Лікування аутоімунних захворювань у пацієнта з неадекватною відповіддю на інгібітор tnf-альфа

1. Спосіб лікування ревматоїдного артриту в ссавця з неадекватною реакцією на інгібітор TNFα, який полягає у введенні такому ссавцеві двох доз по 1000 мг антитіла, яке зв'язується з CD20 і яке, будучи зв'язаним з CD20, знищує або зменшує Вклітини в організмі ссавця, де перша доза вводиться у 1-ий день лікування, а друга доза - на 15ий день. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що в ньому ссавцем є людина. 3. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що в ньому антитіло не кон'юговане із цитотоксичним агентом. 4. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що в ньому антитілом є ритуксимаб. C2 2 UA 1 3 91961 4 лімфоцитів: В-лімфоцити (В-клітини) і Т-лімфоцити плазматичні клітини (Nadler, L., Типування лімфо(Т-клітини). Найбільший інтерес представляють Вцитів II, 2:3-37 і Додаток; Renling et al.,. eds. (1986), клітини. Springer Verlag). На відміну від CD20, антитіло, яке В-клітини дозрівають у кістковому мозку й зазв'язується з CD19, викликає інтерналізацію CD19 лишають його, експресуючи на своїй поверхні анантигену. CD19 антиген серед інших розпізнається тигензв'язувальне антитіло. Коли нативна Вантитілом HD237-CD19 (яке також називається клітина вперше зустрічається з антигеном, по від"В4" антитілом) (Kiesel et al., Дослідження лейкозу ношенню до якого експресоване на її поверхні II, 12:1119 (1987)). Антиген CD19 виявляється в 4антитіло є специфічним, вона починає швидко 8% мононуклеарних клітин периферичної крові й ділитися і її потомство диференціюється в Вбільше ніж в 90% В-клітин, виділених з перифериклітини пам'яті й ефекторні клітини, який називачної крові, селезінки, лімфатичного вузла або мигються "плазматичними клітинами". В-клітини падалини. CD19 не визначається в Т-клітинах перим'яті мають більший час життя й продовжують ексферичної крові, моноцитів або гранулоцитів. пресувати зв'язане з мембраною антитіло тієї ж Практично всі Т-клітинні гострі лімфобластні лейспецифічності, що й батьківські клітини. Плазматикози (ALL), B-клітинні хронічні лімфоцитарні лейкочні клітини не продукують зв'язане з мембраною зи (CLL) і В-клітинні лімфоми експресують CD19, антитіло, але замість цього синтезують антитіло в який розпізнається В4 антитілом (Nadler et al., J. секретованій формі. Секреторні антитіла є основImmunol. 131:244 (1983), а також Nadler et al. у ними ефекторними молекулами гуморального імуроботі "Прогрес у гематології" Vol. XII pp. 187-206. нітету. Brown, E. ed. (1981), Grune & Stratton, Inc.). СD20-антиген (який також називається рестКрім того, виділені додаткові антитіла, які розриктивним диференціювальним антигеном Впізнають антигени, специфічні для кожного етапу лімфоцитів людини, Вр35) являє собою гідрофобдиференціювання В-клітинної лінії. Серед них моний трансмембранний білок з молекулярною мажна вказати на антитіло В2 до антигену CD21; ансою приблизно 35 kD, який експресується перед-В титіло В3 до антигену CD22 й антитіло J5 до антиі зрілими В-лімфоцитами (Valentine et al., J. Biol. гену CD10 (яке також називається СALLА). Див. Chem. 264(19):11282-11287(1989); і Einfeld et al., патент US No. 5595721 від 21 січня 1997 p. EMBO J. 7(3):711-717(1988)). Вказаний антиген (Kaminski et al.). також експресується більше, ніж 90% В-клітин неРитуксимаб (RITUXAN ) являє собою генноходжкінських лімфом (NHL) (Anderson et al., Blood інженерне химерне моноклональне антитіло типу 63(6):1424-1433 (1984)), але не виявляється на "людина/миша", направлене проти антигену CD20. поверхні гемопоетичних стовбурних клітин, про-ВУ патенті US No. 5,736,137 від 7 квітня 1998 p. клітин, нормальних плазматичних клітин або інших (Anderson et al.) ритуксимаб фігурує під назвою клітин здорових тканин (Tedder et al., J. Immunol. "С2В8". RITUXAN призначений для лікування 135(2):973-979(1985)). CD20 регулює ранній(ранні) пацієнтів з рецидивуючою або резистентною низьетап(и) процесу активації ініціації клітинного циклу кодиференційованою або фолікулярною CD20 й диференціювання (Tedder et al., supra) і, можлипозитивною В-клітинною неходжкінською лімфово, функціонує як кальцієвий іонний канал (Tedder мою. Дослідження механізму дії in vitro показали, et al J,. Cell. Biochem. 14D:195(1990)). що RITUXAN зв'язується із системою комплемеВстановлена експресія CD20 В-клітинами лінту людини й руйнує лімфоїдні В-клітинні лінії за мфом дозволяє розглядати цей антиген як потендопомогою комплемент-опосередкованої цитотокційну "мішень" для впливу на відповідні лімфоми. сичності (CDC, від англ. Complement-Dependent У принципі, це можна представити в такий спосіб: Cytotoxicity) (Reff et al., Blood 83(2):435-445(1994)). пацієнтові вводять антитіла, специфічні по відноКрім того, він має значну активність у дослідженшенню до поверхневого антигену В-клітин CD20. нях антитіло залежної клітинно-опосередкованої Ці анти-CD20-антитіла специфічно зв'язуються з цитотоксичності (ADCC, від англ. AntibodyCD20 антигеном, швидше за все,як нормальних, Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity). Недавно в так і злоякісних В-клітин; антитіло, яке зв'язалося з експериментах з включення клітинами міченого поверхневим CD20 антигеном, може забезпечуватритієм тимідину було показано, що RITUXAN ти руйнування й зменшення числа неопластичних має анти-проліферативний ефект і здатний безпоВ-клітин. Крім того, хімічні агенти або радіоактивні середньо викликати апоптоз клітин, у той час як мітки, які мають здатність руйнувати пухлину, моінші анти-CD19 й анти-CD20 антитіла цих властижуть бути кон'юговані з анти-CD20-антитілом тавостей не мають (Maloney et al., Blood 88(10):637a ким чином, що агент цілеспрямовано "доставля(1996)). Також експериментально був встановлеється" безпосередньо до неопластичних В-клітин. ний синергізм у дії RITUXAN , препаратів для хіНезалежно від підходу, основною метою є руйнуміотерапії й токсинів. Зокрема, RITUXAN сенсивання пухлини; специфічний підхід може полягати білізує лікарсько-стійкі В-клітинні лінії лімфом до в застосуванні певного анти-CD20 антитіла, і, отцитотоксичного ефекту доксорубіцину, CDDP, VPже, можливі підходи для впливу на CD20 антиген 16, дифтерійного токсину й рицину (Demidem et al., можуть значно відрізнятися. Хіміотерапія й радіофармацевтика ракових захвоCD19 являє собою інший поверхневий антирювань 12(3):177-186(1997)). Передклінічні досліген, який експресується В-клітинами. Як й CD20, дження in vivo показали, що RITUXAN сприяє CD19 виявляється на поверхні В-клітин на всіх зникненню В-клітин з периферичної крові, лімфаетапах їх диференціювання, починаючи від стовтичних вузлів і кісткового мозку в мавп циномолбурної клітини й закінчуючи клітиною, яка безпосегус, очевидно, за допомогою опосередкованих редньо передує кінцевій стадії диференціювання в 5 91961 6 комплементом й антитілами процесів (Reff et al., 22 хворих на ревматоїдний артрит" Ann Rheum Dis Blood 83(2):435-445 (1994)). 61:833-888 (2002); Leandro et al., "Виснаження ліПатенти й заявки на патенти, які стосуються мфоцитів при ревматоїдному артриті: безпека, антитіл до CD20, включають патенти US 5776456, ефективність і дозова відповідь" Arthritis and 5736137, 6399061 й 5843439, а також заявки на Rheumatism 44(9):S370 (2001); Leandro et al., "Відпатент US US2002/0197255 Α1 й US2003/0021781 крите дослідження виснаження В-лімфоцитів при A1 (Anderson et al.); патент US No. 6 455 043B1 і системному червоному вовчаку" Arthritis and заявку WO00/09160 (Grillo-Lopez.A.); заявку Rheumatism 46(1):2673-2677 (2002); Edwards and WO00/27428 (Grillo-Lopez and White); заявку Cambridge, "Тривале поліпшення при ревматоїдWO00/27433 (Grillo-Lopez and Leonard); заявку ному артриті при використанні методики виснаWO00/44788 (Braslawsky et al.); заявку ження В-лімфоцитів" Rhematology 40:2050211 WO01/10462 (Rastetter, W.); заявку WO01/10461 (2001); Edwards et al., "Терапія, заснована на ви(Rastetter and White); заявку WO01/10460 (White снаженні В-лімфоцитів, при ревматоїдному артриті and Grillo-Lopez); заявку на патент US та інших аутоімунних захворюваннях" Biochem. US2002/0006404 A1 і заявку WO02/04021 (Hanna Soc. Trans. 30(4):824-828 (2002); Edwards et al., and Hariharan); заявку на патент US "Ефективність і безпека ритуксимабу, химерного US2002/0012665 A1 і заявку WO01/74388 (Hanna, моноклонального антитіла, направленого до ВΝ.); заявку на патент US US2002/0009444 Α1 і заяклітин: рандомізовані, контрольовані за допомогою вку WO01/80884 (Grillo-Lopez, Α.); заявку плацебо дослідження хворих на ревматоїдний WO01/97858 (White, С); заявку на патент US артрит" Arthritis and Rheumatism 46(9):S197 (2002); US2002/0128488 Α1 і заявку WO02/34790 (Reff, Levine й Pestronk, "Зв'язані з IgM-антитілами поліM.); заявку WO02/060955 (Braslawsky et al.); заявку нейропатії: хіміотерапія, заснована на виснаженні WO02/096948 (Braslawsky et al.); заявку В-клітин, при використанні ритуксимабу" Neurology WO02/079255 (Reff and Davies); патент US No. 52:1701-1704 (1999); DeVita et al., "Ефективність 6171586 B1 і заявку WO98/56418 (Lam et al.); заяввибірної блокади В-клітин при терапії ревматоїдку WO98/58964 (Raju, S.); заявку WO99/22764 ного артриту" Arthritis and Rheumatism 46:2029(Raju, S.); заявку WO99/51642 і патенти US No. 2033 (2002); Hidashida et al., "Лікування DMARD6194551 B1, 6242195 B1, 6528624 B1, 6538124 B1 рефрактерного ревматоїдного артриту ритуксима(Idusogie et al.); заявку WO00/42072 (Presta, L.); бом" Annual Scientific Meeting of the American заявку WO00/67796 (Curd et al.); заявку College of Rheumatology; Жовтень 24-29; Новий WO01/03734 (Grillo-Lopez et al.); заявку на патент Орлеан, LA 2002; Tuscano, J., "Успішне лікування US US2002/0004587 A1 і заявку WO01/77342 (Miller інфліксімаб-рефрактерного ревматоїдного артриту and Presta); заявку на патент US US2002/0197256 ритуксимабом" Annual Scientific Meeting of the A1 (Grewal, І.); патенти US No. 6090365 В1, American College of Rheumatology; Жовтень 24-29; 6287537 В1, 6015542 В1, 5843398 B1 й 5595721 B1 Новий Орлеан, LA 2002. (Kaminski et al.); патенти US No. 5500362 В1, Ревматоїдний артрит (РА) являє собою аутоі5677180 В1, 5721108 B1 й 6120767 B1 (Robinson et мунне захворювання невідомої етіології. У більшоal.); патент US No. 6410391 B1 (Raubitschek et al.); сті пацієнтів, які страждають від хронічного РА, патент US No. 6244866 В1 і заявку WO00/20864 навіть при належній терапії, можуть відбуватися (Barbera-Guillem, E.); заявку WO01/13945 (Barberaпрогресивне руйнування суглобів, їх деформація, Guillem, E.); заявку WO00/67795 (Goldenberg); порушення багатьох функцій і навіть передчасна WO00/74718 (Goldenberg й Hansen); заявку смерть. Більше дев'яти мільйонів хворих на ревWO00/76542 (Golay et al.); заявку WO01/72333 матоїдний артрит відвідують лікарів і більше (Wolin й Rosenblatt); патент US No. 6368596 B1 250000 пацієнтів щорічно піддаються госпіталіза(Ghetie et al.); заявку на патент US No. ції. Завдання терапії РА полягають у запобіганні US2002/0041847 A1 (Goldenberg, D.); заявку на або контролюванні пошкоджень суглобів, запобіпатент US No. US2003/0026801 A1 (Weiner й ганні втрати їх функції й зменшенні болю. ПервинHartmann); заявку WO02/102312 (Engleman, E.), які на терапія ΡА звичайно включає застосування наведені тут як посилання. Див. також патент US одного або декількох наступних лікарських засобів: No. 5849898 і заявку ЕР No. 330191 (Seed et al.); нестероїдних протизапальних препаратів патент US No. 4861579 і заявку ЕР 332865 А2 (NSAIDs), глюкокортикоїдів (внутрішньосуглобові (Meyer й Weiss) і заявку WO95/03770 (Bhat et al.). ін'єкції) і преднізолону в низьких дозах. Див. "ПосіДо опублікованих джерел інформації, у яких бник з лікування ревматоїдного артриту" Arthritis розкрита терапія при використанні ритуксимабу, and Rheumatism 46(2):328-346 (Лютий 2002). До належать наступні: Perotta й Abuel "Відповідь у більшої частини пацієнтів із заново діагностованим хворих із хронічно рецидивуючою ідіопатичною РА застосовується антиревматична лікарська тромбоцитопенічною пурпурою на ритуксимаб (DMARD) терапія, яка модіфікує захворювання, протягом 10 років його застосування" Реферат # протягом трьох місяців з моменту постановки діаг3360, Blood 10(1) (частина 1-2):стор. 88У; Stashi et нозу. Під час DMARD-терапії РА звичайно викориal.,. "Лікування дорослих хворих із хронічною ідіостовують гідроксихлороквін, сульфазалазин, метопатичною тромбоцитопенічною пурпурою при витрексат, лефлуномід, етанерсепт, інфліксимаб користанні химерного моноклонального антитіла (разом з метотрексатом, який вводять перорально до CD20 (ритуксимабу)" Blood 98(4):952-957 й підшкірно), азатіоприн, D-пеніциламін, Gold (пе(2001); Matthews, R., "Медичні єретики" New рорально), Gold (внутрішньом'язово), міноциклін, Scientist (7 Квітня; 2001); Leandro et al., "Клінічний циклоспорин, імуноадсорбований білок А стафілорезультат терапії з виснаженням В-лімфоцитів в коків. 7 91961 8 Оскільки при захворюванні РА в організмі хвоТермін "фактор некрозу пухлин альфа рого синтезується фактор некрозу пухлин альфа (TNF )", який використовується у даному описі, (TNF ), інгібітори TNF використовуються для стосується молекули TNF людини, яка має амінолікування вказаного захворювання. кислотну послідовність, описану Реnnіса et al., Етанерсепт (ENBREL ) являє собою ін'єкційNature 312:721(1984) або Aggarwal et al., JBC ний лікарський препарат, який дозволений в US 260:2345(1985). для лікування активної форми РА. Етанерсепт Термін "інгібітор TNF ", який використовується зв'язується з TNF і видаляє його більшу частину у даному описі, стосується агента, який до деякої із суглобів і крові, тим самим, запобігаючи розвитміри інгібує біологічну функцію TNF , головним ку запалення й інших симптомів РА, обумовлене чином, шляхом зв'язування з TNF і нейтралізації TNF . Етанерсепт є імуноадгезивним білком злитйого активності. Прикладами інгібіторів TNF , які тя, який складається з позаклітинної ділянки рецеспеціальним чином розглядаються тут, є етанерптора фактора некрозу пухлин людини (TNFR) септ (ENBREL ), інфліксимаб (REMICADE ) і мол. маси 75 kD (р75), яка зв'язує ліганд, з'єднаної адалімумаб (HUMIRA ). з Fc-ділянкою lgG1 людини. Цей лікарський препаТермін "неадекватна відповідь на інгібітор рат має ряд побічних ефектів, у тому числі може TNF " означає неадекватну відповідь на попередвикликати серйозні інфекції й сепсис, розлади ненє або поточне лікування інгібітором TNF , зв'язарвової системи, такі, як розсіяний склероз (МС). не з токсичністю лікарських препаратів та/або з Див., наприклад, www.remicadeнедостатньою ефективністю лікування. Неадекваinfliximab.com/pages/enbrel_embrel.html. тна відповідь може бути визначена лікарем, який Інфліксимаб, який надходить у продаж під тормає певний досвід у даній галузі. говельним найменуванням REMICADE , являє Ссавцями, у яких під час попереднього або пособою імуносупресорний лікарський препарат, точного лікування інгібітор TNF проявляв або призначений для лікування РА й хвороби Крона. проявляє "токсичність", є такі ссавці, у яких споІнфліксимаб являє собою химерне моноклональне стерігалися або спостерігаються один або декілька антитіло, яке цілеспрямовано зв'язується з TNF в небажаних побічних ефектів, таких, як інфекції організмі хворого й зменшує зумовлене TNF за(головним чином, важкі інфекції), застійна серцева палення. Показано взаємозв'язок інфліксимабу з недостатність, демієлінізація (яка приводить до летальними процесами, наприклад, серцевою нерозвитку МС), гіперчутливість, неврологічна симпдостатністю й інфекційними захворюваннями, у томатика, аутоімунізація, неходжкінська лімфома, тому числі туберкульозом, а також демієлінізацією, туберкульоз (ТВ), утворення аутоантитіл, і т.д. яка приводить до МС. У ссавців з "неадекватною ефективністю" збеУ грудні 2002 р. компанія Abbott Laboratories рігалися прояви активної форми захворювання під одержала дозвіл FDA на випуск препарату адалічас попереднього або поточного лікування інгібімумаб (HUMIRA ), до цього відомого під назвою тором TNF . Наприклад, у пацієнта може зберігаD2E7. Адалімумаб являє собою моноклональне тися активний процес після одного або трьох місяантитіло людини, яке зв'язується з TNF , для якоців лікування інгібітором TNF . го було показано, що воно здатне знижувати проПід терміном "зниження ризику розвитку негаяви й симптоми, а також сповільнювати прогреситивних побічних ефектів" мається на увазі зниженвний розвиток структурних змін у дорослих людей, ня ризику розвитку побічних ефектів, які виникають хворих на РА від середньої до важкої форми, які у результаті лікування антагоністом, який зв'язувиявляють недостатню відповідь на традиційну ється з поверхневим маркером В-клітин, до рівня терапію DMARD. нижче того, який спостерігається при лікуванні Суть винаходу інгібітором TNF . Такі побічні ефекти включають Даний винахід, у першу чергу, стосується споінфекції (головним чином, важкі інфекції), серцеву собу лікування аутоімунних захворювань у ссавця недостатність і демієлінізацію (розсіяний склероз) і з неадекватною відповіддю на інгібітор TNF , який т.д. полягає у введенні такому ссавцеві терапевтично Термін "поверхневий маркер В-клітин", який ефективної кількості антагоніста, який зв'язується використовується у даному описі, стосується антиз поверхневим маркером В-клітин. гену, який експресується на поверхні В-клітин, що Наприклад, даний винахід стосується способу є "мішенню" для дії антагоніста, який з ним зв'язулікування ревматоїдного артриту в ссавця з неається. Прикладами поверхневих маркерів В-клітин декватною відповіддю на інгібітор TNF , який поможуть служити CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, лягає у введенні такому ссавцеві ефективної теCD23, CD24, CD37, CD40, CD53, CD72, CD73, рапевтичної кількості антитіла, яке зв'язується з CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, Cd79a, CD20. CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85 й Крім того, даний винахід стосується способу CD86 лейкоцитарні поверхневі маркери. Поверхзниження ризику розвитку негативних побічних невим маркером В-клітин, які представляють осоефектів, включаючи інфекції, серцеву недостатбливий інтерес, є такий маркер, який експресуєтьність і демієлінізацію, який полягає у введенні ссася переважно В-клітинами в порівнянні з іншими вцеві з аутоімунним захворюванням терапевтично не-В-клітинними тканинами ссавців, причому як ефективної кількості антагоніста, який зв'язується попередниками В-клітин, так і зрілими В-клітинами. з поверхневим маркером В-клітин. Відповідно до одного варіанта здійснення даного Докладний опис винаходу винаходу, маркером є CD20 або CD19, який виявІ. Визначення ляється на поверхні В-клітин на всіх етапах їх ди 9 91961 10 ференціювання, починаючи зі стовбурної клітини Versus Host Desease), пухирчатка бульозна, пухиаж до клітини, яке безпосередньо передує кінцевій рчатка, аутоімунні поліендокринопатії, синдром стадії диференціювання в плазматичні клітини. Рейтера, синдром "дерев'яної людини", гігантокліПереважним поверхневим маркером В-клітин є тинний артеріїт, імунокомплексний нефрит, IgA CD20. нефропатія, IgM полінейропатії або опосередковаАнтиген "CD20" - це неглікозилований фосфоні IgM нейропатії, ідіопатична тромбоцитопенічна протеїн з молекулярною вагою ~35 kDа, який випурпура (ІТР, від англ. Idiopathic Thrombocytopenic являється на поверхні більше, ніж 90% В-клітин Purpura), тромботична тромбоцитопенічна пурпура периферичної крові або лімфоїдних органів. CD20 (ТТР, від англ. Thrombotic Thrombocytopenic експресується ранніми попередниками В-клітин і Purpura), аутоімунна тромбоцитопенія, аутоімунні зберігається аж до кінцевої стадії диференціюванзахворювання яєчок й яєчників, включаючи аутоіня в плазматичні клітини. CD20 виявляється на мунний орхіт й оофорит, первинний гіпотиреоїповерхні як нормальних, так і злоякісних В-клітин. дизм, аутоімунні ендокринні захворювання, вклюІншими назвами CD20, які зустрічаються в літерачаючи аутоімунний тиреоїдит, хронічний тиреоїдит турі, є "В-лімфоцитарний рестриктивний антиген" й (тиреоїдит Хашимото), підгострий тиреоїдит, ідіо"Вр35". Антиген CD20 описаний, наприклад, Clark патичний гіпотиреоїдизм, хвороба Адісона, хвороet al., PNAS (USA) 82:1766 (1985). ба Грейвса, аутоімунний полігландулярний синдТермін "аутоімунне захворювання", який викором (або синдроми полігландулярної ристовується у даному описі, стосується захворюендокринопатії), діабет І типу, який також називавання або патологічного стану, що виникає у власється інсулінзалежним цукровим діабетом (IDDM, них тканинах організму, і спрямованому проти них. від англ. Insulin-Dependent Diabetes Mellitus) і синПрикладами аутоімунних захворювань або патолодром Шихана, аутоімунний гепатит, лімфоїдний гічних станів є (без обмежень вказаними) артрит інтерстиціальний пневмоніт (HIV), облітеруючий (ревматоїдний артрит, хвороба Стілла, остеоартбронхіоліт (нетрансплантаційний) на противагу рит, псоріатичний артрит), псоріаз, дерматит, поNSIP, синдром Гієйна-Барре, васкуліти великих ліміозит/дерматоміозит, токсичний епідермальний судин (включаючи ревматичну поліміалгію й гіганнекроліз, системна склеродермія й системний токлітинний артеріїт (хвороба Такаясу), васкуліти склероз, імунні відповіді, зв'язані із запальними судин середнього діаметра (включаючи хворобу захворюваннями кишечнику, хвороба Крона, вираКавасакі й вузликовий поліартеріїт), анкілозуючий зковий коліт, респіраторний дистрес-синдром, респондиліт, хвороба Бергера (IgA нефропатія), спіраторний дистрес-синдром дорослих (ARDS, від швидко прогресуючий гломерулонефрит, первинангл. Adult Respiratory Distress Syndrome), менінгіт, ний біліарний цироз, целіакія (глютенова ентероенцефаліт, увеїт, коліт, гломерулонефрит, алергіпатія), кріоглобулінемія, бічний аміотрофічний чні стани, екзема, астма, стани, які супроводжусклероз (ALS, від англ. Amyotrophic Lateral ються Т-клітинною інфільтрацією й хронічною заSclerosis), ішемічна хвороба серця й ін. пальною відповіддю, атеросклероз, аутоімунний Термін "антагоніст" означає молекулу, яка при міокардит, порушення адгезії лейкоцитів, системзв'язуванні з поверхневим маркером В-клітин, руйний червоний вовчак (SLE, від англ. System Lupus нує В-клітини або знижує їх кількість в організмі Erythernatosus), ювенільний діабет, розсіяний ссавців та/або перешкоджає реалізації однієї або склероз, алергічний енцефаломієліт, імунні відподекількох функцій В-клітин, наприклад, шляхом віді, зв'язані з реакцією гіперчутливості негайного запобігання або зниження рівня гуморальної імунй сповільненого типів, опосередкованої цитокінами ної відповіді, забезпечуваної В-клітинами. Перей Т-лімфоцитами, туберкульоз, саркоїдоз, грануважно, антагоніст має здатність виснажувати пул ломатоз, включаючи грануломатоз Вегенера, агВ-клітин (тобто знижувати рівень циркулюючих Вранулоцитоз, васкуліт (включаючи ANCA), апласклітин) у ссавців, які одержують його як лікарський тична анемія, анемія Дайємонда-Блекфена, імунна засіб. Таке зниження може бути досягнуте за догемолітична анемія, включаючи аутоімунну гемоліпомогою здійснення декількох механізмів, таких, як тичну анемію (АІНА, від англ. Autoimmune антитілозалежна клітинно-опосередкована цитотоHemolytic Anemia), перніциозна анемія, справжня ксичність (ADCC) і/або комплементопосередковаеритроцитарна аплазія (PRCA, від англ. Pure Red на цитотоксичність (CDC), інгібування проліфераCell Aplasia), недостатність фактора VIII, гемофілія ції В-клітин та/або індукування загибелі В-клітин А, аутоімунна нейтропенія, панцитопенія, лейко(наприклад, шляхом апоптозу). До антагоністів, які пенія, захворювання, асоційовані з діапедезом розглядаються у рамках даного винаходу, налелейкоцитів, запальні захворювання центральної жать антитіла, синтетичні або нативні пептидні нервової системи (CNS, від англ. Central Nervous послідовності й невеликі молекули антагоністів, які System), синдром множинного ураження органів, зв'язуються з поверхневим маркером В-клітин, міастенія гравіс, захворювання, опосередковані необов'язково кон'юговані або злиті із цитотоксичкомплексом антиген-антитіло, захворювання, зв'яним агентом. Переважним антагоністом є антитіло. зані з утворенням антигломерулярних антитіл у Терміни "антитілозалежна клітиннобазальній мембрані, антифосфоліпідний синдром, опосередкована цитотоксичність" й "ADCC" ознаалергічний нейрит, хвороба Бехчета, синдром Качають опосередковувану клітинами реакцію, у якій стельмана, синдром Гудпасчера, міастенічний неспецифічні цитотоксичні клітини, які експресусиндром Ламберта-Ітона, Синдром Рейно, синдють рецептори Fc (FcRs) [наприклад, натуральні ром Шегрена, синдром Стівенса-Джонсона, реаккілери (NK), нейтрофіли й макрофаги], розпізнають ція відторгнення трансплантата, реакція "транспзв'язане антитіло на клітині-мішені й потім лізують лантат проти хазяїна" (GVHD, від англ. Graft таку клітину-мішень. Основні клітини, які опосере 11 91961 12 дковують ADCC, а саме натуральні кілери, експреклад, як описано Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163(1996). сують лише Fc RIII, у той час як моноцити експреДо антагоністів, "які інгібують ріст", належать сують Fc RI, Fc RII й FcRIII. Експресія FcR гемоантагоністи, які запобігають або знижують проліпоетичними клітинами узагальнена в Таблиці 3 на ферацію клітин, що експресують антиген, з яким стор. 464 у роботі Ravetch й Kinet, Annu. Rev. зв'язуються ці антагоністи. Наприклад, антагоніст Immunol. 9:457-92(1991). Для оцінки активності може запобігати або знижувати проліферацію Вмолекули, яке представляє інтерес, у відношенні клітин in vitro та/або in vivo. ADCC можна здійснити аналіз ADCC in vitro, як До антагоністів, "які індукують апоптоз", налеописано в патенті US No. 5500362 або 5821337. жать такі антагоністи, які індукують запрограмоваПідходящими ефекторними клітинами для такого ну клітинну загибель, наприклад, загибель Ваналізу є мононуклеарні клітини периферичної клітин, що визначається в стандартних дослідженкрові (РВМС) і натуральні кілери (NK). Альтернанях апоптозу, таких, як зв'язування аннексину V, тивно або додатково оцінка активності молекули, фрагментація ДНК, зморщування клітин, дилатація яка представляє інтерес, у відношенні ADCC може ендоплазматичного ретикулума, клітинна фрагмебути здійснена in vivo, наприклад, на модельній нтація та/або формування мембранних везикул тварині, як це описано Clynes et al.,. PNAS (USA) (які також називають тільцями апоптозу). 95:652-656(1998). Термін "антитіло", який використовується у "Ефекторні клітини людини" - це лейкоцити, які даному описі, має дуже широке значення, і спеціаекспресують один або більше FcRs і виконують льним чином стосується інтактних моноклональефекторні функції. Переважно, клітини експресуних антитіл, поліклональних антитіл, мультиспеють, принаймні, FcRIII і виконують ефекторну фунцифічних антитіл (наприклад, біспецифічних кцію у відношенні ADCC. Прикладами лейкоцитів антитіл), сконструйованих, принаймні, на основі людини, які опосередковують ADCC, є мононукледвох інтактних антитіл, і фрагментів антитіл за арні клітини периферичної крові (РВМС), натураумови, що вони мають необхідну біологічну активльні кілери (NK), моноцити, цитотоксичні Т-клітини ність. й нейтрофіли; найбільш переважними є PBMCs й Термін "фрагменти антитіл" стосується ділянок NK. інтактних антитіл, переважно, які містять антигензТермін "Fc рецептор" або "FcR" використовув'язу вальну ділянку. Прикладами фрагментів анється для опису рецептора, який зв'язується з Fcтитіл є Fab, Fab', F(ab')2 й Fv фрагменти; діатіла; ділянкою молекули антитіла. Переважним FcR є лінійні антитіла; одноланцюгові молекули антитіл і нативна послідовність FcR антитіла людини. Крім мультиспецифічні антитіла, сконструйовані з антитого, переважним FcR є такий рецептор, який зв'ятільних фрагментів. зується з антитілом IgG (гамма-рецептор). До вкаТермін "нативні антитіла" звичайно використозаного FcR належать рецептори Fc RI, Fc RII й вується по відношенню до гетеротетрамерних гліFc RIII підкласів, у тому числі їх алельні варіанти й копротеїнів з молекулярною масою близько рецептори, отримані в результаті альтернативного 150000 Дальтон, які складаєються із двох ідентичсплайсингу. Fc RII рецептори включають Fc RIIA них легких (L) ланцюгів і двох ідентичних важких ("активуючий рецептор") і Fc RIIB ("інгібуючий реланцюгів (Н). Кожен легкий ланцюг зв'язаний з цептор"), які мають подібні амінокислотні послідоважким ланцюгом за допомогою ковалентного дивності, які відрізняються, головним чином, тільки в сульфідного зв'язку, при цьому число дисульфідцитоплазматичних доменах. Активуючий рецепних зв'язків у важких ланцюгах змінються залежно тор, Fc RIIA у своєму цитоплазматичному домені від ідиотипу імуноглобуліну. Кожен важкий і легкий містить імунорецепторну, засновану на тирозині ланцюг також має симетрично розташовані дисуактивуючу структуру (ITAM). Інгібуючий рецептор льфідні містки. Кожен важкий ланцюг на одному Fc RIIB у своєму цитоплазматичному домені міскінці має варіабельний домен (VH), за яким розтатить імунорецепторну, засновану на тирозині інгішовані декілька константних доменів. Кожен легбуючу структуру (ІТІМ). (див. Daëron, Annu. Rev. кий ланцюг має варіабельний домен (VL) на одноImmunol. 15:203-234 (1997)). FcRs описані Ravetch му кінці й константний домен на іншому кінці; й Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92(1991); Capel константний домен легкого ланцюга розташований et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); і de Haas et на одній лінії з першим константним доменом важal., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41(1995). Інші FcRs, кого ланцюга, а варіабельний домен легкого ланвключаючи ті, які будуть ідентифіковані в майбутцюга знаходиться на одній лінії з варіабельним ньому, тут об'єднані загальним терміном "FcR". доменом важкого ланцюга. Вважається, що конЦей термін також стосується неонатального рецетакт між варіабельними доменами легкого й важптора FcRn, який відповідає за передачу материнкого ланцюгів забезпечується певними амінокисського IgGs плоду (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 лотними залишками. (1976) і Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)). Термін "варіабельний" означає те, що послі"Комплементопосередкована цитотоксичність" довності певних ділянок варіабельних доменів або "CDC" означає здатність молекули лізувати різних антитіл значно відрізняються між собою й "мішень" у присутності комплементу. Каскад реакзабезпечують специфічність зв'язування кожного цій активації комплементу ініціюється зв'язуванням антитіла зі своїм певним антигеном. Однак варіапершого компонента системи комплементу (C1q) з бельність не розподілена випадковим чином серед молекулою (наприклад, антитілом) у комплексі з варіабельних доменів антитіл. Вона сконцентророзпізнаваним антигеном. Для оцінки активності вана в трьох сегментах, які називаються гіперварікомплементу можна здійснити аналіз CDC, наприабельними ділянками, розташованих у варіабель 13 91961 14 них доменах, як легких, так і важких ланцюгів. одного із двох існуючих типів, які позначаються Найбільш консервативні ділянки варіабельних каппа ( ) і лямбда ( ), що засновано на амінокисдоменів називаються каркасними ділянками (FRs). лотній послідовності константних доменів. Всі варіабельні домени нативних важких і легких Залежно від амінокислотної послідовності конланцюгів мають чотири FRs, які забезпечують стантних доменів важких ланцюгів антитіла москладчасту структуру й зв'язані трьома гіперваріажуть бути розділені на різні класи. Існує п'ять осбельними ділянками, які формують петлі, і, у деновних класів інтактних антитіл: IgA, IgD, IgE, IgG й IgM, причому деякі з них, у свою чергу, також мояких випадках, частину -складчастої структури. жуть бути розділені на підкласи (ідіотипи), наприГіперваріабельні ділянки в кожному ланцюзі тісно клад, lgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 й IgA2. Констанзв'язані між собою за допомогою FRs, а також з тні домени важких ланцюгів, які відповідають гіперваріабельними ділянками іншого ланцюга й беруть участь у формуванні антигензв'язувальної різним класам антитіл, позначаються , , , і , ділянки антитіла (див. Kabat et al., Послідовності відповідно. Крім того, добре вивчена структура імунологічно важливих білків, 5th Ed. Public Health окремих субодиниць і три можливі просторові Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. конфігурації різних класів імуноглобулінів. (1991)). Константні домени безпосередньо не бе"Одноланцюгові Fv" або "scFv" фрагменти анруть участь у зв'язуванні антитіла з антигеном, але титіл включають VH й VL домени антитіл, при цьовиконують різні ефекторні функції, такі, як забезму вказані домени знаходяться в одному поліпеппечення антитіло залежної цитотоксичності тидному ланцюзі. Переважно, Fv поліпептиди (ADCC). також мають поліпептидний лінкер між VH й VL доРозщеплення антитіл папаїном приводить до менами, який забезпечує формування необхідної утворення двох ідентичних антигензв'язувальних для зв'язування антигену конфігурації scFv. Для фрагментів, які називаються "Fab''-фрагментами, більш докладного ознайомлення див. Plückthun, кожний з яких містить одну антигензв'язувальну Фармакологія моноклональнга антитіл vol. 113, ділянку, і залишкового "Fc''-фрагмента, назва якоRosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New го відображає його здатність до швидкої кристаліYork, pp. 269-315 (1994). зації. Обробка пепсином приводить до одержання Термін "діатіла" стосується невеликих фрагF(ab')2-фрагмента, які має дві антигензв'язу вальні ментів антитіл із двома антигензв'язувальними ділянки й усе ще має здатність до перехресного ділянками, які включають варіабельний домен зв'язування антигену. важкого ланцюга (VH), зв'язаний з варіабельним "Fv" являє собою мінімальний фрагмент антидоменом легкого ланцюга (VL) у тому ж поліпептитіла, який включає повноразмірні антигендному ланцюзі (VH-VL). Оскільки лінкер є занадто розпізнавальну й антигензв'язувальну ділянки. Ця коротким для того, щоб забезпечити утворення ділянка являє собою димер одного варіабельного пари між двома доменами в одному ланцюзі, додомену важкого ланцюга й одного варіабельного мени об'єднуються в пару за допомогою компледомену легкого ланцюга, які знаходятьсяу тісному ментарних доменів іншого ланцюга й утворюють нековалентному взаємозв'язку. Його конфігурація дві антигензв'язувальні ділянки. Діатіла докладно така, що три гіперваріабельні ділянки кожного ваописані, наприклад, у європейському патенті ЕР ріабельного домену взаємодіють із утворенням 404097; міжнародній заявці WO 93/11161 й антигензв'язувальної ділянки на поверхні VH-VL Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444димеру. Всі разом шість гіперваріабельних ділянок 6448 (1993). забезпечують специфічність зв'язування антитіла з Термін "моноклональне антитіло", який викоантигеном. Однак, навіть один варіабельний дористовується у даному описі, стосується антитіла, мен (або половина Fv, яка містить тільки три гіпервиділеного з популяції практично повністю гомоваріабельні ділянки, специфічних по відношенню генних антитіл, тобто індивідуальні антитіла, які до антигену) має здатність розпізнавати й зв'язуутворюють популяцію, є ідентичними, за винятком вати антиген, хоча й з меншою афінністю, ніж повтого, що вони можуть мати невелике число приронорозмірна зв'язувальна ділянка. дних мутацій. Моноклональні антитіла є високосFab-фрагмент також містить константний допецифічними й направленими проти одного антимен легкого ланцюга й перший константний домен генного сайту. Крім того, на відміну від звичайних (СН1) важкого ланцюга. Fab'-фрагменти відрізня(поліклональних) препаратів антитіл, які звичайно ються від Fab-фрагментів тим, що вони на карбоквключають різні антитіла, направлені проти різних си-кінцевій ділянці СН1 домену важкого ланцюга детермінант (епітопів), кожне моноклональне анмають декілька додаткових амінокислотних залититіло направлене проти однієї антигенної детершків, включаючи один або більше залишків цистемінанти. Крім своєї високої специфічності, монокїну із шарнірної ділянки антитіла. Fab'-SH у даному лональні антитіла мають ту перевагу, що вони тексті позначає Fab'-фрагмент, у якому залишки синтезуються гібридомною культурою, "незабрудцистеїну константного домену мають принаймні неною" іншими антитілами. Прикметник "моноклоодну вільну тіолову групу. F(ab')2-фрагменти антинальний" означає, що антитіло отримане з повністіл спочатку були отримані як спарені Fab'тю гомогенної популяції антитіл і не може бути фрагменти, між якими розташовані шарнірні залиотримане способом, який застосовується для одешки цистеїну. Крім того, відомі інші структури, ржання звичайних антитіл. Наприклад, моноклопредставлені з'єднаними між собою фрагментами нальні антитіла, які використовують відповідно до антитіл. даного винаходу, можуть бути отримані за допо"Легкі ланцюги" антитіл (імуноглобулінів) будьмогою гібридомного методу, вперше описаного яких хребетних тварин можуть бути віднесені до Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), або можуть 15 91961 16 бути отримані за допомогою методу рекомбінантзування антигену. Гіперваріабельні ділянки містять них ДНК (див, наприклад патент US No. 4816567). амінокислотні залишки з "ділянки, яка визначає "Моноклональні антитіла" можуть бути також видікомплементарність" або "CDR" [наприклад, залишлені з фагових антитільних бібліотек з використанки 24-34 (L1), 50-56 (L2) і 89-97 (L3) у варіабельням методик, описаних, наприклад, Clackson et al., ному домені легкого ланцюга й 31-35 (Н1), 50-65 Nature, 352:624-628 (1991) і Marks et al., J. Mol. (Н2) і 95-102 (Н3) у варіабельному домені важкого Biol., 222:581-597 (1991). ланцюга; Kabat et al., Послідовності імунологічно Моноклональні антитіла, заявлені відповідно важливих білків, 5th Ed. Public Health Service, до даного винаходу, включають "химерні" антитіла National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] (імуноглобуліни), у яких частина важкого та/або та/або залишки з "гіперваріабельної петлі" (наприлегкого ланцюга ідентична або гомологічна до відклад, залишки 26-32 (L1), 50-52 (L2) і 91-96 (L3) у повідної послідовності антитіл, отриманих від певваріабельному домені легкого ланцюга й залишки ного виду тваринних або які належать до певного 26-32 (Н1), 53-55 (Н2) і 96-101 (Н3) у варіабельнокласу або підкласу, у той час як, ділянки ланцюга му домені важкого ланцюга; Chothia and Lesk, J. (ланцюгів), що залишилися, ідентичні або гомолоMol. Biol. 196:901-917(1987)). "Каркасні" або "FR" гічні до відповідної послідовності антитіл, отримазалишки - це такі залишки варіабельного домену, них від інших видів тваринних або які належать до які відрізняються від амінокислотних залишків гііншого класу або підкласу, так само, як і фрагменперваріабельної ділянки, як визначено в тексті. ти таких антитіл, якщо вони мають відповідну біоАнтагоніст, "який зв'язується" з антигеном, логічну активність (патент US No. 4816567; який представляє інтерес, наприклад, з поверхнеMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851вим В-клітин, являє собою такий антагоніст, який 6855 (1984)). Химерні антитіла, яке представляють здатний зв'язувати антиген з достатньою афіннісінтерес відповідно до даного винаходу, включають тю та/або авідністю таким чином, що його можна "приматизовані" антитіла, яке мають антигензв'явикористати як лікарський засіб, направлений прозувальні послідовності варіабельних доменів, які ти клітин-мішеней, які експресують антиген. походять з антитіл приматів, які не є людиною (наПрикладами антитіл, які зв'язуються з антигеприклад, мавп "старого світу", таких, як бабуїн, ном CD20, є: "С2В8", яке у цей час відомо під намакака резус або мавпа циномолгус), і константні звою "ритуксимаб" ("RITUXAN ") (див. патент US ділянки антитіл людини (патент US No. 5693780). No. 5736137, наведений тут як посилання); мічене "Гуманізовані" форми антитіл різних видів тваітрієм-[90] антитіло 2В8 миші, яке позначається як рин, за винятком людини (наприклад, антитіл ми"Y2B8" (див. патент US No. 5736137, наведений ші), являють собою химерні антитіла, які включатут також як посилання); IgG2a "B1" миші, при не131 131 ють мінімальну послідовність, яка походить з обхідності мічене І з одержанням антитіла " Іімуноглобулінів різних видів тварин, за винятком В1" (BEXXAR ) (див. патент US No. 5595721, налюдини. В більшості, гуманізовані антитіла являведений тут як посилання); моноклональне антитіють собою імуноглобуліни людини (антитіла рецило миші "1F5" (Press et al.,. Blood 69(2):584-591 пієнта), у яких амінокислотні залишки гіперваріа(1987)); "химерне антитіло 2Н7" (див. патент US бельної ділянки заміщені залишками No. 5677180, наведений тут як посилання); "гумагіперваріабельної ділянки антитіл інших видів тванізоване антитіло 2Н7 v16" (див. нижче); huMaxрин, за винятком людини (антитіла донора), наCD20 (Genmab, Denmark); ΑΜΕ-133 (Applied приклад, миші, щура, кролика або примата, які Molecular Evolution), а також моноклональні антимають бажану специфічність, афінність й властитіла L27, G28-2, 93-1B3, B-Cl або NU-B2, доступні в вості. У деяких випадках, амінокислотні залишки міжнародній лабораторії з типування лейкоцитів каркасної ділянки (FR) людського імуноглобуліну (Valentine et al., у книзі: Типування лейкоцитів III заміщені відповідними амінокислотними залишка(McMichael, Ed., р.440, Oxford University Press ми антитіл інших видів тварин, за винятком люди(1987)). ни. Крім того, гуманізовані антитіла можуть вклюПрикладами антитіл, які зв'язуються з антигечати залишки, які не виявляються в антитілах ном CD19, є анти-CD19 антитіла, описані Hekman реципієнта або в антитілах донора. Ці модифікації et al., Cancer Immunol. Immunother. 32:364-372 здійснюються для додаткового поліпшення функції (1991) і Vlasveld et al., Cancer Immunol. антитіл. У цілому, гуманізоване антитіло буде Immunother. 40:37-47 (1995), і антитіло В4, описане включати, принаймні, один, а, як правило, два ваKiesel et al.,. Leukemia Research II, 12:1119 (1987). ріабельні домени, у яких всі, або практично всі, Терміни "ритуксимаб" або "RITUXAN ", які вигіперваріабельні петлі відповідають таким імуногкористовують в даному описі, стосуються отрималобуліну інших видів, за винятком людини, і всі, ного за допомогою генної інженерії химерного моабо практично всі, FRs відповідають послідовносноклонального антитіла типу "миша/людин", тям імуноглобуліну людини. Гуманізоване антитіло направленого проти антигену CD20 і яке позначаможе також включати, принаймні, частину констається як "С2В8" у патенті US No. 5736137, наведентної ділянки імуноглобуліну (Fc), звичайно імуноному тут як посилання. Це антитіло належать до глобуліну людини. Для більш точної інформації ізотипу IgG1 з легкими каппа-ланцюгами й містить див. Jones et al., Nature 321:522-525 (1986): варіабельні послідовності легких і важких ланцюгів Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); and антитіла миші й константні послідовності антитіла Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). людини. Афінність зв'язування ритуксимабу з анТермін "гіперваріабельна ділянка", який викотигеном CD20 становить приблизно 8.0 нМ. ристовується у даному описі, стосується амінокислотних залишків антитіла, які відповідають за зв'я 17 91961 18 Виключно для цілей даного винаходу нижче ізольований антагоніст одержують тільки після наводяться варіабельні послідовності легких і ваодного етапу очищення. жких ланцюгів "гуманізованого антитіла 2Н7 v16". Термін "ссавці", який використовується відпоВаріабельний домен легкого ланцюга hu2H7 відно до даного винаходу, стосується будь-якої v16 тварини, яка класифікується як ссавець, включаюDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMH чи людину, домашніх і сільськогосподарських тваWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGT рин, тварин зоопарків, спортивних тварин, а також DFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKV домашніх улюбленців, таких як собаки, коні, кішки, EIKR (SEQ ID NO:1) корови й т.п. Переважно, ссавцем є людина. Варіабельний домен важкого ланцюга hu2H7 Термін "лікування" стосується як терапевтичv16 них, так і превентивних або профілактичних мір. EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSY До тих, хто має потребу в лікуванні належать індиNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFK відууми, які вже мають захворювання або патолоGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVY гічний стан, а також ті, хто має потребу в профілаYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:2) ктиці розвитку захворювання або патологічного Переважне гуманізоване антитіло 2Н7 v16 має стану. Отже, у ссавця вже може бути діагностованаступну амінокислотну послідовність легкого лано захворювання або патологічний стан або ж він нцюга може бути схильний до розвитку захворювання. DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMH Термін "терапевтично ефективна кількість" WYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGT означає таку кількість антагоніста, яка є ефективDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKV ною для запобігання, поліпшення перебігу або EIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYP лікування аутоімунного захворювання, про яке REAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL йдеться. SSTLTLSICADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN Термін "імуносупресивний агент", який викориRGEC (SEQ ID NO:3); стовується тут при описі терапевтичних підходів, і наступну амінокислотну послідовність важкостосується сполуки, яка пригнічує або екранує імуго ланцюга нну систему ссавця, який піддається лікуванню. Це EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSY стосується сполук, які інгібують продукцію цитокіNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFK нів, пригнічують самоекспресію антигену або масGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVY кують МНС антигени. Прикладами таких агентів є YSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAP 2-аміно-6-арил-5-заміщені піримідини (див. патент SSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS US No. 4665077, наведений тут як посилання); GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN нестероїдні протизапальні засоби (NSAIDs); азатіVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG оприн; циклофосфамід; бромокриптин; даназол; GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPE дапсон; глутаральдегід (який маскує антигени VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLT МНС, як описано в патенті US No. 4120649); антиVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP ідіотипічні антитіла до МНС антигенів й МНС фраREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV гментам; циклоспорин А; стероїди, такі, як глюкоEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK кортикоїди, наприклад, преднізолон, метилпредніSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK золон і дексаметазон; метотрексат (для (SEQ ID NO:4). перорального або підшкірного введення); гідрок"Ізольований" антагоніст являє собою такий сихлорохін; сульфасалазин; лефлуномід; антагоантагоніст, який був ідентифікований і виділений ністи цитокінів або їх рецепторів, включаючи антита/або отриманий з компонентів природного серетіла до інтерферону , або , антитіла до довища, яке його оточує. Забруднюючі компоненти фактора некрозу пухлин (інфліксимаб або адаприродного середовища антагоніста - це матеріалімумаб), анти-TNF імуноадгезин (етанерсепт), ли, які будуть перешкоджати діагностичному або антитіла до ΤΝF , антитіла до інтерлейкіну 2 і до терапевтичному використанню антагоніста й морецептора IL-2; анти-LFA-1-антитіла, включаючи жуть включати ферменти, гормони й інші білкові анти-С11а й анти-CD18 антитіла; анти-L3Т4 антиабо небілкові сполуки. У переважному варіанті тіла; гетерологічний антилімфоцитарний імуноглоздійснення даного винаходу антагоніст очищають булін; пан-Т антитіла, переважно, анти-CD3- або (1) до ступеня чистоти, який становить більше 95% анти CD4/CD4a антитіла; розчинний пептид, що (за вагою), що визначають методом Лоурі й, більш має LFA-3-зв'язувальний домен (WO 90/08187 від переважно, більше 99% (за вагою); (2) до рівня, 7/26/90); стрептокіназа; TGF- ; стрептодорназа; достатнього для одержання принаймні 15 залишків РНК або ДНК хазяїна; FK506; RS-61443; дезоксисN-кінцевої або внутрішньої послідовності при випергуалін; рапаміцин; Т-клітинний рецептор користанні обертового чашкового секвенатора або (Cohen et al., патент US No. 5114721); фрагменти (3) до гомогенності за допомогою SDS-PAGE у Т-клітинного рецептора (Offher et al., Science, відновлювальних або не відновлювальних умовах 251:430-432 (1991); WO 90/11294; Ianeway, Nature з використанням Кумасі голубого або, переважно, 341: 482 (1989); WO 91/01133) і антитіла до Тсрібного фарбування. Ізольований антагоніст клітинного рецептора (ЕР 340109), такі, як Т10В9. включає антагоніст in situ усередині рекомбінантТермін "цитотоксичний агент", який використоних клітин доти, поки принаймні один з компоненвується у даному описі, стосується сполуки, яка тів, що становлять природне оточення цього антаінгібує або перешкоджає функціонуванню клітин гоніста, не буде вилучений. Однак звичайно та/або викликає їх руйнування. Цей термін об'єднує радіоактивні ізотопи (наприклад, Аr211, І131, І125, 19 91961 20 Y90, Re186, Re188, Sm153, Ві212, Ρ32 і радіоактивні ізотор топоізомерази RFS 2000; дифторметилорнітин топи Lu), хіміотерапевтичні агенти й токсини, такі, (DMFO); ретиноєва кислота; еспераміцини; капеяк низькомолекулярні токсини або токсини з ферцитабін, а також будь-які фармацевтично прийнятментативною активністю бактеріального, грибковоні солі, кислоти або похідні сполук, перерахованих го, рослинного або тваринного походження, а тавище. Крім того, до хіміотерапевтичних агентів кож їх фрагменти. належать протигормональні агенти, які регулюють "Хіміотерапевтичний агент" являє собою хімічабо інгібують гормональну активність пухлин, такі, ну сполуку, яка використовується для лікування як антиестрогени, включаючи тамоксифен, ралокраку. Прикладами хіміотерапевтичних агентів є сифен, 4(5)-імідазоли, які інгібують ароматазу, 4алкілуючі агенти, такі, як тіотепа й циклофосфамід гідрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон і тореміфен (фарестон); (CYTOXAN ); алкілсульфонати, такі, як бісульантиандрогени, такі, як флутамід, нілутамід, бікафан, імпросульфан і піпосульфан; азиридини, такі, лутамід, лейпролід і гозерелін; а також фармацевяк бензодопа, карбохіон, метуредопа й уредопа; тично прийнятні солі, кислоти або похідні вказаних етиленіміни й метиламеламіни, включаючи алтресполук. тамін, триетиленмеламін, тритиленфосфорамід, Термін "цитокін" стосується білків, синтезоватриетилентіофосфаорамід і триметилоломеламін; них однією клітинною популяцією, які впливають нітроіприти, такі, як хлорамбуцил, хлорнафазин, на інші клітини й виконують функцію міжклітинних хлорфосфамід, естрамустин, іфосфамід, мехлоремедіаторів. Прикладами таких цитокінів є лімфокітамін, гідрохлорид оксиду мехлоретаміну, мелфани, монокіни й звичайні пептидні гормони. До цитолан, новембіцин, фенестерин, преднімустин, трокінів належать гормон росту, зокрема, людський фосфамід, іприт урацилу; похідні нітрозосечовини, гормон росту; N-метіонілований людський гормон такі, як кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, росту й бичачий гормон росту; паратиреоїдний ломустин, німустин, ранімустин; антибіотики, такі, гормон; тироксин; інсулін; проінсулін; релаксин; як аклациномізини, актиноміцин, аутраміцин, азапрорелаксин; глікопротеїнові гормони, такі, як фосерин, блеоміцини, кактиноміцин, каліхеаміцин, лікулостимулювальний гормон (ФСГ), тиреотропкарабіцин, карміноміцин, карзинофілін, хромоміний гормон (ТТГ) і лютеїнізуючий гормон (ЛГ); фацини, дактиноміцин, даунорубіцин, деторубіцин, 6ктор росту гепатоцитів; фактор росту діазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубіцин, епірубіфібробластів; пролактин; плацентарний лактоген; цин, езорубіцин, ідарубіцин, марцеломіцин, мітоміцини, мікофенольна кислота, ногаламіцин, оліфактор некрозу пухлин- і - ; фактор, який інгібує воміцини, пепломіцин, убенімекс, зіностатин, мюлерову протоку; мишиний гонадотропінзорубіцин; антиметаболіти, такі, як метотрексат й асоційований пептид; інгібін; активін; фактор росту 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолієвої кислоти, ендотелію судин; інтегрин; тромбопоетин (ТРО); такі, як деноптерин, метотрексат, тіаміприн, тіогуфактори росту нервів, такі, як NGF- ; фактор росту анин; аналоги піримідину, такі, як анцитабін, азатромбоцитів; трансформуючі фактори росту цитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабін, діде(TGFs), такі, як TGF- і TGF- ; інсуліноподібний оксіуридин, доксифлуридин, еноцитабін, фактор росту-І й -II; еритропоетин (ЕРО); остеоінфлоксуридин, 5-FU; андрогени, такі, як калустедуктйвні фактори; інтерферони, такі, як інтерферон, дромостанолону пропіонат, епитіостанол, рон- , - і - ; колонієстимулюючі фактори (CSFs), мепитіостан, тестолактон; препарати, які пригнічутакі, як макрофагальний CSF (M-CSF); гранулоциють гіперфункцію надниркових залоз, такі, як амітарно-макрофагальний CSF (GM- CSF) і гранулоноглютетімід, мітотан, трилостан; похідне фолієвої цитарний CSF (G-CSF); інтерлейкіни (ILs), такі, як кислоти, таке, як формілтетрагідрофолієва кислоIL-1, IL-1 , IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, та; ацеглатон; алдофосфаміду глюкозид; амінолеIL-11, IL-12, IL-15; фактор некрозу пухлин, такий, вулінова кислота; амсакрин; бестабуцил; бізантяк TNF- або TNF- , а також інші поліпептидні фарен; едатраксат; дефофамін; демеколцин; ктори, включаючи LIF й KL. У даному описі термін діазихіон; елфорнітин; ацетат еліптину; етоглюцитокін стосується білків природного походження цид; нітрат галію; гідроксисечовина; лентинан; або отриманих за допомогою рекомбінантної клілонідамін; мітогуазон; мітокстантрон; мопідамол; тинної лінії, а також біологічно активних еквіваленнітракрин; пентостатин; фенамет; пірарубіцин; тів природних цитокінів. подофілінова кислота; 2-етилгідразид; прокарбаТермін "проліки", який використовується у дазин; PSK ; разоксан; сизофіран; спірогерманій; ному описі, стосується попередника або похідного теніазонова кислота; триазихіон; 2,2,2'фармацевтично активної сполуки, який є менш трихлортриетиламін; уретан; віндезин; дакарбацитотоксичним по відношенню до пухлинних клізин; маномустин; мітобронітол; мітолактол; піпобтин, ніж вихідний лікарський засіб і може бути акроман; гацитозин; арабінозид ("Аrа-С"); циклофотивований ферментативно або перетворений в сфамід; тіотепа; таксоїди, наприклад, паклітаксел більш активну вихідну форму. Див, наприклад, (TAXOL , Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, Wilman, "Проліки в хіміотерапії раку" Biochemical NJ) і доксетаксел (TAXOTERE , Rhone-Poulenc Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Rorer, Antony, France); хлорамбуцил; гемцитабін; Belfast (1986) і Stella et al., "Проліки: хімічний підхід 6-тіогуанін; меркаптопурин; метотрексат; аналоги до цілеспрямованої доставки лікарських препараплатини, такі, як цисплатин і карбоплатин; вінблатів" Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. стин; платина; етопозид (VP-16); іфосфамід; міто247-267, Humana Press (1985). До про ліків, заявміцин С; мітоксантрон; вінкристин; вінорелбін; налених відповідно до даного винаходу, належать велбін; новантрон; теніпозид; дауноміцин; (без обмежень вказаними) фосфат-вмісні проліки, аміноптерин; кселода; ібандронат; СРТ-11; інгібітіофосфатвмісні проліки, сульфатвмісні проліки, 21 91961 22 пептидвмісні проліки, проліки на основі модифікоПоліклональні антитіла переважно одержують шляхом множинної підшкірної або інтраперитоневаних D-амінокислот, глікозиловані проліки, альної імунізації тварин відповідним антигеном й лактам-вмісні проліки, факультативно заміщені ад'ювантом. Крім того, вказаний антиген може буфеноксиацетамідвмісні проліки або факультативти кон'югований з білком, який є імуногенним по но заміщені фенілацетамідвмісні проліки, проліки відношенню до тих видів тварин, які піддаються 5-фторурацилу й інші 5-фторуридинові проліки, які імунізації, наприклад, с гемоціаніном молюска фіможуть бути перетворені в більш активні вільні сурелі, сироватковим альбуміном, тиреоглобуліцитотоксичні сполуки. Прикладами цитотоксичних ном великої рогатої худоби або інгібітором трипагентів, які можуть бути перетворені у форму просину соєвих бобів при використанні ліків для використання відповідно до даного винабіфункціонального або дериватизуючого агента, ходу, є (без обмежень вказаними) всі перераховані такого, як складний ефір малеімідобензоїл сульвище хіміотерапевтичні сполуки. фосукциніміду (кон'югація відбувається за допомо"Ліпосома" являє собою невелику везикулу, гою цистеїнових залишків), N-гідроксисукцинімід сформовану з різних типів ліпідів, фосфоліпідів (кон'югація відбувається за допомогою залишків та/або сурфактанта, яка використовується для лізину), глутаральдегід, ангідрид янтарної кислоти, доставки лікарських засобів (таких, як антагоністи, SOCl2, R1N=C=NR, де R й R1 є різними алкільними розкриті в даному описі, і, можливо, хіміотерапевгрупами. тичні агенти) в організм ссавців. Компоненти ліпоТварин імунізують антигеном, імуногенними соми звичайно організовані у вигляді двошарової кон'югатами або їх похідними, об'єднуючи, наприструктури, аналогічно до того, як розташовуються клад, 100 мкг або 5 мкг білка або кон'югата (для ліпіди в біологічних мембранах. кроликів або мишей, відповідно) із трьома об'ємаII. Одержання антагоністів ми повного ад'юванта Фрейнда й здійснюючи ін'єкДаний винахід також стосується способів й ції отриманого розчину внутрішньошкірно в різні умов одержання антагоністів, які взаємодіють з ділянки. Через один місяць тварин бустують 1/5 поверхневим маркером В-клітин, які описані ниж1/10 вихідної кількості пептиду або кон'югата в че. повному ад'юванті Фрейнда підшкірними ін'єкціями Поверхневий маркер В-клітин, який викорисв різні ділянки. Через 7-14 днів здійснюють збір товується для одержання й скринінгу антагоніскрові у тварин і визначають титр антитіл в отримата(ів), може бути, наприклад, представлений розній сироватці. Тварин бустують доти, поки титр чинною формою антигену або його ділянки, які антитіл не встановиться. Переважно, тварин бусмістять потрібний епітоп. Альтернативно або дотують кон'югатом того ж самого антигену, але датково, В-клітини, які експресують поверхневий кон'югованого з іншим білком та/або з тим же самаркер, можуть бути використані для одержання й мим, але при використанні іншого перекрестнозскринінгу антагоніста(ів). Інші форми поверхневого в'язувального агента. Кон'югати також можуть бути маркера В-клітин, які використовують для одеротримані за допомогою культури рекомбінантних жання антагоністів, очевидні для фахівця в даній клітин у формі білків злиття. Крім того, для посигалузі знань. Переважно, поверхневий маркер Влення імунної відповіді можуть бути використані клітин являє собою антиген CD20. агенти, які сприяють агрегації, наприклад, алюмініУ тому випадку, якщо переважний антагоніст є єві галуни. антитілом, інші антагоністи, відмінні від антитіл, (іі) Моноклональні антитіла розглядаються тут особливо. Наприклад, антагоМоноклональні антитіла являють собою попуніст може являти собою невелику молекулу, злиту ляцію по суті гомогенних антитіл, тобто індивідуаабо кон'юговану із цитотоксичним агентом (таким, льні антитіла, які становлять популяцію, ідентичні, як розкриті в даному описі цитотоксичні агенти). за винятком антитіл, що мають можливі природні Бібліотеки невеликих молекул можуть бути промутації, які можуть становити незначну частину скриновані відносно поверхневого маркера Впопуляції. Таким чином, поняття "моноклональні" клітин, що представляє інтерес, з метою виявленвказує на те, що антитіла не є сумішшю дискретня невеликої молекули, яка зв'язується з антигених антитіл. ном. Далі невелика молекула може піддатися Наприклад, моноклональні антитіла можуть скринінгу на антагоністичні властивості та/або бути отримані при використанні гібридомного мекон'югуванню із цитотоксичним агентом. тоду, вперше розробленого Келером й ін. [Kohler Антагоніст також може являти собою пептид, et al., Nature, 256:495 (1975)], або ж за допомогою отриманий шляхом конструювання або фаговотехнології рекомбінантних ДНК (патент US дисплейного методу (див., наприклад, 44816567). WO98/35036, опубл. 13 серпня 1998 p.). Відповідно Згідно із гібридомним методом, мишей або індо одного варіанта, антагоніст може являти собою ших підходящих тварин, наприклад, хом'яків, імумолекулу, яка імітує CDR, або аналог антитіла, нізують, як описано вище, для того, щоб викликати який містить CDRs заданого антитіла. Крім того, генерацію лімфоцитів, продукуючих або здатних що такі пептиди можуть бути антагоністами самі по продукувати антитіла, які специфічним чином зв'ясобі, вони можуть бути кон'юговані із цитотоксичзуються з білком, використовуваним для імунізації. ними агентами, які впливають на антагоністичні Альтернативно, лімфоцити можуть бути імунізовавластивості пептидів або підсилюють їх. ні in vitro. Потім лімфоцити зливають із клітинами Нижче наведені приклади способів одержання мієломи при використанні підходящого агента для антитіл, які мають антагоністичну активність, викозлиття, такого, як поліетиленгліколь, з одержанням ристовуваних відповідно до даного винаходу. клітин гібридоми (Goding, "Моноклональні антиті(і) Політональні антитіла 23 91961 24 ла: принципи й застосування", стор. 59-103 тидних проб, здатних специфічно зв'язуватися з (Academic Press, 1986)). генами, які кодують важкі або легкі ланцюга антиОтримані в такий спосіб гібридомні клітини витіл миші). Гібридомні клітини служать переважним сівають і вирощують у підходящому культуральджерелом такої ДНК. Після виділення ДНК вбудоному середовищі, яке переважно містить одну або вують у вектор експресії, яким потім трансформубільше сполук, які інгібують ріст і виживаність неють клітини-хазяї, такі, як Е. coli, COS, CHO (клітизлитих, батьківських клітин мієломи. Наприклад, ни яєчника китайського хом'ячка) або мієломні якщо батьківські клітини мієломи втратили здатклітини, які не продукують імуноглобулінів, для ність синтезу ферменту гіпоксантин гуанін фосфоодержання моноклональних антитіл у рекомбінанрибозилтрансферази (HGPRT або HPRT), у культних клітинах-хазяїнах. Огляд публікацій, присвятуральне середовище для росту гібридомних чених рекомбінантній експресії в бактеріях ДНК, клітин звичайно додають гіпоксантин, аміноптерин яка кодує антитіла, включає огляди Skerra et al., і тімідин (середовище HAT), які перешкоджають Curr. Opinion in Immunol, 5:256-262 росту клітин, дефіцитних за HGPRT. (1993)Pluckthun, Immunol. Revs., 130:151Переважними мієломними клітинами є такі клі188(1992). тини, які підлягають ефективному злиттю, підтриВ іншому випадку антитіла або їх фрагменти мують стабільно високий рівень синтезу антитіл можуть бути виділені з антитільних фагових біблівідібраними для злиття антитілопродукуючими отек, отриманих способами, описаними McCafferty клітинами й чутливі до середовища HАТ. Серед et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., таких клітин переважними є клітини мієломи миші, Nature, 352:624-628 (1991) і Marks et al., J. Mol. наприклад, що походять з пухлин МОРС-21 і МРСBiol, 222:581-597 (1991), відповідно, описують ви11, які можуть бути отримані в Клітинному центрі ділення антитіл миші й людини при використанні Солковського інституту, Сан Дієго, Каліфорнія, US, фагових бібліотек. У наступних публікаціях розкі клітини ліній SP-2 й X63-Ag8-653, які можна одеривається одержання антитіл людини високої ржати в Американській колекції типових клітинних афінності (рівень нМ) шляхом перестановки ланкультур, Роквілл, Мериленд, US. Крім того, для цюгів [Marks et al., Boi/Technology, 10:779-783 одержання моноклональних антитіл людини мо(192)], а також комбінаторіальним інфікуванням і жуть використовуватися мієломні клітини людини рекомбінацією in vivo з конструюванням об'ємних й гетеромієломні клітинні лінії людини й миші фагових бібліотек [Waterhouse et al., Nuc. Acids. [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Res., 21:2265-2266 (1993)]. Таким чином, вказані "Способи й одержання моноклональних антитіл", методики є альтернативними традиційним спосоpp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]. бам одержання моноклональних антитіл за допоКультуральне середовище, у якому вирощумогою гібридомної технології. валися гібридомні клітини, досліджують на наявКрім того, ДНК, яка кодує антитіла, може бути ність моноклональних антитіл, направлених на модифікована, наприклад, заміщенням гомологічантиген. Переважно, специфічність зв'язування них послідовностей антитіла миші на кодувальні моноклональних антитіл, які продукуються клітипослідовності константних доменів важких і легких нами гібридоми, визначають імунопреципітацією ланцюгів антитіла людини [патент US 4816567; або дослідженням зв'язування in vitro, наприклад, Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 радіоімунологічним аналізом (РІА) або імуноадсо(1984)] або ковалентним зв'язуванням послідовнорбцією (ELISA). сті, яка кодує імуноглобулін, з усією або частиною Афінність зв'язування антитіл з антигеном мопослідовності, яка кодує поліпептид неімуноглобуже бути визначена, наприклад, методом Скетчарлінової природи. да, описаним Munson et al., Anal. Biochem., Звичайно такими поліпептидами неімуногло107:220 (1980). булінової природи заміщають константні домени Після того, як ідентифікують гібридомні клітиантитіла або варіабельні домени антигензв'язувани, які продукують антитіла потрібної специфічнольної ділянки антитіла з метою одержання химерсті, афінності та/або активності, клони можуть бути них бівалентних антитіл, які містять одну антигенсубклоновані методом лімітуючих розведень, і зв'язувальну ділянку, яка має високу специфічність вирощені при використанні стандартних методів по відношенню до одного антигену, і іншу антиген[Goding, "Моноклональні антитіла: принципи й зв'язувальну ділянку, яка має високу специфічність практика", pp. 59-103 (Academic Press, 1986)]. Підпо відношенню до іншого антигену. ходяще для цих цілей середовище включає, на(iiі) Гуманізовані антитіла приклад, D-MEM або RPMI-1640. Крім того, гібриСпособи гуманізування антитіл нелюдського домні клітини можуть бути вирощені in vivo у формі походження описані в попередньому рівні техніки. асцитних пухлин в організмі тварин. Переважно, гуманізовані антитіла мають один або Моноклональні антитіла, які секретуються суббільше амінокислотних залишків антитіла нелюдклонами, виділяють із культурального середовиського походження, вбудованих в антитіло людища, асцитної рідини або сироватки підходящими ни. Вказані амінокислотні залишки антитіла неметодами імунологічного очищення, наприклад, з людського походження часто називають використанням протеїн А-сефарози, гідроксилапа"імпортними" залишками, які звичайно одержують титною хроматографією, гель-електрофорезом, із "імпортного" варіабельного домену. Гуманізовадіалізом або афінною хроматографією. ні, головним чином, здійснюють при використанні ДНК, яка кодує моноклональні антитіла, видіметоду, розробленого Winter с співавторами ляють і секвенують за допомогою стандартних [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann методів (наприклад, при використанні олігонуклеоet al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., 25 91961 26 Science, 239:1534-1536 (1988)], шляхом заміщення імунізації синтезується повний спектр антитіл люпослідовностей гіперваріабельних ділянок антитідини при відсутності ендогенної продукції імуногла людини відповідними послідовностями гіпервалобулінів. Наприклад, відомо, що гомозиготна деріабельних ділянок нелюдського походження. По леція гена, який кодує фрагмент, який з'єднує суті, такі "гуманізовані" антитіла є химерними анділянки важких ланцюгів антитіла (JH), у клітинах титілами (патент US 4816567) і звичайно являють зародкової лінії в химерних і мутантних мишей собою антитіла людини, у яких амінокислотні заприводить до повного інгібування ендогенної пролишки гіперваріабельних ділянок й, можливо, деякі дукції антитіл. Перенесення гена клітин зародкової залишки каркасних ділянок заміщені залишками з лінії, який кодує імуноглобулін людини, у клітини аналогічних ділянок антитіл гризунів. таких мутантних мишей приводить до синтезу анВибір варіабельних доменів, як легких, так і титіл людини в організмі вказаних тварин при відважких ланцюгів антитіл людини, які будуть викоповідній імунізації антигеном. Див., наприклад, ристані для одержання гуманізованих антитіл, є Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 надзвичайно важливим для зниження їх антиген(1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); ності. Відповідно до так званого методу "найкраBruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993), а щої припасування" послідовність варіабельного також патенти US 5591669, 5589369 й 5545807. домену антитіла гризуна скринують проти цілої Крім того, для одержання антитіл людини й бібліотеки відомих послідовностей варіабельних фрагментів антитіл in vitro може бути використана доменів антитіл людини. Послідовність антитіла фагово-дисплейна технологія (McCafferty et al., людини, яка найбільш близька до послідовності Nature 348:552-553 (1990)), заснована на створенні антитіла гризуна за структурою, потім використобібліотеки генів варіабельних (V) доменів імуногвують як каркасну ділянку для гуманізування антилобулінів імунізованих донорів. Відповідно до цієї тіл [Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); технології гени V-домену антитіла клонують у єдиChothia et al., J. Med. Biol, 196:901 (1987)]. Інший ній рамці зчитування з генами великого й малого метод передбачає використання певної каркасної білків оболонки нитчастого бактеріофага, наприділянки, яка походить з консенсусної послідовності клад, М13 або fd, і функціональні фрагменти антивсіх антитіл людини з певним типом легких і важтіл експонуються на поверхні фагової частинки. ких ланцюгів. Та сама каркасна послідовність моОскільки фагова частинка містить одноланцюгову же використовуватися для одержання різних гумакопію фагового геному, відбір, заснований на фуннізованих антитіл [Carter et al., Proc. Natl. Acad. кціональних властивостях антитіла, також привоSci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol, дить до відбору гена, який кодує антитіло, яке має 151:2623 (1993)]. такі властивості. Таким чином, бактеріофаг імітує Крім того, представляється важливим, що гудеякі властивості В-клітин. Фагово-дисплейний манізовані антитіла зберігають високу активність метод може застосовуватися різним чином; див., зв'язування з антигеном і мають інші цінні біологічнаприклад, огляд Johnson, Kevin S. і Chiswell, ні властивості. Для досягнення вказаної мети, відDavid J., Current Opinion in Structural Biology 3:564повідно до переважного способу, гуманізовані ан571 (1993). Для здійснення фагово-дисплейного титіла одержують, аналізуючи послідовності методу можуть використовуватися різні джерела батьківських антитіл і різні концептуальні продукти сегментів V-генів. Clackson et al., Nature, 352:624гуманізування при використанні методу тривимір628 (1991) виділив панель різноманітних антитіл ного моделювання батьківських і гуманізованих до оксазолону з невеликої рандомізованої комбіпослідовностей. Тривимірні моделі імуноглобулінів наторної бібліотеки V-генів, отриманої із селезінки є загальнодоступними й добре відомими фахівцеві імунізованої миші. Може бути сконструйований в даній галузі. Комп'ютерні програми, які демоннабір V-генів імунізованих людей (донорів), на осструють можливі тривимірні конформаційні струкнові якого за допомогою технології, описаної Marks тури вибраних кандидатних послідовностей імуноet al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991) або Griffith et глобулінів, також загальнодоступні. Аналіз al., EMBO J. 12:725-734 (1993), можливе одержанвказаних зображень дозволяє оцінити внесок різня антитіл, направлених на різні антигени, у тому них амінокислотних залишків у функціональні влачислі аутоантигени. Див. також патенти US стивості вибраної послідовності імуноглобуліну, 5565332 й 5573905. тобто тих залишків, які впливають на його здатАнтитіла людини також можуть бути отримані ність зв'язуватися з відповідним антигеном. За in vitro за допомогою активованих В-клітин (див. допомогою вказаного підходу залишки каркасних патенти US 5567 й 5229275). ділянок можуть бути відібрані й скомбіновані з ре(ν) Фрагменти антитіл ципієнтними й "імпортними" послідовностями з Для одержання фрагментів антитіл можуть заодержанням антитіл, які мають потрібні властивостосовуватися різні технології. Звичайно такі фрасті, такими, як підвищена афінність зв'язування з гменти одержують шляхом протеолітичного розантигеном-мішенню. У цілому, амінокислотні защеплення інтактних антитіл [див., наприклад, лишки гіперваріабельних ділянок безпосереднім Morimoto et al., Journal of Biochemical and чином і найбільш значимим чином задіяні в зміні Biophysical Methods 24:107-117 (1992) і Brennan et ангигензв'язувальної активності. al., Science, 229:81 (1985)]. Однак фрагменти ан(iv) Антитіла людини титіл у цей час можуть бути отримані прямим споЯк альтернатива гуманізуванню, можуть бути собом при використанні рекомбінантних клітинотримані антитіла людини. Наприклад, у цей час хазяїв. Наприклад, фрагменти антитіл виділяють із це можливо при використанні трансгенних тварин антитільних фагових бібліотек, описаних вище. (наприклад, мишей), в організмі яких у результаті Альтернативно, Fab'-SH фрагменти можуть бути 27 91961 28 виділені із клітин Е. coli і хімічним шляхом з'єднані ноглобуліну, і, якщо це необхідно, легкий ланцюг між собою з утворенням F(ab')2-фрагментів [Carter імуноглобуліну, вбудовують в окремі вектори ексet al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]. Відповідпресії, якими спільно трансфікують підходящий но до іншого підходу F(ab')2-фрагменти можуть організм-хазяїн. Це створює більш широкі можлибути виділені безпосередньо з культури рекомбівості для забезпечення належного співвідношення нантних клітин-хазяїв. Інші методики одержання між трьома поліпептидними фрагментами в тому фрагментів антитіл повинні бути зрозумілі фахіввипадку, коли при конструюванні з досягненням цеві в даній галузі. У деяких випадках потрібним оптимального виходу кінцевого продукту викорисфрагментом антитіла є одноланцюговий Fv фрагтовуються нерівні співвідношення трьох поліпепмент (scFv). Див. WO 93/16185 і патенти US тидних ланцюгів. Однак можливо вбудовувати 5571894 й 5587458. Фрагмент антитіла може бути кодувальні послідовності двох або всі трьох полій "лінійним антитілом", наприклад, описаним у пептидних ланцюгів в один вектор експресії, коли патенті US 5641870. Такі фрагменти можуть бути експресуються принаймні два поліпептидні ланцюмоноспецифічними або біспецифічними. ги в еквівалентному співвідношенні з високим ви(vi) Біспецифічні антитіла ходом або коли співвідношення не мають істотного Біспецифічні антитіла - це антитіла, які специзначення. фічні принаймні до двох різних епітопів. НаприУ переважному варіанті здійснення вказаного клад, такі антитіла можуть зв'язувати два різні епіпідходу біспецифічні антитіла складаються з гібтопи поверхневого маркера В-клітин. Іншим ридного важкого ланцюга імуноглобуліну, який має прикладом можуть служити антитіла, які зв'язують специфічну здатність до зв'язування першого анперший В-клітинний маркер і другий В-клітинний тигену на одному плечі, і гібридної пари легкого й маркер. Альтернативно, ділянка антитіла, яка зв'яважкого ланцюгів імуноглобуліну (що має специфізує В-клітинний маркер, може бути скомбінована з чну здатність до зв'язування другого антигену) на ділянкою, яка зв'язує молекулу-активатор, наприіншому плечі. Виявлено, що така асиметрична клад, поверхневий рецептор лейкоцитів, такий, як структура забезпечує більш легке відділення потТ-клітинний рецептор (наприклад, CD2 або CD3) рібної біспецифічної конструкції від небажаних комбінацій імуноглобулінових ланцюгів, якщо легабо Fc-рецептори Ig (Fc R), наприклад, Fc RI кий ланцюг імуноглобуліну становить тільки поло(CD64), Fc RII (CD32) і Fc RIII (CD16) так, щоб вину від біспецифічних молекул. Відповідний підпідсилити захисні механізми В-клітин. Біспецифічні хід розкритий у заявці WO 94/04690. Для більш антитіла можуть бути також використані для локадетального ознайомлення з методами одержання лізації цитотоксичних агентів на В-клітинах. Такі біспецифічних антитіл див., наприклад, Suresh et антитіла містять ділянку, яка зв'язує В-клітинний al., Методи в ензимології, 121:210 (1986). маркер, і ділянку, яка зв'язує цитотоксичний агент Відповідно до іншої методики, описаної в па(наприклад, сапорин, анти-інтерферон альфа, алтенті US № 5731168, поверхня розділу між парою калоїд барвінку, А ланцюг рицину, метотрексат антитільних молекул може бути створена для одеабо мічений радіоізотопом гаптен). Біспецифічні ржання найбільшого відсотка гетеродимерів, які антитіла можуть бути отримані у вигляді повноровиділяють з культури рекомбінантних клітин. Пезмірних антитіл або антитільних фрагментів (нареважна поверхня розділу включає, принаймні, приклад, F(ab')2 біспецифічних фрагментів). частину Сн3-домену константної ділянки антитіла. Способи одержання біспецифічних антитіл віВідповідно до даного методу одну або більше амідомі з рівня техніки. Звичайна методика одержаннокислот першого антитіла з невеликими боковиня повнорозмірних біспецифічних антитіл засноми ланцюгами, які створюють поверхню розділу, вана на спільній експресії пар важкого й легкого заміняють амінокислотами, які мають бокові ланланцюгів імуноглобуліну, які мають різну специфіцюги більшого розміру (наприклад, тирозином і чність [Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)]. триптофаном). Рівноцінні порожнини ідентичного Оскільки відбувається вибіркова зборка важкого й або подібного розміру, утворені боковими ланцюлегкого ланцюгів імуноглобуліну, такі гібридоми гами більшої величини, створюють на поверхні (квадроми) продукують суміш із 10 різних антитірозділу з боку молекули другого антитіла замільних молекул, з яких тільки одна буде мати потщенням амінокислот із вказаними боковими ланрібну біспецифічну структуру. Очищення вказаних цюгами на амінокислоти з боковими ланцюгами антитіл, яке звичайно здійснюється за допомогою меншого розміру (наприклад, на аланін або треоафінної хроматографії, значно більш складне й нін). Це дозволяє збільшити вихід гетеродимерів вихід продукту низький. Аналогічні методики опивідносно виходу небажаних кінцевих продуктів, які сані в заявці WO 93/08829, а також у роботі представляють собою гомодимери. Trauncker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991). До біспецифічних антитіл належать й перехВідповідно до іншого підходу, варіабельні дорестно-зв'язані гетерокон'югати антитіл. Напримени антитіл з потрібною специфічністю (антигенклад, одне антитіло в такому гетерокон'югаті може зв'язувальні ділянки) зливають із послідовностями бути зв'язане з авідином, а інше - з біотином. Такі константних доменів імуноглобулінів. Злиття переантитіла, наприклад, направляють клітини імунної важно здійснюють із константними доменами важсистеми на небажані клітини (патент US 4676980) і ких ланцюгів, які містять принаймні частину шарніможуть використовуватися для лікування СНІДу рної ділянки, СН2 і СН3 ділянки. Бажано одержати (WO 91/00360, WO 92/200373 й ЕР 03089). Гетеропершу константну ділянку важкого ланцюга (СН1), кон'югати антитіл можуть бути отримані при викояка містить сайт, необхідний для зв'язування легристанні підходящих методів перехресного зв'язукого ланцюга, принаймні в одному із продуктів вання. Підходящі агенти для перехресного злиття. ДНК, яка кодує злитий важкий ланцюг іму 29 91961 30 зв'язування добре відомі з рівня техніки й розкриті Відомі також полівалентні антитіла. Наприв патенті US 4676980 поряд з методиками перехклад, можуть бути отримані триспецифічні антитіресного зв'язування. ла [Trutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)]. У літературі також описані способи одержання III. Кон'югати та інші модифікації антагоністів біспецифічних антитіл із фрагментів антитіл. НаАнтагоністи, які використовують в заявлених приклад, біспецифічні антитіла можуть бути отриспособах, або які входять до складу заявлених мані шляхом хімічного зв'язування. Brennan et al., засобів, можуть бути кон'юговані із цитотоксичним Science, 229:81 (1985) описують спосіб, відповідно агентом. до якого інтактні антитіла розщеплюють протеоліХіміотерапевтичні агенти, корисні для одертично з одержанням F(ab')2-фрагментів. Ці фрагжання такого роду кон'югатів антагоніста й цитотоменти відновлюють у присутності зв'язувального ксичної речовини, описані вище. дитіол агента арсеніту натрію для стабілізації сусіКон'югати антагоніста й однієї або більше недніх дитіолів і запобігання утворення міжмолекувеликих молекул токсинів, наприклад, каліхеамілярних дисульфідних зв'язків. Далі Fab'цину, мейтанзину (патент US 5208020), трихотену фрагменти переводять у похідні тіонітробензоату й СС1065 також охоплюються даним описом. Від(TNB). Одне з похідних Fab'-TNB потім назад пеповідно до одного варіанта здійснення винаходу реводять в Fab'-тіол відновленням меркаптоетиантагоніст кон'югують з однією або більше молеламіном і змішують із еквимолярною кількістю покулами мейтанзину (наприклад, від близько 1 до хідного Fab'-TNB з одержанням біспецифічного близько 10 молекул мейтанзину на молекулу антаантитіла. Отримані в такий спосіб біспецифічні гоніста). Мейтанзин, наприклад, може бути переантитіла можуть використовуватися як агенти для ведений у форму May-SS-Me, яка може бути відселективної іммобілізації ферментів. новлена у форму May-SH3 й введений у реакцію з Успіхи сучасної біотехнології забезпечили момодифікованим антагоністом [Chari et al., Cancer жливість безпосереднього виділення Fab'-SH фраResearch 52:127-131 (1992)] для одержання кон'югментів з Е. coli, які можуть бути хімічним способом гата мейтанзиноїд-антагоніст. зв'язані з утворенням біспецифічних антитіл. Альтернативно, антагоніст кон'югують з однією Shalaby et al., J. Exp. Med., 175:217-225 (1992) або більше молекулами каліхеаміцину. Антибіотиописують спосібодержання повністю гуманізоваки ряду каліхеаміцину здатні генерувати пошконих біспецифічних антитільних F(ab')2 молекул. дження дволанцюгової молекули ДНК у субпікомоКожен Fab'-фрагмент окремо виділяють із Е. coli і лярних концентраціях. Структурні аналоги піддають прямому хімічному зв'язуванню in vitro з каліхеаміцину, які можуть бути використані на одержанням біспецифічних антитіл. Отримані в практиці, включають, без обмежень вказаними, 1I, I I I I такий спосіб біспецифічні антитіла здатні зв'язува2, 3 , N-ацетил- 1 , PSAG й 1 [Hinman et al. тися із клітинами, які понадекспресують ЕrbВ2Cancer Research 53:3336-3342 (1993) і Lode et al. рецептори, і нормальними Т-клітинами, ініціюючи Cancer Research 58:2925-2928 (1998)]. літичну активність цитотоксичних лімфоцитів люЕнзиматично активні токсини і їх фрагменти, дини відносно пухлинних клітин раку грудей. які можуть бути використані на практиці, включаВідомі також різні способи одержання й видіють А ланцюг дифтерійного токсину, незв'язувальлення біспецифічних антитільних фрагментів безні активні фрагменти дифтерійного токсину, А лапосередньо з культури рекомбінантних клітин. Нанцюг екзотоксину (Pseudomonas aerations), А приклад, біспецифічні антитіла можуть бути ланцюг рицину, А ланцюг барину, А ланцюг модеотримані при використанні «лейцинових блискацину, альфа-саркин, білки Aleurites fordii, білки вок» [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 діантину, білки Phytolaca americana (РАРІ, ΡАРII й (1992)]. «Лейцинові зіпперні пептиди» з Fos й Jun PAP-S), інгібітор Momordica charantia, курцин, кробілків зв'язують із Fab'-ділянками двох різних антитин, інгібітор Sapaonaria offlcinalis, гелонін, мітогетіл шляхом злиття генів. Гомодимери антитіл потім лін, рестриктоцин, феноміцин, еноміцин і трикотевідновлюють у шарнірній ділянці з одержанням цени. Див., наприклад, WO 93/21232, опубл. 28 мономерів і далі повторно окисляють до антитільжовтня 1993 р. них гетеродимерів. Ця методика може використоДаний винахід також стосується антагоністів, вуватися й для одержання гомодимерів антитіл. які кон'юговані із сполукою, яка має нуклеолітичну Технологія «діатіл», описана Hollinger et al., Proc. активність (наприклад, рибонуклеазою або ДНКNatl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993), передендонуклеазою, такою, як дезоксирибонуклеаза, бачає альтернативний підхід до одержання біспеДНКаза). цифічних фрагментів антитіл. Ці фрагменти місДля одержання антагоністів, кон'югованих з тять варіабельний домен важкого ланцюга (VH), радіоактивними сполуками, можуть використовузв'язаний з варіабельним доменом легкого ланцюватися різноманітні радіоактивні ізотопи. Приклага (VL) за допомогою лінкера, який є настільки кодами таких ізотопів можуть служити At211, I131, I125, ротким, що забезпечує взаємозв'язок між двома Y90, Re186, Re188, Sm153, Ві212, Ρ32 і радіоактивні ізодоменами одного й того ж ланцюга. Відповідно, топи Lu. (VH) і (VL) домени одного фрагмента утворюють Кон'югати антагоніста й цитотоксичного агента пари з комплементарними (VH) і (VL) доменами можуть бути отримані за допомогою різних агентів, іншого фрагмента, формуючи антигензв'язувальні які зв'язують біфункціональні білки, таких, як Nділянки. Відома й інша методика одержання фрагсукцинімідил-3-(2-піридилдитіол) пропіонат ментів біспецифічних антитіл при використанні (SPDP), сукцинімідил-4-(N-малеімідометил) циклоодноланцюгових Fv (s Fv) димерів [см. Gruber et al., гексан-1-карбоксилат, імінотіолан (IT), біфункціоJ. Immunol, 152:5368 (1994)]. нальні похідні імідоефірів (наприклад, диметила 31 91961 32 дипімідат HCL), активні складні ефіри (такі, як димодифіковані за аміногрупами за допомогою фесукцинімідилсуберат), альдегіди (такі, як глутароноксіацетилових або фенілацетилових груп, відповий альдегід), біс-азидо сполуки [такі, як біс (рвідно, у вільні ліки. Альтернативно, антитіла з еназидобензоїл)-гександіамін], похідні біс-діазонію зиматичною активністю, відомі з рівня техніки як [такі, як біс (р-діазоній бензоїл)-етилендіамін], діі«абзими», можуть використовуватися для перетзоціанати (такі, як толуол 2,6-діізоціанат) і бісворення проліків, заявлених відповідно до винахоактивні сполуки фтору (такі, як 1,5-дифтор-2,4ду, у вільні активні ліки [див., наприклад, Massey, динітробензол). Наприклад, рициновий імунотокNature 328:457-458 (1987)]. Кон'югати антагоніста з син може бути отриманий, як описано Vitetta et al., абзимами, які використовують для доставки абзиScience 238:1098 (1987). Прикладом хелатуючого му до популяції пухлинних клітин, можуть бути агента, який використовується для кон'югування отримані, як розкрито в даному описі. радіонуклеотиду з антагоністом, може служити Ферменти, заявлені відповідно до даного вимічена С14 1-ізотіоціанатобензил-3-метилдіетилен находу, можуть бути ковалентно зв'язані з антаготриамінпентаоцтова кислота (MX-DTPA). Див., ністом за допомогою методик, добре відомих з наприклад, WO 94/11026. Лінкер може бути розрівня техніки, наприклад, при використанні гетерощеплювальним і забезпечувати вивільнення цитобіфункціональних перехресно-зв'язувальних реатоксичного лікарського препарату в клітину. Нагентів, описаних вище. Альтернативно, за допомоприклад, може бути використаний чутливий до гою добре відомої технології рекомбінантних ДНК кислоти лінкер, чутливий до пептидази лінкер, диможуть бути отримані білки злиття, які містять метиловий лінкер або дисульфідвмісний лінкер принаймні антигензв'язувальну ділянку заявленого (Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992). відповідно до даного винаходу антагоніста, з'єднаАльтернативно, можуть бути отримані білки ну принаймні з функціонально активною ділянкою злиття, які містять антагоніст і цитотоксичний ферменту, заявленого відповідно до даного винаагент, наприклад, за допомогою рекомбінантної ходу [див., наприклад, Neuberger et al., Nature технології або пептидним синтезом. 312:604-608 (1984)]. Відповідно до ще одного варіанта здійснення Інші модифікації антагоніста розкриті в даному винаходу антагоніст може бути кон'югований з описі. Наприклад, антагоніст може бути зв'язаний з рецептором (таким, як стрептавідин) для викорисодним із численних полімерів небілкової природи, тання з метою попереднього націлювання на пухнаприклад, поліетиленгліколем, поліпропіленглілину, коли кон'югат антагоніста з рецептором ввоколем, поліоксіалкіленами або співполімерами дять пацієнтові, видаляють кон'югат, який не поліетиленгліколю й поліпропіленгліколю. зв'язався, із циркуляції за допомогою спеціального Розкриті в даному описі антагоністи можуть агента й потім вводять ліганд (наприклад, авідин), бути занурені в ліпосоми. Ліпосоми, які містять який кон'югований із цитотоксичним агентом (наантагоніст, можуть бути отримані методами, відоприклад, радіонуклеотидом). мими з рівня техніки, наприклад, описаними Відповідно до даного винаходу антагоністи Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Set USA 82:3688 можуть бути кон'юговані з ферментом, який акти(1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA вує проліки, який перетворює проліки (наприклад, 77:4030 (1980), а також у патентах US 4485045 й пептидил хіміотерапевтичний агент, див. WO 4544545 і заявці WO 97/38731, опубл. 23 жовтня 81/01145) в активні ліки проти злоякісних пухлин. 1997 p. Ліпосоми зі збільшеним часом циркуляції в Див, наприклад, WO 88/07378 і патент US крові розкриті в патенті US 5013556. 4975278. Особливо переважні ліпосоми можуть бути Фермент, який входить до складу таких кон'юотримані методом зворотно-фазового випарювангатів, може бути представлений ферментом, здатня й сформовані композицією ліпідів, яка включає ним впливати на проліки таким чином, щоб перетфосфатидилхолін, холестерол і фосфатидилетаворювати їх в більш активну, цитотоксичну форму. ноламін, модифікований поліетиленгліколем Ферменти, які можуть бути використані в заяв(PEG-РЕ). Ліпосоми пропускають через фільтри із леному способі, включають, без обмежень вказазаданим розміром пор для одержання ліпосом ними, алкалінфосфатазу, здатну перетворювати потрібного діаметра. Fab'-фрагменти антитіла, фосфат-вмісні проліки у вільні ліки; арилсульфазаявленого відповідно до даного винаходу, можуть тазу, здатну перетворювати сульфатвмісні проліки бути кон'юговані з ліпосомами, як описано Martin et у вільні ліки; цитозиндезаміназу, здатну перетвоal., J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982) у реакції рювати нетоксичний 5-фторцитозин у протиракові утворення міжланцюгових дисульфідних зв'язків. ліки 5-фторурацил; протеази, такі, як претеаза З ліпосомами може бути кон'югований хіміотеSerratia, термолізин, субтилізин, карбоксипептидарапевтичний агент. Див. Gabizon et al., J. National зи й катепсини (такі, як катепсини В й L), які перетCancer Inst. 81 (19) 1484 (1989). ворюють пептидвмісні проліки у вільні ліки; DДаним винаходом охоплюються також модифіаланілкарбоксипептидази, конвертуючі проліки, які кації амінокислотних послідовностей білкових або містять D-амінокислотні замісники; ферменти, які пептидних антагоністів. Наприклад, при необхідрозщеплюють вуглеводи, такі, як бетаності можуть бути поліпшені зв'язувальна афінгалактозидаза й нейрамінідаза, які розщеплюють ність та/або інші біологічні властивості антагоніста. глікозиловані проліки з утворенням вільних ліків; Варіанти амінокислотних послідовностей антагонібета-лактамаза, яка розщеплює ліки, модифіковаста одержують введенням відповідних нуклеотидні за допомогою бета-лактамів, у вільні ліки; пеніних замін у послідовність нуклеотидів, яка кодує цилінамідази, такі, як пеніцилін V амідаза або пеантагоніст, або шляхом пептидного синтезу. Такі ніцилін G амідаза, які перетворюють ліки, модифікації включають, наприклад, делецїї, і/або 33 91961 34 інсерції, і/або заміни амінокислотних залишків у варіанти антагоністів піддають скринінгу на задану білковій або пептидній послідовності антагоніста. активність. Для одержання антагоністів, які мають необхідні Вставки амінокислотних послідовностей вклювластивості, можуть бути використані будь-які чають аміно- і карбокси-кінцеві злиті ділянки, які комбінації амінокислотних делецій, інсерцій і зазмінюються за довжиною від одного залишку до мін. Амінокислотні заміни можуть змінювати постполіпептиду, що містить сто або більше амінокистрансляційну модифікацію антагоніста, наприклад, лотних залишків, а також ділянки з одного або дезмінювати число або положення сайтів глікозилукількох амінокислотних залишків, які знаходяться вання. всередині послідовностей. Прикладами кінцевих Корисним методом ідентифікації певних аміновставок є антагоністи з N-кінцевим залишком метікислотних залишків або ділянок молекули антагооніну або антагоністи, злиті із цитотоксичним полініста, які є переважними для мутагенезу, є "аланіпептидом. Інші інсерційні варіанти антагоністів нсканувальний метагенез". Вказаний метод опису включають антагоністи, злиті за N- і С-кінцевими Cunningham й Wells, Science 244:1081-1085 (1989). ділянками з молекулами ферментів або поліпепВідповідно до даного методу ідентифікують залитидів, які підсилюють час напівжиття антагоністів у шок або групу залишків-мішеней (наприклад, засироватці крові. ряджені залишки, такі, як arg, asp, his, lys й glu) і До іншого типу варіантів антагоністів належать заміщають їх нейтральними або негативно заряваріанти, засновані на заміщенні амінокислотних дженими амінокислотами (найбільш переважно, залишків. У цих варіантах принаймні один аміноаланіном або поліаланіном) з досягненням взаєкислотний залишок у молекулі антагоніста заміщемодії амінокислот з антигеном. Такі положення ний на інший залишок. Сайти, найбільш переважні амінокислот, які виявляють функціональну чутлидля здійснення заміщувального мутагенезу у мовість до замін, далі модифікують введенням вкалекулі антитіла, включають гіперваріабельні ділянзаних амінокислот або інших варіантів. Таким чики, але каркасні ділянки також можуть бути задіяні. ном, у той час як сайт введення варіантів Консервативні заміни наведені в Таблиці під загоамінокислотної послідовності переддетерміноваловком "Переважні заміни". Якщо такі заміни зміний, природа мутації per se не обов'язково може нюють біологічну активність, то вони є найбільш бути переддетермінованою. Наприклад, для анапереважними й наведені в Таблиці під заголовком лізу здійснення мутації в даному сайті аланін"Найбільш переважні заміни" або розкриваються сканувальний або вибірковий мутагенез проводять нижче з посиланням на класи амінокислот. Такі у кодоні-мішені й ділянці-мішені й експресовані заміни вводять у молекули антагоністів й отримані продукти піддають скринінгу. Таблиця Початкові залишки Ala (A) Arg (R) Asn (N) Asp (D) Cys (С) Gln (Q) Glu (E) Gly (G) His (H) lle (I) Leu (L) Lys (K) Met (M) Phe (F) Pro (P) Ser (S) Thr (T) Trp (W) Tyr (Y) Val (V) Найбільш переважні заміни val; leu; ile lys; gln; asn gln; his; asp, lys; arg glu; asn ser; ala asn; glu asp; gln ala asn; gln; lys; arg leu; val; met; ala; phe; норлейцин норлейцин; ile; val; met; ala; phe arg; gln; asn leu; phe; ile leu; val; ile; ala; tyr ala thr ser tyr; phe trp; phe; thr; ser ile; leu; met; phe; ala; норлейцин Істотні модифікації біологічних властивостей антагоністів супроводжуються вибірними замінами, які значно відрізняються за здатністю підтримувати (а) структуру поліпептидного скелету в ділянці заміни, наприклад, складчасту або спіральну конформацію, (б) заряд або гідрофобність молекули в сайті-мішені й (в) розміри бокового Переважні заміни val lys gln glu ser asn asp ala arg leu ile arg leu tyr ala thr ser tyr phe leu ланцюга. Природні залишки поділяються на групи залежно від загальних властивостей бокових ланцюгів: гідрофобні: норлейцин, met, ala, val, leu, ile; нейтральні гідрофільні: cys, ser, thr; кислі: asp, glu; основні: asn, gln, his, lys, arg; 35 91961 36 залишки, які впливають на орієнтацію ланцюТрипептидні послідовності аспарагін-Х й аспарагів: gly, pro й гін-Х-треонін, де X являє собою будь-яку амінокиароматичні: tip, tyr, phe. слоту, крім проліну, є послідовностями для ферНеконсервативні заміни включають заміни ментативного приєднання вуглеводної молекули амінокислотних залишків одного класу на амінодо бокового ланцюга аспарагіну. Таким чином, кислотні залишки іншого класу. наявність трипептидних послідовностей у складі Цистеїнові залишки, які не залучені в підтриполіпептиду створює потенційний сайт глікозилумання належної конформації антагоніста, також вання. О-зв'язане глікозилування полягає в прикможуть бути заміщені, в основному, серином, для ріпленні одного із цукрів, до яких належать Nпосилення стійкості молекули до окислення й ацетилгалактозамін, галактоза або ксилоза, до запобігання небажаного перехресного зв'язувангідроксіамінокислоти, здебільшого серину або ня. Навпроти, цистеїнові зв'язки можуть бути треоніну, хоча 5-гідроксипролін або 5введені в молекулу антагоніста для поліпшення її гідроксилізин також можуть бути використані. стабільності (особливо в тих випадках, коли антаДодавання сайтів глікозилування до антагогоніст являє собою фрагмент антитіла, такий, як ніста супроводжується зміною амінокислотної Fv фрагмент). послідовності таким чином, що вона включає одОсобливо переважні варіанти антагоністів, ну або більше описаних вище трипептидних посзасновані на заміщенні амінокислот, включають лідовностей (для N-зв'язаних сайтів глікозилуваріанти, у яких заміщення зроблені в гіперваріавання). Зміна також може бути зроблена бельних ділянках вихідного антитіла. В основнододаванням, заміщенням одного або більше заму, такі варіанти, відібрані для подальшої модилишків серину або треоніну в амінокислотній посфікації, мають поліпшені біологічні властивості по лідовності вихідного антагоніста (сайти Овідношенню до вихідного антитіла, з якого вони зв'язаного глікозилування). отримані. Підходящим способом одержання таМолекули нуклеїнової кислоти, які кодують ких варіантів є афінне дозрівання при викорисваріанти амінокислотних послідовностей антаготанні фагово-дисплейної методики. Коротко, деніста, одержують за допомогою різноманітних кілька сайтів гіперваріабельної ділянки способів, добре відомих фахівцям у даній галузі. (наприклад, 6-7 сайтів) піддають мутагенезу з До таких способів належать (без обмежень вкаодержанням всіх можливих амінокислотних замін заними) виділення нуклеїнової кислоти із прироу кожному сайті. Отримані в такий спосіб варіанти дних джерел (у випадку наявності природних ваантитіла далі виявляють у моновалентній формі ріантів амінокислотних послідовностей) або на поверхні частинок нитчастого бактеріофага у одержання за допомогою опосередкованого оліформі їх злиття із продуктом гена III бактеріофага гонуклеотидами (або сайт-специфічного) мутагеМ13, упакованого у фагову частинку. Φаговонезу, мутагенезу за допомогою ПЛР, а також за дисплейні варіанти потім скринують на їх біологідопомогою касетного мутагенезу раніше отримачну активність (наприклад, афінність зв'язуванних варіантних або неваріантних версій антагоніня), як описано в даній заявці. Для того, щоб ідеста. нтифікувати можливі сайти модифікації Може виявитися бажаним модифікувати заягіперваріабельних ділянок, можна здійснити алавлений відповідно до винаходу антагоніст із менін-сканувальний мутагенез, який дозволяє ідентою надання йому ефекторних функцій, напритифікувати залишки гіперваріабельних ділянок, клад, підсилити ADCC та/або CDC антагоніста. які в значній мірі забезпечують зв'язування антиЦе може бути досягнуто введенням однієї або гену. Альтернативно або додатково може виявибільше амінокислотних замін в Fc-ділянку антитітися корисним проаналізувати кристалічну струкла, яке є антагоністом. Альтернативно або додатуру комплексу антиген-антитіло для того, щоб тково в Fc-ділянку можна ввести один або більше ідентифікувати точки контакту між антигеном й цистеїнових залишків, тим самим, забезпечуючи антитілом. Такі контактуючі залишки й сусідні утворення міжланцюгового дисульфідного зв'язку залишки є потенційними мішенями для заміщенв цій ділянці. Отримане в такий спосіб гомодименя, відповідно до методик, представлених у дарне антитіло може мати поліпшену здатність до ному описі. Після створення таких варіантів, їх інтерналізації та/або підвищеного опосередковапіддають скринінгу, як описано в даній заявці, і ну комплементом кілерну активність і підвищену антитіла з поліпшеними властивостями, як це ADCC. Див. Caron et al., J. Exp. Med. 176:1191встановлюється в одному чи декількох відповід1195 (1992) Shopes, В., J. Immunol. 148:2918:2922 них дослідженнях, відбирають для подальшої (1992). Гомодимерні антитіла з підвищеною промодифікації. типухлинною активністю можуть бути отримані Іншим амінокислотним варіантом антагоніста при використанні гетеробіфункціональних перехє такий, при якому змінюється початковий проресно-зв'язувальних лінкерів, описаних Wolf et al., філь глікозилування антагоніста. Під зміною маCancer Research 53:2560-2565 (1993). Альтернається на увазі делеція однієї або більше вуглевотивно, може бути отримане антитіло, яке має дві дної молекули антагоніста, і/або додавання Fc-ділянки й, відповідно, підвищену здатність до одного або більше сайтів глікозилування, які відкомплементопосередкованого лізису й підвищену сутні в антагоніста. ADCC. Див. Stevenson et al. Anticancer Drug Глікозилування поліпептидів звичайно є NDesign 3:219-230 (1989). зв'язаним або О-зв'язаним. N-зв'язане глікозилуДля збільшення часу напівжиття антагоніста вання являє собою приєднання вуглеводної мов сироватці крові в нього може бути введений лекули до бокового ланцюга залишку аспарагіну. епітоп, який зв'язує "рятувальний рецептор" (осо 37 91961 38 бливо, антитільний фрагмент), як описано, наляють несприятливого впливу одна на одну. Наприклад, у патенті US 5739277. Який використоприклад, може виявитися бажаним ввести до вується тут термін "епітоп, який зв'язує рятувальскладу композиції цитотоксичний агент, хіміотений рецептор", стосується епітопу на Fc-ділянці рапевтичний агент, цитокін або імуносупресор молекули Ig (наприклад, lgG1, IgG2, IgG3 або (наприклад, що діє на Т-клітини, такий, як циклоIgG4), який відповідає за збільшення часу напівспорин або антитіло, яке зв'язує Т-клітини, наприжиття молекули Ig у сироватці крові in vivo. клад, яке взаємодіє з LFA-1). Ефективна кількість IV. Фармацевтичні композиції таких інгредієнтів залежить від кількості антагоніТерапевтично активні композиції антагоніста, ста, який міститься в композиції, характеру заякі використовують відповідно до даного винахохворювання або порушення, які підлягають лікуду, одержують змішуванням антагоніста з необванню, і інших факторів, описаних вище. хідним ступенем чистоти й необов'язкових фарЗвичайно такі компоненти використовуються в мацевтично прийнятних носіїв, наповнювачів або тих же самих дозах і вводяться тим же самим стабілізаторів [Remington s Pharmaceutical шляхом, як описано вище, або ж їх кількість стаSciences, 16-e видання, під ред. Osol, A. (1980)] і новить біля 1-99% вказаних доз. зберігають у формі ліофілізованих складів або Активні інгредієнти можуть бути занурені в водних розчинів. Підходящі носії, наповнювачі мікрокапсули, які одержують, наприклад, метоабо стабілізатори, які нетоксичні для пацієнта у дом коацервації або міжфазної полімеризації, використовуваних дозах і концентраціях, вклюнаприклад, гідроксиметилцелюлозні або желатичають буфери, такі, як фосфатний, цитратний і нові мікрокапсули або полі-метилметацилатні буфери на основі інших органічних кислот; антиомікрокапсули, відповідно, а також у колоїдні сисксиданти, у тому числі аскорбінову кислоту й метеми доставки лікарських препаратів (наприклад, тіонін; консерванти, такі, як октадецилдиметилліпосоми, альбумінові мікросфери, мікроемульсії, бензил хлорид амонію, хлорид гексаметонію, наночастинки й монокапсули) або в макроемульхлорид бензалконію, хлорид бензетонію, фенол, сії. Такі методи описані в Remington s бутил або бензиловий спирт, алкіл-парабени, Pharmaceutical Sciences, 16-е видання, під ред. наприклад, метил- або пропіл-парабен, катехол, Osol, A. (1980). резорцинол, циклогексанол, 3-пентанол й мМожуть бути отримані препарати з підтримукрезол); пептиди низької молекулярної маси (меваним вивільненням. Прикладами таких препаранше 10 амінокислотних залишків); білки, такі, як тів служать напівпроникні матриці твердих гідросироватковий альбумін, желатин або імуноглобуфобних полімерів, які містять антагоніст, які ліни; гідрофільні полімери, такі, як полівінілпіромають певні параметри, наприклад, знаходяться лідон; амінокислоти, такі, як гліцин, глутамін, асу вигляді плівки або мікрокапсул. Приклади матпарагін, гістидин, аргінін або лізин; риць із підтримуваним вивільненням включають моносахариди, дисахариди й інші вуглеводи, у складні поліефіри, гідрогелі [наприклад, полі(2тому числі глюкоза, маноза або декстрани; хелагідроксіетил-метакрилат або полівініловий спирт], туючі агенти, такі, як EDTA; цукри, такі, як сахаполілактиди (патент US 3773919), співполімери Lроза, манітол, трегалоза або сорбітол; протиіони, глутамінової кислоти й етил-L-глутамату, етиякі утворюють солі; комплекси металів (наприленвінілацетат, який не розпадається, співполіклад, Zn-білкові комплекси) і/або неіонні сурфакмери молочної кислоти й гліколевої кислоти, які танти, такі, як TWEEN , PLURONICS або полірозпадаються, такі, як LUPRON DEPOT (ін'єкоетиленгліколь (PEG). вані мікросфери, які містять співполімери молочПриклади композицій на основі антитіл до ної кислоти йгліколевої кислоти й лейпролідацеCD-20 описані в заявці WO 98/56418, включеної в тат) і полі-D-(-)-3-гідроксимасляну кислоту. даний опис винятково як посилання. У вказаній Композиції, які використовують in vivo, повинзаявці розкриваються рідкі мультидозові компоні бути стерильними, що забезпечується фільтзиції, які містять 40 мг/мл ритуксимабу, 25 мМ руванням через стерилізуючі мембранні фільтри. ацетату, 150 мм трегалози, 0.9% бензилового V. Терапія антагоністами спирту, 0.02% полісорбату при рН 5.0, яка має Даний винахід стосується терапії субпопулячас зберігання два роки при 2-8°С. Інші фармації ссавців, особливо, людей, які страждають від цевтичні композиції на основі антитіл до CD-20, аутоімунного захворювання або схильних до ньоякі представляють інтерес, містять 10 мг/мл ритуго, у яких виявляється неадекватна відповідь на ксимабу в 9.0 мг/мл хлориду натрію, 7.35 мг/мл попереднє або поточне лікування інгібітором дигідрату цитрату натрію, 0.7 мг/мл полісорбату TNF-альфа. У цілому, ссавця, який підлягає те80 і стерильну воду для ін'єкцій при рН 6.5. рапії відповідно до заявленого винаходу, ідентиЛіофілізовані композиції, придатні для підшфікують у процесі одного або більше курсів лікукірного введення, описані в заявці WO 97/04801. вання одним або більше інгібіторами TNF-альфа, Такі ліофілізовані композиції можуть бути відновтакими, як етанерсепт (ENBREL ), інфліксимаб лені для застосування за допомогою підходящого (REMICADE ) або адалімумаб (HUMIRA ), на розчинника з досягненням високої концентрації підставі виявлення в нього неадекватної відповіді білка й далі введені підшкірно ссавцеві, який потна попереднє або поточне лікування інгібітором ребує лікування. TNF-альфа, оскільки воно виявляється токсичним Фармацевтичні композиції можуть містити біта/або недостатньо ефективно. Однак винахід не льше однієї активної сполуки, якщо це необхідно обмежується оцінкою попередньої стадії терапії з для лікування певного захворювання, переважно, використанням інгібітора TNF-альфа, наприклад, з комплементарними активностями, які не виявпацієнт може вважатися таким, який має схиль 39 91961 40 ність до прояву токсичності, наприклад, кардіолоблизько 50 мг/м2 до близько 200 мг/м2, а наступна гічної, по відношенню до інгібітора TNF-альфа до від близько 250 мг/м поверхні тіла до близько того, як почате лікування, або ж пацієнт може 1000 мг/м поверхні тіла. бути вибраний, як такий, що в небажаний спосіб Як відзначалося вище, вказані передбачувані відповідає на терапію інгібітором TNF-альфа. кількості антагоніста суттєво залежать від конкАутоімунні захворювання, які підлягають ліретної ситуації й підбираються обережно. Вирікуванню відповідно до даного винаходу, наведені шальним фактором вибору дози й схеми її ввевище в розділі "Визначення". Переважними задення є той кінцевий результат, якого хочуть хворюваннями є ревматоїдний артрит, псоріатичдосягти. Наприклад, відносно високі дози можуть ний артрит або хвороба Крона. бути необхідні первинно для лікування захворюУ цілому, ссавець, який підлягає лікуванню вання, яке постійно розвивається, і гострого завідповідно до заявленого винаходу, не має злояхворювання. Для досягнення максимальної ефекісної В-клітинної патології. ктивності залежно від захворювання або Відповідно до одного варіанта здійснення, порушення антагоніст вводять якомога раніше по заявлений винахід стосується способу терапії, відношенню до першого симптому, прояву або спрямованому на зниження побічних ефектів (навиявлення захворювання або порушення або до приклад, інфекцій, серцевої недостатності й депостановки діагнозу, а також під час ремісії замієлінізації), які супроводжують лікування за дохворювання або порушення. помогою інгібітора TNF-альфа. Антагоніст може вводитися будь-яким підхоКомпозиції, які містять антагоніст, який зв'ядящим способом, наприклад, парентеральним, зується з поверхневим маркером В-клітин, мопідшкірним, інтраперитонеальним, внутрішньолежуть бути приготовлені, дозовані й введені відпогеневим й інтраназальним, а також, якщо це бавідно до існуючої медичної практики. У контексті жано, проводять місцеве імуносупресивне лікуданого опису значущими факторами по відновання, застосовуючи антагоніст безпосередньо в шенню до використовуваної терапії є природа зоні ушкодження. Парентеральні способи ввезахворювання або порушення, яке підлягає лікудення включають у тому числі внутрішньом'язованню, вид ссавця, клінічний стан пацієнта, тяжвий, внутрішньовенний і внутрішньоартеріальний. кість захворювання або порушення, ділянка, у яку Крім того, антагоніст може вводитися пульсовою необхідно доставити діючу речовину, спосіб ввеінфузією, наприклад, зі зниженням дози. Доза, дення лікарського засобу, схема лікування та інші яку вводять шляхом ін'єкцій, найбільше переважфактори, відомі в медичній практиці. Терапевтично, внутрішньовенних або підшкірних, залежить но ефективна кількість антагоніста, яку необхідно частково від того, чи є введенням короткостроковвести пацієнтові, підбирається залежно від вкавим або постійним. заних факторів. Разом з антагоністом можуть вводитися інші У цілому, терапевтично ефективна кількість сполуки, такі, як цитотоксичні агенти, хіміотераантагоніста, яку вводять парентерально, змінюпевтичні агенти, імуносупресивні агенти та/або ється від близько 0.1 до близько 20 мг на кг маси цитокіни. Комбіноване введення включає спільне тіла пацієнта розраховуючи на день, причому введення при використанні окремих препаратів звичайна початкова доза антагоніста становить або однієї фармацевтичної композиції й послідоблизько 2-10 мг/кг. вне введення в певному порядку, причому існує Переважним антагоністом є антитіло, наприперіод часу, коли два (або всі) активні агенти одночасно проявляють свою біологічну активність. клад, таке, як RITUXAN , яке не кон'юговане із Для ревматоїдного артриту й інших аутоімунних цитотоксичним агентом. Підходящими дозами захворювань антагоніст (наприклад, антитіло до некон'югованого антитіла, є, наприклад, такі дози, CD20) може бути об'єднаний з одним або більше як від близько 20 мг/м2 поверхні тіла до близько DMARDs, таких, як гідроксихлороквін, сульфаза1000 мг/м2 поверхні тіла. Відповідно до одного з лазин, метотрексат, лефлуномід, азатіоприн, Dваріантів здійснення винаходу доза антитіла відпеніциламін, Gold (перорально), Gold (внутрішрізняється від такої, яка у цей час рекомендована ньом'язово) міноциклін, циклоспорин, імуноадсодля RITUXAN . Наприклад, можна вводити пацірбент білок А стафілокока, внутрішньовенний єнтові одну або більше доз антитіла, значно імуноглобулін (IVIG), нестероїдні протизапальні менших, ніж 375 мг/м2 поверхні тіла, наприклад засоби, глюкокортикоїди (наприклад, внутрішньодоза може змінюватися від близько 20 мг/м2 посуглобовою ін'єкцією), кортикостероїди (наприверхні тіла до близько 250 мг/м2 поверхні тіла, у клад, метилпреднізолон та/або преднізолон), тому числі від близько 50 мг/м2 до близько 200 фолат й ін. Переважно, інгібітор TNF-альфа не мг/м2 . вводять ссавцеві під час лікування антагоністом Приклади дозових режимів включають 375 CD20. мг/м2 поверхні тіла щотижня протягом чотирьох Крім використання білкового антагоніста, тижнів або 1000 мг/м2 поверхні тіла двічі, наприякий вводять пацієнтові в терапевтичних цілях, клад, у день 1 й 15. даний винахід стосується застосування антагоніБільш того, можна вводити одну або більше ста для генної терапії. Таке застосування заснопочаткових доз антитіла й далі одну або більше ване на використанні нуклеїнової кислоти, яка наступних доз, причому наступна доза антитіла в кодує терапевтично ефективну кількість антагонімг в розрахунку на м2 поверхні тіла перевищує ста. Див., наприклад, заявку WO 96/07321, опубл. попередню. Наприклад, початкова доза може 14 березня 1996 p., що стосується генної терапії, становити від близько 20 мг/м2 поверхні тіла до близько 250 мг/м2 поверхні тіла, у тому числі від 41 91961 42 яка забезпечує синтез внутрішньоклітинних антиКандидатами для такої терапії, відповідно до тіл. даного прикладу, є пацієнти, у яких спостерігалаІснують два основні підходи введення нуклеся неадекватна відповідь на попередню або роїнової кислоти (необов'язково вбудованої у векточну терапію етанерсептом, інфліксимабом тор) у клітини пацієнта: in vivo й ex vivo. Для доста/або адалімумабом, зв'язана з токсичністю або тавки нуклеїнової кислоти in vivo її безпосереднім недостатньою ефективністю (етанерсепт 3 місячином ін'єкують пацієнтові, звичайно в ту ділянку, ців у дозі 25 мг два рази на тиждень або принайде потрібний вплив антагоніста. Для терапії ex мні 4 інфузії інфліксимабу 3 мг/кг) цих препараvivo виділяють клітини пацієнта, вводять у них тів. нуклеїнову кислоту й у такий спосіб модифіковані Пацієнти при скринінгу й рандомізованих доклітини назад вводять пацієнтові як безпосередслідженнях можуть мати значення показника нім чином або інкапсулюють у пористі мембрани, припухлості суглобів (SJC) 8 (досліджували 66 які імплантують в організм пацієнта (див., наприсуглобів) і показника болючості суглобів (TJC) 8 клад, патенти US 4892538 й 5283187). Для вве(досліджували 68 суглобів), а також значення Сдення нуклеїнової кислоти в живі клітини існують реактивного білка 1.5 мг/дл (15 мг/л) або ШОЕ різноманітні методи. Їх вибір залежить від того, 28 мм/год, і/або ж рентгенологічні ознаки урачи вводиться нуклеїнова кислота в культивовані ження принаймні одного суглоба у вигляді ерозій клітини in vitro або ж in vivo у клітини вибраного суглобової поверхні, що специфічно для ревмахазяїна. Методика, яка підходить для перенесентоїдного артриту й визначається в основних сугня нуклеїнової кислоти в клітини ссавців in vitro, лобах, які уражаються при ревматоїдному артриті включає застосування ліпосом, електропорацію, (можна враховувати зміни в будь-яких суглобах мікроін'єкції, злиття клітин, а також DEAEкисті, зап'ястя й стоп, за винятком дистальних декстрановий і кальційфосфатпреципітуючий міжфалангових суглобів кисті). методи та багато інших. Звичайним вектором, Для терапії можна використовувати антитіло який використовують для доставки потрібного до CD20, а саме ритуксимаб (комерційно доступгена в клітини in vivo, є ретровірусний вектор. ний препарат компанії Genentech, Inc.) або гумаЯкі використовують в цей час переважні технізоване антитіло 2Н7 ν16. нології перенесення нуклеїнових кислот in vivo Пацієнтам вводять терапевтично ефективні включають трансфекцію за допомогою вірусних дози антитіла до CD20, наприклад, 1000 мг внутвекторів (таких, як аденовірусні, аденоасоційоварішньовенно в дні 1 й 15, або 375 мг/м2 внутрішні й вектори на основі вірусу простого герпесу ньовенно щотижня протягом 4 тижнів. типу І) і систем, заснованих на ліпідах (корисними Пацієнти також можуть одержувати супутню ліпідами для ліпідопосередкованої трансфекції терапію МТХ (10-25 мг/на тиждень перорально генів є, наприклад, DOTMA, DOPE й DC-Chol). У або парентерально) разом з кортикостероїдами, деяких випадках бажано зв'язати нуклеїнову кисвключаючи метилпреднізолон у дозі 100 мг внутлоту з агентом, який забезпечує її націлювання рішньовенно протягом 30 хвилин перед введенна потрібні клітини-мішені, наприклад, з антитіням антитіла до CD20 і преднізолон у дозі 60 мг лом, специфічним по відношенню до поверхневоперорально в дні лікування 2-7 й у дозі 30 мг пего мембранного клітинного білка на клітинахрорально в дні лікування 8-14 з поверненням до мішенях, лігандом, який зв'язує рецептор на кліосновної дози з 16-го дня. Пацієнти також можуть тинах-мішенях і т.д. При використанні ліпосом одержувати фолат (5 мг на тиждень) в однократдля націлювання та/або забезпечення захопленній дозі або розділеній на кілька прийомів. Протяня нуклеїнової кислоти можуть бути застосовані гом періоду лікування пацієнти можуть продовжубілки, які зв'язуються з поверхневим мембранним вати одержувати базову терапію білком, асоційованим з ендоцитозом, наприклад, кортикостероїдами ( 10 мг преднізолону в день капсидні білки або їх фрагменти, які мають тропабо його еквівалента). ність по відношенню до певного типу клітин, анПервинним кінцевим результатом може бути титіла до білків, які піддаються інтерналізації в пропорція числа пацієнтів з АСR20-відповіддю на процесі клітинного циклу, а також білки, які наці24-ому тижні, яка встановлюється при порівнянні люють нуклеїнову кислоту на внутрішньоклітинну групових відмінностей пацієнтів з використанням локалізацію й збільшують її період напівжиття в тесту Кохрана-Мантеля-Хензеля (СМН) у відноклітинах. Методика опосередкованого рецептошенні ревматоїдного фактора. рами ендоцитозу описана, наприклад, Wu et al., Можливі вторинні кінцеві результати включаJ. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987) і Wagner et ють: al., Proc. Natl. Acad. Set USA 87:3410-3414 (1990). 1. Пропорцію пацієнтів з ACR50 й ACR70 відДля ознайомлення із сучасними методиками маповідями на 24-ому тижні. Ці пацієнти можуть ркування генів і генної терапії див. огляд бути досліджені, як й у випадку первинного кінцеAnderson et al., Science 256:808-813 (1992), заяввого результату. ку WO 93/25673 і наведені в ній джерела інфор2. Зміна показника активності захворювання мації. (DAS) від початку скринінгу до 24-ого тижня. Це Приклад 1 може бути зроблене при використанні комп'ютерПацієнтові з активним ревматоїдним артриної моделі ANOVA з базовою лінією DAS, ревматом, у якого спостерігається неадекватна відпотоїдним фактором й обробкою даних, як це певідь на один або декілька інгібіторів TNF , проредбачено розробником моделі. водиться лікування антитілом, яке зв'язується з 3. Пацієнти з безумовним DAS (EULARповерхневим антигеном В-клітин CD20. відповідь) на 24-ому тижні. Такі пацієнти можуть 43 91961 44 бути виявлені при використанні тесту СМН у відвикористанні бінарної моделі або моделі, засноношенні ревматоїдного фактора. ваної на постійно повторюваних вимірюваннях, як 4. Зміни при скринінгу основних показників загальноприйнято. Діагностичний радіографічний ACR (SJC, TJC, загальна оцінка пацієнтами і їх аналіз, який включає визначення пропорції пацієлікарями, HAQ, біль, С-реактивний білок, ШОЕ). нтів, які не мають прогресивного розвитку ерозій, Для цих параметрів може бути використана опиможе бути проведений на 24-ому тижні й далі. сова статистика. Інші діагностичні кінцеві результати (напри5. Зміни при скринінгу за допомогою методиклад, повна клінічна відповідь, період відсутності ки SF-36. Описова статистика може бути застозахворювання) можуть бути проаналізовані за сована для оцінки 8 доменів і ментальних і фізидопомогою описової статистики як складової часчних компонентів. Крім того, оцінка ментальних і тини досліджень під час продовженого періоду фізичних компонентів далі може бути категоризоспостереження. вана й піддана аналізу. Зміни при скринінгу втоми (методика FACIT6. Зміна загального радіографічного показниF) можуть бути проаналізовані за допомогою ка в модифікації Шарпа, оцінка ерозії, оцінка діописової статистики. лянки, прилеглої до суглоба. Ці показники можуть Терапія РА антитілом до CD20 по відношенбути проаналізовані при використанні методики ню до пацієнтів з неадекватною відповіддю на тривалого спостереження й категоризації, як заінгібітор TNF , описана вище, може привести до гальноприйнято. поліпшеного клінічного стану відповідно до одноДіагностичні кінцеві результати й аналізи мого або більше показників кінцевих результатів, жуть включати: розкритими раніше в даній заявці. ACR (20/50/70 й ACR n) і зміна DAS на тижні 8, 12, 16, 20, 24 і далі можуть бути оцінені при 45 91961 46 47 91961 48 49 91961 50 51 91961 52 53 Комп’ютерна верстка О. Гапоненко 91961 Підписне 54 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601