Лікування аутоімунних захворювань у пацієнта з неадекватною відповіддю на інгібітор tnf-альфа

Реферат: Винахід стосується застосування ритуксимабу для приготування лікарського засобу для лікування ревматоїдного артриту у пацієнта-людини з неадекватною відповіддю на інгібітор TNF-альфа для одержання сприятливої клінічної відповіді. UA 99933 C2 (12) UA 99933 C2 UA 99933 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід стосується терапії антагоністами, які зв'язуються з поверхневими маркерами В-клітин. Зокрема, даний винахід стосується використання такого роду антагоністів для лікування аутоімунних захворювань у ссавців, які виявляють неадекватну відповідь на інгібітор TNF-альфа. Передумови створення винаходу Лімфоцити - це один з багатьох типів білих клітин крові, які утворюються в кістковому мозку в процесі гемопоезу. Існують дві основні популяції лімфоцитів: В-лімфоцити (В-клітини) і Тлімфоцити (Т-клітини). Найбільший інтерес представляють В-клітини. В-клітини дозрівають у кістковому мозку й залишають його, експресуючи на своїй поверхні антигензв'язувальне антитіло. Коли нативна В-клітина вперше зустрічається з антигеном, по відношенню до якого експресоване на її поверхні антитіло є специфічним, вона починає швидко ділитися і її потомство диференціюється в В-клітини пам'яті й ефекторні клітини, який називаються "плазматичними клітинами". В-клітини пам'яті мають більший час житія й продовжують експресувати зв'язане з мембраною антитіло тієї ж специфічності, що й батьківські клітини. Плазматичні клітини не продукують зв'язане з мембраною антитіло, але замість цього синтезують антитіло в секрегованій формі. Секреторні антитіла є основними ефекторними молекулами гуморального імунітету. СD 20-антиген (який також називається рестриктивним диференціювальним антигеном Влімфоцитів людини, Вр35) являє собою гідрофобний трансмембранний білок з молекулярною масою приблизно 35 kD, який експресується перед-В і зрілими В-лімфоцитами (Valentine et al, J. Biol. С hem. 264(19):11282-11287(1989); і Einfeld et al, EMBO J. 7(3):711-717(1988)). Вказаний антиген також експресується більше, ніж 90 % В-клітин неходжкінських лімфом (NHL) (Anderson et al, Blood 63(6):1424-1433 (1984)), але не виявляється на поверхні гемопоетичних стовбурних клітин, про-В-клітин, нормальних плазматичних клітин або інших клітин здорових тканин (Tedder et al, J. Immunol. 135(2):973-979(1985)). CD20 регулює ранній(ранні) етап(и) процесу активації ініціації клітинного циклу й диференціювання (Tedder et al, supra) і, можливо, функціонує як кальцієвий іонний канал (Tedder et al J,. Cell. Biochem. 14D: 195(1990)). Встановлена експресія CD20 В-клітинами лімфом дозволяє розглядати цей антиген як потенційну "мішень" для впливу на відповідні лімфоми. У принципі, це можна представити в такий спосіб: пацієнтові вводять антитіла, специфічні по відношенню до поверхневого антигену В-клітин CD 20. Ці анти-СD20-антитіла специфічно зв'язуються з CD 20 антигеном, швидше за все, як нормальних, так і злоякісних В-клітин; антитіло, яке зв'язалося з поверхневим CD 20 антигеном, може забезпечувати руйнування й зменшення числа неопластичних В-клітин. Крім того, хімічні агенти або радіоактивні мітки, які мають здатність руйнувати пухлину, можуть бути кон'юговані з анти-СD20-антитілом таким чином, що агент цілеспрямовано "доставляється" безпосередньо до неопластичних В-клітин. Незалежно від підходу, основною метою є руйнування пухлини; специфічний підхід може полягати в застосуванні певного антиСD20 антитіла, і, отже, можливі підходи для впливу на CD20 антиген можуть значно відрізнятися. CD 19 являє собою інший поверхневий антиген, який експресується В-клітинами. Як й CD 20, CD 19 виявляється на поверхні В-клітин на всіх етапах їх диференціювання, починаючи від стовбурної клітини й закінчуючи клітиною, яка безпосередньо передує кінцевій стадії диференціювання в плазматичні клітини (Nadler, L., Типування лімфоцитів II, 2:3-37 і Додаток; Renling et al,. eds. (1986), Springer Verlag). На відміну від CD20, антитіло, яке зв'язується з CD 19, викликає інтерналізацію CD 19 антигену. CD 19 антиген серед інших розпізнається антитілом HD237-CD19 (яке також називається "В4" антитілом) (Kiesel et al., Дослідження лейкозу II, 12:1119 (1987)). Антиген CD 19 виявляється в 4-8 % мононуклеарних клітин периферичної крові й більше ніж в 90 % В-клітин, виділених з периферичної крові, селезінки, лімфатичного вузла або мигдалини. CD 19 не визначається в Т-клітинах периферичної крові, моноцитів або гранулоцитів. Практично всі Т-клітинні гострі лімфобластні лейкози (ALL), Bклітинні хронічні лімфоцитарні лейкози (CLL) і В-клітинні лімфоми експресують CD 19, який розпізнається В4 антитілом (Nadler et al., J. Immunol. 131:244 (1983), а також Nadler et al. у роботі "Прогресу гематології" Vol. XII pp. 187-206. Brown, E. ed. (1981), Grune & Stratton, Inc.). Крім того, виділені додаткові антитіла, які розпізнають антигени, специфічні для кожного етапу диференціювання В-клітинної лінії. Серед них можна вказати на антитіло В2 до антигену CD 21; антитіло В3 до антигену CD22 й антитіло J5 до антигену CD 10 (яке також називається CALLA). Див. патент US No. 5 595 721 від 21 січня 1997 p. (Kaminski et al). Ритуксимаб (RITUXAN®) являє собою генно-інженерне химерне моноклональне антитіло типу "людина/миша", направлене проти антигену CD20. У патенті US No. 5,736,137 від 7 квітня 1998 p. (Anderson et al.) ритуксимаб фігурує під назвою "С2В8". RITUXAN® призначений для 1 UA 99933 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 лікування пацієнтів з рецидивуючою або резистентною низькодиференційованою або фолікулярною CD20 позитивною В-клітинною неходжкінською лімфомою. Дослідження механізму дії in vitro показали, що RITUXAN® зв'язується із системою комплементу людини й руйнує лімфоїдні В-клітинні лінії за допомогою комплемент-опосередкованої цитотоксичності (CDC, від англ. Complement-Dependent Cytotoxicity) (Reff et al, Blood 83(2):435-445(1994)). Крім того, він має значну активність у дослідженнях антитіло залежної клітинно-опосередкованої цитотоксичності (ADCC, від англ. Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity). Недавно в експериментах з включення клітинами міченого тритієм тимідину було показано, що RITUXAN® має анти-проліферативний ефект і здатний безпосередньо викликати апоптоз клітин, у той час як інші анти-CD 19 й анти-СD20 антитіла цих властивостей не мають (Maloney et al, Blood 88(10):637a (1996)). Також експериментально був встановлений синергізм у дії RITUXAN®, препаратів для хіміотерапії й токсинів. Зокрема, RITUXAN® сенсибілізує лікарсько-стійкі Вклітинні лінії лімфом до цитотоксичного ефекту доксорубіцину, CDDP, VP-16, дифтерійного токсину й рицину (Demidem et al, Хіміотерапія й радіофармацевтика ракових захворювань 12(3):177-186(1997)). Передклінічні дослідження in vivo показали, що RITUXAN® сприяє зникненню В-клітин з периферичної крові, лімфатичних вузлів і кісткового мозку в мавп циномолгус, очевидно, за допомогою опосередкованих комплементом й антитілами процесів (Reff e/a/., Blood 83(2):435-445 (1994)). Патенти й заявки на патенти, які стосуються антитіл до CD20, включають патенти US 5 776 456, 5 736 137, 6 399 061 й 5 843 439, а також заявки на патент US US2002/0197255 Al й US2003/0021781 Al (Anderson et al.); патент US No. 6 455 043B1 і заявку WO00/09160 (GrilloLopez.A.); заявку WO00/27428 (Grillo-Lopez and White); заявку WO00/27433 (Grillo-Lopez and Leonard); заявку WO00/44788 (Braslawsky et al.); заявку WO01/10462 (Rastetter, W.); заявку WO01/10461 (Rastetter and White); заявку WO01/10460 (White and Grillo-Lopez); заявку на патент US US2002/0006404 Al і заявку WO02/04021 (Hanna and Hariharan); заявку на патент US US2002/0012665 Al і заявку WO01/74388 (Hanna, N.); заявку на патент US US2002/0009444 А1 і заявку WO01/80884 (Grillo-Lopez, А.); заявку WO01/97858 (White, C); заявку на патент US US2002/0128488 Al і заявку WO02/34790 (Reff, M.); заявку WO02/060955 (Braslawsky et al.); заявку WO02/096948 (Braslawsky et al.); заявку WO02/079255 (Reff and Davies); патент US No. 6 171 586 Bl і заявку WO98/56418 (Lam et al.); заявку WO98/58964 (Raju, S.); заявку WO99/22764 (Raju, S.); заявку WO99/51642 і патенти US No. 6 194 551 Bl, 6 242 195 Bl, 6 528 624 Bl, 6 538 124 Bl (Idusogie et al.); заявку WO00/42072 (Presta, L.); заявку WO00/67796 (Curd et al.); заявку WO01/03734 (Grillo-Lopez et al.); заявку на патент US US2002/0004587 Al і заявку WO01/77342 (Miller and Presta); заявку на патент US US2002/0197256 Al (Grewal, І.); патенти US No. 6 090 365 В1, 6 287 537 Bl, 6 015 542 В1, 5 843 398 Bl й 5 595 721 Bl (Kaminski et al.); патенти US No. 5 500 362 В1, 5 677 180 В1, 5 721 108 Bl й 6 120 767 Bl (Robinson et al.); патент US No. 6 410 391 Bl (Raubitschek et al.); патент US No. 6 244 866 В1 і заявку WO00/20864 (Barbera-Guillem, E.); заявку WOO 1/13945 (Barbera- Guillem, E.); заявку WO00/67795 (Goldenberg); WO00/74718 (Goldenberg й Hansen); заявку WO00/76542 (Golay et al.); заявку WO01/72333 (Wolin й Rosenblatt); патент US No. 6 368 596 Bl (Ghetie et al.); заявку на патент US No. US2002/0041847 Al (Goldenberg, D.); заявку на патент US No. US2003/0026801 Al (Weiner й Hartmann); заявку WO02/102312 (Engleman, E.), які наведені тут як посилання. Див. також патент US No. 5 849 898 і заявку ЕР No. 330 191 (Seed et al.); патент US No. 4 861 579 і заявку ЕР 332 865 А2 (Meyer й Weiss) і заявку WO95/03770 (Bhat et al.). До опублікованих джерел інформації, у яких розкрита терапія при використанні ритуксимабу, належать наступні: Perotta й Abuel "Відповідь у хворих із хронічно рецидивуючою ідіопатичною тромбоцитопенічною пурпурою на ритуксимаб протягом 10 років його застосування" Реферат # 3360, Blood 10(1) (частина 1-2):стор. 88У; Stashi et al,. "Лікування дорослих хворих із хронічною ідіопатичною тромбоцитопенічною пурпурою при використанні химерного моноклонального антитіла до CD20 (ритуксимабу)" Blood 98(4):952-957 (2001); Matthews, R., " Медичні єретики" New Scientist (7 Квітня; 2001); Leandro et al,. "Клінічний результат терапії з виснаженням Влімфоцитів в 22 хворих на ревматоїдний артрит" Ann Rheum Dis 61:833-888 (2002); Leandro et al., "Виснаження лімфоцитів при ревматоїдному артриті: безпека, ефективність і дозова відповідь" Arthritis and Rheumatism 44(9):S370 (2001); Leandro et al., " Відкрите дослідження виснаження В-лімфоцитів при системному червоному вовчаку" Arthritis and Rheumatism 46(l):2673-2677 (2002); Edwards and Cambridge, "Тривале поліпшення при ревматоїдному артриті при використанні методики виснаження В-лімфоцитів" Rhematology 40:2050211 (2001); Edwards et al., "Терапія, заснована на виснаженні В-лімфоцитів, при ревматоїдному артриті та інших аутоімунних захворюваннях" Biochem. Soc. Trans. 30(4):824-828 (2002); Edwards et al, "Ефективність і безпека ритуксимабу, химерного моноклонального антитіла, направленого до В 2 UA 99933 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 клітин: рандомізовані, контрольовані за допомогою плацебо дослідження хворих на ревматоїдний артрит" Arthritis and Rheumatism 46(9):S197 (2002); Levine й Pestronk, "Зв'язані з IgM-антитілами полінейропатії: хіміотерапія, заснована на виснаженні В-клітин, при використанні ритуксимабу" Neurology 52:1701-1704 (1999); DeVita et al, "Ефективність вибірної блокади В-клітин при терапії ревматоїдного артриту" Arthritis and Rheumatism 46:2029-2033 (2002); Hidashida et al," Лікування DMARD-рефрактерного ревматоїдного артриту ритуксимабом" Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology; Жовтень 24-29; Новий Орлеан, LA 2002; Tuscano, J., "Успішне лікування інфліксімаб-рефрактерного ревматоїдного артриту ритуксимабом" Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology; Жовтень 24-29; Новий Орлеан, LA 2002. Ревматоїдний артрит (РА) являє собою аутоімунне захворювання невідомої етіології. У більшості пацієнтів, які страждають від хронічного РА, навіть при належній терапії, можуть відбуватися прогресивне руйнування суглобів, їх деформація, порушення багатьох функцій і навіть передчасна смерть. Більше дев'яти мільйонів хворих на ревматоїдний артрит відвідують лікарів і більше 250 000 пацієнтів щорічно піддаються госпіталізації. Завдання терапії РА полягають у запобіганні або контролюванні пошкоджень суглобів, запобіганні втрати їх функції й зменшенні болю. Первинна терапія РА звичайно включає застосування одного або декількох наступних лікарських засобів: не стероїдних протизапальних препаратів (NSAIDs), глюкокортикоїдів (внутрішньосуглобові ін'єкції) і преднізолону в низьких дозах. Див. "Посібник з лікування ревматоїдного артриту" Arthritis and Rheumatism 46(2):328-346 (Лютий 2002). До більшої частини пацієнтів із заново діагностованим РА застосовується антиревматична лікарська (DMARD) терапія, яка модифікує захворювання, протягом трьох місяців з моменту постановки діагнозу. Під час DMARD-терапії РА звичайно використовують гідроксихлороквін, сульфазалазин, метотрексат, лефлуномід, етанерсепт, інфліксимаб (разом з метотрексатом, який вводять перорально й підшкірно), азатіоприн, D-пеніциламін, Gold (перорально), Gold (внутрішньом'язово), міноциклін, циклоспорин, імуноадсорбований білок А стафілококів. Оскільки при захворюванні РА в організмі хворого синтезується фактор некрозу пухлин альфа (TNFa), інгібітори TNFa використовуються для лікування вказаного захворювання. Етанерсепт (ENBREL®) являє собою ін'єкційний лікарський препарат, який дозволений в US для лікування активної форми РА. Етанерсепт зв'язується з TNFa і видаляє його більшу частину із суглобів і крові, тим самим, запобігаючи розвитку запалення й інших симптомів РА, обумовлене TNFa. Етанерсепт є імуноадгезивним білком злиття, який складається з позаклітинної ділянки рецептора фактора некрозу пухлин людини (TNFR) мол. маси 75 Ш (р75), яка зв'язує ліганд, з'єднаної з Fc-ділянкою IgGl людини. Цей лікарський препарат має ряд побічних ефектів, у тому числі може викликати серйозні інфекції й сепсис, розлади нервової системи, такі, як розсіяний склероз (МС). Див., наприклад, www.remicadeinfliximab.com/pages/enbrel embrel.html Інфліксимаб, який надходить у продаж під торговельним найменуванням REMICADE®, являє собою імуносупресорний лікарський препарат, призначений для лікування РА й хвороби Крона. Інфліксимаб являє собою химерне моноклональне антитіло, яке цілеспрямовано зв'язується з TNFa в організмі хворого й зменшує зумовлене TNFa запалення. Показано взаємозв'язок інфліксимабу з летальними процесами, наприклад, серцевою недостатністю й інфекційними захворюваннями, у тому числі туберкульозом, а також демієлінізацією, яка приводить до МС. У грудні 2002 р. компанія Abbott Laboratories одержала дозвіл FDA на випуск препарату адалімумаб (HUMIRA™), до цього відомого під назвою D2E7. Адалімумаб являє собою моноклональне антитіло людини, яке зв'язується з TNFa, для якого було показано, що воно здатне знижувати прояви й симптоми, а також сповільнювати прогресивний розвиток структурних змін у дорослих людей, хворих на РА від середньої до важкої форми, які виявляють недостатню відповідь на традиційну терапію DMARD. Суть винаходу Даний винахід, у першу чергу, стосується способу лікування аутоімунних захворювань у ссавця з неадекватною відповіддю на інгібітор TNF  , який полягає у введенні такому ссавцеві терапевтично ефективної кількості антагоніста, який зв'язується з поверхневим маркером Вклітин. Наприклад, даний винахід стосується способу лікування ревматоїдного артриту в ссавця з неадекватною відповіддю на інгібітор TNFa, який полягає у введенні такому ссавцеві ефективної терапевтичної кількості антитіла, яке зв'язується з CD20. Крім того, даний винахід стосується способу зниження ризику розвитку негативних побічних ефектів, включаючи інфекції, серцеву недостатність і демієлінізацію, який полягає у введенні 3 UA 99933 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ссавцеві з аутоімунним захворюванням терапевтично ефективної кількості антагоніста, який зв'язується з поверхневим маркером В-клітин. Докладний опис винаходу І. Визначення Термін "фактор некрозу пухлин альфа (TNF  )", який використовується у даному описі, стосується молекули TNFa людини, яка має амінокислотну послідовність, описану Реnnіса et al, Nature 312:721(1984) або Aggarwal et al, JBC 260:2345(1985). Термін "інгібітор TNF  ", який використовується у даному описі, стосується агента, який до деякої міри інгібує біологічну функцію TNF  , головним чином, шляхом зв'язування з TNF  і нейтралізації його активності. Прикладами інгібіторів TNF  , які спеціальним чином розглядаються тут, є етанерсепт (ENBREL®), інфліксимаб (REMICADE®) і адалімумаб (HUMIRA™). Термін "неадекватна відповідь на інгібітор TNF  " означає неадекватну відповідь на попереднє або поточне лікування інгібітором TNF  , зв'язане з токсичністю лікарських препаратів та/або з недостатньою ефективністю лікування. Неадекватна відповідь може бути визначена лікарем, який має певний досвід у даній галузі. Ссавцями, у яких під час попереднього або поточного лікування інгібітор TNF  проявляв або проявляє "токсичність", є такі ссавці, у яких спостерігалися або спостерігаються один або декілька небажаних побічних ефектів, таких, як інфекції (головним чином, важкі інфекції), застійна серцева недостатність, демієлінізація (яка приводить до розвитку МС), гіперчутливість, неврологічна симптоматика, аутоімунізація, неходжкінська лімфома, туберкульоз (ТВ), утворення аутоантитіл, і т.д. У ссавців з "неадекватною ефективністю" зберігалися прояви активної форми захворювання під час попереднього або поточного лікування інгібітором TNF  . Наприклад, у пацієнта може зберігатися активний процес після одного або трьох місяців лікування інгібітором TNF  . Під терміном "зниження ризику розвитку негативних побічних ефектів" мається на увазі зниження ризику розвитку побічних ефектів, які виникають у результаті лікування антагоністом, який зв'язується з поверхневим маркером В-клітин, до рівня нижче того, який спостерігається при лікуванні інгібітором TNFa. Такі побічні ефекти включають інфекції (головним чином, важкі інфекції), серцеву недостатність і демієлінізацію (розсіяний склероз) і т.д. Термін "поверхневий маркер В-клітин", який використовується у даному описі, стосується антигену, який експресується на поверхні В-клітин, що є "мішенню" для дії антагоніста, який з ним зв'язується. Прикладами поверхневих маркерів В-клітин можуть служити CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD40, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, Cd79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85 й CD86 лейкоцитарні поверхневі маркери. Поверхневим маркером В-клітин, які представляють особливий інтерес, є такий маркер, який експресується переважно В-клітинами в порівнянні з іншими не-Вклітинними тканинами ссавців, причому як попередниками В-клітин, так і зрілими В-клітинами. Відповідно до одного варіанта здійснення даного винаходу, маркером є CD 20 або CD 19, який виявляється на поверхні В-клітин на всіх етапах їх диференціювання, починаючи зі стовбурної клітини аж до клітини, яке безпосередньо передує кінцевій стадії диференціювання в плазматичні клітини. Переважним поверхневим маркером В-клітин є CD20. Антиген "CD 20" - це неглікозилований фосфопротеїн з молекулярною вагою ~ 35 kDa, який виявляється на поверхні більше, ніж 90 % В-клітин периферичної крові або лімфоїдних органів. CD 20 експресується ранніми попередниками В-клітин і зберігається аж до кінцевої стадії диференціювання в плазматичні клітини. CD 20 виявляється на поверхні як нормальних, так і злоякісних В-клітин. Іншими назвами CD 20, які зустрічаються в літературі, є "В-лімфоцитарний рестриктивний антиген" й "Вр35". Антиген CD 20 описаний, наприклад, Clark et al, PNAS (USA) 82:1766 (1985). Термін "аутоімунне захворювання", який використовується у даному описі, стосується захворювання або патологічного стану, що виникає у власних тканинах організму, і спрямованому проти них. Прикладами аутоімунних захворювань або патологічних станів є (без обмежень вказаними) артрит (ревматоїдний артрит, хвороба Стілла, остеоартрит, псоріатичний артрит), псоріаз, дерматит, поліміозит/дерматоміозит, токсичний епідермальний некроліз, системна склеродермія й системний склероз, імунні відповіді, зв'язані із запальними захворюваннями кишечнику, хвороба Крона, виразковий коліт, респіраторний дистрес-синдром, респіраторний дистрес-синдром дорослих (ARDS, від англ. Adult Respiratory Distress Syndrome), менінгіт, енцефаліт, увеїт, коліт, гломерулонефрит, алергічні стани, екзема, астма, стани, які супроводжуються Т-клітинною інфільтрацією й хронічною запальною відповіддю, атеросклероз, аутоімунний міокардит, порушення адгезії лейкоцитів, системний червоний вовчак (SLE, від 4 UA 99933 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 англ. System Lupus Erythematosus), ювенільний діабет, розсіяний склероз, алергічний енцефаломієліт, імунні відповіді, зв'язані з реакцією гіперчутливості негайного й сповільненого типів, опосередкованої цитокінами й Т-лімфоцитами, туберкульоз, саркоїдоз, грануломатоз, включаючи грануломатоз Вегенера, агранулоцитоз, васкуліт (включаючи ANCA), апластична анемія, анемія Дайємонда-Блекфена, імунна гемолітична анемія, включаючи аутоімунну гемолітичну анемію (АІНА, від англ. Autoimmune Hemolytic Anemia), перніциозна анемія, справжня еритроцитарна аплазія (PRCA, від англ. Pure Red Cell Aplasia), недостатність фактора VIII, гемофілія А, аутоімунна нейтропенія, панцитопенія, лейкопенія, захворювання, асоційовані з діапедезом лейкоцитів, запальні захворювання центральної нервової системи (CNS, від англ. Central Nervous System), синдром множинного ураження органів, міастенія гравіс, захворювання, опосередковані комплексом антиген-антитіло, захворювання, зв'язані з утворенням антигломерулярних антитіл у базальній мембрані, антифосфоліпідний синдром, алергічний нейрит, хвороба Бехчета, синдром Кастельмана, синдром Гудпасчера, міастенічний синдром Ламберта-Ітона, Синдром Рейно, синдром Шегрена, синдром Стівенса-Джонсона, реакція відторгнення трансплантата, реакція "трансплантат проти хазяїна" (GVHD, від англ. Graft Versus Host Desease), пухирчатка бульозна, пухирчатка, аутоімунні поліендокринопатії, синдром Рейтера, синдром "дерев'яної людини", гігантоклітинний артеріїт, імунокомплексний нефрит, IgA нефропатія, IgM полінейропатії або опосередковані IgM нейропатії, ідіопатична тромбоцитопенічна пурпура (ІТР, від англ. Idiopathic Thrombocytopenic Purpura), тромботична тромбоцитопенічна пурпура (ТТР, від англ. Thrombotic Thrombocytopenic Purpura), аутоімунна тромбоцитопенія, аутоімунні захворювання яєчок й яєчників, включаючи аутоімунний орхіт й оофорит, первинний гіпотиреоїдизм, аутоімунні ендокринні захворювання, включаючи аутоімунний тиреоїдит, хронічний тиреоїдит (тиреоїдит Хашимото), підгострий тиреоїдит, ідіопатичний гіпотиреоїдизм, хвороба Адісона, хвороба Грейвса, аутоімунний полігландулярний синдром (або синдроми полігландулярної ендокринопатії), діабет І типу, який також називається інсулінзалежним цукровим діабетом (IDDM, від англ. Insulin-Dependent Diabetes Mellitus) і синдром Шихана, аутоімунний гепатит, лімфоїдний інтерстиціальний пневмоніт (HIV), облітеруючий бронхіоліт (нетрансплантаційний) на противагу NSIP, синдром Гієйна-Барре, васкуліти великих судин (включаючи ревматичну поліміалгію й гігантоклітинний артеріїт (хвороба Такаясу), васкуліти судин середнього діаметра (включаючи хворобу Кавасакі й вузликовий поліартеріїт), анкілозуючий спондиліт, хвороба Бергера (IgA нефропатія), швидко прогресуючий гломерулонефрит, первинний біліарний цироз, целіакія (глютенова ентеропатія), кріоглобулінемія, бічний аміотрофічний склероз (ALS, від англ. Amyotrophic Lateral Sclerosis), ішемічна хвороба серця й ін. Термін "антагоніст" означає молекулу, яка при зв'язуванні з поверхневим маркером В-клітин, руйнує В-клітини або знижує їх кількість в організмі ссавців та/або перешкоджає реалізації однієї або декількох функцій В-клітин, наприклад, шляхом запобігання або зниження рівня гуморальної імунної відповіді, забезпечуваної В-клітинами. Переважно, антагоніст має здатність виснажувати пул В-клітин (тобто знижувати рівень циркулюючих В-клітин) у ссавців, які одержують його як лікарський засіб. Таке зниження може бути досягнуте за допомогою здійснення декількох механізмів, таких, як антитілозалежна клітинно-опосередкована цитотоксичність (ADCC) і/або комплементопосередкована цитотоксичність (CDC), інгібування проліферації В-клітин та/або індукування загибелі В-клітин (наприклад, шляхом апоптозу). До антагоністів, які розглядаються у рамках даного винаходу, належать антитіла, синтетичні або нативні пептидні послідовності й невеликі молекули антагоністів, які зв'язуються з поверхневим маркером В-клітин, необов'язково кон'юговані або злиті із цитотоксичним агентом. Переважним антагоністом є антитіло. Терміни "антитілозалежна клітинно-опосередкована цитотоксичність" й "ADCC" означають опосередковувану клітинами реакцію, у якій неспецифічні цитотоксичні клітини, які експресують рецептори Fc (FcRs) [наприклад, натуральні кілери (NK), нейтрофіли й макрофаги], розпізнають зв'язане антитіло на клітині-мішені й потім лізують таку клітину-мішень. Основні клітини, які опосередковують ADCC, а саме натуральні кілери, експресують лише Fc  RIII, у той час як моноцити експресують Fc  RI, Fc  RII й FcRIII. Експресія FcR гемопоетичними клітинами узагальнена в Таблиці 3 на стор. 464 у роботі Ravetch й Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92(1991). Для оцінки активності молекули, яке представляє інтерес, у відношенні ADCC можна здійснити аналіз ADCC in vitro, як описано в патенті US No. 5 500 362 або 5 821 337. Підходящими ефекторними клітинами для такого аналізу є мононуклеарні клітини периферичної крові (РВМС) і натуральні кіл ери (NK). Альтернативно або додатково оцінка активності молекули, яка представляє інтерес, у відношенні ADCC може бути здійснена in vivo, наприклад, на модельній тварині, як це описано dynes et al,. PNAS (USA) 95:652656(1998). 5 UA 99933 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 "Ефекторні клітини людини" - це лейкоцити, які експресують один або більше FcRs і виконують ефекторні функції. Переважно, клітини експресують, принаймні, FcRIII і виконують ефекторну функцію у відношенні ADCC. Прикладами лейкоцитів людини, які опосередковують ADCC, є мононуклеарні клітини периферичної крові (РВМС), натуральні кілери (NK), моноцити, цитотоксичні Т-клітини й нейтрофіли; найбільш переважними є PBMCs й NK. Термін "Fc рецептор" або "FcR" використовується для опису рецептора, який зв'язується з Fc-ділянкою молекули антитіла. Переважним FcR є нативна послідовність FcR антитіла людини. Крім того, переважним FcR є такий рецептор, який зв'язується з антитілом IgG (гаммарецептор). До вказаного FcR належать рецептори Fc  RI, Fc  RII й Fc  RIII підкласів, у тому числі їх алельні варіанти й рецептори, отримані в результаті альтернативного сплайсингу. Fc  RII рецептори включають Fc  RIIA ("активуючий рецептор") і Fc  RIIB ("інгібуючий рецептор"), які мають подібні амінокислотні послідовності, які відрізняються, головним чином, тільки в цитоплазматичних доменах. Активуючий рецептор, Fc  RIIA у своєму цитоплазматичному домені містить імунорецепторну, засновану на тирозині активуючу структуру (ІТАМ). Інгібуючий рецептор Fc  RIIB у своєму цитоплазматичному домені містить імунорецепторну, засновану на тирозині інгібуючу структуру (ІТІМ). (див. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). FcRs описані Ravetch й Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92(1991); Capel et al, Immunomethods 4:25-34 (1994); і de Haas et al, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41(1995). Інші FcRs, включаючи ті, які будуть ідентифіковані в майбутньому, тут об'єднані загальним терміном "FcR". Цей термін також стосується неонатального рецептора FcRn, який відповідає за передачу материнського IgGs плоду (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) і Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)). "Комплементопосередкована цитотоксичність" або "CDC" означає здатність молекули лізувати "мішень" у присутності комплементу. Каскад реакцій активації комплементу ініціюється зв'язуванням першого компонента системи комплементу (Clq) з молекулою {наприклад, антитілом) у комплексі з розпізнаваним антигеном. Для оцінки активності комплементу можна здійснити аналіз CDC, наприклад, як описано Gazzano-Santoro et al,. J. Immunol. Methods 202:163(1996). До антагоністів, "які інгібують ріст", належать антагоністи, які запобігають або знижують проліферацію клітин, що експресують антиген, з яким зв'язуються ці антагоністи. Наприклад, антагоніст може запобігати або знижувати проліферацію В-клітин in vitro та/або in vivo. До антагоністів, "які індукують апоптоз", належать такі антагоністи, які індукують запрограмовану клітинну загибель, наприклад, загибель В-клітин, що визначається в стандартних дослідженнях апоптозу, таких, як зв'язування аннексину V, фрагментація ДНК, зморщування клітин, дилатація ендоплазматичного ретикулума, клітинна фрагментація та/або формування мембранних везикул (які також називають тільцями апоптозу). Термін "антитіло", який використовується у даному описі, має дуже широке значення, і спеціальним чином стосується інтактних моноклональних антитіл, поліклональних антитіл, мультиспецифічних антитіл (наприклад, біспецифічних антитіл), сконструйованих, принаймні, на основі двох інтактних антитіл, і фрагментів антитіл за умови, що вони мають необхідну біологічну активність. Термін "фрагменти антитіл" стосується ділянок інтактних антитіл, переважно, які містять антигензв'язувальну ділянку. Прикладами фрагментів антитіл є Fab, Fab', F(ab') 2 й Fv фрагменти; діатіла; лінійні антитіла; одноланцюгові молекули антитіл і мультиспецифічні антитіла, сконструйовані з антитільних фрагментів. Термін "нативні антитіла" звичайно використовується по відношенню до гетеротетрамерних глікопротеїнів з молекулярною масою близько 150 000 Дальтон, які складаються із двох ідентичних легких (L) ланцюгів і двох ідентичних важких ланцюгів (Н). Кожен легкий ланцюг зв'язаний з важким ланцюгом за допомогою ковалентного дисульфідного зв'язку, при цьому число дисульфідних зв'язків у важких ланцюгах змінюються залежно від ідіотипу імуноглобуліну. Кожен важкий і легкий ланцюг також має симетрично розташовані дисульфідні містки. Кожен важкий ланцюг на одному кінці має варіабельний домен (V H), за яким розташовані декілька константних доменів. Кожен легкий ланцюг має варіабельний домен (V L) на одному кінці й константний домен на іншому кінці; константний домен легкого ланцюга розташований на одній лінії з першим константним доменом важкого ланцюга, а варіабельний домен легкого ланцюга знаходиться на одній лінії з варіабельним доменом важкого ланцюга. Вважається, що контакт між варіабельними доменами легкого й важкого ланцюгів забезпечується певними амінокислотними залишками. 6 UA 99933 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Термін "варіабельний" означає те, що послідовності певних ділянок варіабельних доменів різних антитіл значно відрізняються між собою й забезпечують специфічність зв'язування кожного антитіла зі своїм певним антигеном. Однак варіабельність не розподілена випадковим чином серед варіабельних доменів антитіл. Вона сконцентрована в трьох сегментах, які називаються гіперваріабельними ділянками, розташованих у варіабельних доменах, як легких, так і важких ланцюгів. Найбільш консервативні ділянки варіабельних доменів називаються каркасними ділянками (FRs). Всі варіабельні домени нативних важких і легких ланцюгів мають чотири FRs, які забезпечують  -складчасту структуру й зв'язані трьома гіперваріабельними ділянками, які формують петлі, і, у деяких випадках, частину  -складчастої структури. Гіперваріабельні ділянки в кожному ланцюзі тісно зв'язані між собою за допомогою FRs, а також з гіперваріабельними ділянками іншого ланцюга й беруть участь у формуванні антигензв'язувальної ділянки антитіла (див. Kabat ei аі, Послідовності імунологічно важливих th білків, 5 Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Константні домени безпосередньо не беруть участь у зв'язуванні антитіла з антигеном, але виконують різні ефекторні функції, такі, як забезпечення антитіло залежної цитотоксичності (ADCC). Розщеплення антитіл папаїном приводить до утворення двох ідентичних антигензв'язувальних фрагментів, які називаються "Fab''-фрагментами, кожний з яких містить одну антигензв'язувальну ділянку, і залишкового "Fc''-фрагмента, назва якого відображає його здатність до швидкої кристалізації. Обробка пепсином приводить до одержання F(ab')2фрагмента, які має дві антигензв'язувальні ділянки й усе ще має здатність до перехресного зв'язування антигену. "Fv" являє собою мінімальний фрагмент антитіла, який включає повнорозмірні антигенрозпізнавальну й антигензв'язувальну ділянки. Ця ділянка являє собою димер одного варіабельного домену важкого ланцюга й одного варіабельного домену легкого ланцюга, які знаходяться у тісному нековалентному взаємозв'язку. Його конфігурація така, що три гіперваріабельні ділянки кожного варіабельного домену взаємодіють із утворенням антигензв'язувальної ділянки на поверхні VH-VL димеру. Всі разом шість гіперваріабельних ділянок забезпечують специфічність зв'язування антитіла з антигеном. Однак, навіть один варіабельний домен (або половина Fv, яка містить тільки три гіперваріабельні ділянки, специфічних по відношенню до антигену) має здатність розпізнавати й зв'язувати антиген, хоча й з меншою афінністю, ніж повнорозмірна зв'язувальна ділянка. Fab-фрагмент також містить константний домен легкого ланцюга й перший константний домен (СНІ) важкого ланцюга. Fab'-фрагменти відрізняються від Fab-фрагментів тим, що вони на карбоксикінцевій ділянці СНІ домену важкого ланцюга мають декілька додаткових амінокислотних залишків, включаючи один або більше залишків цистеїну із шарнірної ділянки антитіла. Fab'-SH у даному тексті позначає Fab'-фрагмент, у якому залишки цистеїну константного домену мають принаймні одну вільну тіолову групу. F (ab') 2-фрагменти антитіл спочатку були отримані як спарені Fab'-фрагменти, між якими розташовані шарнірні залишки цистеїну. Крім того, відомі інші структури, представлені з'єднаними між собою фрагментами антитіл. "Легкі ланцюги" антитіл (імуноглобулінів) будь-яких хребетних тварин можуть бути віднесені до одного із двох існуючих типів, які позначаються каппа (  ) і лямбда (  ), що засновано на амінокислотній послідовності константних доменів. Залежно від амінокислотної послідовності константних доменів важких ланцюгів антитіла можуть бути розділені на різні класи. Існує п'ять основних класів інтактних антитіл: IgA, IgD, IgE, IgG й IgM, причому деякі з них, у свою чергу, також можуть бути розділені на підкласи (ідіотипи), наприклад, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 й IgA2. Константні домени важких ланцюгів, які відповідають різним класам антитіл, позначаються , , ,  і  , відповідно. Крім того, добре вивчена структура окремих субодиниць і три можливі просторові конфігурації різних класів імуноглобулінів. "Одноланцюгові Fv" або "scFv" фрагменти антитіл включають V H й VL домени антитіл, при цьому вказані домени знаходяться в одному поліпептидному ланцюзі. Переважно, Fv поліпептиди також мають поліпептидний лінкер між VH й VL доменами, який забезпечує формування необхідної для зв'язування антигену конфігурації scFv. Для більш докладного ознайомлення див. Pllickthun, Фармакологія моноклональних антитіл vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994). Термін "діатіла" стосується невеликих фрагментів антитіл із двома антигензв'язувальними ділянками, які включають варіабельний домен важкого ланцюга (V H), зв'язаний з варіабельним доменом легкого ланцюга (VL) у тому ж поліпептидному ланцюзі (VH - VL). Оскільки лінкер є 7 UA 99933 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 занадто коротким для того, щоб забезпечити утворення пари між двома доменами в одному ланцюзі, домени об'єднуються в пару за допомогою комплементарних доменів іншого ланцюга й утворюють дві антигензв'язувальні ділянки. Діатіла докладно описані, наприклад, у європейському патенті ЕР 404 097; міжнародній заявці WO 93/11161 й Hollinger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993). Термін "моноклональне антитіло", який використовується у даному описі, стосується антитіла, виділеного з популяції практично повністю гомогенних антитіл, тобто індивідуальні антитіла, які утворюють популяцію, є ідентичними, за винятком того, що вони можуть мати невелике число природних мутацій. Моноклональні антитіла є високоспецифічними й направленими проти одного антигенного сайту. Крім того, на відміну від звичайних (поліклональних) препаратів антитіл, які звичайно включають різні антитіла, направлені проти різних детермінант (епітопів), кожне моноклональне антитіло направлене проти однієї антигенної детермінанти. Крім своєї високої специфічності, моноклональні антитіла мають ту перевагу, що вони синтезуються гібридомною культурою, "незабрудненою" іншими антитілами. Прикметник "моноклональний" означає, що антитіло отримане з повністю гомогенної популяції антитіл і не може бути отримане способом, який застосовується для одержання звичайних антитіл. Наприклад, моноклональні антитіла, які використовують відповідно до даного винаходу, можуть бути отримані за допомогою гібридомного методу, вперше описаного Kohler et al, Nature, 256:495 (1975), або можуть бути отримані за допомогою методу рекомбінантних ДНК (див, наприклад патент US No. 4 816 567). "Моноклональні антитіла" можуть бути також виділені з фагових антитільних бібліотек з використанням методик, описаних, наприклад, Clackson et al, Nature, 352:624-628 (1991) і Marks et al, J. Моl. Віоl, 222:581-597 (1991). Моноклональні антитіла, заявлені відповідно до даного винаходу, включають "химерні" антитіла (імуноглобуліни), у яких частина важкого та/або легкого ланцюга ідентична або гомологічна до відповідної послідовності антитіл, отриманих від певного виду тваринних або які належать до певного класу або підкласу, у той час як, ділянки ланцюга (ланцюгів), що залишилися, ідентичні або гомологічні до відповідної послідовності антитіл, отриманих від інших видів тваринних або які належать до іншого класу або підкласу, так само, як і фрагменти таких антитіл, якщо вони мають відповідну біологічну активність (патент US No. 4 816 567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Химерні антитіла, яке представляють інтерес відповідно до даного винаходу, включають "приматизовані" антитіла, яке мають антигензв'язувальні послідовності варіабельних доменів, які походять з антитіл приматів, які не є людиною (наприклад, мавп "старого світу", таких, як бабуїн, макака резус або мавпа циномолгус), і константні ділянки антитіл людини (патент US No. 5 693 780). "Гуманізовані" форми антитіл різних видів тварин, за винятком людини (наприклад, антитіл миші), являють собою химерні антитіла, які включають мінімальну послідовність, яка походить з імуноглобулінів різних видів тварин, за винятком людини. В більшості, гуманізовані антитіла являють собою імуноглобуліни людини (антитіла реципієнта), у яких амінокислотні залишки гіперваріабельної ділянки заміщені залишками гіперваріабельної ділянки антитіл інших видів тварин, за винятком людини (антитіла донора), наприклад, миші, щура, кролика або примата, які мають бажану специфічність, афінність й властивості. У деяких випадках, амінокислотні залишки каркасної ділянки (FR) людського імуноглобуліну заміщені відповідними амінокислотними залишками антитіл інших видів тварин, за винятком людини. Крім того, гуманізовані антитіла можуть включати залишки, які не виявляються в антитілах реципієнта або в антитілах донора. Ці модифікації здійснюються для додаткового поліпшення функції антитіл. У цілому, гуманізоване антитіло буде включати, принаймні, один, а, як правило, два варіабельні домени, у яких всі, або практично всі, гіперваріабельні петлі відповідають таким імуноглобуліну інших видів, за винятком людини, і всі, або практично всі, FRs відповідають послідовностям імуноглобуліну людини. Гуманізоване антитіло може також включати, принаймні, частину константної ділянки імуноглобуліну (Fc), звичайно імуноглобуліну людини. Для більш точної інформації див. Jones et al, Nature 321:522-525 (1986): Riechmann et al, Nature 332:323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Термін "гіперваріабельна ділянка", який використовується у даному описі, антигену. Гіперваріабельні ділянки містять амінокислотні залишки з "ділянки, яка визначає комплементарність" або "CDR" [наприклад, залишки 24-34(L1), 50-56(L2) і 89-97 (L3) у варіабельному домені легкого ланцюга й 31-35 (НІ), 50-65 (Н2) і 95-102 (Н3) у варіабельному th домені важкого ланцюга; Kabat et al., Послідовності імунологічно важливих білків, 5 Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] та/або залишки з "гіперваріабельної петлі" (наприклад, залишки 26-32 (L1), 50-52 (L2) і 91-96 (L3) у варіабельному домені легкого ланцюга й залишки 26-32 (Н1), 53-55 (Н2) і 96-101 (Н3) у варіабельному домені 8 UA 99933 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 важкого ланцюга; Chothia and Lesk, J. Мої. Biol. 196:901-917(1987)). "Каркасні" або "FR" залишки - це такі залишки варіабельного домену, які відрізняються від амінокислотних залишків гіперваріабельної ділянки, як визначено в тексті. Антагоніст, "який зв'язується" з антигеном, який представляє інтерес, наприклад, з поверхневим В-клітин, являє собою такий антагоніст, який здатний зв'язувати антиген з достатньою афінністю та/або авідністю таким чином, що його можна використати як лікарський засіб, направлений проти клітин-мішеней, які експресують антиген. Прикладами антитіл, які зв'язуються з антигеном CD20, є: "С2В8", яке у цей час відомо під назвою "ритуксимаб" ("RITUXAN®") (див. патент US No. 5 736 137, наведений тут як посилання); мічене ітрієм-[90] антитіло 2В8 миші, яке позначається як "Y2B8" (див. патент US No. 5 736 137, І31 наведений тут також як посилання); IgG2a "B1" миші, при необхідності мічене І з одержанням 131 антитіла " І-В1" (BEXXAR™) (див. патент US No. 5 595 721, наведений тут як посилання); моноклональне антитіло миші "1F5" (Press et al,. Blood 69(2):584-591 (1987)); "химерне антитіло 2Н7" (див. патент US No. 5 677 180, наведений тут як посилання); "гуманізоване антитіло 2Н7 vl6" (див. нижче); huMax-CD20 (Genmab, Denmark); AME-133 (Applied Molecular Evolution), а також моноклональні антитіла L27, G28-2, 93-1B3, B-Cl або NU-B2, доступні в міжнародній лабораторії з типування лейкоцитів (Valentine et al., у книзі: Типування лейкоцитів III (McMichael, Ed., p.440, Oxford University Press (1987)). Прикладами антитіл, які зв'язуються з антигеном CD 19, є анти-CD 19 антитіла, описані Hekman et al, Cancer Immunol. Immunother. 32:364-372 (1991) і Vlasveld et al, Cancer Immunol. Immunother. 40:37-47 (1995), і антитіло В4, описане Kiesel et al,. Leukemia Research II, 12:1119 (1987). Терміни "ритуксимаб" або "RITUXAN®", які використовують в даному описі, стосуються отриманого за допомогою генної інженерії химерного моноклонального антитіла типу "миша/людина", направленого проти антигену CD20 і яке позначається як "С2В8" у патенті US No. 5 736 137, наведеному тут як посилання. Це антитіло належать до ізотипу IgGj з легкими каппа-ланцюгами й містить варіабельні послідовності легких і важких ланцюгів антитіла миші й константні послідовності антитіла людини. Афінність зв'язування ритуксимабу з антигеном CD20 становить приблизно 8.0 нМ. Виключно для цілей даного винаходу нижче наводяться варіабельні послідовності легких і важких ланцюгів "гуманізованого антитіла 2Н7 vl6". Варіабельний домен легкоголанцюга hu2H7 vl6 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGS GSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEI KR(SEQIDNO:1) Варіабельний домен важкого ланцюга hu2H7 vl6 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQ KFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVV YYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 2) Переважне гуманізоване антитіло 2Н7 v16 має наступну амінокислотну послідовність легкого ланцюга DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGS GSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVV CLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ GLSSPVTKSFNR GEC(SEQIDNO:3); і наступну амінокислотну послідовність важкого ланцюга EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQ KFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGP SVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 4). "Ізольований" антагоніст являє собою такий антагоніст, який був ідентифікований і виділений та/або отриманий з компонентів природного середовища, яке його оточує. Забруднюючі компоненти природного середовища антагоніста - це матеріали, які будуть перешкоджати діагностичному або терапевтичному використанню антагоніста й можуть включати ферменти, гормони й інші білкові або небілкові сполуки. У переважному варіанті здійснення даного винаходу антагоніст очищають (1) до ступеня чистоти, який становить більше 95 % (за вагою), що визначають методом Лоурі й, більш переважно, більше 99 % (за вагою); (2) до рівня, достатнього для одержання принаймні 15 залишків N-кінцевої або внутрішньої 9 UA 99933 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовності при використанні обертового чашкового секвенатора або (3) до гомогенності за допомогою SDS-PAGE у відновлювальних або не відновлювальних умовах з використанням Кумасі голубого або, переважно, срібного фарбування. Ізольований антагоніст включає антагоніст in situ усередині рекомбінантних клітин доти, поки принаймні один з компонентів, що становлять природне оточення цього антагоніста, не буде вилучений. Однак звичайно ізольований антагоніст одержують тільки після одного етапу очищення. Термін "ссавці", який використовується відповідно до даного винаходу, стосується будь-якої тварини, яка класифікується як ссавець, включаючи людину, домашніх і сільськогосподарських тварин, тварин зоопарків, спортивних тварин, а також домашніх улюбленців, таких як собаки, коні, кішки, корови й т.п. Переважно, ссавцем є людина. Термін "лікування" стосується як терапевтичних, так і превентивних або профілактичних мір. До тих, хто має потребу в лікуванні належать індивідууми, які вже мають захворювання або патологічний стан, а також ті, хто має потребу в профілактиці розвитку захворювання або патологічного стану. Отже, у ссавця вже може бути діагностовано захворювання або патологічний стан або ж він може бути схильний до розвитку захворювання. Термін "терапевтично ефективна кількість" означає таку кількість антагоніста, яка є ефективною для запобігання, поліпшення перебігу або лікування аутоімунного захворювання, про яке йдеться. Термін "імуносупресивний агент", який використовується тут при описі терапевтичних підходів, стосується сполуки, яка пригнічує або екранує імунну систему ссавця, який піддається лікуванню. Це стосується сполук, які інгібують продукцію цитокінів, пригнічують самоекспресію антигену або маскують МНС антигени. Прикладами таких агентів є 2-аміно-6-арил-5-заміщені піримідини (див. патент US No. 4 665 077, наведений тут як посилання); нестероїдні протизапальні засоби (NSAIDs); азатіоприн; циклофосфамід; бромокриптин; даназол; дапсон; глутаральдегід (який маскує антигени МНС, як описано в патенті US No. 4 120 649); антиідіотипічні антитіла до МНС антигенів й МНС фрагментам; циклоспорин А; стероїди, такі, як глюкокортикоїди, наприклад, преднізолон, метилпреднізолон і дексаметазон; метотрексат (для перорального або підшкірного введення); гідроксихлорохін; сульфасалазин; лефлуномід; антагоністи цитокінів або їх рецепторів, включаючи антитіла до інтерферону у, (3 або а, антитіла до фактора некрозу пухлин а (інфліксимаб або адалімумаб), анти-TNF  імуноадгезин (етанерсепт), антитіла до TNF  , антитіла до інтерлейкіну 2 і до рецептора IL-2; анти-LFA-lантитіла, включаючи анти-С11а й анти-CD 18 антитіла; анти-L3Т4 антитіла; гетерологічний антилімфоцитарний імуноглобулін; пан-Т антитіла, переважно, анти-CDS- або анти CD4/CD4a антитіла; розчинний пептид, що має LFA-3-зв'язувальний домен (WO 90/08187 від 7/26/90); стрептокіназа; TGF-  ; стрептодорназа; РНК або ДНК хазяїна; FK506; RS-61443; дезоксиспергуалін; рапаміцин; Т-клітинний рецептор (Cohen et al., патент US No. 5 114 721); фрагменти Т-клітинного рецептора (Offher et al, Science, 251:430-432 (1991); WO 90/11294; Ianeway, Nature 341: 482 (1989); WO 91/01133) і антитіла до Т-клітинного рецептора (ЕР 340 109), такі, як Т10В9. Термін "цитотоксичний агент", який використовується у даному описі, стосується сполуки, яка інгібує або перешкоджає функціонуванню клітин та/або викликає їх руйнування. Цей термін 211 131 125 90 186 188 153 212 32 об'єднує радіоактивні ізотопи (наприклад, Аr , І , І , Y , Re , Re , Sm , Ві , Р і радіоактивні ізотопи Lu), хіміотерапевтичні агенти й токсини, такі, як низькомолекулярні токсини або токсини з ферментативною активністю бактеріального, грибкового, рослинного або тваринного походження, а також їх фрагменти. "Хіміотерапевтичний агент" являє собою хімічну сполуку, яка використовується для лікування раку. Прикладами хіміотерапевтичних агентів є алкілуючі агенти, такі, як тіотепа й IM циклофосфамід (CYTOXAN ); алкілсульфонати, такі, як бісульфан, імпросульфан і піпосульфан; азиридини, такі, як бензодопа, карбохіон, метуредопа й уредопа; етиленіміни й метиламеламіни, включаючи алтретамін, триетиленмеламін, тритиленфосфорамід, триетилентіофосфаорамід і триметилоломеламін; нітроіприти, такі, як хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорфосфамід, естрамустин, іфосфамід, мехлоретамін, гідрохлорид оксиду мехлоретаміну, мелфалан, новембіцин, фенестерин, преднімустин, трофосфамід, іприт урацилу; похідні нітрозосечовини, такі, як кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, німустин, ранімустин; антибіотики, такі, як аклациномізини, актиноміцин, аутраміцин, азасерин, блеоміцини, кактиноміцин, каліхеаміцин, карабіцин, карміноміцин, карзинофілін, хромоміцини, дактиноміцин, даунорубіцин, деторубіцин, 6-діазо-5-оксо-Lнорлейцин, доксорубіцин, епірубіцин, езорубіцин, ідарубіцин, марцеломіцин, мітоміцини, мікофенольна кислота, ногаламіцин, олівоміцини, пепломіцин, убенімекс, зіностатин, зорубіцин; антиметаболіти, такі, як метотрексат й 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолієвої кислоти, такі, як 10 UA 99933 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 деноптерин, метотрексат, тіаміприн, тіогуанин; аналоги піримідину, такі, як анцитабін, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабін, дідеоксіуридин, доксифлуридин, еноцитабін, флоксуридин, 5-FU; андрогени, такі, як калустерон, дромостанолону пропіонат, епитіостанол, мепитіостан, тестолактон; препарати, які пригнічують гіперфункцію надниркових залоз, такі, як аміноглютетімід, мітотан, трилостан; похідне фолієвої кислоти, таке, як формілтетрагідрофолієва кислота; ацеглатон; алдофосфаміду глюкозид; амінолевулінова кислота; амсакрин; бестабуцил; бізантрен; едатраксат; дефофамін; демеколцин; діазихіон; елфорнітин; ацетат еліптину; етоглюцид; нітрат галію; гідроксисечовина; лентинан; лонідамін; мітогуазон; мітокстантрон; мопідамол; нітракрин; пентостатин; фенамет; пірарубіцин; подофілінова кислота; 2-етилгідразид; прокарбазин; PSK®; разоксан; сизофіран; спірогерманій; теніазонова кислота; триазихіон; 2,2,2'-трихлортриетиламін; уретан; віндезин; дакарбазин; маномустин; мітобронітол; мітолактол; піпоброман; гацитозин; арабінозид ("Ага-С"); циклофосфамід; тіотепа; таксоїди, наприклад, паклітаксел (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) і доксетаксел (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); хлорамбуцил; гемцитабін; 6-тіогуанін; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платини, такі, як цисплатин і карбоплатин; вінбластин; платина; етопозид (VP-16); іфосфамід; мітоміцин С; мітоксантрон; вінкристин; вінорелбін; навелбін; новантрон; теніпозид; дауноміцин; аміноптерин; кселода; ібандронат; СРТ-11; інгібітор топоізомерази RFS 2000; дифторметилорнітин (DMFO); ретиноєва кислота; еспераміцини; капецитабін, а також будь-які фармацевтично прийнятні солі, кислоти або похідні сполук, перерахованих вище. Крім того, до хіміотерапевтичних агентів належать протигормональні агенти, які регулюють або інгібують гормональну активність пухлин, такі, як антиестрогени, включаючи тамоксифен, ралоксифен, 4(5)-імідазоли, які інгібують ароматазу, 4-гідрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон і тореміфен (фарестон); антиандрогени, такі, як флутамід, нілутамід, бікалутамід, лейпролід і гозерелін; а також фармацевтично прийнятні солі, кислоти або похідні вказаних сполук. Термін "цитокін" стосується білків, синтезованих однією клітинною популяцією, які впливають на інші клітини й виконують функцію міжклітинних медіаторів. Прикладами таких цитокінів є лімфокіни, монокіни й звичайні пептидні гормони. До цитокінів належать гормон росту, зокрема, людський гормон росту; N-метіонілований людський гормон росту й бичачий гормон росту; паратиреоїдний гормон; тироксин; інсулін; проінсулін; релаксин; прорелаксин; глікопротеїнові гормони, такі, як фолікулостимулювальний гормон (ФСГ), тиреотропний гормон (ТТГ) і лютеїнізуючий гормон (ЛГ); фактор росту гепатоцитів; фактор росту фібробластів; пролактин; плацентарний лактоген; фактор некрозу пухлин-  і -  ; фактор, який інгібує мюлерову протоку; мишиний гонадотропін-асоційований пептид; інгібін; активін; фактор росту ендотелію судин; інтегрин; тромбопоетин (ТРО); фактори росту нервів, такі, як NGF-  ; фактор росту тромбоцитів; трансформуючі фактори росту (TGFs), такі, як TGF-  і TGF-  ; інсуліноподібний фактор росту-І й -II; еритропоетин (ЕРО); остеоіндуктивні фактори; інтерферони, такі, як інтерферон-  , -  і -  ; колонієстимулюючі фактори (CSFs), такі, як макрофагальний CSF (M-CSF); гранулоцитарно-макрофагальний CSF (GM- CSF) і гранулоцитарний CSF (G-CSF); інтерлейкіни (ILs), такі, як IL-1, IL-1  , IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-15; фактор некрозу пухлин, такий, як TNF-  або TNF-  , а також інші поліпептидні фактори, включаючи LIF й KL. У даному описі термін цитокін стосується білків природного походження або отриманих за допомогою рекомбінантної клітинної лінії, а також біологічно активних еквівалентів природних цитокінів. Термін "проліки", який використовується у даному описі, стосується попередника або похідного фармацевтично активної сполуки, який є менш цитотоксичним по відношенню до пухлинних клітин, ніж вихідний лікарський засіб і може бути активований ферментативно або перетворений в більш активну вихідну форму. Див, наприклад, Wilman, "Проліки в хіміотерапії th раку" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615 Meeting Belfast (1986) і Stella et al., "Проліки: хімічний підхід до цілеспрямованої доставки лікарських препаратів" Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985). До проліків, заявлених відповідно до даного винаходу, належать (без обмежень вказаними) фосфат-вмісні проліки, тіофосфатвмісні проліки, сульфатвмісні проліки, пептидвмісні проліки, проліки на основі модифікованих D-амінокислот, глікозиловані проліки,  -лактам-вмісні проліки, факультативно заміщені феноксиацетамідвмісні проліки або факультативно заміщені фенілацетамідвмісні проліки, проліки 5-фторурацилу й інші 5-фторуридинові проліки, які можуть бути перетворені в більш активні вільні цитотоксичні сполуки. Прикладами цитотоксичних агентів, які можуть бути перетворені у форму проліків для використання відповідно до даного винаходу, є (без обмежень вказаними) всі перераховані вище хіміотерапевтичні сполуки. 11 UA 99933 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 "Ліпосома" являє собою невелику везикулу, сформовану з різних типів ліпідів, фосфоліпідів та/або сурфактанта, яка використовується для доставки лікарських засобів (таких, як антагоністи, розкриті в даному описі, і, можливо, хіміотерапевтичні агенти) в організм ссавців. Компоненти ліпосоми звичайно організовані у вигляді двошарової структури, аналогічно до того, як розташовуються ліпіди в біологічних мембранах. II. Одержання антагоністів Даний винахід також стосується способів й умов одержання антагоністів, які взаємодіють з поверхневим маркером В-клітин, які описані нижче. Поверхневий маркер В-клітин, який використовується для одержання й скринінгу антагоніста(ів), може бути, наприклад, представлений розчинною формою антигену або його ділянки, які містять потрібний епітоп. Альтернативно або додатково, В-клітини, які експресують поверхневий маркер, можуть бути використані для одержання й скринінгу антагоніста(ів). Інші форми поверхневого маркера В-клітин, які використовують для одержання антагоністів, очевидні для фахівця в даній галузі знань. Переважно, поверхневий маркер В-клітин являє собою антиген CD20. У тому випадку, якщо переважний антагоніст є антитілом, інші антагоністи, відмінні від антитіл, розглядаються тут особливо. Наприклад, антагоніст може являти собою невелику молекулу, злиту або кон'юговану із цитотоксичним агентом (таким, як розкриті в даному описі цитотоксичні агенти). Бібліотеки невеликих молекул можуть бути проскриновані відносно поверхневого маркера В-клітин, що представляє інтерес, з метою виявлення невеликої молекули, яка зв'язується з антигеном. Далі невелика молекула може піддатися скринінгу на антагоністичні властивості та/або кон'югуванню із цитотоксичним агентом. Антагоніст також може являти собою пептид, отриманий шляхом конструювання або фагово-дисплейного методу (див., наприклад, WO98/35036, опубл. 13 серпня 1998 p.). Відповідно до одного варіанта, антагоніст може являти собою молекулу, яка імітує CDR, або аналог антитіла, який містить CDRs заданого антитіла. Крім того, що такі пептиди можуть бути антагоністами самі по собі, вони можуть бути кон'юговані із цитотоксичними агентами, які впливають на антагоністичні властивості пептидів або підсилюють їх. Нижче наведені приклади способів одержання антитіл, які мають антагоністичну активність, використовуваних відповідно до даного винаходу. (і) Поліклональні антитіла Поліклональні антитіла переважно одержують шляхом множинної підшкірної або інтраперитонеальної імунізації тварин відповідним антигеном й ад'ювантом. Крім того, вказаний антиген може бути кон'югований з білком, який є імуногенним по відношенню до тих видів тварин, які піддаються імунізації, наприклад, з гемоціаніном молюска фісурелі, сироватковим альбуміном, тиреоглобуліном великої рогатої худоби або інгібітором трипсину соєвих бобів при використанні біфункціонального або дериватизуючого агента, такого, як складний ефір малеімідобензоїл сульфосукциніміду (кон'югація відбувається за допомогою цистеїнових залишків), N-гідроксисукцинімід (кон'югація відбувається за допомогою залишків лізину), 1 1 глутаральдегід, ангідрид янтарної кислоти, SOCl2, R N=C=NR, де R й R є різними алкільними групами. Тварин імунізують антигеном, імуногенними кон'югатами або їх похідними, об'єднуючи, наприклад, 100 мкг або 5 мкг білка або кон'югата (для кроликів або мишей, відповідно) із трьома об'ємами повного ад'юванта Фрейнда й здійснюючи ін'єкції отриманого розчину внутрішньошкірно в різні ділянки. Через один місяць тварин бустують 1/5 - 1/10 вихідної кількості пептиду або кон'югата в повному ад'юванті Фрейнда підшкірними ін'єкціями в різні ділянки. Через 7-14 днів здійснюють збір крові у тварин і визначають титр антитіл в отриманій сироватці. Тварин бустують доти, поки титр антитіл не встановиться. Переважно, тварин бустують кон'югатом того ж самого антигену, але кон'югованого з іншим білком та/або з тим же самим, але при використанні іншого перекрестнозв'язувального агента. Кон'югати також можуть бути отримані за допомогою культури рекомбінантних клітин у формі білків злиття. Крім того, для посилення імунної відповіді можуть бути використані агенти, які сприяють агрегації, наприклад, алюмінієві галуни. (іі) Моноклональні антитіла Моноклональні антитіла являють собою популяцію по суті гомогенних антитіл, тобто індивідуальні антитіла, які становлять популяцію, ідентичні, за винятком антитіл, що мають можливі природні мутації, які можуть становити незначну частину популяції. Таким чином, поняття моноклональні" вказує на те, що антитіла не є сумішшю дискретних антитіл. 12 UA 99933 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Наприклад, моноклональні антитіла можуть бути отримані при використанні гібридомного методу, вперше розробленого Келером й ін. [Kohler et al, Nature, 256:495 (1975)], або ж за допомогою технології рекомбінантних ДНК (патент US 44816567). Згідно із гібридомним методом, мишей або інших підходящих тварин, наприклад, хом'яків, імунізують, як описано вище, для того, щоб викликати генерацію лімфоцитів, продукуючих або здатних продукувати антитіла, які специфічним чином зв'язуються з білком, використовуваним для імунізації. Альтернативно, лімфоцити можуть бути імунізовані in vitro. Потім лімфоцити зливають із клітинами мієломи при використанні підходящого агента для злиття, такого, як поліетиленгліколь, з одержанням клітин гібридоми (Goding, "Моноклональні антитіла: принципи й застосування", стор. 59-103 (Academic Press, 1986)). Отримані в такий спосіб гібридомні клітини висівають і вирощують у підходящому культуральному середовищі, яке переважно містить одну або більше сполук, які інгібують ріст і виживаність незлитих, батьківських клітин мієломи. Наприклад, якщо батьківські клітини мієломи втратили здатність синтезу ферменту гіпоксантин гуанін фосфорибозилтрансферази (HGPRT або HPRT), у культуральне середовище для росту гібридомних клітин звичайно додають гіпоксантин, аміноптерин і тімідин (середовище HAT), які перешкоджають росту клітин, дефіцитних за HGPRT. Переважними мієломними клітинами є такі клітини, які підлягають ефективному злиттю, підтримують стабільно високий рівень синтезу антитіл відібраними для злиття антитілопродукуючими клітинами й чутливі до середовища HAT. Серед таких клітин переважними є клітини мієломи миші, наприклад, що походять з пухлин МОРС-21 і МРС-11, які можуть бути отримані в Клітинному центрі Солковського інституту, Сан Дієго, Каліфорнія, US, і клітини ліній SP-2 й X63-Ag8-653, які можна одержати в Американській колекції типових клітинних культур, Роквілл, Мериленд, US. Крім того, для одержання моноклональних антитіл людини можуть використовуватися мієломні клітини людини й гетеромієломні клітинні лінії людини й миші [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al, "Способи й одержання моноклональних антитіл", pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]. Культуральне середовище, у якому вирощувалися гібридомні клітини, досліджують на наявність моноклональних антитіл, направлених на антиген. Переважно, специфічність зв'язування моноклональних антитіл, які продукуються клітинами гібридоми, визначають імунопреципітацією або дослідженням зв'язування in vitro, наприклад, радіоімунологічним аналізом (РІА) або імуноадсорбцією (ELISA). Афінність зв'язування антитіл з антигеном може бути визначена, наприклад, методом Скетчарда, описаним Munson et al, Anal. Biochem., 107:220 (1980). Після того, як ідентифікують гібридомні клітини, які продукують антитіла потрібної специфічності, афінності та/або активності, клони можуть бути субклоновані методом лімітуючих розведень, і вирощені при використанні стандартних методів [Goding, "Моноклональні антитіла: принципи й практика", рр.59-103 (Academic Press, 1986)]. Підходяще для цих цілей середовище включає, наприклад, D-MEM або RPMI-1640. Крім того, гібридомні клітини можуть бути вирощені in vivo у формі асцитних пухлин в організмі тварин. Моноклональні антитіла, які секретуються субклонами, виділяють із культурального середовища, асцитної рідини або сироватки підходящими методами імунологічного очищення, наприклад, з використанням протеїн А-сефарози, гідроксилапатитною хроматографією, гельелектрофорезом, діалізом або афінною хроматографією. ДНК, яка кодує моноклональні антитіла, виділяють і секвенують за допомогою стандартних методів {наприклад, при використанні олігонуклеотидних проб, здатних специфічно зв'язуватися з генами, які кодують важкі або легкі ланцюга антитіл миші). Гібридомні клітини служать переважним джерелом такої ДНК. Після виділення ДНК вбудовують у вектор експресії, яким потім трансформують клітини-хазяї, такі, як Е. coli, COS, CHO (клітини яєчника китайського хом'ячка) або мієломні клітини, які не продукують імуноглобулінів, для одержання моноклональних антитіл у рекомбінантних клітинах-хазяїнах. Огляд публікацій, присвячених рекомбінантній експресії в бактеріях ДНК, яка кодує антитіла, включає огляди Skerra et al, Curr. Opinion in Immunol, 5:256-262 (1993) Pluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188(1992). В іншому випадку антитіла або їх фрагменти можуть бути виділені з антитільних фагових бібліотек, отриманих способами, описаними McCafferty et al, Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al, Nature, 352:624-628 (1991) і Marks et al, J. Мої Віоі, 222:581-597 (1991), відповідно, описують виділення антитіл миші й людини при використанні фагових бібліотек. У наступних публікаціях розкривається одержання антитіл людини високої афінності (рівень нМ) шляхом перестановки ланцюгів [Marks et al, Boi/Technology, 10:779-783 (192)], а також комбінаторіальним інфікуванням і рекомбінацією in vivo з конструюванням об'ємних фагових 13 UA 99933 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 бібліотек [Waterhouse et al, Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)]. Таким чином, вказані методики є альтернативними традиційним способам одержання моноклональних антитіл за допомогою гібридомної технології. Крім того, ДНК, яка кодує антитіла, може бути модифікована, наприклад, заміщенням гомологічних послідовностей антитіла миші на кодувальні послідовності константних доменів важких і легких ланцюгів антитіла людини [патент US 4 816 567; Morrison, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)] або ковалентним зв'язуванням послідовності, яка кодує імуноглобулін, з усією або частиною послідовності, яка кодує поліпептид неімуноглобулінової природи. Звичайно такими поліпептидами неімуноглобулінової природи заміщають константні домени антитіла або варіабельні домени антигензв'язувальної ділянки антитіла з метою одержання химерних бівалентних антитіл, які містять одну антигензв'язувальну ділянку, яка має високу специфічність по відношенню до одного антигену, і іншу антигензв'язувальну ділянку, яка має високу специфічність по відношенню до іншого антигену. (iii) Гуманізовані антитіла Способи гуманізування антитіл нелюдського походження описані в попередньому рівні техніки. Переважно, гуманізовані антитіла мають один або більше амінокислотних залишків антитіла нелюдського походження, вбудованих в антитіло людини. Вказані амінокислотні залишки антитіла нелюдського походження часто називають "імпортними" залишками, які звичайно одержують із "імпортного" варіабельного домену. Гуманізовані, головним чином, здійснюють при використанні методу, розробленого Winter с співавторами [Jones et al, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al, Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al, Science, 239:1534-1536 (1988)], шляхом заміщення послідовностей гіперваріабельних ділянок антитіла людини відповідними послідовностями гіперваріабельних ділянок нелюдського походження. По суті, такі "гуманізовані" антитіла є химерними антитілами (патент US 4 816 567) і звичайно являють собою антитіла людини, у яких амінокислотні залишки гіперваріабельних ділянок й, можливо, деякі залишки каркасних ділянок заміщені залишками з аналогічних ділянок антитіл гризунів. Вибір варіабельних доменів, як легких, так і важких ланцюгів антитіл людини, які будуть використані для одержання гуманізованих антитіл, є надзвичайно важливим для зниження їх антигенності. Відповідно до так званого методу "найкращої припасування" послідовність варіабельного домену антитіла гризуна скринують проти цілої бібліотеки відомих послідовностей варіабельних доменів антитіл людини. Послідовність антитіла людини, яка найбільш близька до послідовності антитіла гризуна за структурою, потім використовують як каркасну ділянку для гуманізування антитіл [Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Med. Biol., 196:901 (1987)]. Інший метод передбачає використання певної каркасної ділянки, яка походить з консенсусної послідовності всіх антитіл людини з певним типом легких і важких ланцюгів. Та сама каркасна послідовність може використовуватися для одержання різних гуманізованих антитіл [Carter et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Frestaet al, J. Immunol., 151:2623 (1993)]. Крім того, представляється важливим, що гуманізовані антитіла зберігають високу активність зв'язування з антигеном і мають інші цінні біологічні властивості. Для досягнення вказаної мети, відповідно до переважного способу, гуманізовані антитіла одержують, аналізуючи послідовності батьківських антитіл і різні концептуальні продукти гуманізування при використанні методу тривимірного моделювання батьківських і гуманізованих послідовностей. Тривимірні моделі імуноглобулінів є загальнодоступними й добре відомими фахівцеві в даній галузі. Комп'ютерні програми, які демонструють можливі тривимірні конформаційні структури вибраних кандидатних послідовностей імуноглобулінів, також загальнодоступні. Аналіз вказаних зображень дозволяє оцінити внесок різних амінокислотних залишків у функціональні властивості вибраної послідовності імуноглобуліну, тобто тих залишків, які впливають на його здатність зв'язуватися з відповідним антигеном. За допомогою вказаного підходу залишки каркасних ділянок можуть бути відібрані й скомбіновані з реципієнтними й "імпортними" послідовностями з одержанням антитіл, які мають потрібні властивості, такими, як підвищена афінність зв'язування з антигеном-мішенню. У цілому, амінокислотні залишки гіперваріабельних ділянок безпосереднім чином і найбільш значимим чином задіяні в зміні ангигензв'язувальної активності. (iv) Антитіла людини Як альтернатива гуманізуванню, можуть бути отримані антитіла людини. Наприклад, у цей час це можливо при використанні трансгенних тварин (наприклад, мишей), в організмі яких у результаті імунізації синтезується повний спектр антитіл людини при відсутності ендогенної продукції імуноглобулінів. Наприклад, відомо, що 14 UA 99933 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гомозиготна делеція гена, який кодує фрагмент, який з'єднує ділянки важких ланцюгів антитіла (Jh), у клітинах зародкової лінії в химерних і мутантних мишей приводить до повного інгібування ендогенної продукції антитіл. Перенесення гена клітин зародкової лінії, який кодує імуноглобулін людини, у клітини таких мутантних мишей приводить до синтезу антитіл людини в організмі вказаних тварин при відповідній імунізації антигеном. Див., наприклад, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al, Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al, Year in Immuno., 7:33 (1993), а також патенти US 5 591 669, 5 589 369 й 5 545 807. Крім того, для одержання антитіл людини й фрагментів антитіл in vitro може бути використана фагово-дисплейна технологія (McCafferty et al, Nature 348:552-553 (1990), заснована на створенні бібліотеки генів варіабельних (V) доменів імуноглобулінів імунізованих донорів. Відповідно до цієї технології гени V-домену антитіла клонують у єдиній рамці зчитування з генами великого й малого білків оболонки нитчастого бактеріофага, наприклад, МІ3 або fd, і функціональні фрагменти антитіл експонуються на поверхні фагової частинки. Оскільки фагова частинка містить одноланцюгову копію фагового геному, відбір, заснований на функціональних властивостях антитіла, також приводить до відбору гена, який кодує антитіло, яке має такі властивості. Таким чином, бактеріофаг імітує деякі властивості В-клітин. Фаговодисплейний метод може застосовуватися різним чином; див., наприклад, огляд Johnson, Kevin S. і Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993). Для здійснення фагово-дисплейного методу можуть використовуватися різні джерела сегментів V-генів. Clackson et al, Nature, 352:624-628 (1991) виділив панель різноманітних антитіл до оксазолону з невеликої рандомізованої комбінаторної бібліотеки V-генів, отриманої із селезінки імунізованої миші. Може бути сконструйований набір V-генів імунізованих людей (донорів), на основі якого за допомогою технології, описаної Marks et al, J. Моl. Вiol. 222:581-597 (1991) або Griffith et al, EMBO J. 12:725-734 (1993). можливе одержання антитіл, направлених на різні антигени, у тому числі аутоантигени. Див. також патенти US 5 565 332 й 5 573 905. Антитіла людини також можуть бути отримані in vitro за допомогою активованих В-клітин (див. патенти US 5567 й 5229275). (v) Фрагменти антитіл Для одержання фрагментів антитіл можуть застосовуватися різні технології. Звичайно такі фрагменти одержують шляхом протеолітичного розщеплення інтактних антитіл [див., наприклад, Morimoto et al, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) і Brennan et al., Science, 229:81 (1985)]. Однак фрагменти антитіл у цей час можуть бути отримані прямим способом при використанні рекомбінантних клітин-хазяїв. Наприклад, фрагменти антитіл виділяють із антитільних фагових бібліотек, описаних вище. Альтернативно, Fab-SH фрагменти можуть бути виділені із клітин Е. соїі і хімічним шляхом з'єднані між собою з утворенням F(аb’)2-фрагментів [Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]. Відповідно до іншого підходу F(ab)2-фрагменти можуть бути виділені безпосередньо з культури рекомбінантних клітин-хазяїв. Інші методики одержання фрагментів антитіл повинні бути зрозумілі фахівцеві в даній галузі. У деяких випадках потрібним фрагментом антитіла є одноланцюговий Fv фрагмент (scFv). Див. WO 93/16185 і патенти US 5 571 894 й 5 587 458. Фрагмент антитіла може бути й "лінійним антитілом", наприклад, описаним у патенті US 5 641 870. Такі фрагменти можуть бути моноспецифічними або біспецифічними. (vi) Біспецифічні антитіла Біспецифічні антитіла - це антитіла, які специфічні принаймні до двох різних епітопів. Наприклад, такі антитіла можуть зв'язувати два різні епітопи поверхневого маркера В-клітин. Іншим прикладом можуть служити антитіла, які зв'язують перший В-клітинний маркер і другий Вклітинний маркер. Альтернативно, ділянка антитіла, яка зв'язує В-клітинний маркер, може бути скомбінована з ділянкою, яка зв'язує молекулу-активатор, наприклад, поверхневий рецептор лейкоцитів, такий, як Т-клітинний рецептор (наприклад, CD2 або CD3) або Fc- рецептори Ig (Fc  R), наприклад, Fc  RI (CD64), Fc  RII, (CD32) і Fc  RIII (CD 16) так, щоб підсилити захисні механізми В-клітин. Біспецифічні антитіла можуть бути також використані для локалізації цитотоксичних агентів на В-клітинах. Такі антитіла містять ділянку, яка зв'язує В-клітинний маркер, і ділянку, яка зв'язує цитотоксичний агент (наприклад, сапорин, анти-інтерферон альфа, алкалоїд барвінку, А ланцюг рицину, метотрексат або мічений радіоізотопом гаптен). Біспецифічні антитіла можуть бути отримані у вигляді повнорозмірних антитіл або антитільних фрагментів (наприклад, F(ab)2 біспецифічних фрагментів). Способи одержання біспецифічних антитіл відомі з рівня техніки. Звичайна методика одержання повнорозмірних біспецифічних антитіл заснована на спільній експресії пар важкого й легкого ланцюгів імуноглобуліну, які мають різну специфічність [Millstein et al, Nature, 305:537539 (1983)]. Оскільки відбувається вибіркова зборка важкого й легкого ланцюгів імуноглобуліну, 15 UA 99933 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 такі гібридоми (квадроми) продукують суміш із 10 різних антитільних молекул, з яких тільки одна буде мати потрібну біспецифічну структуру. Очищення вказаних антитіл, яке звичайно здійснюється за допомогою афінної хроматографії, значно більш складне й вихід продукту низький. Аналогічні методики описані в заявці WO 93/08829, а також у роботі Trauncker et al., EMBO J., 10:3655-3659(1991). Відповідно до іншого підходу, варіабельні домени антитіл з потрібною специфічністю (антигензв'язувальні ділянки) зливають із послідовностями константних доменів імуноглобулінів. Злиття переважно здійснюють із константними доменами важких ланцюгів, які містять принаймні частину шарнірної ділянки, СН2 і СН3 ділянки. Бажано одержати першу константну ділянку важкого ланцюга (СНІ), яка містить сайт, необхідний для зв'язування легкого ланцюга, принаймні в одному із продуктів злиття. ДНК, яка кодує злитий важкий ланцюг імуноглобуліну, і, якщо це необхідно, легкий ланцюг імуноглобуліну, вбудовують в окремі вектори експресії, якими спільно трансфікують підходящий організм-хазяїн. Це створює більш широкі можливості для забезпечення належного співвідношення між трьома поліпептидними фрагментами в тому випадку, коли при конструюванні з досягненням оптимального виходу кінцевого продукту використовуються нерівні співвідношення трьох поліпептидних ланцюгів. Однак можливо вбудовувати кодувальні послідовності двох або всі трьох поліпептидних ланцюгів в один вектор експресії, коли експресуються принаймні два поліпептидні ланцюги в еквівалентному співвідношенні з високим виходом або коли співвідношення не мають істотного значення. У переважному варіанті здійснення вказаного підходу біспецифічні антитіла складаються з гібридного важкого ланцюга імуноглобуліну, який має специфічну здатність до зв'язування першого антигену на одному плечі, і гібридної пари легкого й важкого ланцюгів імуноглобуліну (що має специфічну здатність до зв'язування другого антигену) на іншому плечі. Виявлено, що така асиметрична структура забезпечує більш легке відділення потрібної біспецифічної конструкції від небажаних комбінацій імуноглобулінових ланцюгів, якщо легкий ланцюг імуноглобуліну становить тільки половину від біспецифічних молекул. Відповідний підхід розкритий у заявці WO 94/04690. Для більш детального ознайомлення з методами одержання біспецифічних антитіл див., наприклад, Suresh et al, Методи в ензимології, 121:210 (1986). Відповідно до іншої методики, описаної в патенті US № 5731168, поверхня розділу між парою антитільних молекул може бути створена для одержання найбільшого відсотка гетеродимерів, які виділяють з культури рекомбінантних клітин. Переважна поверхня розділу включає, принаймні, частину СH3-домену константної ділянки антитіла. Відповідно до даного методу одну або більше амінокислот першого антитіла з невеликими боковими ланцюгами, які створюють поверхню розділу, заміняють амінокислотами, які мають бокові ланцюги більшого розміру (наприклад, тирозином і триптофаном). Рівноцінні порожнини ідентичного або подібного розміру, утворені боковими ланцюгами більшої величини, створюють на поверхні розділу з боку молекули другого антитіла заміщенням амінокислот із вказаними боковими ланцюгами на амінокислоти з боковими ланцюгами меншого розміру (наприклад, на аланін або треонін). Це дозволяє збільшити вихід гетеродимерів відносно виходу небажаних кінцевих продуктів, які являють собою гомодимери. До біспецифічних антитіл належать й перехрестнозв'язані гетерокон'югати антитіл. Наприклад, одне антитіло в такому гетерокон'югаті може бути зв'язане з авідином, а інше - з біотином. Такі антитіла, наприклад, направляють клітини імунної системи на небажані клітини (патент US 4676980) і можуть використовуватися для лікування СНІДу (WO 91/00360, WO 92/200373 й ЕР 03089). Гетерокон'югати антитіл можуть бути отримані при використанні підходящих методів перехресного зв'язування. Підходящі агенти для перехресного зв'язування добре відомі з рівня техніки й розкриті в патенті US 4 676 980 поряд з методиками перехресного зв'язування. У літературі також описані способи одержання біспецифічних антитіл із фрагментів антитіл. Наприклад, біспецифічні антитіла можуть бути отримані шляхом хімічного зв'язування. Brennan et al., Science, 229:81 (1985) описують спосіб, відповідно до якого інтактні антитіла розщеплюють протеолітично з одержанням F(ab') 2-фрагментів. Ці фрагменти відновлюють у присутності зв'язувального дитіол агента арсеніту натрію для стабілізації сусідніх дитіолів і запобігання утворення міжмолекулярних дисульфідних зв'язків. Далі Fab'-фрагменти переводять у похідні тіонітробензоату (TNB). Одне з похідних Fab'-TNB потім назад переводять в Fab'-тіол відновленням меркаптоетиламіном і змішують із еквимолярною кількістю похідного Fab'-TNB з одержанням біспецифічного антитіла. Отримані в такий спосіб біспецифічні антитіла можуть використовуватися як агенти для селективної іммобілізації ферментів. 16 UA 99933 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 Успіхи сучасної біотехнології забезпечили можливість безпосереднього виділення Fab'-SH фрагментів з Е. соlі, які можуть бути хімічним способом зв'язані з утворенням біспецифічних антитіл. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175:217-225 (1992) описують спосіб одержання повністю гуманізованих біспецифічних антитільних F(ab')2 молекул. Кожен Fab'-фрагмент окремо виділяють із Е. соlі і піддають прямому хімічному зв'язуванню in vitro з одержанням біспецифічних антитіл. Отримані в такий спосіб біспецифічні антитіла здатні зв'язуватися із клітинами, які понадекспресують ЕгЬВ2-рецептори, і нормальними Т-клітинами, ініціюючи літичну активність цитотоксичних лімфоцитів людини відносно пухлинних клітин раку грудей. Відомі також різні способи одержання й виділення біспецифічних антитільних фрагментів безпосередньо з культури рекомбінантних клітин. Наприклад, біспецифічні антитіла можуть бути отримані при використанні «лейцинових блискавок» [Kostelny et al, J. Immunol., 148(5): 15471553 (1992)]. «Лейцинові зіпперні пептиди» з Fos й Jun білків зв'язують із Fab'-ділянками двох різних антитіл шляхом злиття генів. Гомодимери антитіл потім відновлюють у шарнірній ділянці з одержанням мономерів і далі повторно окисляють до антитільних гетеродимерів. Ця методика може використовуватися й для одержання гомодимерів антитіл. Технологія "діатіл", описана Hollinger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993), передбачає альтернативний підхід до одержання біспецифічних фрагментів антитіл. Ці фрагменти містять варіабельний домен важкого ланцюга (Vh), зв'язаний з варіабельним доменом легкого ланцюга (VL) за допомогою лінкера, який є настільки коротким, що забезпечує взаємозв'язок між двома доменами одного й того ж ланцюга. Відповідно, (VH) і (VL) домени одного фрагмента утворюють пари з комплементарними (VH) і (VL) доменами іншого фрагмента, формуючи антигензв'язувальні ділянки. Відома й інша методика одержання фрагментів біспецифічних антитіл при використанні одноланцюгових Fv (s Fv) димерів [см. Gruber etal, J. Immunol, 152:5368 (1994)]. Відомі також полівалентні антитіла. Наприклад, можуть бути отримані триспецифічні антитіла [Trutt et al, J. Immunol. 147:60 (1991)]. III. Кон'югати та інші модифікації антагоністів Антагоністи, які використовують в заявлених способах, або які входять до складу заявлених засобів, можуть бути кон'юговані із цитотоксичним агентом. Хіміотерапевтичні агенти, корисні для одержання такого роду кон'югатів антагоніста й цитотоксичної речовини, описані вище. Кон'югати антагоніста й однієї або більше невеликих молекул токсинів, наприклад, каліхеаміцину, мейтанзину (патент US 5 208 020), трихотену й СС1065 також охоплюються даним описом. Відповідно до одного варіанта здійснення винаходу антагоніст кон'югують з однією або більше молекулами мейтанзину (наприклад, від близько 1 до близько 10 молекул мейтанзину на молекулу антагоніста). Мейтанзин, наприклад, може бути переведений у форму May-SS-Me, яка може бути відновлена у форму May-SH3 й введений у реакцію з модифікованим антагоністом [Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)] для одержання кон'югата мейтанзиноїд-антагоніст. Альтернативно, антагоніст кон'югують з однією або більше молекулами каліхеаміцину. Антибіотики ряду каліхеаміцину здатні генерувати пошкодження дволанцюгової молекули ДНК у субпікомолярних концентраціях. Структурні аналоги каліхеаміцину, які можуть бути використані I 45 50 55 60 I I I I на практиці, включають, без обмежень вказаними, 1,  2, 3 , N-ацетил- 1, , PSAG й 1 [Hinman et al. Cancer Research 53:3336-3342 (1993) і Lode et al. Cancer Research 58:2925-2928 (1998)]. Ензиматично активні токсини і їх фрагменти, які можуть бути використані на практиці, включають А ланцюг дифтерійного токсину, незв'язувальні активні фрагменти дифтерійного токсину, А ланцюг екзотоксину (Pseudomonas aerations), А ланцюг рицину, А ланцюг барину, А ланцюг модецину, альфа-саркин, білки Aleurites fordii, білки діантину, білки Phytolaca americana (РАРІ, РАРП й PAP-S), інгібітор Momordica charantia, курцин, кротин, інгібітор Sapaonaria offwinalis, гелонін, мітогелін, рестриктоцин, феноміцин, еноміцин і трикотецени. Див., наприклад, WO 93/21232, опубл. 28 жовтня 1993 р. Даний винахід також стосується антагоністів, які кон'юговані із сполукою, яка має нуклеолітичну активність (наприклад, рибонуклеазою або ДНК-ендонуклеазою, такою, як дезоксирибонуклеаза, ДНКаза). Для одержання антагоністів, кон'югованих з радіоактивними сполуками, можуть використовуватися різноманітні радіоактивні ізотопи. Прикладами таких ізотопів можуть служити 211 131 125 90 186 188 153 212 32 At , І , І , Y , Re , Re , Sm , Ві , Р і радіоактивні ізотопи Lu. Кон'югати антагоніста й цитотоксичного агента можуть бути отримані за допомогою різних агентів, які зв'язують біфункціональні білки, таких, як N-сукцинімідил-3-(2-піридилдитіол) пропіонат (SPDP), сукцинімідил-4-CN-малеімідометил) циклогексан-1-карбоксилат, імінотіолан (IT), біфункціональні похідні імідоефірів (наприклад, диметиладипімідат HCL), активні складні 17 UA 99933 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ефіри (такі, як дисукцинімідилсуберат), альдегіди (такі, як глутаровий альдегід), біс-азидо сполуки [такі, як біс (р-азидобензоїл)- гександіамін], похідні біс-діазонію [такі, як біс (р-діазоній бензоїл)-етилендіамін], діізоціанати (такі, як толуол 2,6-діізоціанат) і біс-активні сполуки фтору (такі, як 1,5-дифтор-2,4-динітробензол). Наприклад, рициновий імунотоксин може бути отриманий, як описано Vitetta et al. Science 238:1098 (1987). Прикладом хелатуючого агента, який використовується для кон'югування радіонуклеотиду з антагоністом, може служити мічена 14 С 1-ізотіоціанатобензил-З-метилдіетилен триамінпентаоцтова кислота (MX-DTPA). Див., наприклад, WO 94/11026. Лінкер може бути розщеплювальним і забезпечувати вивільнення цитотоксичного лікарського препарату в клітину. Наприклад, може бути використаний чутливий до кислоти лінкер, чутливий до пептидази лінкер, диметиловий лінкер або дисульфідвмісний лінкер (Chari et al, Cancer Research 52:127-131 (1992). Альтернативно, можуть бути отримані білки злиття, які містять антагоніст і цитотоксичний агент, наприклад, за допомогою рекомбінантної технології або пептидним синтезом. Відповідно до ще одного варіанта здійснення винаходу антагоніст може бути кон'югований з рецептором (таким, як стрептавідин) для використання з метою попереднього націлювання на пухлину, коли кон'югат антагоніста з рецептором вводять пацієнтові, видаляють кон'югат, який не зв'язався, із циркуляції за допомогою спеціального агента й потім вводять ліганд {наприклад, авідин), який кон'югований із цитотоксичним агентом (наприклад, радіонуклеотидом). Відповідно до даного винаходу антагоністи можуть бути кон'юговані з ферментом, який активує проліки, який перетворює проліки (наприклад, пептидил хіміотерапевтичний агент, див. WO 81/01145) в активні ліки проти злоякісних пухлин. Див, наприклад, WO 88/07378 і патент US 4975278. Фермент, який входить до складу таких кон'югатів, може бути представлений ферментом, здатним впливати на проліки таким чином, щоб перетворювати їх в більш активну, цитотоксичну форму. Ферменти, які можуть бути використані в заявленому способі, включають, без обмежень вказаними, алкалінфосфатазу, здатну перетворювати фосфатвмісні проліки у вільні ліки; арилсульфатазу, здатну перетворювати сульфатвмісні проліки у вільні ліки; цитозиндезаміназу, здатну перетворювати нетоксичний 5-фторцитозин у протиракові ліки 5-фторурацил; протеази, такі, як претеаза Serratia, термолізин, субтилізин, карбоксипептидази й катепсини (такі, як катепсини В й L), які перетворюють пептидвмісні проліки у вільні ліки; Dаланілкарбоксипептидази, конвертуючі проліки, які містять D-амінокислотні замісники; ферменти, які розщеплюють вуглеводи, такі, як бета-галактозидаза й нейрамінідаза, які розщеплюють глікозиловані проліки з утворенням вільних ліків; бета-лактамаза, яка розщеплює ліки, модифіковані за допомогою бета-лактамів, у вільні ліки; пеніцилінамідази, такі, як пеніцилін V амідаза або пеніцилін G амідаза, які перетворюють ліки, модифіковані за аміногрупами за допомогою феноксіацетилових або фенілацетилових груп, відповідно, у вільні ліки. Альтернативно, антитіла з ензиматичною активністю, відомі з рівня техніки як «абзими», можуть використовуватися для перетворення проліків, заявлених відповідно до винаходу, у вільні активні ліки [див., наприклад, Massey, Nature 328:457-458 (1987)]. Кон'югати антагоніста з абзимами, які використовують для доставки абзиму до популяції пухлинних клітин, можуть бути отримані, як розкрито в даному описі. Ферменти, заявлені відповідно до даного винаходу, можуть бути ковалентно зв'язані з антагоністом за допомогою методик, добре відомих з рівня техніки, наприклад, при використанні гетеробіфункціональних перехресно-зв'язувальних реагентів, описаних вище. Альтернативно, за допомогою добре відомої технології рекомбінантних ДНК можуть бути отримані білки злиття, які містять принаймні антигензв'язувальну ділянку заявленого відповідно до даного винаходу антагоніста, з'єднану принаймні з функціонально активною ділянкою ферменту, заявленого відповідно до даного винаходу [див., наприклад, Neuberger etal, Nature 312:604-608 (1984)]. Інші модифікації антагоніста розкриті в даному описі. Наприклад, антагоніст може бути зв'язаний з одним із численних полімерів небілкової природи, наприклад, поліетиленгліколем, поліпропіленгліколем, поліоксіалкіленами або співполімерами поліетиленгліколю й поліпропіленгліколю. Розкриті в даному описі антагоністи можуть бути занурені в ліпосоми. Ліпосоми, які містять антагоніст, можуть бути отримані методами, відомими з рівня техніки, наприклад, описаними Epstein et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980), а також у патентах US 4485045 й 4544545 і заявці WO 97/38731, опубл. 23 жовтня 1997 p. Ліпосоми зі збільшеним часом циркуляції в крові розкриті в патенті US 5 013 556. Особливо переважні ліпосоми можуть бути отримані методом зворотно-фазового випарювання й сформовані композицією ліпідів, яка включає фосфатидилхолін, холестерол і 18 UA 99933 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 фосфатидилетаноламін, модифікований поліетиленгліколем (PEG-РЕ). Ліпосоми пропускають через фільтри із заданим розміром пор для одержання ліпосом потрібного діаметра. Fab'фрагменти антитіла, заявленого відповідно до даного винаходу, можуть бути кон'юговані з ліпосомами, як описано Martin et al, J. Biol Chem. 257:286-288 (1982) у реакції утворення міжланцюгових дисульфідних зв'язків. З ліпосомами може бути кон'югований хіміотерапевтичний агент. Див. Gabizon et al, J. National Cancer Inst. 81 (19) 1484 (1989). Даним винаходом охоплюються також модифікації амінокислотних послідовностей білкових або пептидних антагоністів. Наприклад, при необхідності можуть бути поліпшені зв'язувальна афінність та/або інші біологічні властивості антагоніста. Варіанти амінокислотних послідовностей антагоніста одержують введенням відповідних нуклеотидних замін у послідовність нуклеотидів, яка кодує антагоніст, або шляхом пептидного синтезу. Такі модифікації включають, наприклад, делеції, і/або інсерції, і/або заміни амінокислотних залишків у білковій або пептидній послідовності антагоніста. Для одержання антагоністів, які мають необхідні властивості, можуть бути використані будь-які комбінації амінокислотних делецій, інсерцій і замін. Амінокислотні заміни можуть змінювати пост-трансляційну модифікацію антагоніста, наприклад, змінювати число або положення сайтів глікозилування. Корисним методом ідентифікації певних амінокислотних залишків або ділянок молекули антагоніста, які є переважними для мутагенезу, є "аланінсканувальний метагенез". Вказаний метод опису Cunningham й Wells, Science 244:1081-1085 (1989). Відповідно до даного методу ідентифікують залишок або групу залишків-мішеней (наприклад, заряджені залишки, такі, як arg, asp, his, lys й glu) і заміщають їх нейтральними або негативно зарядженими амінокислотами (найбільш переважно, аланіном або поліаланіном) з досягненням взаємодії амінокислот з антигеном. Такі положення амінокислот, які виявляють функціональну чутливість до замін, далі модифікують введенням вказаних амінокислот або інших варіантів. Таким чином, у той час як сайт введення варіантів амінокислотної послідовності переддетермінований, природа мутації per se не обов'язково може бути переддетермінованою. Наприклад, для аналізу здійснення мутації в даному сайті аланін-сканувальний або вибірковий мутагенез проводять у кодоні-мішені й ділянці-мішені й експресовані варіанти антагоністів піддають скринінгу на задану активність. Вставки амінокислотних послідовностей включають аміно- і карбоксикінцеві злиті ділянки, які змінюються за довжиною від одного залишку до поліпептиду, що містить сто або більше амінокислотних залишків, а також ділянки з одного або декількох амінокислотних залишків, які знаходяться всередині послідовностей. Прикладами кінцевих вставок є антагоністи з N-кінцевим залишком метіоніну або антагоністи, злиті із цитотоксичним поліпептидом. Інші інсерційні варіанти антагоністів включають антагоністи, злиті за N- і С-кінцевими ділянками з молекулами ферментів або поліпептидів, які підсилюють час напівжиття антагоністів у сироватці крові. До іншого типу варіантів антагоністів належать варіанти, засновані на заміщенні амінокислотних залишків. У цих варіантах принаймні один амінокислотний залишок у молекулі антагоніста заміщений на інший залишок. Сайти, найбільш переважні для здійснення заміщувального мутагенезу у молекулі антитіла, включають гіперваріабельні ділянки, але каркасні ділянки також можуть бути задіяні. Консервативні заміни наведені в Таблиці 1 під заголовком "Переважні заміни". Якщо такі заміни змінюють біологічну активність, то вони є найбільш переважними й наведені в Таблиці 1 під заголовком "Найбільш переважні заміни" або розкриваються нижче з посиланням на класи амінокислот. Такі заміни вводять у молекули антагоністів й отримані продукти піддають скринінгу. Таблиця 1 Початкові залишки Ala (A) Arg (R) Asn (N) Asp (D) Cys (C) Gin (Q) Glu (E) Gly (G) His (H) Iie (I) Leu (L) Найбільш переважні заміни val; leu; ile lys; gin; asn gin; his; asp, lys; arg glu; asn ser; ala asn; glu asp; gin ala asn; gin; lys; arg leu; val; met; ala; phe; норлейцин норлейцин; ile; val; met; ala; phe 19 Переважні заміни val lys gin glu ser asn asp ala arg leu ile UA 99933 C2 Lys (K) Met (M) Phe(F) Pro (P) Ser (S) Thr (T) Trp(W) Tyr (Y) Val (V) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 arg; gin; asn leu; phe; ile leu; val; ile; ala; tyr ala thr ser tyr; phe trp; phe; thr; ser ile; leu; met; phe; ala; норлейцин arg leu tyr ala thr ser tyr phe leu Істотні модифікації біологічних властивостей антагоністів супроводжуються вибірними замінами, які значно відрізняються за здатністю підтримувати (а) структуру поліпептидного скелету в ділянці заміни, наприклад, складчасту або спіральну конформацію, (б) заряд або гідрофобність молекули в сайті-мішені й (в) розміри бокового ланцюга. Природні залишки поділяються на групи залежно від загальних властивостей бокових ланцюгів: - гідрофобні: норлейцин, met, ala, val, leu, ile; - нейтральні гідрофільні: cys, ser, thr; - кислі: asp, glu; - основні: asn, gin, his, lys, arg; - залишки, які впливають на орієнтацію ланцюгів: gly, pro й ароматичні: trp, tyr, phe. Неконсервативні заміни включають заміни амінокислотних залишків одного класу на амінокислотні залишки іншого класу. Цистеїнові залишки, які не залучені в підтримання належної конформації антагоніста, також можуть бути заміщені, в основному, серином, для посилення стійкості молекули до окислення й запобігання небажаного перехресного зв'язування. Навпроти, цистеїнові зв'язки можуть бути введені в молекулу антагоніста для поліпшення її стабільності (особливо в тих випадках, коли антагоніст являє собою фрагмент антитіла, такий, як Fv фрагмент). Особливо переважні варіанти антагоністів, засновані на заміщенні амінокислот, включають варіанти, у яких заміщення зроблені в гіперваріабельних ділянках вихідного антитіла. В основному, такі варіанти, відібрані для подальшої модифікації, мають поліпшені біологічні властивості по відношенню до вихідного антитіла, з якого вони отримані. Підходящим способом одержання таких варіантів є афінне дозрівання при використанні фагово-дисплейної методики. Коротко, декілька сайтів гіперваріабельної ділянки (наприклад, 6-7 сайтів) піддають мутагенезу з одержанням всіх можливих амінокислотних замін у кожному сайті. Отримані в такий спосіб варіанти антитіла далі виявляють у моновалентній формі на поверхні частинок нитчастого бактеріофага у формі їх злиття із продуктом гена III бактеріофага МІ3, упакованого у фагову частинку. Фагово-дисплейні варіанти потім скринують на їх біологічну активність (наприклад, афінність зв'язування), як описано в даній заявці. Для того, щоб ідентифікувати можливі сайти модифікації гіперваріабельних ділянок, можна здійснити аланін-сканувальний мутагенез, який дозволяє ідентифікувати залишки гіперваріабельних ділянок, які в значній мірі забезпечують зв'язування антигену. Альтернативно або додатково може виявитися корисним проаналізувати кристалічну структуру комплексу антиген-антитіло для того, щоб ідентифікувати точки контакту між антигеном й антитілом. Такі контактуючі залишки й сусідні залишки є потенційними мішенями для заміщення, відповідно до методик, представлених у даному описі. Після створення таких варіантів, їх піддають скринінгу, як описано в даній заявці, і антитіла з поліпшеними властивостями, як це встановлюється в одному чи декількох відповідних дослідженнях, відбирають для подальшої модифікації. Іншим амінокислотним варіантом антагоніста є такий, при якому змінюється початковий профіль глікозилування антагоніста. Під зміною мається на увазі делеція однієї або більше вуглеводної молекули антагоніста, і/або додавання одного або більше сайтів глікозилування, які відсутні в антагоніста. Глікозилування поліпептидів звичайно є N-зв'язаним або О-зв'язаним. N-зв'язане глікозилування являє собою приєднання вуглеводної молекули до бокового ланцюга залишку аспарагіну. Трипептидні послідовності аспарагін-Х й аспарагін-Х-треонін, де X являє собою будь-яку амінокислоту, крім проліну, є послідовностями для ферментативного приєднання вуглеводної молекули до бокового ланцюга аспарагіну. Таким чином, наявність трипептидних послідовностей у складі поліпептиду створює потенційний сайт глікозилувания. О-зв'язане глікозилування полягає в прикріпленні одного із цукрів, до яких належать N-ацетилгалактозамін, галактоза або ксилоза, до гідроксіамінокислоти, здебільшого серину або треоніну, хоча 5гідроксипролін або 5-гідроксилізин також можуть бути використані. 20 UA 99933 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Додавання сайтів глікозилування до антагоніста супроводжується зміною амінокислотної послідовності таким чином, що вона включає одну або більше описаних вище трипептидних послідовностей (для N-зв'язаних сайтів глікозилування). Зміна також може бути зроблена додаванням, заміщенням одного або більше залишків серину або треоніну в амінокислотній послідовності вихідного антагоніста (сайти О-зв'язаного глікозилування). Молекули нуклеїнової кислоти, які кодують варіанти амінокислотних послідовностей антагоніста, одержують за допомогою різноманітних способів, добре відомих фахівцям уданій галузі. До таких способів належать (без обмежень вказаними) виділення нуклеїнової кислоти із природних джерел (у випадку наявності природних варіантів амінокислотних послідовностей) або одержання за допомогою опосередкованого олігонуклеотидами (або сайт-специфічного) мутагенезу, мутагенезу за допомогою ПЛР, а також за допомогою касетного мутагенезу раніше отриманих варіантних або неваріантних версій антагоніста. Може виявитися бажаним модифікувати заявлений відповідно до винаходу антагоніст із метою надання йому ефекторних функцій, наприклад, підсилити ADCC та/або CDC антагоніста. Це може бути досягнуто введенням однієї або більше амінокислотних замін в Fc-ділянку антитіла, яке є антагоністом. Альтернативно або додатково в Fc-ділянку можна ввести один або більше цистеїнових залишків, тим самим, забезпечуючи утворення міжланцюгового дисульфідного зв'язку в цій ділянці. Отримане в такий спосіб гомодимерне антитіло може мати поліпшену здатність до інтерналізації та/або підвищеного опосередковану комплементом кілерну активність і підвищену ADCC. Див. Caron et al, J. Exp. Med. 176:1191-1195 (1992) Shopes, В., J. Immunol. 148:2918:2922 (1992). Гомодимерні антитіла з підвищеною протипухлинною активністю можуть бути отримані при використанні гетеробіфункціональних перехресно-зв'язувальних лінкерів, описаних Wolf et al, Cancer Research 53:2560-2565 (1993). Альтернативно, може бути отримане антитіло, яке має дві Fc-ділянки й, відповідно, підвищену здатність до комплементопосередкованого лізису й підвищену ADCC. Див. Stevenson et al. Anticancer Drug Design 3:219-230 (1989). Для збільшення часу напівжиття антагоніста в сироватці крові в нього може бути введений епітоп, який зв'язує "рятувальний рецептор" (особливо, антитільний фрагмент), як описано, наприклад, у патенті US 5 739 277. Який використовується тут термін "епітоп, який зв'язує рятувальний рецептор", стосується епітопу на Fc-ділянці молекули Ig (наприклад, IgGl, IgG2, IgG3 або IgG4), який відповідає за збільшення часу напівжиття молекули Ig у сироватці крові in vivo. IV. Фармацевтичні композиції Терапевтично активні композиції антагоніста, які використовують відповідно до даного винаходу, одержують змішуванням антагоніста з необхідним ступенем чистоти й необов'язкових фармацевтично прийнятних носіїв, наповнювачів або стабілізаторів [Remington s Pharmaceutical Sciences, 16-e видання, під ред. Osol, A. (1980)] і зберігають у формі ліофілізованих складів або водних розчинів. Підходящі носії, наповнювачі або стабілізатори, які нетоксичні для пацієнта у використовуваних дозах і концентраціях, включають буфери, такі, як фосфатний, цитратний і буфери на основі інших органічних кислот; антиоксиданти, у тому числі аскорбінову кислоту й метіонін; консерванти, такі, як октадецилдиметилбензил хлорид амонію, хлорид гексаметонію, хлорид бензалконію, хлорид бензетонію, фенол, бутил або бензиловий спирт, алкіл-парабени, наприклад, метил- або пропіл-парабен, катехол, резорцинол, циклогексанол, 3-пентанол й  крезол); пептиди низької молекулярної маси (менше 10 амінокислотних залишків); білки, такі, як сироватковий альбумін, желатин або імуноглобуліни; гідрофільні полімери, такі, як полівінілпіролідон; амінокислоти, такі, як гліцин, глутамін, аспарагін, гістидин, аргінін або лізин; моносахариди, дисахариди й інші вуглеводи, у тому числі глюкоза, маноза або декстрани; хелатуючі агенти, такі, як EDTA; цукри, такі, як сахароза, манітол, трегалоза або сорбітол; протиіони, які утворюють солі; комплекси металів (наприклад, Zn-білкові комплекси) і/або неіонні сурфактанти, такі, як TWEEN™, PLURONICS ™ або поліетиленгліколь (PEG). Приклади композицій на основі антитіл до CD-20 описані в заявці WO 98/56418, включеної в даний опис винятково як посилання. У вказаній заявці розкриваються рідкі мультидозові композиції, які містять 40 мг/мл ритуксимабу, 25 мМ ацетату, 150 мм трегалози, 0.9% бензилового спирту, 0.02% полісорбату при рН 5.0, яка має час зберігання два роки при 2-8°С. Інші фармацевтичні композиції на основі антитіл до CD-20, які представляють інтерес, містять 10 мг/мл ритуксимабу в 9.0 мг/мл хлориду натрію, 7.35 мг/мл дигідрату цитрату натрію, 0.7 мг/мл полісорбату 80 і стерильну воду для ін'єкцій при рН 6.5. Ліофілізовані композиції, придатні для підшкірного введення, описані в заявці WO 97/04801. Такі ліофілізовані композиції можуть бути відновлені для застосування за допомогою 21 UA 99933 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 підходящого розчинника з досягненням високої концентрації білка й далі введені підшкірно ссавцеві, який потребує лікування. Фармацевтичні композиції можуть містити більше однієї активної сполуки, якщо це необхідно для лікування певного захворювання, переважно, з комплементарними активностями, які не виявляють несприятливого впливу одна на одну. Наприклад, може виявитися бажаним ввести до складу композиції цитотоксичний агент, хіміотерапевтичний агент, цитокін або імуносупресор (наприклад, що діє на Т-клітини, такий, як циклоспорин або антитіло, яке зв'язує Т-клітини, наприклад, яке взаємодіє з LFA-1). Ефективна кількість таких інгредієнтів залежить від кількості антагоніста, який міститься в композиції, характеру захворювання або порушення, які підлягають лікуванню, і інших факторів, описаних вище. Звичайно такі компоненти використовуються в тих же самих дозах і вводяться тим же самим шляхом, як описано вище, або ж їх кількість становить біля 1- 99 % вказаних доз. Активні інгредієнти можуть бути занурені в мікрокапсули, які одержують, наприклад, методом коацервації або міжфазної полімеризації, наприклад, гідроксиметилцелюлозні або желатинові мікрокапсули або полі-метилметацилатні мікрокапсули, відповідно, а також у колоїдні системи доставки лікарських препаратів {наприклад, ліпосоми, альбумінові мікросфери, мікроемульсії, наночастинки й монокапсули) або в макроемульсії. Такі методи описані в Remington s Pharmaceutical Sciences, 16-e видання, під ред. Osol, A. (1980). Можуть бути отримані препарати з підтримуваним вивільненням. Прикладами таких препаратів служать напівпроникні матриці твердих гідрофобних полімерів, які містять антагоніст, які мають певні параметри, наприклад, знаходяться у вигляді плівки або мікрокапсул. Приклади матриць із підтримуваним вивільненням включають складні поліефіри, гідрогелі [наприклад, полі(2-гідроксіетил-метакрилат або полівініловий спирт], полілактиди (патент US 3 773 919), співполімери L-глутамінової кислоти й у етил-b-глутамату, етиленвінілацетат, який не розпадається, співполімери молочної кислоти й гліколевої кислоти, які розпадаються, такі, як LUPRON DEPOT™ (ін'єковані мікросфери, які містять співполімери молочної кислоти й гліколевої кислоти й лейпролідацетат) і полі-0-(-)-3-гідроксимасляну кислоту. Композиції, які використовують in vivo, повинні бути стерильними, що забезпечується фільтруванням через стерилізуючі мембранні фільтри. V. Терапія антагоністами Даний винахід стосується терапії субпопуляції ссавців, особливо, людей, які страждають від аутоімунного захворювання або схильних до нього, у яких виявляється неадекватна відповідь на попереднє або поточне лікування інгібітором TNF-альфа. У цілому, ссавця, який підлягає терапії відповідно до заявленого винаходу, ідентифікують у процесі одного або більше курсів лікування одним або більше інгібіторами TNF-альфа, такими, як етанерсепт (ENBREL®), інфліксимаб (REMICADE®) або адалімумаб (HUMIRA™ ), на підставі виявлення в нього неадекватної відповіді на попереднє або поточне лікування інгібітором TNF-альфа, оскільки воно виявляється токсичним та/або недостатньо ефективно. Однак винахід не обмежується оцінкою попередньої стадії терапії з використанням інгібітора TNF-альфа, наприклад, пацієнт може вважатися таким, який має схильність до прояву токсичності, наприклад, кардіологічної, по відношенню до інгібітора TNF-альфа до того, як почате лікування, або ж пацієнт може бути вибраний, як такий, що в небажаний спосіб відповідає на терапію інгібітором TNF-альфа. Аутоімунні захворювання, які підлягають лікуванню відповідно до даного винаходу, наведені вище в розділі "Визначення". Переважними захворюваннями є ревматоїдний артрит, псоріатичний артрит або хвороба Крона. У цілому, ссавець, який підлягає лікуванню відповідно до заявленого винаходу, не має злоякісної В-клітинної патології. Відповідно до одного варіанта здійснення, заявлений винахід стосується способу терапії, спрямованому на зниження побічних ефектів (наприклад, інфекцій, серцевої недостатності й демієлінізації), які супроводжують лікування за допомогою інгібітора TNF-альфа. Композиції, які містять антагоніст, який зв'язується з поверхневим маркером В-клітин, можуть бути приготовлені, дозовані й введені відповідно до існуючої медичної практики. У контексті даного опису значущими факторами по відношенню до використовуваної терапії є природа захворювання або порушення, яке підлягає лікуванню, вид ссавця, клінічний стан пацієнта, тяжкість захворювання або порушення, ділянка, у яку необхідно доставити діючу речовину, спосіб введення лікарського засобу, схема лікування та інші фактори, відомі в медичній практиці. Терапевтично ефективна кількість антагоніста, яку необхідно ввести пацієнтові, підбирається залежно від вказаних факторів. 22 UA 99933 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У цілому, терапевтично ефективна кількість антагоніста, яку вводять парентерально, змінюється від близько 0.1 до близько 20 мг на кг маси тіла пацієнта розраховуючи на день, причому звичайна початкова доза антагоніста становить близько 2-10 мг/кг. Переважним антагоністом є антитіло, наприклад, таке, як RITUXAN®, яке не кон'юговане із цитотоксичним агентом. Підходящими дозами некон'югованого антитіла, є, наприклад, такі дози, 2 як від близько 20 мг/м поверхні тіла до близько 1000 мг/м поверхні тіла. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу доза антитіла відрізняється від такої, яка у цей час рекомендована для RITUXAN®. Наприклад, можна вводити пацієнтові одну або більше доз 2 антитіла, значно менших, ніж 375 мг/м поверхні тіла, наприклад доза може змінюватися від 2 2 близько 20 мг/м поверхні тіла до близько 250 мг/м поверхні тіла, у тому числі від близько 50 2 2 мг/м до близько 200 мг/м . 2 Приклади дозових режимів включають 375 мг/м поверхні тіла щотижня протягом чотирьох 2 тижнів або 1000 мг/м поверхні тіла двічі, наприклад, у день їй 15. Більш того, можна вводити одну або більше початкових доз антитіла й далі одну або більше 2 наступних доз, причому наступна доза антитіла в мг в розрахунку на м поверхні тіла перевищує 2 попередню. Наприклад, початкова доза може становити від близько 20 мг/м поверхні тіла до 2 близько 250 мг/м поверхні тіла, у тому числі від близько 50 мг/м до близько 200 мг/м , а 2 2 наступна від близько 250 мг/м поверхні тіла до близько 1000 мг/м поверхні тіла. Як відзначалося вище, вказані передбачувані кількості антагоніста суттєво залежать від конкретної ситуації й підбираються обережно. Вирішальним фактором вибору дози й схеми її введення є той кінцевий результат, якого хочуть досягти. Наприклад, відносно високі дози можуть бути необхідні первинно для лікування захворювання, яке постійно розвивається, і гострого захворювання. Для досягнення максимальної ефективності залежно від захворювання або порушення антагоніст вводять якомога раніше по відношенню до першого симптому, прояву або виявлення захворювання або порушення або до постановки діагнозу, а також під час ремісії захворювання або порушення. Антагоніст може вводитися будь-яким підходящим способом, наприклад, парентеральним, підшкірним, інтраперитонеальним, внутрішньолегеневим й інтраназальним, а також, якщо це бажано, проводять місцеве імуносупресивне лікування, застосовуючи антагоніст безпосередньо в зоні ушкодження. Парентеральні способи введення включають у тому числі внутрішньом'язовий, внутрішньовенний і внутрішньоартеріальний. Крім того, антагоніст може вводитися пульсовою інфузією, наприклад, зі зниженням дози. Доза, яку вводять шляхом ін'єкцій, найбільше переважно, внутрішньовенних або підшкірних, залежить частково від того, чи є введенням короткостроковим або постійним. Разом з антагоністом можуть вводитися інші сполуки, такі, як цитотоксичні агенти, хіміотерапевтичні агенти, імуносупресивні агенти та/або цитокіни. Комбіноване введення включає спільне введення при використанні окремих препаратів або однієї фармацевтичної композиції й послідовне введення в певному порядку, причому існує період часу, коли два (або всі) активні агенти одночасно проявляють свою біологічну активність. Для ревматоїдного артриту й інших аутоімунних захворювань антагоніст (наприклад, антитіло до CD20) може бути об'єднаний з одним або більше DMARDs, таких, як гідроксихлороквін, сульфазалазин, метотрексат, лефлуномід, азатіоприн, D-пеніциламін, Gold (перорально), Gold (внутрішньом'язово) міноциклін, циклоспорин, імуноадсорбент білок А стафілокока, внутрішньовенний імуноглобулін (IVIG), нестероїдні протизапальні засоби, глюкокортикоїди (наприклад, внутрішньосуглобовою ін'єкцією), кортикостероїди (наприклад, метилпреднізолон та/або преднізолон), фолат й ін. Переважно, інгібітор TNF-альфа не вводять ссавцеві під час лікування антагоністом CD 20. Крім використання білкового антагоніста, який вводять пацієнтові в терапевтичних цілях, даний винахід стосується застосування антагоніста для генної терапії. Таке застосування засноване на використанні нуклеїнової кислоти, яка кодує терапевтично ефективну кількість антагоніста. Див., наприклад, заявку WO 96/07321, опубл. 14 березня 1996 p., що стосується генної терапії, яка забезпечує синтез внутрішньоклітинних антитіл. Існують два основні підходи введення нуклеїнової кислоти (необов'язково вбудованої у вектор) у клітини пацієнта: in vivo й ex vivo. Для доставки нуклеїнової кислоти in vivo її безпосереднім чином ін'єкують пацієнтові, звичайно в ту ділянку, де потрібний вплив антагоніста. Для терапії ex vivo виділяють клітини пацієнта, вводять у них нуклеїнову кислоту й у такий спосіб модифіковані клітини назад вводять пацієнтові як безпосереднім чином або інкапсулюють у пористі мембрани, які імплантують в організм пацієнта (див., наприклад, патенти US 4 892 538 й 5 283 187). Для введення нуклеїнової кислоти в живі клітини існують різноманітні методи. їх вибір залежить від того, чи вводиться нуклеїнова кислота в культивовані 23 UA 99933 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 клітини in vitro або ж in vivo у клітини вибраного хазяїна. Методика, яка підходить для перенесення нуклеїнової кислоти в клітини ссавців in vitro, включає застосування ліпосом, електропорацію, мікроін'єкції, злиття клітин, а також DEAE-декстрановий і кальційфосфатпреципітуючий методи та багато інших. Звичайним вектором, який використовують для доставки потрібного гена в клітини in vivo, є ретровірусний вектор. Які використовують в цей час переважні технології перенесення нуклеїнових кислот in vivo включають трансфекцію за допомогою вірусних векторів (таких, як аденовірусні, аденоасоційовані й вектори на основі вірусу простого герпесу типу І) і систем, заснованих на ліпідах (корисними ліпідами для ліпідопосередкованої трансфекції генів є, наприклад, DOTMA, DOPE й DC-Chol). У деяких випадках бажано зв'язати нуклеїнову кислоту з агентом, який забезпечує її націлювання на потрібні клітини-мішені, наприклад, з антитілом, специфічним по відношенню до поверхневого мембранного клітинного білка на клітинах-мішенях, лігандом, який зв'язує рецептор на клітинах-мішенях і т.д. При використанні ліпосом для націлювання та/або забезпечення захоплення нуклеїнової кислоти можуть бути застосовані білки, які зв'язуються з поверхневим мембранним білком, асоційованим з ендоцитозом, наприклад, капсидні білки або їх фрагменти, які мають тропність по відношенню до певного типу клітин, антитіла до білків, які піддаються інтерналізації в процесі клітинного циклу, а також білки, які націлюють нуклеїнову кислоту на внутрішньоклітинну локалізацію й збільшують її період напівжиття в клітинах. Методика опосередкованого рецепторами ендоцитозу описана, наприклад, Wu et al, J. ВЫ. Chem. 262:4429-4432 (1987) і Wagner et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3410-3414 (1990). Для ознайомлення із сучасними методиками маркування генів і генної терапії див. огляд Anderson et al, Science 256:808-813 (1992), заявку WO 93/25673 і наведені в ній джерела інформації. Приклад 1 Пацієнтові з активним ревматоїдним артритом, у якого спостерігається неадекватна відповідь на один або декілька інгібіторів TNF  , проводиться лікування антитілом, яке зв'язується з поверхневим антигеном В-клітин CD20. Кандидатами для такої терапії, відповідно до даного прикладу, є пацієнти, у яких спостерігалася неадекватна відповідь на попередню або поточну терапію етанерсептом, інфліксимабом та/або адалімумабом, зв'язана з токсичністю або недостатньою ефективністю (етанерсепт > 3 місяців у дозі 25 мг два рази на тиждень або принаймні 4 інфузії інфліксимабу > 3 мг/кг) цих препаратів. Пацієнти при скринінгу й рандомізованих дослідженнях можуть мати значення показника припухлості суглобів (SJC) > 8 (досліджували 66 суглобів) і показника болючості суглобів (TJC) > 8 (досліджували 68 суглобів), а також значення С-реактивного білка >1.5 мг/дл (15 мг/л) або ШОЕ >28 мм/год., і/або ж рентгенологічні ознаки ураження принаймні одного суглоба у вигляді ерозій суглобової поверхні, що специфічно для ревматоїдного артриту й визначається в основних суглобах, які уражаються при ревматоїдному артриті (можна враховувати зміни в будь-яких суглобах кисті, зап'ястя й стоп, за винятком дистальних міжфалангових суглобів кисті). Для терапії можна використовувати антитіло до CD20, а саме ритуксимаб (комерційно доступний препарат компанії Genentech, Inc.) або гуманізоване антитіло 2Н7 v16. Пацієнтам вводять терапевтично ефективні дози антитіла до CD20, наприклад, 1000 мг 2 внутрішньовенно в дні 1 й 15, або 375 мг/м внутрішньовенно щотижня протягом 4 тижнів. Пацієнти також можуть одержувати супутню терапію МТХ (10-25 мг/на тиждень перорально або парентерально) разом з кортикостероїдами, включаючи метилпреднізолон у дозі 100 мг внутрішньовенно протягом 30 хвилин перед введенням антитіла до CD20 і преднізолон у дозі 60 мг перорально в дні лікування 2-7 й у дозі 30 мг перорально в дні лікування 8-14 з поверненням до основної дози з 16-го дня. Пацієнти також можуть одержувати фолат (5 мг на тиждень) в однократній дозі або розділеній на кілька прийомів. Протягом періоду лікування пацієнти можуть продовжувати одержувати базову терапію кортикостероїдами (< 10 мг преднізолону в день або його еквівалента). Первинним кінцевим результатом може бути пропорція числа пацієнтів з АСК20-відповіддю на 24-ому тижні, яка встановлюється при порівнянні групових відмінностей пацієнтів з використанням тесту Кохрана-Мантеля-Хензеля (СМН) у відношенні ревматоїдного фактора. Можливі вторинні кінцеві результати включають: 1. Пропорцію пацієнтів з ACR50 й ACR70 відповідями на 24-ому тижні. Ці пацієнти можуть бути досліджені, як й у випадку первинного кінцевого результату. 24 UA 99933 C2 5 10 15 20 25 2. Зміна показника активності захворювання (DAS) від початку скринінгу до 24-ого тижня. Це може бути зроблене при використанні комп'ютерної моделі ANOVA з базовою лінією DAS, ревматоїдним фактором й обробкою даних, як це передбачено розробником моделі. 3. Пацієнти з безумовним DAS (EULAR-відповідь) на 24-ому тижні. Такі пацієнти можуть бути виявлені при використанні тесту СМН у відношенні ревматоїдного фактора. 4. Зміни при скринінгу основних показників ACR (SJC, TJC, загальна оцінка пацієнтами і їх лікарями, HAQ, біль, С-реактивний білок, ШОЕ). Для цих параметрів може бути використана описова статистика. 5. Зміни при скринінгу за допомогою методики SF-36. Описова статистика може бути застосована для оцінки 8 доменів і ментальних і фізичних компонентів. Крім того, оцінка ментальних і фізичних компонентів далі може бути категоризована й піддана аналізу. 6. Зміна загального радіографічного показника в модифікації Шарпа, оцінка ерозії, оцінка ділянки, прилеглої до суглоба. Ці показники можуть бути проаналізовані при використанні методики тривалого спостереження й категоризації, як загальноприйнято. Діагностичні кінцеві результати й аналізи можуть включати: ACR (20/50/70 й ACR n) і зміна DAS на тижні 8, 12, 16, 20, 24 і далі можуть бути оцінені при використанні бінарної моделі або моделі, заснованої на постійно повторюваних вимірюваннях, як загальноприйнято. Діагностичний радіографічний аналіз, який включає визначення пропорції пацієнтів, які не мають прогресивного розвитку ерозій, може бути проведений на 24-ому тижні й далі. Інші діагностичні кінцеві результати (наприклад, повна клінічна відповідь, період відсутності захворювання) можуть бути проаналізовані за допомогою описової статистики як складової частини досліджень під час продовженого періоду спостереження. Зміни при скринінгу втоми (методика FACIT-F) можуть бути проаналізовані за допомогою описової статистики. Терапія РА антитілом до CD20 по відношенню до пацієнтів з неадекватною відповіддю на інгібітор TNF  , описана вище, може привести до поліпшеного клінічного стану відповідно до одного або більше показників кінцевих результатів, розкритими раніше в даній заявці. 25 UA 99933 C2 26 UA 99933 C2 27 UA 99933 C2 5 28