють промотори, використовувані для транскрипції вірусними полімеразами РНК. Способи, що призначені для того, щоб увести конструкт полінуклеотида в рослини і експресувати білок, закодований там, при цьому утягуючи вірусну ДНК або молекули РНК, відомі в даній галузі техніки. Див., наприклад, U.S. Patent Nos. 5,889,191, 5,889,190, 5,866,785, 5,589,367 and 5,316,931; у даному описі включений як посилання. Клітини, що були трансформовані, можуть бути вирощені в рослинах відповідно до звичайних способів. Див., наприклад, McCormick і ін. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Ці рослини можуть бути далі вирощені, і / або обпилені з тим же самим штамом трансформанта, або різними штамами, і отриманий гібрид має конститутивну експресію особливого бажаного ідентифікованого фенотипу. Два або більше покоління можуть бути вирощені, для того, щоб гарантувати, що експресія особливого бажаного ідентифікованого фенотипу є стійко підтримуваною і є успадкованою, і далі проводять відбір отриманих фенотипів для того, гарантувати, що експресію особливого бажаного ідентифікованого фенотипу було досягнуто. З цього погляду, представлений винахід реалізує трансформоване насіння (також називане як "трансгенне насіння"), що має конструкт полінуклеотида відповідно до винаходу, наприклад, касети експресії відповідно до винаходу, стійко інкорпоровані в його геном. Високобілкові рослини пшениці відповідно до даного винаходу знаходять використання в способах через те, щоб контролювати появу бур'янів. Таким чином, представлений винахід далі забезпечує спосіб, призначений для того, щоб контролювати появу бур'янів біля рослини пшениці з високим вмістом білка, відповідно до даного винаходу. Спосіб включає застосування ефективної кількості гербіциду до бур'янів і для рослини пшениці з високим вмістом білка, при чому рослина пшениці з високим вмістом білка має збільшену стійкість принаймні до одного гербіциду, особливо імідазоліноновому або сульфонілсечовиновому гербіцидові, у той час, коли в порівнянні з подібною рослиною пшениці дикого типу, такого не відбувається. Представлені у даному винаході високобілкові рослини пшениці, з підвищеною стійкістю до гербіцидів, особливо імідазоліноновим і сульфонілсечовиновим гербіцидам, можуть бути використаними у великій розмаїтості композицій, для того, щоб захистити рослини від бур'янів, для того, щоб збільшити ріст рослини і зменшити боротьбу за живильні речовини. Гербіцид може використовуватися окремо, для попередньої обробки, після обробки, перед щепленням і при забезпеченні контролю бур'янів на тих ділянках, що оточують рослини, описані в даному описі, або ж імідазолінонова композиція гербіциду може бути використана, при цьому зазначена містить інші добавки. Гербіцид може також використовуватися при обробці насіння. При цьому ефективна концентрація або ефективна кількість гербіциду, або складу, що включає ефективну концентрацію або ефективну кількість гербіциду, може бути застосована безпосередньо до насінь до або під час посіву насінь. Добавки, що утримуються в імідазолінових або сульфонілсечовинних композиціях гербіциду або складах, включають інші гербіциди, миючі засоби, додаткові речовини, спреєві агенти, клеючі агенти, агенти, що стабілізують, або подібні ім. Композиція гербіциду може бути підготовлена у вологій або сухій формах і може включати, але не є обмеженою, флотуючі порошки, емульсійні концентрати і рідкі концентрати. Гербіцид і композиції гербіциду можуть бути застосовані відповідно до звичайних способів, наприклад, шляхом розпилення, шляхом іригації, шляхом чищення, шляхом покриття, і тлі. Представлений винахід забезпечує способи, що призначені для того, щоб завдяки їм були одержані рослини пшениці з високим вмістом білка, шляхом звичайного розмноження рослини, що включає полове розмноження. Способи включають схрещування першої батьківської рослини пшениці, що включає в її геномі принаймні одну копію гена пшениці AHASL1A S653N або полінуклеотид із другою батьківською рослиною пшениці, для того, щоб одержати нащадків F 1. Перша рослина може бути кожною з рослин пшениці білка, з високим вмістом білка, відповідно до даного винаходу включаючи, наприклад, трансгенні рослини пшениці, що включають принаймні одну копію гена пшениці AHASL1A S653N або і нетрансгенні рослини пшениці, що включають ген пшениці AHASL1A S653N, такі, як отримані мутагенезом так, як це розкрито у WO 2004 / 106529 і U.S. Patent Application Publication Nos. 2004 / 0237134 2004 / 13 UA 98768 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 0244080; усі з яких у даному описі включені як посилання. Друга батьківська рослина пшениці може бути будь-як рослиною пшениці, що здатно до виробництва життєздатних нащадків рослин пшениці (тобто, насіння), що схрещується з першою рослиною. Як правило, але не обов'язково, перші і другі батьківські рослини пшениці походять від тих же самих різновидів пшениці. Способи можуть далі включати селфінг нащадка F1, для того, щоб одержати нащадка F2. Додатково, способи відповідно до представленого винаходу можуть далі включати одне або більш зворотних схрещувань поколінь F1 або рослин нащадків F2 з рослиною тієї ж самої лінії або генотипу, або як у якості першої, або як у якості другої батьківської рослини пшениці. Альтернативно, нащадки F1 першого схрещування або будь-якого наступного схрещування можуть бути схрещені з третьою рослиною пшениці, що має складну лінію або генотип, чим перша або чим друга рослина. Способи відповідно до представленого винаходу можуть додатково включати селекцію рослин, що включають, особливо, стійкість до гербіциду першої рослини, наприклад, застосовуючи ефективну кількість гербіциду на рослини нащадків пшениці, що включають ген пшениці AHASL1 S653N або стандартними способами, для того, щоб знайти ген AHASL1 S653N такі як, наприклад, ПЦР. Представлений винахід забезпечує способи, що включають використання AHAS інгібуючого гербіциду. У цих способах AHAS - інгібуючий гербіцид може бути застосований будьяким способом, відомим у даній галузі техніки включаючи, але не обмежуючи обробку насіння, обробку ґрунту, і листяну обробку. Відповідно до опису, AHAS - інгібуючий гербіцид може бути перетворений у загально прийняті композиції, наприклад розчини, емульсії, суспензії, дуети, порошки, пасти і гранули. Форма використання залежить від специфіки наміченої мети; у кожнім випадку це повинно гарантувати результат і навіть дистриб'юцію композиції відповідно до винаходу. Композиції наготовлюють відомими способами (див. наприклад, для огляду US 3,060,084, ЕР-А 707 445 (для рідких концентратів), Browning, "Agglomeration", Chemical Engineering, Dec. 4, 1967, 147-48, Perry's Chemical Engineer's Handbook, 4th Ed., McGraw-Hill, New York, 1963, pages 8-57 and et seq. WO 91/13546, US 4,172,714, US 4,144,050, US 3,920,442, US 5,180,587, US 5,232,701, US 5,208,030, GB 2,095,558, US 3,299,566, Klingman, Weed Control as a Science, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1961, Hance і ін., Weed Control Handbook, 8th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1989 and Mollet, H., Grubemann, A., Formulation technology, Wiley VCH Verlag Gmb, Weinheim (Germany), 2001, 2. D. A. Knowles, Chemistry and Technology of Agrochemical Formulations, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 1998 (ISBN 0-7514-0443-8), наприклад для посилення активного інгредієнта, композиція може містити допоміжні компоненти, що підходять для композиції агрохімікатів, такі, як розчинники і / або носії, якщо бажано, те емульгатори, сурфактанти і диспергатори, консерванти, агенти, що антиспінюють, антифризні агенти, для композиції, призначеної для обробки насіння, також підходять барвники і / або носії і / або агенти, що склеюють. Приклади підходящих розчинників - вода, ароматичні розчинники (наприклад продукти Solvesso, ксилол), керосини (наприклад фракції мінеральної олії), спирти (наприклад метанол, бутанол, пентанол, алкоголь бензила), кетони (наприклад циклогексанон, гама - бутиролактон), піролідони (NMP, NOP), ацетати (гліколь діацетат), гліколі, диметиламіди жирних кислот, жирні кислоти і естери жирних кислот. У принципі, можуть також використовуватися розчинюючі суміші. Приклади підходящих носіїв - засновані на природних корисних копалинах (наприклад каоліни, глини, тальк, крейда) і засновані на синтетичних корисних копалинах (наприклад високо диспергований кварц, силікати). Підходящі емульгатори - неіоногенні й аніонні емульгатори (наприклад поліоксиетиленові жирні ефіри алкоголю, алкілсульфонати й арилсульфонати). Приклади диспергаторів - лігнін - сульфіти у водній формі і метилцелюлоза. Підходящі використовувані сурфактанти є лужним металом, лужноземельним металом і солями амонію лігносульфонової кислоти, такими, як нафталенсульфонова кислота, фенолсульфонова кислота, дибутилнафталенсульфонова кислота, алкіларилсульфонати, алкільовані сульфати, алкілсульфонати, жирні сульфати алкоголю, жирні кислоти і сульфатовані жирні ефіри гліколя алкоголю, крім того, конденсати сульфонатів нафталіну і похідних нафталіну з формальдегідом, конденсати нафталіну або нафталенсульфонової кислоти з фенолом і формальдегідом, поліоксиетилен октилфенол ефір, етоксильований ізооктилфенол, октилфенол, нонилфенол, алкілфенолефіри полігліколя, трибутилфенил ефір полігліколя, тристеарилфенил ефір полігліколя, алкіл арил поліефір алкоголі, алкоголь і жирні етиленові конденсати окису алкоголю, етоксильована касторова олія, поліоксиетилен 14 UA 98768 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 алкільовані ефіри, етоксильовані поліоксипропілени, лауриловий ефір полігліколя алкоголю ацетат, сорбитол естери, лігносульфит і метилцелюлоза. Речовини, що є підходящими для підготовки безпосередньо спрейового розчину, емульсії, пасти або нафтова дисперсія, є фракціями мінеральної олії в середовищі з високою крапкою кипіння, такими як газ або дизельне паливо, крім того, олія бітуму і рослинна олія або олія тваринного походження, аліфатичні, циклічні і ароматичні вуглеводні, наприклад толуол, ксилол, газ, тетрагідронафтален, алкільовані нафталіни або їхні похідні, метанол, етанол, пропанол, бутанол, циклогексанол, циклогексанон, ізофорон, сильно полярні розчинники, наприклад сульфоксид етану, N-метилпіролидон або вода. Також антифризні агенти, такі як гліцерин, етиленовий гліколь, гліколь пропілену і бактерициди, такі, котрі можуть бути додані до композиції. Підходящі агенти, що анти спінюються, наприклад, що агенти анти спінюються, засновані на стеараті кремнію або магнію. Підходящі консерванти, наприклад, дихлорофен і ензил алкогольгемиформаль. Композиції для обробки насіння можуть додатково включати носії і довільно барвники. Носії можуть бути додані, для того, щоб поліпшити прилипання активних матеріалів до насінь після обробки. Підходящі носії - блоксополімери сурфактанти ЕО/РО, але також і полівінілалкоголь, полівінілпіролідони, поліакрилати, поліметакрилати, полібутени, поліізобутени, пінопласт, поліетиленаміни, поліетиленаміди, поліетиленіміди (Lupasol ®, Полімін ®), поліефіри, поліуретани, полівінілацетати, тилоза і співполімери, отримані з цих полімерів. Переважно, також барвники можуть бути включені в композицію. Підходящі барвники або фарби для композицій обробки насіння - Родамін В, С.І. пігмент червоний 112, С.І. розчинюючий червоний 1, пігмент синій 15:4, пігмент синій 15:3, пігмент синій 15:2, пігмент синій 15:1, пігмент синій 80, пігмент жовтий 1, пігмент жовтий 13, пігмент червоний 112, пігмент червоний 48:2, пігмент червоний 48:1, пігмент червоний 57:1, пігмент червоний 53:1, жовтогарячий пігмент 43, жовтогарячий пігмент 34, жовтогарячий пігмент 5, пігмент зелений 36, пігмент зелений 7, білий пігмент 6, коричневий пігмент 25, основний фіалковий 10, основний фіалковий 49, кислотний червоний 51, кислотний червоний 52, кислотний червоний 14, кислотний синій 9, кислотний жовті 23, основне червоний 10, основний червоний 108. Приклади підходящого агента, що склеюється - караген (Satiagel®). Порошки, матеріали придатні для розподілу, і дустові продукти можуть бути підготовлені, шляхом змішування або попутно можуть бути розмелені з активною речовиною і розчинюючим носієм. Гранули, наприклад покриті гранули, просочені гранули і гомогенні гранули, можуть бути підготовлені шляхом зв'язування активних композицій з розчинюючим носієм. Приклади розчинюючих носіїв - земельні мінерали, такі як гелі кварцу, силікати, тальк, каолін, аттаклей, вапняк, вапно, крейда, стовбурні відходи, ліс, глина, доломіт, діатомова земля, сульфат кальцію, сульфат магнію, окис магнію, основні синтетичні матеріали, добрива, такі як, наприклад, сульфат амонію, фосфат амонію, нітрат амонію, сечовини, і продукти рослинного походження, такі як зернові продукти, продукти з кори дерева, продукти з дерева і продукти з горіхової шкарлупи, порошки целюлози й інші розчинюючі носії. Загалом, композиції включають від 0,01 до 95 % по вазі, переважно від 0,1 до 90 % по вазі, AHAS-інгібуючого гербіциду. У цьому випадку, AHAS-інгібуючі гербіциди використовуються в чистоті від 90 % до 100 % по вазі, переважно 95 % до 100 % по вазі (відповідно до спектра NMR). З метою обробки насіння відповідні композиції можуть бути розчинені в 2-10 разів, що приводить до концентрацій у готовому виді, для того, щоб використовувати готування 0,01 до 60 % вазі активного складу по вазі, переважно 0,1 до 40 % по вазі. AHAS - інгібуючий гербіцид може використовуватися як такий, у формі їхніх композицій або формах використання, підготовлених для цих цілей, наприклад у формі безпосередньо спрейового розчину, порошку, суспензії або дисперсії, емульсії, нафтовій дисперсії, пасти, дустових продуктів, матеріалів, призначених для спридинга, або гранул, за допомогою розпилення, дроблення, чищення, спридинга або заливання. Форми використання залежать цілком від намічених цілей; вони призначені для того, щоб гарантувати в кожнім випадку найкращий розподіл AHAS-інгібуючого гербіциду відповідно до винаходу. Водні форми для використання можуть бути підготовлені з концентратів емульсії, паст або порошків, що змочуються, (спреєві порошки, нафтова дисперсія), додаючи при цьому воду. Для того, щоб підготувати емульсії, пасти або нафтову дисперсію, речовини, як такі, або розчинені в нафті або розчиннику, можуть бути гомогенізовані у воді за допомогою більш вологого, підвищувальної клейкості диспергатора або емульгатора. Однак, також можливо підготувати 15 UA 98768 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 концентрати, складені з активної речовини, більш вологого, підвищувальної клейкості диспергатора або емульгатора і, якщо необхідно, розчинника або нафти, і такі концентрати є підходящими для розчинення з водою. Активні компоненти концентрації в готових до використання готуваннях можуть бути різні в межах щодо широких діапазонів. Загалом, вони складають від 0,0001 до 10 %, переважно від 0,01 до 1 % по вазі. AHAS - інгібуючий гербіцид може також використовуватися успішно в процесі "украй низького обсягу" (ULV), це є можливим для того, щоб застосувати композиції, що включають більш ніж 95 % по вазі активної композиції, або навіть застосувати активну композицію без добавок. Далі приведені приклади композицій: 1. Продукти для розчинення з водою для застосування на листах. З метою обробки насіння такі продукти можуть бути застосовані до насіння, у розчиненому виді або чистому виді. А) Розчинні у воді концентрати (SL, LS) Десять частин по вазі AHAS-інгібуючого гербіциду розчинені в 90 частинах по вазі води або розчинного у воді розчинника. Як альтернатива, додані зволожувачі або інші допоміжні речовини. AHAS - інгібуючий гербіцид розчиняється при розчиненні з водою, за допомогою чого отримана композиція з 10 % (вага / вага) AHAS-інгібуючого гербіциду. B) Диспергуючі концентрати (DC) Двадцять частин по вазі AHAS-інгібуючого гербіциду розчинені в 70 частинах по вазі циклогексанона з додаванням 10 частин по вазі диспергатора, наприклад полівінілпіролідона. Розчинення з водою дає дисперсію, за допомогою чого отримана композиція з 20 % (вага/вага) AHAS - інгібуючого гербіциду. C) Емульгуючі концентрати (EC) П'ятнадцять частин по вазі AHAS-інгібуючого гербіциду розчинені в 7 частинах по вазі ксилолу з додаванням кальцію додецилбензенсульфоната і етоксильованої касторової олії (у кожнім випадку 5 частин по вазі). Розчинення з водою дає емульсію, за допомогою чого отримана композиція з 15 % (вага / вага) AHAS - інгібуючого гербіциду. D) Емульсії (EW, ЕО, ES) Двадцять п'ять частин по вазі AHAS-інгібуючого гербіциду розчинені в 35 частинах по вазі ксилолу з додаванням кальцію додецилбензенсульфоната і етоксильованої касторової олії (у кожнім випадку 5 частин по вазі). Ця суміш введена в 30 частин по вазі води за допомогою машинного емульгатора (наприклад, Ultraturrax) і перетворена в гомогенну емульсію. Розчинення з водою дає емульсію, за допомогою чого отримана композиція з 25 % (вага / вага) AHAS - інгібуючого гербіциду. E) Суспензії (SC, OD, FS) У спеціальному кульовому млині, 20 частин по вазі AHAS - інгібуючого гербіциду були роздроблені з додаванням 10 частин по вазі диспергаторів, змащувала і 70 частин по вазі води або органічного розчинника, для того, щоб одержати гарну суспензію AHAS - інгібуючого гербіциду. Розчинення з водою дає стійку суспензію AHAS - інгібуючого гербіциду, за допомогою чого отримана композиція з 20 % (вага / вага) AHAS - інгібуючого гербіциду. F) Водно-дисперговані гранули і розчинні у воді гранули (WG, SG) П'ятдесят частин по вазі AHAS - інгібуючого гербіциду використовували як основу, далі точно додали 50 частин по вазі диспергаторів, і зволожувачів, і одержували як воднодисперговані, так і розчинні у воді гранули, за допомогою технічних приладів (наприклад екструзія, розпорошувальне сушіння, флюїдизація). Розчинення з водою дає стійку дисперсію або розчин AHAS - інгібуючого гербіциду, за допомогою чого отримана композиція з 50 % (вага / вага) AHAS - інгібуючого гербіциду. G) Водно-дисперговані порошки і розчинні у воді порошки (WP, SP, SS, WS) Сімдесят п'ять частин по вазі AHAS - інгібуючого гербіциду були основою для роторстартерного млина з додаванням 25 частин по вазі диспергаторів, зволожувачів і гелю кварцу. Розчинення з водою дає стійку дисперсію або розчин AHAS - інгібуючого гербіциду, за допомогою чого отримана композиція з 75 % (вага / вага) AHAS - інгібуючого гербіциду. І) Гелева композиція (GF) У пристрої кульового млина, 20 частин по вазі додано було AHAS - інгібуючого гербіциду, далі роздроблено з додаванням 10 частин по вазі диспергаторів, 1 частина по вазі агента, що склеюється, зволожувача, і 70 частин по вазі води або органічного розчинника, для того, щоб одержати гарну суспензію AHAS - інгібуючого гербіциду. Розчинення з водою дає стійку суспензію AHAS - інгібуючого гербіциду, за допомогою чого отримана композиція з 20 % (вага / 16 UA 98768 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вага) AHAS - інгібуючого гербіциду. Ця композиція гелю є підходящою для даного винаходу як композиція для обробки насіння. 2. Продукти, що будуть застосовані на листях Для того, щоб обробляти насіння, такі продукти можуть бути застосовані як розчини на насіння. А) Дустові порошки (DP, DS) П'ять частин по вазі AHAS - інгібуючого гербіциду ґрунтовно і точно, ретельно було перемішано з 95 частинами по вазі точно розділеного каоліну. Це дає одержати дустовий продукт, що має 5 % (вага / вага) AHAS - інгібуючого гербіциду. Гранули В) (GR, FG, GG, MG) Половину частини по вазі AHAS - інгібуючого гербіциду ґрунтовно і точно було зв'язано з 95,5 частинами по вазі носіїв, за допомогою чого була отримана композиція з 0,5 % (вага / вага) ґрунтовно і точно. При цьому минулому використані такі способи - екструзія, розпорошувальне сушіння або флюїдизація. Це дає одержати гранули, що будуть застосовані тільки для листяного використання. Звичайні композиції для обробки насіння включають, наприклад, рідкий концентрат FS, розчини LS, порошки для сухої обробки DS, воднодисперговані для глинистої обробки WS, розчинні у воді порошки SS і емульсія ES і EC і композиції гелю GF. Ці композиції можуть бути застосовані до насіння, як у розчиненому виді, так і в чистому виді. Застосування для насінь може бути виконане перед сіянням, або безпосередньо на насіннях. У переважному втіленні композиція FS використовується для обробки насіння. Типово, композиція FS може включати 1-800 г/л активного компонента, 1-200 г/л сурфактантів, від 0 до 200 г/л антифризного агента, від 0 до 400 г/л носія, від 0 до 200 г/л пігменту і до 1 літра розчинника, переважно, яким є вода. Для обробки насіння рослин пшениці з високим вмістом білка відповідно до даного винаходу обробляють з гербіцидами, переважно гербіцидами, обраними з групи, що складає з AHAS інгібуючих гербіцидів, таких як амідосульфурон, азимсульфурон, бензсульфурон, хлоримурон, хлорсульфурон, циносульфурон, циклосульфамурон, етаметсульфурон, етоксисульфурон, флазасульфурон, флюпирсульфурон, форамсульфурон, галосульфурон, імазосульфурон, іодосульфурон, мезосульфурон, метсульфурон, никосульфурон, оксасульфурон, примисульфурон, просульфурон, піразосульфурон, ринсульфурон, сульфометурон, сульфосульфурон, трифенсульфурон, тріасульфурон, трибенурон, трифлохусульфурон, трифлусульфурон, тритосульфурон, імазаметабенз, імазамокс, імазапик, імазапир, імазаквин, імазефапир, хлорансулам, диклосулам, хлорасулам, флуметсулам, метосулам, пенокссулам, биспірабак, пириминобак, пропоксикарбазон, флукарбазон, пирибензоксим, пирифталид, пиритіобак, і суміші їх, або з композицією, що включає AHAS - інгібуючий гербіцид. У більш кращому варіанті, насіння рослин пшениці з високим вмістом білка відповідно даному винаходові обробляють з імідазоліноновим гербіцидом. Термін "обробка насіння" включає всі підходящі способи обробки насіння, відомі в даній галузі техніки, такі як дезінфекція насіння, дражжування насіння, замочування насіння, і здобрення розчинами насіння. Відповідно до одного варіанта даного винаходу, подальший предмет винаходу - це спосіб обробки ґрунту відповідно до опису, особливо в рядових сівалках: або гранульованою композицією, що містить AHAS - інгібуючий гербіцид як склад / композиції (наприклад, гранульована композиція, з довільно одним або більш твердого або рідким, з погляду сільського господарства прийнятним носієм, і / або довільно з одним або більш із точки зору сільського господарства прийнятним сурфактантом. Цей спосіб з користю використовується, наприклад, у грядах хлібних злаків, кукурудзи, бавовни і соняшника. Представлений винахід також включає насіння, що покриті композицією або оброблені композицією, що включає принаймні один ALS інгібітор, що обраний із групи, що включає амідосульфурон, азимсульфурон, бензсульфурон, хлоримурон, хлорсульфурон, циносульфурон, циклосульфурон, етаметсульфурон, етоксисульфурон флазасульфурон, флюпирсульфурон, форамсульфурон, галосульфурон, імазосульфурон, іодосульфурон, мезосульфурон, метсульфурон, никосульфурон, оксасульфурон, примисульфурон, просульфурон, піразосульфурон, ринсульфурон, сульфометурон, сульфосульфурон, трифенсульфурон, тріасульфурон, трибенурон, трифлохусульфурон, трифлусульфурон, тритосульфурон, імазамметабенз, імазамокс, імазапик, імазапир, імазаквин, імазефапир, хлорансулам, диклосулам, хлорасулам, флуметсулам, метосулам, пенокссулам, биспірабак, пириминобак, пропоксикарбазон, флукарбазон, пирибензоксим, пирифталид і пиритіобак. Переважно, ALS інгібітор - імідазоліноновий гербіцид. 17 UA 98768 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Термін насіння, використовується для насінь, груп насіння і рослин усіх видів, що розмножуються, включаючи, але не є при цьому обмеженим, безпосередньо самими насіннями, частинами насіння, відростками, клубнецибулинами, цибулинами, фруктами, бульбами, зернами, пагонками, і т.п., у переважному втіленні, усіма насіннями. Термін, "покритий і / або утримуючий" загалом, означає, що активний компонент знаходиться по більшій частині на поверхні розповсюджуваного продукту під час обробки, хоча велика або менша частина компонента може проникнути усередину розповсюджуваного продукту, у залежності від способу обробки. Коли згаданий розповсюджуваний продукт є реплантованим, він може адсорбувати активний компонент. Нанесення при обробці насінь AHAS - інгібуючого гербіциду або композиції, що включає AHAS - інгібуючий гербіцид, виконують шляхом розпилення або очищення насінь перш, ніж висіяти рослини і перед висадженням рослин. При обробці насінь відповідні композиції можуть бути застосовані для обробки насіння, з ефективною кількістю AHAS-інгібуючого гербіциду або композиції, що включає AHAS інгібуючий гербіцид. При даному застосуванні, використовують кількість у загальному від 0,1 м до 10 кг а. і. (або суміші а. і. або композиції) на 100 кг насінні, переважно від 1 м до 5 кг на 100 кг насінні, особливо від 1 м до 2,5 кг на 100 кг насінні. Для визначених зернових культур, таких як салат, норма може бути вище. Рослина пшениці з високим вмістом білка відповідно до даного винаходу, знаходить своє використання в способі, призначеному для того, щоб боротися з небажаною рослинністю або контролювати бур'яни, що включає контакт насінь рослин пшениці з високим вмістом білка відповідно до існуючого винаходу перш, ніж посіяти і / або після попереднього проростання, з AHAS-інгібуючим гербіцидом. Спосіб може далі включати висівання насінь, наприклад, у ґрунт у визначеній галузі або в герметизированому середовищі в оранжереї. Спосіб знаходить специфічне використання в боротьбі з небажаною рослинністю або контролюванні бур'янів у безпосередній близькості від насіння. Контроль небажаної рослинності розуміють у значенні знищення бур'янів і / або затримки росту, або інгібування нормального росту бур'янів. Бур'яни, у самому широкому змісті, розуміють у значенні всіх тих рослин, що ростуть у місцях розташування, де вони є небажаними. Бур'яни відповідно до даного винаходу включають, наприклад, двочасткові й однодольні бур'яни. Бур'яни двочасткові включають, але не є обмеженими, бур'яни родів: Sinapis, Lepidium, Galium, Stellaria, Matricaria, Anthemis, Galinsoga, Chenopodium, Urtica, Senecio, Amaranthus, Portulaca, Xanthium, Convolvulus, Ipomoea, Polygonum, Sesbania, Ambrosia, Cirsium, Carduus, Sonchus, Solatium, Rorippa, Rotala, Lindernia, Lamium, Veronica, Abutilon, Emex, Datura, Viola, Galeopsis, Papaver, Centaurea, Trifolium, Ranunculus, and Taraxacum. Бур'яни Monocotyledonous включають, але не є обмеженими, бур'яни пологів: Echinochloa, Setaria, Panicum, Digitaria, Phleum, Poa, Festuca, Eleusine, Brachiaria, Lolium, Bromus, Avena, Cyperus, Sorghum, Agropyron, Cynodon, Monochoria, Fimbristyslis, Sagittaria, Eleocharis, Scirpus, Paspalum, Ischaemum, Sphenoclea, Dactyloctenium, Agrostis, Alopecurus, and Apera. Крім того, бур'яни відповідно до даного винаходу можуть включати, наприклад, хлібні злаки, що ростуть у небажаному місці розташування. Наприклад, вільна рослина кукурудзи, що знаходиться на ділянці, що переважно включає рослини сої, може вважатися бур'яном, якщо рослина кукурудзи є небажаним на ділянці для рослин сої. Артиклі, що використовувані в даному описі, є необхідними для того, щоб виділити один або більше чим один (тобто, принаймні один) граматичний об'єкт статті. Так, наприклад, "елемент" означає один або більш елементів. У тім значенні, як використано в даному описі, слово "включаючий", або тієї зміни, що "включають" або "включення", будуть розумітися як такі, під якими мається на увазі включення встановленого елемента, цілого числа або стадії, або групи елементів, цілих чисел або стадій, але не виключення будь-якого іншого елемента, цілого числа або стадії, або групи елементів, цілих чисел або стадій. Наступні приклади пропонуються для цілей ілюстрування, але ні в якому разі, для цілей обмеження. ПРИКЛАД 1: Лінії пшениці зі збільшеним вмістом білка в зерні Лінії пшениці були отримані, використовуючи стандартний мутагенез і звичайні способи розмноження рослини. Ціль мутагенезу полягала в тому, щоб одержати лінії пшениці з толерантністю до імідазолінових гербіцидів. Мутація, відповідальна за імідазолінову толерантність у цих лініях пшениці, є єдиною зміною нуклеотида гуаніну на аденин, що приводить до зміни кодона від AGC до ААС і єдиної заміни амінокислоти серину на аспарагін у 18 UA 98768 C2 5 10 15 20 25 30 35 великий субодиниці білка AHASL (ацетогідроксилацид синтаза), обумовлений як AHASL1A S653N. Фермент AHAS каталізує перший крок у біосинтезі амінокислот з розгалуженим ланцюгом, валіні, лейцині і ізолейцині (Stidham and Singh (1991) "Imidazolinone-Acetohydroxyacid Synthase Interactions, " In: The Imidazolinone Herbicides, Ch. 6, Shaner, D., and O'Connor, S., eds.; CRC Press, Boca Raton, Florida, U.S.A., pp. 71-90) і знаходиться під регулюванням зворотного зв'язку цими амінокислотами в рослинах. Єдина точка мутації в гені AHAS забезпечує толерантність до імідазолінонових гербіцидів, змінюючи єднальну ділянку для цих гербіцидів у мутанті ферменту AHAS, але не має ніякого виявленого ефекту на регулювання зворотного зв'язку з амінокислотами з розгалуженим ланцюгом і нормальною біосинтетичною функцією ферменту (Newhouse і ін., (1992) Plant Physiol 100:882-886) (фіг. 1). Дослідження композиційних зерен проводилися під час процесів вибору ліній пшениці, що показують толерантність гербіциду, і в цих дослідженнях був виявлений більш високий вміст білка в зерні. Ці дослідження проводилися в різних географічних місцях розташування (Каліфорнія, Міннесота, Північна Дакота, штат Вашингтон і Канада) і роки з 1999 до 2004 (Табл. 2). Ці п'ять ліній (BW 255-2, BW 238-3, К42, Теаl15А і ElsaxEM2) показували ця якість незалежна від того, як вони були отримані, і з різної зародкової плазми, і незалежно від проведеного мутагенезу, а одна лінія (ElsaxEM2) була отримана шляхом інтрогресії з пшениці Einkorn (Triticum monococcum), що була мутагенізована. Процентний уміст білка був високим для ліній BW 255-2, BW 238-3, К42, Теаl15А і ElsaxEM2 у порівнянні з їхніми батьками (Табл. 1). Істотні збільшення протягом багатьох років і місць розташування коливалися від 3 до 13 % у порівнянні з тими, котрі відповідають батьківській лінії (Табл. 2) або фактичний приріст від 0,4 до 2,1 %, що складав у середньому 1,3 % через усі місця розташування ліній і роки в порівнянні з їхній батьками. Вміст для змінених розгалужених амінокислот зміни валіну, ізолейцину і лейцину й істотно амінокислот лізину, метіоніну, цистину і треоніну були звичайно значно вище, але були деякі виключення (Табл. 2). Середнє збільшення коливалося від 6 до 11 % у порівнянні з тими, що відповідають батьківській лінії (Табл. 2) або фактичний приріст від 0,02 до 0,09 усереднень 0,04 % через всі кількості амінокислот у порівнянні з їхніми батьками. Врожай зерна і тестований обсяг для мутантів BW 255-2, і BW 2383 не були значно різні, чим їхні відповідні батьківські лінії для польових іспитів, вирощених у 2003 і 2004 (Табл. 3). Аналогічно, результати інгібування зворотного зв'язку представлені для ліній, BW 255-2 і батьківській BW 255 (фіг. 1) і порівнянні для інших ліній, і показують, що не було ніякого ефекту мутації для інгібування зворотного зв'язку, що, можливо, змінило б регулювання біосинтезу амінокислот розгалуженого ланцюга. Гербіцид толерантні лінії пшениці, використовувані в дослідженнях, представлених у цьому прикладі, є поколінням М 5 або старшим і є гомозиготами для AHASL1A S653N ознак. Таблиця 1 Середнє збільшення відсотка вмісту білка в зерні для ліній гомозигот для AHASL1A S653N у порівнянні з їхніми батьками, підведений підсумок через роки і місця розташування Лінії BW 238-3 BW 255-2 К42 EM2xElsa Теаl15А Білок (% вмісту) 7,4 7,3 13,3 5,6 8,2 Таблиця 2 Порівняння білка і цінності амінокислот TaAHASL1A S653N мутантів до їх батьків Аналізована речовина % 1999 Білок Валін Ізолейцин Рік 1,2 Teal 15,9 b 0,71b 0,57 b TeaІ15A % складності 17,2 a 0,75 a 0,62 a 8,2 5,6 8,8 19 UA 98768 C2 Продовження таблиці 2 Порівняння білка і цінності амінокислот TaAHASL1A S653N мутантів до їх батьків Рік Аналізована речовина % Лейцин Лізин Метіонін Цистин Треонін Аналізована речовина % 2002 Протеїн Валін Ізолейцин Лейцин Лізин Метіонін Цистин Треонін Рік Аналізована речовина % 2003 Протеїн Валін Ізолейцин Лейцин Лізин Метіонін Цистин Треонін Рік Аналізована речовина % Протеїн Валін Ізолейцин Лейцин Лізин Метіонін Цистин Треонін Аналізована речовина % 2004 Протеїн Валін Ізолейцин Лейцин Лізин Метіонін Цистин Треонін Рік 1,2 TeaІ15A % складності 1,06 b 0,41b 0,25 a 0,37 a 0,52 b 1,15 a 0,44 a 0,27a 0,39 a 0,56 a 8,5 7,3 8,0 5,4 7,7 BW 238 BW 238-3 % складності BW 255 17,5 а 0,7 а 0,53 а 1,05 а 0,44 а 0,27 а 0,35 а 0,51а 19,1 bc 0,77 bc 0,67 b 1,26 b 0,48 bc 0,3 b 0,39 b 0,56 c 9,1 10,0 26,4 20,0 9,1 11,1 11,4 9,8 18,3 ab 0,75 b 0,63 b 1,21 b 0,47 b 0,3 b 0,37 ab 0,53 b BW 238 BW 238-3 % складності BW 255 16,9 а 0,72 а 0,6 а 1,17а 0,44 а 0,25 а 0,35 а 0,52 а 18,1 bc 0,78 b 0,65 b 1,26 b 0,46 b 0,27 b 0,36 a 0,57 bc 7,1 8,3 8,3 7,7 4,5 8,0 2,9 9,6 18 ab 0,73 a 0,62 ab 1,21 ab 0,43 a 0,25 a 0,36 a 0,55 ab 19,4 c 0,81 b 0,7 c 1,33 c 0,47 b 0,28 b 0,41b 0,58 c 7,8 11,0 12,9 9,9 9,3 12,0 13,9 5,5 Elsa EM2xElsa % складності Krichu aff K42 % складності 16,2 b 0,71b 0,58b 1,18b 0,42 b 0,24 а 0,36 а 0,5 b 17,1 a 0,75 a 0,62 a 1,11 a 0,44 a 0,25 а 0,37 а 0,53 а 5,6 5,6 6,9 -5,9 4,8 4,2 2,8 6,0 13,5 b 0,59 b 0,46 b 0,93 b 0,38 b 0,22 a 0,35 a 0,46 a 15,3 a 0,71 a 0,57 a 1,06 a 0,42 a 0,23 a 0,36 a 0,5 a 13,3 20,3 23,9 14,0 10,5 4,5 2,9 8,7 BW 238 BW 238-3 % складності BW 255 16,7 а 0,69 e 0,56 e 1,14а 0,42 b 0,23 bc 0,33 с 0,47 с 17,7 b 0,66 cd 0,53 d 1,18b 0,42 b 0,24 cd 0,37 d 0,5 d 6,0 -4,3 -5,4 3,5 0,0 4,3 12,1 6,4 15,2 c 0,62 a 0,49 b 1,03 c 0,39 a 0,21 a 0,29 a 0,44 a Teal 1 BW 255-2 % складності 20,4 c 0,81 с 0,69 b 1,32 b 0,5 c 0,33 c 0,41 с 0,59 d 11,5 8,0 9,5 9,1 6,4 10,0 10,8 11,3 BW 255-2 % складності BW 255-2 % складності 15,6 d 0,65 be 0,52 cd 1,08 d 0,41 b 0,24 cd 0,32 bc 0,46 b 2,6 4,8 6,1 4,9 5,1 14,3 10,3 4,5 Обсяги засобу для дев'яти спостережень (% сухої основи ваги). Мутанти і батьківські джерела були вирощені в блокових копіюваних польових іспитах. 2 Статистичний аналіз був пророблений у межах даної аналізованої речовини для порівняння мутанта до батька. Як зазначено, розходження не значні. 20 UA 98768 C2 Таблиця 3 Врожай і випробуваний ваговий обсяг батьківських ліній BW 255 і BW 238 і мутантів BW 255-2 і BW 238-3 (TaAHASL1A S653N), вирощених у трьох місцях розташування в США протягом 2003 і 2004 Рік Варіант 2003 BW 255 BW 255-2 BW 238 BW 238-3 Рік Варіант 2004 BW 255 BW 255-2 BW 238 BW 238-3 Врожай зерна 1 bu/A) 60,9 60,6 60,4 60,6 F=0,57 Р 0,64 Врожай зерна bu/A) 57,4 54,4 65,4 59,1 F=1,86 Р=0,149 2 Група* а а а а LSD=1,0 Група* ab а b ab LSD=9,8 Тестована вага (lbs/bu) 60,1 60 59,4 61,6 F=0,85 P 0,45 Тестована вага (lbs/bu) 61,9 62,4 59,6 59,3 F=2,00 P=0,151 Група* а а а а LSD=3,0 Група * ab b a a LSD=2,7 1 Обсяги засобу для дев'яти спостережень, вирощених у блокових повних іспитах на польових ділянках, без указівки ND і MN, листя не значно різні. 2 Як зазначено, розходження не значні. 5 10 15 20 25 30 Вміст білка в зерні, незамінні амінокислоти з розгалуженим ланцюгом істотно оцінювали для ліній зерна, що є стійкими до імідазолінових гербіцидів, вони були значно збільшені в порівнянні з їх відповідними батьківськими лініями. Чотири незалежно отриманих лінії, що мають Triticum aestivum ген AHASL1А S653N і інші, відбулися через інтрогресію тієї ж самої мутації від Triticum monococcum L., усі вони показали збільшення якостей білка в зерні, коли в порівнянні з їх відповідними батьківськими лініями, цього не було. Ці результати демонструють, що збільшення білка в зерні відбувається через мутацію пшениці AHASL1A S653N, і що не було ні зменшення у врожаї зерна, ні зміни у відповіді інгібування зворотного зв'язку в цих лініях AHASL1A S653N у порівнянні з батьками. У той час, як усі лінії пшениці AHASL1A S653N, досліджені до дійсного часу, включають кодон ААС для аспарагіна 653, лінії пшениці, що включають кодон ААТ для аспарагіна 653, як також очікували, зробили зерно зі збільшеним вмістом білка. Перевага збільшення вмісту білка в зерні, забезпеченого мутацією S653N, обмежена тільки геном AHASL1A. Лінії пшениці з мутацією S653N, що відбувається з гомології AHASL1D і гени AHASL1B, не показували збільшення білка в зерні (дані, не показані). ПРИКЛАД 2: Стійкі до гербіциду білки пшениці AHASL Представлений винахід розкриває використання полінуклеотидів, що кодують поліпептиди пшениці AHASL1A S653N. Рослини, що включають стійкі до гербіциду поліпептиди AHASL, були раніше ідентифіковані, і багато які зі збережених ділянок поліпептидів AHASL, що є ділянками замін амінокислоти, що обумовлюють стійкість до гербіцидів, були описані. Див., Devine and Eberlein (1997) "Physiological, biochemical and molecular aspects of herbicide resistance based on altered target sites". In: Herbicide Activity: Toxicology, Biochemistry and Molecular Biology, Roe і ін. (eds.), pp. 159-185, IOS Press, Amsterdam; and Devine and Shukla, (2000) Crop Protection 19:881889. Використовуючи послідовності пшениці AHASL1A S653N для винаходу і способів, відомих для фахівців, що мають звичайні навички в даній галузі техніки, можна одержати додаткові полінуклеотиди, що кодують стійкі до гербіциду поліпептиди AHASL, що мають заміну S653N і одну, дві, три, або більше додаткових замін амінокислоти на ідентифікованих ділянках у цих збережених областях. Табл. 4 показує збережені галузі білків AHASL, заміни амінокислоти, відомі як такі, що забезпечують стійкість гербіциду в межах цих збережених ділянок, і відповідні амінокислоти в білку пшениці (Triticum aestivum) AHASL 1. 21 UA 98768 C2 Таблиця 4 Заміни амінокислоти в збережених областях поліпептидів AHASL, що, як відомо, забезпечують стійкість до гербіциду Консервативна дялінка 1 Мутація 2 Позиція амінокислоти в Triticum aestivum Реферат 4 VFAYPGGASMEIHQALTRS 3 Bernasconi и др. 5 Wright & Penner 6 Boutsalis і ін. 7 Guttieri і ін. 8 Guttieri / in. 7 Guttieri і ін. 9 Kolkman і ін. 7 Guttieri і iн. 6 Boutsalis і iн. 7 Guttieri і iн. 7 Guttieri і iн. 10 Hartnett і iн. 11 Simpson 9 Kolkman і iн. 12 White і iн. 13 Bruniard 6 Boutsalis і iн. 14 Devine & Eberlein 15 Chang & Duggleby Ala122 to Thr Про197 to Ala Про197 to Thr Про197 tо His AJTGQVPRRMIGT 3 Про197 to Leu Про197 to Arg Про197 tо Ile Про197 to Gln Про197 to Ser Аlа205 to Asp AFQETP QWED 3 IPSGG 3 3 11 Ala205 to Val Trp574 to Leu Ser653 to Asn Ser653 to Thr Ser653 to Phe Lee і iн. 1 5 10 15 20 25 16 Ala48 Про123 Ala131 Trp500 Ser579 Conserved regions from Devine and Eberlein (1997) "Physiological, biochemical and molecular aspects of herbicide resistance based on altered target sites". In: Herbicide Activity: Toxicology, Biochemistry and Molecular Biology, Roe і ін. (eds.), pp. 159-185, IOS Press, Amsterdam and Devine and Shukla, (2000) Crop Protection 19: 881-889. 2 Amino acid numbering corresponds to the amino acid sequence of the Arabidopsis thaliana AHASL polypeptide. 3 The amino acid sequence of the wild-type Triticum aestivum AHASL 1 comprises the same conserved region. 4 Bernasconi і ін. (1995) J. Biol. Chem. 270(29): 17381-17385. 5 Wright and Penner (1998) Theor. Appl. Genet. 96: 612-620. 6 Boutsalis і ін. (1999) Pestic. Sci. 55: 507-516. 7 Guttieri і ін. (1995) Weed Sci. 43: 143-178. 8 Guttieri і ін. (1992) Weed Sci. 40: 670-678. 9 Kolkman і ін. (2004) Theor. Appl. Genet. 109: 1147-1159. 10 Hartnett і ін. (1990) "Herbicide-resistant plants carrying mutated acetolactate synthase genes, " In: Managing Resistance to Agrоchemicals: Fundamental Research to Practical Strategies, Green і ін. (eds.), American Chemical Soc. Symp., Series No. 421, Washington, DC, USA 11 Simpson (1998) Down to Earth 53(l): 26-35. 12 White і ін. (2003) Weed Sci. 51: 845-853. 13 Bruniard (2001) Inheritance of imidazolinone resistance, characterization of cross-resistance pattern, and identification of molecular markers in sunflower (Helianthus annuus L.). Ph.D. Thesis, North Dakota State University, Fargo, ND, USA, pp 1-78. l4 Devine and Eberlein (1997) "Physiological, biochemical and molecular aspects of herbicide resistance based on altered target sites". In: Herbicide Activity: Toxicology, Biochemistry and Molecular Biology, Roe і ін. (eds.), pp. 159-185, IOS Press, Amsterdam. 15 Chang and Duggleby (1998) Biochem J. 333: 765-777. 16 Lee і ін. (1999) FEBSLett. 452: 341-345. 22 UA 98768 C2 5 10 15 20 25 30 ПРИКЛАД 3: Технічна характеристика польових експлуатаційних іспитів ліній пшениці з високим вмістом білка в Арізоні і Каліфорнії Лінії яриці (Triticum aestivum) включали AHASL1A S653 (У) N мутації і їхні ізогенні, немутантні, батьківські лінії, що були вирощені за зиму (2005-2006) у трьох місцях розташування в Північній півкулі (Каліфорнія й Арізона, США). Вміст білка в зерні кожної з ліній було обмірювано, для того, щоб визначити, чи показали мутовані AHASL1A S653N лінії пшениці збільшений вміст зерна, вирощений щодо їхніх батьківських ліній у навколишнім середовищі, що виходить за межі їхніх зон адаптації і при підоптимальних умовах фотоперіоду (тобто, за більш короткі дні). Записи і місця розташування Гомозиготи мутанти AHASL1A (S653N) у двох генетично відмінних генотипах, Kirchauff-K42 (австралійська лінія яриці, також згадана в даному описі як "К42") і BW 238-3 (північноамериканська лінія яриці), поряд з їх ізогенними, немутантними, батьківськими лініями (Kirchauff і BW 238 відповідно), були вирощені в суміжних великих ділянках (одиничне повторення) у трьох місцях розташування за 2005-2006 зимових сезонів у південно-західних Сполучених Штатах. Два місця розташування були близько до Юма, Арізона, у той час як третє місце розташування було біля Динуба, Каліфорнія. Місця розташування були засіяні в листопаді 2005 і зібрані в липні 2006. Розміри ділянок і норм відбору: 2 Посівна норма: 100 грам насінь на 35 м . Розмір ділянки: 2 × 1,75 м × 10 м (1 уч.). Ділянки були відділені смугами ячменя 10 м шириною. Агрономічні технічні характеристики і врожай зернових культур Усі ділянки були піддані однаковій агротехніці. Ні в одну з ділянок не вносили імідазолінонові гербіциди. Щоб продемонструвати генотипну виразність Kirchauff і ліній BW 238, ділянки були оцінені по росту як традиційний і як високий. Лінія Kirchauff-K42 і її ізогенна батьківська лінія, Kirchauff, були більш високими і показали менше випускання, чим лінія BW 238-3 і її ізогенна батьківська лінія, BW 238. Ніякі істотні розходження в агрономічній роботі не були виявлені між лініями, що містять мутацію AHASL1A S653N і їхній відповідний ізогенний немутант батьківських ліній, що спостерігалося на ділянці в кожному з місць розташування. Таблиця 5 резюмує характер росту для всіх чотирьох ліній у Динуба, Каліфорнійському місці розташування. Таблиця 5 Характеристики росту для чотирьох ліній зерна, вирощених у зимовий період у Динуба, Каліфорнія Лінія пшениці BW -238-3 (S653N лінія) BW -238 (батьківська лінія) К42 (S653N лінія) Kirchauff (батьківська лінія) 35 40 Оцінка 25 січня, 2006 Висота Фаза рослини росту і Зауваження (см) розвитку 10-15 24-27 10-14 24-27 20-33 24-30 20-33 24-30 Оцінка 10 лютого, 2006 Висота Стан рослини Зауваження росту (см) Дуже виснажений ріст 23-30 25-30 23-30 25-30 Прямостоячий ріст 38-52 31 38-52 31 Сильні втечі. Кінці гілок є прямостоячими. Помірні гілки Цілком сталі. У st центра ділянки 1 Результати й обговорення Тестовані зерна, SDS седиментації обсягів, а також процентний уміст білка для двох Юма, місце розташування Арізона і Динуба, місце розташування Каліфорнія, показане в Табл. 6-8, відповідно. Табл. 9 показує підсумки результатів для всіх трьох місць розташування. Коли результати вмісту білка в зерні були усереднені для цих трьох місць розташування, KirchauffK42 показав рівень білка в зерні, що був на 5 % вище, ніж його ізогенна контрольна батьківська лінія (Табл. 9). Точно так само, BW 238-3 показав рівень білка в зерні, що був на 5.1 % вище, ніж його ізогенна контрольна батьківська лінія, коли вміст білка в зерні було усереднено для цих трьох місць розташування (Табл. 9). Середня тестована вага зерна була трохи вище для Kirchauff-K42 у порівнянні з його немутантною батьківською лінією; тоді як тестована вага зерна 23 UA 98768 C2 5 BW 238-3 не була значно відмінна від його немутантної батьківської лінії (Табл. 9). SDS седиментації обсягів, що використовуються, для того, щоб визначити силу склеювання і якість здоби, були також не значно різні між мутантною лінією AHASL1A і відповідними батьківськими контрольними лініями контролю. Ці результати демонструють, що гексаплоїдні лінії зерна, що містять AHASL1A S653N мутацію, продукують зерно з високим вмістом білка в зерні, чим батьківські контрольні лінії, навіть коли вирощена за межами їхніх зон адаптації і за межами їх нормального сільськогосподарського сезону. Таблиця 6 Тестована вага зерна (фунт/бушель), вміст білка в зерні %, і SDS седиментація (мм) обсягів TaAHASL1A S653N мутантної лінії і батьківських ліній в випробуванні Юма 1 Лінія Тестована вага (фунт/бушель) К42 (S653N лінія) Kirchauff (батьківська лінія) BW 238-3 (S653N лінія) BW 238 (батьківська лінія) 61,4 57,5 59,1 59,5 SDS седиментація (мм) 99 99 105 110 Вміст білка в зерні (%) 14,4 13,9 18,7 17,6 Процентний вміст зміни білка † в зерні 3,6 6,3 * SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) седиментація тест для пшениці Американської Асоціації дослідників Хімії зерна (ААСС), є міжнародно схваленим способом, призначеним для того, щоб визначити силу склеювання і якість здоби і для твердої пшениці і для м'якої пшениці. Див., See, Morris і ін. (2007) J. Sci. FoodAgric. 87: 607-615. † Відсоток збільшення вмісту білка в зерні лінії S653N щодо вмісту білка в зерні батьківської лінії. Kirchauff і BW 238 - батьківські лінії для К42 і BW 238-3, відповідно. 10 Таблиця 7 Тестована вага зерна (фунт/бушель), вміст білка в зерні %, і SDS седиментація (мм) обсягів TaAHASL1 A S653N мутантної лінії і батьківських ліній в випробуванні Юма 2 Лінія Тестована вага (фунт/бушель) К42 (S653N лінія) Kirchauff (батьківська лінія) BW 238-3 (S653N лінія) BW 238 (батьківська лінія) 60,0 57,6 58,6 58,4 SDS седиментація (мм) 104 109 111 112 Вміст білка в зерні (%) 14,7 14,1 19,2 18,2 Процентний уміст зміни білка в зерні 4,3 5,5 Таблиця 8 Тестована вага зерна (фунт/бушель), вміст білка в зерні %, і SDS седиментація (мм) обсягів TaAHASL1 A S653N мутантної лінії і батьківських ліній в іспиті Динуба Лінія Тестована вага (фунт/бушель) К42 (S653N лінія) Kirchauff (батьківська лінія) BW 238-3 (S653N лінія) BW 238 (батьківська лінія) 62,0 57,2 59,3 58,2 SDS седиментація (мм) 99 91 114 116 24 Вміст білка в зерні (%) 14,7 13,6 18,1 17,7 Процентний уміст зміни білка в зерні 8,1 2,3 UA 98768 C2 Таблиця 9 Усереднені значення * тестуванням ваги зерна (фунт/бушель), вмісту білка в зерні %, і SDS седиментації (мм) обсягів TaAHASL1 A S653N мутантної лінії і батьківських ліній перехресного розташування Лінія К42 (S653N лінія) Kirchauff (батьківська лінія) BW 238-3 (S653N лінія) BW 238 (батьківська лінія) Процентний Усереднене значення Усереднене значення Усереднене значення уміст зміни тестованої ваги SDS седиментації вмісту білка в зерні білка в (фунт/бушель) (мм) (%) @ зерні † Порівн. (с.о) Порівн. (с.о) Порівн. (с.о) 61,1 1,0 100,7 0,2 14,6 2,9 5,0 57,4 0,2 99,7 0,2 13,9 9,0 59,0 0,4 110,0 0,3 18,7 4,6 5,1 58,7 0,7 112,7 0,1 17,8 3,1 * Середнє число від обсягу для двох іспитів Юма (Табл. 6 і 7) і для іспиту Динуба (Табл. 8). † стандартне відхилення (с.о). @ Процентна зміна усередненого вмісту білка в зерні лінії S653N по середньому вмісті білка в зерні батьківської лінії. Kirchauff і BW 238 - батьківські лінії для К42 і BW 238-3, відповідно. 5 10 15 20 25 30 Приклад 4: Тести хлібопекарської якості зерна, продукованого зі зразків ліній пшениці з високим вмістом білка Зерно, по прикладах, продуковане зі зразків ліній пшениці з високим вмістом білка, вирощеного в двох з цих трьох місць розташування (один у Dinuba, Каліфорнія й один у Yuma, Арізона) у польових випробуваннях, розкритих у Прикладі 3 вище, було піддано багатьом способам тестування пшениці і борошна незалежною лабораторією, для того, щоб визначити, чи впливав ефект збільшення білка в зерні від мутантів AHASL1A на здобу якості. Зразки зерна з кожного періоду (AHASL1A і батьківська ізогенна лінія) були піддані лабораторному борошномельному процесові (Buhler Laboratory Flour Mill), для того, щоб одержати зразки борошна з пшениці на ділянках. Пшениця і змолоті зразки були далі піддані деяким якісним тестам (вологовміст, вміст білка, вміст зольного залишку і число падіння), для того, щоб визначити деякі стандартні якісні параметри пшениці. Спеціалізовані стандартні тести, такі як Єдина система характеристики зерен (SKCS), фаринограф, і тест випікання формового хліба, проводилися, для того, щоб визначити особливості обробки і здоби для кожного зі зразків. Ці способи описані в "Wheat and Flour Testing Methods. A Guide to Understanding Wheat and Flour Quality", (2004) Wheat Marketing Center, Inc. and North American Export Grain Association, Inc., США; у даному описі включений як посилання. Результати цих тестів наведені в таблицях 1013, показаних нижче. Хоча AHASL1A S653N лінії мутанта усі продемонстрували збільшення білка в зерні, жодна з ліній мутанта, не відрізнялася значно від їх батьківських ізогенних ліній з погляду даних по хлібовипіканню (Таблиці 10-13). Це було очікуваним, тому що усереднене значення SDS седиментації, що використовується для того, щоб пророчити силу клейковини і якість здоби (див., приклад 3 вище), були також не значно різними між мутантом лінії AHASL1А і відповідними батьківськими тестами. Збільшений вміст білка в зерні, не торкаючись при цьому якості здоби, - ця якість є бажаною, особливо, для пшеничної промисловості. Таким чином, мутант лінії AHASL1А відповідно до даного винаходу знаходить використання у виробництві борошна, що характеризується підвищеним вмістом білка, що підтримує якість здоби з такого борошна контрольних ліній пшениці. Борошно з зерна мутанта лінії пшениці AHASL1A також знаходить використання у виробництві пекарських товарів зі збільшеним вмістом білка, на відміну від пекарських товарів, що зроблені з борошна, що одержують із зерна контрольних ліній пшениці або ліній пшениці дикого типу. 35 25 UA 98768 C2 Таблиця 10 Дані по пшениці Варіант К42 Kirchauff К42 Kirchauff BW 238-03 BW 238 BW 238-03 BW 238 Приклад CMDTY HWS HWS HWS HWS HRS HRS HRS HRS LOC Yuma Yuma Dinuba Dinuba Yuma Yuma Dinuba Dinuba PRO 13,48 12,92 14,09 13,08 16,85 16,39 16,76 16,19 MOI 8,67 8,61 9,1 8,98 8,59 8,64 8,5 8,86 TW 62,6 59,7 62,8 59,5 60,9 59,4 60,5 60,2 Дані по пшениці TKW HARD FN 31,82 76,03 524 27,61 85,63 524 31,14 71,61 541 26,18 81,31 567 27,88 85,48 593 27,82 84,45 566 25,47 85,92 618 24,66 85,28 604 SKCS Hard 0-4-7-89-1 Hard 1-3-7-89-1 Hard 0-5-19-76-1 Hard 1-2-6-91-1 Hard 0-2-3-95-1 Hard 0-0-5-95-1 Hard 0-1-5-94-1 Hard 2-2-7-89-1 CMDTY, промисловий виріб; HWS, тверда біла весняна пшениця; і HRS, пізня червона весняна пшениця. LOC, місце розташування. PRO, білок % у пшениці при вологості 8,5 %. МОІ, вологість (%). TW, іспитова вага. TKW, маса тисячі зерен (грами). HARD, ядерна Твердість (індекс від-20 до 120). FN, число падіння (секунди). FN - міра в'язкості, визначена при вимірі резистентності борошна і водної пасти при перемішуванні, що знижується. SKCS, Єдина система характеристики зерен. Ця система аналізує 300 зерен індивідуально для ваги зерен (мг), діаметр зерен (мм), вологовміст (%) і твердість зерен (індекс від-20 до 120). Таблиця 11 Дата розмелу і результати фаринографа Варіант К42 Kirchauff К42 Kirchauff BW 238-03 BW 238 BW 238-03 BW 238 Приклад CMDTY HWS HWS HWS HWS HRS HRS HRS HRS LOC Yuma Yuma Dinuba Dinuba Yuma Yuma Dinuba Dinuba Дата розмелу PRO MOI ASH 11,86 13,73 0,499 11,61 13,5 0,511 12,56 12,99 0,515 11,5 13,01 0,549 15,72 13,35 0,605 15,43 13,77 0,551 16,01 13,52 0,564 15,43 13,43 0,557 ABS 63,7 64,0 64,3 62,5 67,8 66,4 68,0 65,9 Фаринограф Peak Стабільність 6,00 9,00 5,00 9,00 5,75 6,25 5,00 5,75 7,00 10,25 7,50 13,75 7,75 24,50 8,00 26,65 MTI 30 30 45 55 20 15 15 15 CMDTY, промисловий виріб; HWS, тверда біла весняна пшениця; і HRS, пізня червона весняна пшениця. LOC, місце розташування. PRO, білок % у пшениці при вологості 14 %. МОІ, вологість (%). ASH, зольний залишок борошна (%). ABS, абсорбція (%): кількість води, необхідної для центрування фаринографа, при повороті на 500-Вrаbеndеr-одиниць (Б/Е) лінії. Peak, Піковий час (хвилини): указує на час обробки тесту, починаючи з моменту додавання води і доти, поки тісто не досягає максимальної консистенції. Стабільність, час стабільності (хвилини): цей час, протягом якого тісто тримає максимальну послідовність. МТІ, індекс стійкості при замісі (хвилини): указує на ступінь зм'якшення тесту під час перемішування. 26 UA 98768 C2 Таблиця 12 Дані по випіканню Приклад Варіант CMDTY LOC К42 HWS Yuma Kirchauff HWS Yuma К42 HWS Dinuba Kirchauff HWS Dinuba BW 238-03 HRS Yuma BW 238 HRS Yuma BW 238-03 HRS Dinuba BW 238 HRS Dinuba Vol cc Vol 877 10 795 5 840 5 797 5 945 10 945 10 955 10 975 10 Дані по випічці Grain Текстура Колір ABS Makeup Hand 10 10 0 3 10 5 10 10 0 3 5 5 5 10 5 3 10 5 10 10 0 3 5 5 5 10 5 3 10 10 10 10 5 3 10 10 10 10 5 3 10 10 10 10 5 J 10 10 Тоl 5 5 5 5 5 10 10 10 BS 53 43 48 40 58 68 68 68 SS 55 40 55 40 60 60 65 65 CMDTY, промисловий виріб; HWS, тверда біла весняна пшениця; і HRS, пізня червона весняна пшениця. LOC, місце розташування. Vol cc, обсяг спеченого формового хліба (кубічні сантиметри). Vol, визначений обсяг - відношення специфічного обсягу до вагового обсягу. Зерно, формовий хліб, приготовлений за допомогою однорідно здрібненого зерна. Текстура, формовий хліб, оцінений по текстурі. Колір, колір борошна визначений при вимірі білизни зразка борошна з еталоном насиченості кольору Minolta і в порівнянні з масштабом. ABS, абсорбція. Таблиця 13 Коментарі до якості випеченого тесту Варіант Приклад CMDTY Коментарі LOC К42 HWS Yuma Kirchauff HWS Yuma К42 HWS Dinuba Kirchauff HWS Dinuba BW 238-03 HRS Yuma BW 238 HRS Yuma BW 238-03 HRS Dinuba BW 238 HRS Dinuba Підвищений протеїн, TW, TKW, і випічка (при низькосортній випічці); слабко жовтий колір для в.в. Випічка низької якості, слабко низький TKW, знижений протеїн; слабко жовтий колір для в.в. Підвищений протеїн, TW, TKW, і випічка (так само при низькосортній випічці); злегка поліпшений колір Випічка низької якості, низький TKW; слабко жовтий колір і дуже хитливі характеристики тесту Дуже високий протеїн, слабко низький TKW, висока абсорбція води, незначна випічка Високий протеїн, слабко низький TKW, висока абсорбція води, гарна випічка і підвищена текстура Високий протеїн, TKW, тривала стабільність і висока абсорбція води, гарна випічка і міцність тесту Високий протеїн, низький TKW, тривала стабільність, гарна випічка і міцність тесту; за аналогією з 4А CMDTY, промисловий виріб; HWS, тверда біла весняна пшениця; і HRS, пізня червона весняна пшениця. LOC, місце розташування. 5 Усі публікації і заявки на патент, згадані в даному описі, є орієнтованими на фахівця, що має кваліфікаційний рівень у даній галузі техніки, до якої належить цей винахід. Усі публікації і заявки на патент у даному описі, є включеними в тім же самому ступені, так, начебто б кожна окрема публікація або заявка на патент були виразно й індивідуально процитовані, для того, щоб бути включеними як посилання. 27 UA 98768 C2 Хоча даний винахід був описаний у деяких деталях за допомогою ілюстрації і приклада з метою ясності розуміння, буде очевидним, що визначені зміни і модифікації можуть бути здійснені в рамках прикладеної формули винаходу. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 1. Спосіб одержання рослини пшениці Triticum aestivum з високим вмістом білка, що включає стадії, на яких: (a) вводять в геном рослини пшениці принаймні одну копію гена пшениці AHASL1A S653N в його нативний локус AHASL1A, причому ген кодує білок AHASL1A, що містить аспарагін замість серину в положенні, що відповідає положенню амінокислоти 653 в Arabidopsis thaliana AHAS; (b) вирощують рослину пшениці або нащадок рослини, що включає ген AHASL1A S653N, для одержання зерна; (c) визначають вміст білка в зерні, продукованому рослиною пшениці або нащадком рослини; і (d) вибирають рослину пшениці або нащадок рослини, що продукує зерно, що має підвищений рівень білка, у порівнянні з зерном, продукованим рослиною пшениці, що не має зазначеного гена пшениці AHASL1A S653N. 2. Спосіб за п. 1, у якому зазначений ген пшениці AHASL1A S653N є Triticum aestivum або Triticum monococcum геном AHASL1A S653N. 3. Спосіб за п. 1, що додатково включає стадію відбору рослини пшениці або нащадка рослини між стадіями (а) і (b), в якому зазначена рослина пшениці або нащадок рослини включає зазначений ген пшениці AHASL1A S653N. 4. Спосіб за п. 3, у якому зазначена стадія відбору включає нанесення AHAS-інгібуючого гербіциду. 5. Спосіб за п. 1, у якому зазначений ген пшениці AHASL1A S653N вводять в зазначену рослину пшениці шляхом перехресного запилення. 6. Спосіб за п. 5, у якому зазначене перехресне запилення включає схрещування першої батьківської рослини пшениці з другою батьківською рослиною пшениці, для одержання принаймні одного потомства F1, причому зазначена перша батьківська рослина пшениці включає принаймні одну копію зазначеного гена AHASL1A S653N, і причому зазначена рослина пшениці з високим вмістом білка походить від зазначеної першої і зазначеної другої батьківських рослин пшениці. 7. Спосіб за п. 6, у якому зазначену першу батьківську рослину пшениці вибирають з групи, що складається з: (a) рослини пшениці будь-якої з ліній Teall5A, Einkorn EM2 i Krichauff-42, причому репрезентативний зразок насіння кожної лінії є відповідно депонованим в Американській Колекції Типів Культур (ATCC) під депозитарним номером РТА-3955, РТА-4113, РТА-4257, відповідно; (b) мутанта, рекомбінанта, або одержаної за допомогою генетичної інженерії рослини пшениці будь-якої з ліній Teall5A, Einkorn EM2 i Krichauff-42; (c) будь-якого нащадка рослини будь-якої з ліній Teall5A, Einkorn EM2 i Krichauff-42; і (d) рослини пшениці, що є нащадком будь-якої або більшої кількості цих рослин. 8. Спосіб за п. 6, у якому зазначена перша батьківська рослина пшениці є донором пилку, а зазначена друга батьківська рослина пшениці є реципієнтом для зазначеного схрещування, і зазначені нащадки F1 одержують на зазначеній другій батьківській рослині пшениці. 9. Спосіб за п. 6, у якому зазначена друга батьківська рослина пшениці є донором пилка, а зазначена перша батьківська рослина пшениці є реципієнтом для зазначеного схрещування, і зазначене потомство F1 одержують на зазначеній першій батьківській рослині пшениці. 10. Спосіб за п. 6, у якому зазначену рослину пшениці з високим вмістом білка вибирають шляхом нанесення ефективної кількості AHAS-інгібуючого гербіциду на потомство F1 для того, щоб вибрати принаймні одну рослину з підвищеною стійкістю до AHAS-інгібуючого гербіциду. 11. Спосіб за п. 6, у якому зазначена перша батьківська рослина пшениці є гетерозиготною або гомозиготною для зазначеного гена AHASL1A S653N. 12. Спосіб за п. 6, у якому потомство F1, одержане зазначеним схрещуванням, вирощують і дозволяють самоопилитися для того, щоб одержати потомство F2. 13. Спосіб за п. 12, у якому зазначену рослину пшениці з високим вмістом білка вибирають з зазначеного потомства F2 шляхом нанесення ефективної кількості AHAS-інгібуючого гербіциду напотомство F2 для того, щоб вибрати принаймні одну рослину пшениці з підвищеною стійкістю до AHAS-інгібуючого гербіциду. 28