Спосіб реплікації вірусу грипу в культурі

Реферат: Винахід належить до способу селекції вірусу грипу для культивування на клітинах культури тканини з метою одержати вірусний ізолят, адаптований до культури тканини. UA 100849 C2 (12) UA 100849 C2 UA 100849 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь винаходу Епідемії грипу та пандемії визнавалися протягом декількох сторіч і призвели до значної втрати життя. Вірус грипу є сегментованим РНК-вмісним вірусом, що належить родині Orthomyxoviridae. Епідемії і пандемії викликаються появою вірусів з новими компонентами оболонки, щодо яких є незначний імунітет у популяції. Ці нові компоненти є часто результатом мутації та/або змішування вірусів грипу людини і тварин. Беручи до уваги, що капсид вірусу грипу трохи плеоморфний, зовнішня поверхня тверда для всіх вірусів і складається з ліпідної оболонки, з якої виконані видимі(випуклі) спайки(шипи) з глікопротеїну двох типів: гемаглютиніну (НА або H) і нейрамінідази (NA або N). Є три типи вірусів грипу: A, B і C. Тільки вірус грипу А додатково класифікується підтипом на основі двох головних поверхневих глікопротеїнів НА і NA. Підтипи вірусу грипу А додатково класифікуються штамами. Вірус грипу В інфікує тільки ссавців і викликає захворювання у людей, але взагалі не настільки серйозне, як тип А. Віруси грипу С також інфікують тільки ссавців, але викликають тільки дуже помірний респіраторний розлад у дітей. Вони є генетично та морфологічно відмінними від типів A і B. Вірус грипу А інфікує широку розмаїтість тварин, включаючи ссавців, наприклад, людей, коней, собак, свиней, тхорів і птахів, наприклад, качки, курчата та індики. Відомі 16 НА серотипів і 9 серотипів NA. Птахи є особливо важливими резервуарами, що генерують пули генетично/антигенно різноманітних вірусів, які повертаються у людську популяцію через тісний контакт між людьми та тваринами. Свині є пермісивними щодо людських і пташиних штамів. Через цю незвичайну особливість свиней вважають "змішувальним резервуаром", що дозволяє генетичний обмін між пташиними та людськими вірусами, коли та ж сама клітина інфікована обома типами вірусу. Геном вірусу грипу складається з єдиного ланцюга (-) РНК в 8 сегментах (7 у Грипі C). Структура генома відома більш детально через величезну кількість генетичного дослідження (звичайне і молекулярне), що було зроблене. Кожен сегмент кодує один або два вірусних протеїнів. Епідемії і пандемії, як вважають, відбуваються через генетичну зміну в НА і NA протеїнах вірусу грипу двома різними способами: антигенний дрейф та антигенна мутація. Антигенний дрейф постійно відбувається, тоді як антигенна мутація трапляється тільки іноді. Тип А вірусу грипу піддається обом видам змін; тип В вірусу грипу змінюється тільки більш поступовим процесом антигенного дрейфу. Антигенний дрейф відноситься до незначних, поступових змін, які відбуваються внаслідок точкових мутацій у двох генах, які містять генетичний матеріал для продукування головних поверхневих протеїнів НА і NA. Антигенна мутація відноситься до різкої, головної зміни для продукування нового підтипу вірусу грипу А у людей, що у цей час не циркулював серед людей. Антигенна мутація може відбутися або безпосередньою трансмісією тварина (домашній птах) людина, або через змішування людського грипу A і генів вірусу грипу А тварин, щоб створити новий людський підтип вірусу грипу А через процес, названий генетичною рекомбінацією. Антигенна мутація приводить до нового людського підтипу грипу А. Генетична рекомбінація відбувається, коли два різних віруси грипу інфікують ту ж саму клітину та використовується один або більше сегментів РНК. Якщо сегмент, що передається, є НА, наприклад, це може призвести до появи нового вірусного штаму, що є антигенно новим входом у популяцію з незначним імунітетом або без нього. Результат може привести до епідемії та/або пандемії. Входження вірусів грипу в клітини полегшено, завдяки зв'язуванню НА спайок з мукопротеїнами, що містить кінцеву групу N-ацетил нейрамінової кислоти (NANA = сіалова кислота). Після зв„язування, частина піддається ендоцитозу через облямовані ямки в ендоцитозному пухирці і нарешті в ендосомах. Вони підкислені клітиною, pН приблизно 5,0, НА мономери розщеплені трипсиноподібними ензимами в ендосомах, щоб активізувати їх для інтерналізації. Після інтерналізації, відбувається вірусна реплікація, що приводить до симптомів грипу. Є значне занепокоєння про недавні спалахи грипу. Серйозний тип респіраторного захворювання був ідентифікований у собак, що відбувається внаслідок вірусу собачого грипу (CIV). Це респіраторне захворювання, як виявилося, було дуже контагіозним. Крім того, CIV може викликати 100% інфекцію з 80% захворюваністю, і аж до 5-8 % смертності при серйозних інфекціях. Починаючи з його першого виявлення в 2004 у гончих мисливських собак (Crawford та ін., Science 310 (5747):482-485 (2005)), CIV швидко поширився у Сполучених Штатах, принаймні 25 штатів повідомили про спалах CIV, і двадцять сім штатів повідомили про домінування серотипу CIV. Серотип CIV, що спричиняв недавній спалах є H3N8. Цей серотип CIV був спочатку виявлений у коней, і, як думають, перетнув видовий бар„єр у собак. Імовірно, що відсутність 1 UA 100849 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ефективної вакцини проти вірусу собачого грипу відіграє головну роль у швидкій і широкій дисемінації у собак цього вірусу. Вірус грипу А (H5N1, пташиний грип) - також названий "вірус H5N1" - підтип вірусу грипу А, що зустрічається головним чином у птахів, є дуже контагіозним серед птахів, і може бути летальним для них. Вірус H5N1 звичайно не інфікує людей, але інфекції із цими вірусами зустрічалися у людей. Дотепер, про більше, ніж 200 підтверджені випадки у людей, які привели до більше, ніж 150 смертельних випадків, повідомили в 10 країнах, головним чином в Азії. На щастя, все-таки, вірус не поширюється легко від птахів людей або від однієї людини до іншої. Однак, це може траплятися, так що в результаті епідемія або пандемія може відбуватися. Кращою стратегією для запобігання захворюваності й смертності, пов'язаної з епідемією або пандемією, є вакцинація. У вакцин проти грипу, які тепер призначають людям, є високе співвідношення перевагакошти в строках запобігання госпіталізацій і смертельних випадків, однак, щорічна продуктивність у світі для сезонної вакцини обмежена та реалістично не покриває глобально високо ризиковану популяцію. Існуючі вакцини одержані з яєць, використовуючи вірус, отриманий від Всесвітньої Організації Охорони Здоров'я (ВОЗ) або Центру Контролю Захворювання (ЦКЗ), які забезпечують вірусний посів для одержання вакцини щороку. Зміни в НА циркулюючих вірусів (антигенний дрейф) вимагають періодичної заміни штамів вакцини під час інтерпандемічних періодів. ВОЗ видає піврічні рекомендації для штамів, які будуть включені для Північних і Південних Півкуль. Щоб дозволити достатню кількість часу для продукування, ВОЗ визначає в лютому, які вакцинні штами повинні бути включені у вакцину наступної зими. Взагалі, 1 доза для дорослих містить еквівалент 45 мкг НА (15 мкг кожного для 3 вірусів). Ця доза - приблизна кількість очищеного вірусу, отриманого з алантоїдної рідини одного інфікованого курячого ембріону. Якщо 100 мільйонів доз убитої вірусної вакцини грипу одержані, виробник повинен забезпечити 100 мільйонів курячих ембріонів. Це робить виробництво вакцини залежною від своєчасної придатності, гарної якості курячих ембріонів, й посівів штамів, наданих ВОЗ/ЦКЗ . Більшість прототипів посівів штамів легко не вирощується до високого титру навіть у яйцях з ембріоном, що розвивається. Щоб перебороти цю проблему, урядові заклади спочатку створюють лабораторні високопродуктивні штами, через класичну рекомбінацію з високопродуктивним A/PR/8/34 лабораторним штамом (на 6:2 рекомбінації, одержуючи 6 сегментів із штаму A/PR/8/34). На жаль, цей процес може бути важким для здійснення й може впливати на антигенність одержаної вакцини. Тому, існує потреба забезпечити альтернативні способи продукування вакцин, які захищають проти клінічних хвороб, викликаних грипом, особливо високо патогенними штамами, такими як H5N1, Крім того, залишається потреба забезпечити способи продукування більших кількостей рятувальних вакцин проти грипу в періоді часу, досить швидкому, щоб ефективно запобігти можливим епідеміям та/або пандеміям. Представлений винахід відноситься до цієї і іншої потреб. Цитата будь-якого посилання тут, не повинна бути розглянута як визнання, що таке посилання доступне як "попередній рівень техніки" для заявки, що розглядається в даний момент. Короткий опис винаходу Представлений винахід має відношення до вакцин для запобігання грипу A і B. Вакцини та пов'язані способи винаходу забезпечують багато переваг перед вакцинами та способами попереднього рівня техніки. Наприклад, вакцини винаходу одержані, використовуючи клітини культури тканини замість курячих ембріонів. Способи продукування за винаходом заощаджують критичний час, обходячи класичну процедуру виготовлення вакцини. Крім того, вакцини винаходу корисні для тих, які мають алергію на матеріал яйця. Представлений винахід також забезпечує нові імуногенні композиції, які можуть використовуватися у вакцинах. Ці нові імуногенні композиції можуть використовуватися, щоб імунізувати тварин, включаючи птахів, проти вірусу грипу. У специфічних втіленнях винаходу одержувач вакцини - ссавець. В одному аспекті, представлений винахід забезпечує вакцину, що захищає собак проти собачого респіраторного захворювання внаслідок вірусу собачого грипу (CIV). В іншому аспекті представлений винахід забезпечує вакцину, що захищає людей проти вірусних штамів грипу, природно одержаних внаслідок генетичної рекомбінації. Винахід забезпечує штами вірусу грипу, які були специфічно адаптовані, щоб рости в клітинах культури тканини. У конкретному втіленні, адаптовані штами вірусу грипу відбирали за їх здатністю рости на вибраній лінії клітин культури тканини, використовуючи клонування граничного розведення. В одному конкретному втіленні відбирали субпопуляцію вірусу грипу, пристосованого до культивування на лінії культивованих клітин шляхом послідовних розведень в ряді аліквот, кількість вірусу грипу, що включає розмаїтість субпопуляцій грипу. Ряд аліквот 2 UA 100849 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 потім контактують та/або вирощують в лінії культивованих клітин. Субпопуляцію вірусу грипу в межах розмаїтості субпопуляцій грипу ідентифікували як таку, що росте на культивованих клітинах при низькій кратності інфікування (кратність інфікування (КІ)) і відбирали як субпопуляцію вірусу грипу, що пристосована до культивування на лінії культивованих клітин. У пов„язаних втіленнях представлений винахід забезпечує способи, що включають взаємодію штаму пристосованого до культури тканин з клітинами культури тканин, ріст протягом достатнього часу, для одержання цитопатичних ефектів (CPE). Цей спосіб може також включати збір вірусів грипу. У деяких таких втіленнях процес клонування граничного розведення включає серійне розведення штаму вірусу грипу та взаємодію кожного розведення з культивованими клітинами, культивування клітин протягом достатнього часу, для одержання цитопатичних ефектів (CPE), збір вірусу від найвищого розведення, що викликає CPE, і повторення процесу із зібраним вірусом. У деяких втіленнях спосіб також включає змішування штаму вірусу грипу з ефективною кількістю трипсину перед взаємодією з культивованими клітинами. У деяких втіленнях суміш інкубували протягом достатнього часу, щоб дозволити трипсину розщеплювати вірусні протеїни, не відокремлюючи клітини від субстрату. Трипсин, використовуваний для того, щоб розщеплювати вірусні протеїни, може бути типом IX трипсину. У деяких випадках, стадія взаємодії штаму пристосованого до культури тканини з клітинами культури тканини здійснюють при кратності інфікування (КІ) менше, ніж приблизно 0,01, включаючи менше, ніж приблизно 0,001 та/або менше, ніж приблизно 0,0001. В інших випадках штам вірусу грипу спочатку тестували на клітинах культури тканини, щоб визначити оптимальну кратність інфікування (КІ). Клітини культури тканини можуть бути клітинами ембріональної нирки ссавця такими як клітини ембріональної нирки людини. Вірус грипу може бути вірусом грипу A, B або C. В одному конкретному втіленні вірус грипу А є штамом H5N1. Штам вірусу грипу може бути отриманий з будь-якого числа джерел, включаючи назальний мазок, тканини легенів, і/або може бути наданий третьою особою, наприклад, ВОЗ. У деяких втіленнях штам вірусу грипу спочатку був культивований у яйцях з ембріоном, що розвивається, щоб одержати великий інокулят для адаптації до культури тканини. Деякі способи включають очищення зібраного вірусу. В одному такому способі стадію очищення виконували, використовуючи ексклюзійно-гранулометричну хроматографію. Способи винаходу можуть також включати змішування другого штаму вірусу грипу з першим штамом до, під час або після очищення, таким чином, що другий штам є відмінним від першого. У деяких способах дослідження титрування дози виконані до змішування двох вірусних штамів, щоб визначити суміш, що надає еквівалентну імуногенність вірусних протеїнів. У деяких способах інактивований грип. У деяких втіленнях цього типу, вірус грипу обробляють кількістю бінарного етиленіміну, ефективною для інактивації. У деяких способах збір здійснюють, коли вміст гемаглютиніну максимальний. Подальші втілення включають вакцину, одержану збиранням вірусного штаму, одержаного способом селекції вірусу грипу для культивування на клітинах культури тканини, титруючи штам вірусу грипу, використовуючи клонування граничного розведення таким чином, що відбирають штам вірусу грипу, що адаптований до клітин культури тканини. У деяких втіленнях вірус одержаний інокуляцією певними патогенами курячого ембріону шляхом інокуляції хоріоналантоїдної (також називаною алантоїдною порожниною) або амніотичної мембрани перед клонуванням граничного розведення. В одному втіленні вірус грипу реплікується спочатку інокуляцією через амніотичну мембрану курячих ембріонів, щоб одержати інокулят для адаптації до клітин культури тканини. Крім того, винахід забезпечує способи селекції вірусу грипу для культивування на людських клітинах ембріональної нирки. В одному такому способі штам вірусу грипу титрували, використовуючи клонування граничного розведення таким чином, що штам вірусу грипу, що адаптований до клітин НЕК був вибраний. Цей спосіб може включати взаємодію НЕКпристосованого штаму з клітинами НЕК і ріст клітин протягом достатнього часу для одержання цитопатичних ефектів (CPE). У конкретному втіленні цього типу, одержаний вірус грипу був зібраний. Винахід також забезпечує вакцину, що включає штам вірусу грипу, отриманий цими способами. Спосіб може також включати змішування штаму вірусу грипу з ефективною кількістю трипсину IX типу перед взаємодією з культивованими клітинами, протягом достатнього часу, щоб дозволити трипсину розщеплювати вірусні протеїни, не відокремлюючи клітини від субстрату. В одному втіленні, стадія взаємодії НЕК-пристосованого штаму з клітинами НЕК виконана при кратності інфікування (КІ) менше, ніж приблизно 0,001. У деяких втіленнях винахід додатково забезпечує вакцини, що включають вірус людського грипу, утворені при менше, ніж 4 мкг НА людського грипу на дозу. У подібному втіленні винахід забезпечує вакцини, що включають вірус людського грипу, утворені при менше, ніж 3 мкг НА людського грипу на дозу. В іншому втіленні винахід забезпечує вакцини, що включають вірус 3 UA 100849 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 людського грипу, утворені при менше, ніж 2 мкг НА людського грипу на дозу. В усі ще іншому втіленні винахід забезпечує вакцини, що включають вірус людського грипу, утворені при 1,5-3,5 мкг НА людського грипу на дозу. У специфічних втіленнях вакцини ад„ювантом є ISCOM. В інших втіленнях вакцини принаймні 70 % вірусів включають НА, що має ту ж саму амінокислотну послідовність. В усе ще інших втіленнях вакцини, принаймні 80 % вірусів включають НА, що має ту ж саму амінокислотну послідовність. В усе ще інших втіленнях вакцини, принаймні 90 % вірусів включають НА, що має ту ж саму амінокислотну послідовність. В усе ще інших втіленнях вакцини, більше ніж 95 % вірусів, включають НА, що має ту ж саму амінокислотну послідовність. Представлений винахід додатково забезпечує комбіновані вакцини для надання імунного захисту проти вірусу грипу, наприклад, вірусу собачого грипу (CIV) і інших хвороб, наприклад, інших собачих інфекційних хвороб. Представлений винахід додатково передбачає спосіб імунізації ссавця, наприклад, собаки, кішки, або коня проти грипу. Способи створення та використання вакцин при інфекційних захворюваннях, наприклад, собачих інфекційних захворюваннях також надані. У конкретному втіленні імуногенна композиція представленого винаходу включає імуногенну композицію, що містить інактивований CIV H3N8 і ад„ювант. Як правило, ад„ювант включає емульсію масло-вода. В одному такому втіленні ад„ювант додатково включає гідроксид алюмінію. У конкретному втіленні цього типу ад„ювантом є Emunade®. В іншому втіленні імуногенна композиція є вакциною. Вакцинна композиція може включати приблизно від 100 одиниць гемаглютинації (HAU) до приблизно 1500 HAU на дозу. Це може широко варіюватися залежно від розміру та інших міркувань щодо здоров„я і індивідуально отримуваного лікування. Композиція звичайно містить між 250 і 750 HAU на дозу. В одному втіленні вакцинна композиція включає приблизно 500 HAU на дозу. Довільно, вакцини представленого винаходу можуть також включати фармацевтично прийнятний імуностимулятор, наприклад, цитокіни, фактори росту, хемокіни, супернатанти від клітинних культур лімфоцитів, моноцитів, або клітин від лімфатичних органів, клітинні препарати та/або екстракти з рослин, бактерій або паразитів, або мітогенів. Вакцини представленого винаходу можуть вводитися шляхами, такими як: парентеральне введення, внутрішньом„язова ін'єкція, підшкірна ін'єкція, перитонеальна ін'єкція, інтрадермальна ін'єкція, оральне введення, інтраназальне введення, скарифікація та їх комбінації. У переважному втіленні винаходу вакцину вводять внутрішньом„язовою ін„єкцією. Винахід також забезпечує сироватку, отриману із вакцинованої тварини, що містить антитіла, які зв'язуються із CIV H3N8 та очищені антитіла безпосередньо. У конкретному втіленні винаходу очищене антитіло, що зв'язується з CIV H3N8, є химерним антитілом. Представлений винахід додатково забезпечує комбіновані вакцини, які включають один або більше штамів інактивованого CIV, наприклад, CIV H3N8, у комбінації з одним або більше іншими собачими патогенами та/або імуногенами, включаючи, наприклад, імуногени для забезпечення імунітету щодо наступних: вірус собачої чуми; собачий аденовірус; собачий аденовірус тип 2; собачий парповірус; вірус собачого парагрипу; собачого коронаровірусу; вірус собачого грипу; і/або серовари Leptospira, наприклад, Leptospira kirschneri, серовар grippotyphosa, Leptospira interrogans, серовар canicola, Leptospira interrogans icterohaemorrhagiae, і/або Leptospira interrogans, серовар pomona. Додаткові собачі патогени, які можуть бути додані до комбінованої вакцини представленого винаходу, включають Bordetella bronchiseptica; Leishmania, такі як Leishmania major й Leishmania infantum; види Borrelia spirochetes, включаючи B. burgdorferi sensu stricto (ss), B. burgdorferi ss, B. garinii, і B. afzelii; види Mycoplasma (наприклад, Mycoplasma cynos); вірус сказу; і Ehrlichia сanis. Представлений винахід передбачає способи культивування CIV H3N8 у культивованих клітинах. У деяких втіленнях культивовані клітини - несобачі ниркові клітини. В одному втіленні клітини - Madin-Darby клітини бичачих нирок (MDBK). В іншому втіленні клітини - клітини Vero. У деяких втіленнях винахід додатково забезпечує вакцини, що включають CIV H3N8 утворений при менше, ніж 500 HAU на дозу. У цих втіленнях ад„ювантом є звичайно гідроксид алюмінію, і принаймні 70 %, звичайно принаймні 90 % НА має ту ж саму амінокислотну послідовність. В інших втіленнях вакцини принаймні 80 % вірусів включають НА, що має ту ж саму амінокислотну послідовність. В усе ще інших втіленнях вакцини, більше, ніж 95 % вірусів включають НА, що має ту ж саму амінокислотну послідовність. Ці й інші аспекти представленого винаходу будуть краще оцінені, посилаючись на наступні фігури і детальний опис. Короткий опис фігур Фіг. 1 демонструє середню клінічну оцінку після імунізації CIV у собак. Невакцинований 4 UA 100849 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 контроль й вакциновані собаки імунізували з CIV і контролювали щодня, від дня-2 протягом 10 днів після за клінічними симптомами, такими як очні і назальні виділення, чхання, кашель, депресія та задишка. Клінічні симптоми були оцінені відповідно до керівних принципів, описаних у Прикладі 1, і середня клінічна оцінка для кожної групи обробки була графічно нанесена проти днів. Фіг. 2 демонструє пост-імунізаційне назальне вірусовиділення у собак. Невакцинований контроль й вакциновані собаки імунізували з CIV. Назальні мазки були зібрані в день перед імунізацією (день-1), щоб підтвердити, що собаки були вільними від CIV. Назальне вірусовиділення було перевірене у імунізованих собак, збираючи назальні мазки щодня протягом 10 днів (день 1-10 після імунізації) і виконуючи титрування на моношарових культурах MDCK. Середні вірусні титри для кожної групи обробки, виражені як Log 10 TCID50/мл, були обчислені й графічно нанесені проти днів після імунізації. Детальний опис винаходу Традиційні способи одержання вакцин проти грипу включають культивування ізольованого штаму в курячих ембріонах принаймні частково, тому що використання яєць дешево та ефективно та тому, що немає ніякого доступного очевидного альтернативного варіанту для культивування вірусів грипу у великій кількості. У випадку людського грипу це особливо актуально, тому що багато ліній клітин, які можуть використовуватися для розмноження вірусу грипу, не були схвалені FDA для одержання вакцини для людей, і тільки дуже низькі титри були отримані в культурі тканини. Коли вакцина одержана з яєць, це взагалі вироблено наступним способом. Спочатку, вірус відновлюють з мазка з горла або подібного джерела та ізолюють у яйцях. Початкова ізоляція в яйці є важкою, але вірус пристосовується до яйця, і наступне розмноження в яйцях відбувається відносно легко. Після культивування в яйці вірус очищують і інактивують формаліном або бетапропіолактоном. Культивування свідчить, що яйце не є оптимальними для розмноження вірусів. Наприклад, звичайна яйцекладка, використовувана в заснованому на яйці виробництві, є високим ризиком для контамінації вірусного препарату ендогенними вірусами, звичайно знайденими в цьому середовищі. Крім того, окрема інокуляція та урожай мільйонів яєць, так само як технологія продукування і виділення цільового продукту, приводять значної можливої контамінації середовищем, що буде введено у вірусний препарат, що є ймовірною причиною відкликання вакцини в 2004. Як згадано раніше, важко повністю видалити матеріал яйця, і це може привести до чутливості до вакцини. Крім того, процес повністю випробовує недолік у гнучкості, якщо вимога раптово збільшується через тилові проблеми внаслідок недоступності більших кількостей прийнятних яєць. Є також свідчення, що культивування у яйцях може зменшити антигенність вірусу. Відповідно, культивування вірусів грипу А або В у яйцях приводить до гетерогенного вірусного продукту, у якого є спектр НА мутацій. На прямому контрасті, відповідне культивування на клітинах-хазяїнах ссавця приводить до вірусів грипу, які структурно ідентичні спочатку ізольованим (Rocha, і ін. J. Gen. Virol 1993; 74:2513-2518). Крім того, віруси грипу, вирощені на клітинах ссавця, виявляють нейтралізацію й інгібування антитіл НА у сироватці людини виключно швидко та з більш високим титром, ніж це роблять їх культивовані у яйцях копії (Oxford, і ін. Bull ВОЗ 1987; 65:181-187). На жаль, тоді як усі штами вірусу грипу, здається, культивують у яйцях, тим не менше, багато з них добре не культивувались в клітинах культури тканини, і ті, які дійсно культивувалися у клітинах культури тканини, часто не культивувалися у кількостях, необхідних, щоб одержати ефективну вакцину. Представлені винахідники тепер розкривають те, що коли вірус грипу культивований у культурі тканини, використовуючи клонування методом серійних розведень, можуть бути одержані штами, адаптовані до культури тканини. Несподівано, винахідники виявили, що реплікація вірусу, одержаного від інокуляції через амніотичну мембрану курячих ембріонів, надає популяцію вірусів, здатних до реплікації і забезпечити високі рівні НА, при розмноженні на клітинах культури тканини (наприклад, Vero клітини). Одержані вірусні штами продукують НА титр, що майже дорівнює отриманим, використовуючи курячі ембріони та НА титр є однією важливою мірою потенціалу вакцини. Тому, один важливий аспект представленого винаходу спрямований на способи продукування вірусних штамів грипу, адаптованих до культури тканин і прийнятні для використання у виробництві вакцин проти грипу, особливо вакцин для ссавців. Способи включають використання клонування граничного розведення, щоб ізолювати та ідентифікувати адаптовані до культури тканини віруси. Одержані штами можуть бути оброблені, щоб одержати вакцину. Таким чином, представлений винахід також спрямований на способи продукування поліпшених вірусних вакцин проти грипу. До цього були забезпечені способи для селекції адаптованого до культури тканини вірусу, шляхом титрування вірусу, використовуючи клонування граничного розведення й повторення 5 UA 100849 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 процесу 2 або більше разів. У деяких способах використовувана клітина культури тканини є клітиною НЕК (клітини ембріональної нирки людини). Трипсин або еквівалентна протеаза можуть використовуватися, щоб збільшити ефективність входження вірусу у клітини. Подальші способи включають титрування трипсину, щоб ідентифікувати кращу концентрацію для використовуваної серії трипсину та для використовуваних клітин. Ідентифікація кращої кратності інфікування (КІ) для кожного використовуваного вірусу грипу та для певних клітин також сприяє успішному розмноженню культури тканини. Ізольований адаптований до культури тканини вірус може використовуватися, щоб одержати вакцину відповідно до стандартних способів. У деяких втіленнях вакцини включають використання ад„юванта ISCOM. У деяких втіленнях вакцини включають використання як ад„юванта гідроксиду алюмінію. Коли, більше, ніж один вірусний штам або ізолят включені у вакцину, способи можуть включати змішування двох в імунологічно еквівалентних кількостях. В цьому документі забезпечуються способи та композиції для адаптованих до культури тканин вірусних ізолятів і для одержаних з них вакцин. I. Способи селекції вірусу, адаптованого до культури тканини Джерело вірусу, використовуване в способах винаходу не є критичним щодо винаходу. Наприклад, вірус може бути отриманий ізоляцією від інфікованої тварини або пацієнта, як посів вірусу, постачений ВОЗ, закупівлею у відповідній організації (наприклад, ATCC) або від науководослідних лабораторій. Зокрема CIV, як відомо, викликає серйозне респіраторне захворювання, включаючи пневмонію. Таким чином, собаки з цими симптомами є корисними джерелами. Відповідні зразки для виділення вірусу включають: назальний змив/аспірат, назофарингеальний мазок, мазок з горла, бронхоальвеолярний лаваж, трахеальний аспірат, пунктат плеври, слину, мазок виділень та аутопсійні зразки. Зразки від живих тварин оптимально повинні бути зібрані рано, і в деяких випадках, протягом 4 днів після початку захворювання. Зразки можуть бути зібрані у прийнятні транспортувальні середовища, щоб бути збереженими до використання або використовуватися негайно. В разі зберігання, для гарантування життєздатності, вірус може бути збережений при зменшеній температурі такій як 4C. Щоб ізолювати вірус грипу із зразка, великі контамінанти можуть бути вилучені (наприклад, центрифугуванням), і супернатант можливо інокулювати у чисельні клітини при чисельних розведеннях. Альтернативно, вірус від тварини може спочатку бути культивований у курячих яйцях. Можуть використовуватися способи, щоб підтвердити, що ізолят вірусу є дійсно грипом у будь-якій стадії технологічного процесу. Для підтвердження присутності бажаного вірусу грипу в будь-який час у процесі одержання адаптованого до культури тканини штаму можуть використовуватися чисельні скринінгові способи. Вірус може бути підданий скринінгу, використовуючи будь-яке відоме та/або прийнятне дослідження для вірусу грипу. Таке дослідження включає (самостійно або в комбінації), вірусну реплікацію, кількісний та/або якісний аналіз інактивації (наприклад, антисироватками), транскрипцію, реплікацію, трансляцію, вбудовування віріону, вірулентність, НА або NA активність, вірусну продутивність та/або морфогенез, використовуючи такі способи як зворотна генетика, рекомбінація, комплементация і/або інфікування. A. Клітини культури тканини Будь-які клітини-хазяїни ссавців, які дозволяють культивуватиі вірус грипу, можуть використовуватися для способів тут. Як правило, клітини-хазяїни відповідно виключають побічні агенти і число пасажу, що може бути сертифіковано згідно з вимогами ВОЗ для одержання вакцини. Чисельні клітинні лінії можуть використовуватися, щоб ізолювати та розмножити віруси грипу. Деякі лінії клітин, які використовувалися, включають: клітини Vero (клітини нирки мавпи), клітини MDCK (клітини Madin-Darby нирки собак ), клітини BHK-21 (нирки немовляти хом„яка) і BSC (клітини нирки мавпи) і клітини НЕК. Таким чином, будь-яка клітина культури тканини, що дозволяє культивування вірусу грипу, може використовуватися. Прийнятні клітини включають, не обмежуючись, наступні: Vero, MDBK, BK21, СV-1, і будь-яка стосовна до ссавців ембріональна ниркова клітина (наприклад, НЕК). У деяких втіленнях використовуються клітини Vero або клітини ембріональної нирки ссавця. У деяких втіленнях використовуються клітини ембріональної нирки людини (НЕК клітини). Прийнятне середовище культури тканини для розмноження вищезгаданих клітинних ліній буде відоме фахівцям у даній галузі. Таке середовище може містити відповідну сироватку (наприклад, ембріональну бичачу сироватку) при концентрації до 20 % об/об. Фахівцями буде оцінено, що середовище, що містить менше, ніж 20 % об/об сироватки (2-5 % об/об), може використовуватися для розмноження вищезгаданих клітинних ліній. B. Оптимізація трипсину для клітин Щоб культивувати високий запас титру вірусу в культурах клітин, відповідна кількість протеази може використовуватися, щоб активізувати гемаглютинін для інтерналізації в клітини. 6 UA 100849 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Розчин, що містить протеазу, може бути доданий до ізоляту безпосередньо або ізолят може бути розведений у протеазі для культивування ізоляту для одержання вакцини. Протеаза може використовуватися, щоб розбавити вірус до відповідної кратності інфікування (КІ) для культивування. Протеаза може бути будь-якою протеазою, що здатна до активування НА для інтерналізації, не ушкоджуючи вірусні протеїни, таким чином, що вони не можуть бути культивовані та/або інфікувати клітини. Такі протеази включають, не обмежуючись, наступні: прокаріотична протеаза, проназа, трипсин, і субтилізин (A), наприклад, трипсин IX. Кількість протеази, що буде використовуватися, повинна бути достатньою, щоб активізувати вірус із дуже незначним токсичним ефектом щодо клітин. Токсичний ефект може бути проаналізований, ідентифікуючи характеристики пошкодження клітини, таке як відділення від планшету або субстрату, присутність продуктів розпаду клітин, поява мертвих клітин і недостача життєздатних клітин. Таким чином, “ефективна кількість трипсину” є тою, коли використовується протягом достатнього часу, дозволяє трипсину розщеплювати вірусні протеїни, не відокремлюючи клітини від субстрату або викликаючи інші токсичні ефекти. Титрування протеази може також використовуватися, щоб збільшити продукування активного вірусу в культурі тканини. Титрування включає ідентифікацію максимальної кількості трипсину, що є мінімально руйнівною для клітин. Ця кількість може мінятися залежно від використовуваних клітин культури тканини та серії протеази. Тому, нові серії протеази можуть бути протитровані, щоб встановити оптимальний рівень до використання, і кожна протеаза може бути протитрована для кожної клітини культури тканини. Титрування включає інокуляцію клітин культури тканини з поетапним розведенням протеази та культивуванням їх протягом -0,5 прийнятного часу. Наприклад, стадія половинного розведення (10 ) протеази може використовуватися. Час інкубації буде мінятися залежно від лінії клітини, але, звичайно буде приблизно між 2 днями та 7 днями. Рівень протеази може бути визначений, використовуючи типовий час інкубації для використовуваних клітин. Наприклад, якщо 4-денна інкубація краща для вірусу грипу, протеаза може бути перевірена, культивуючи протягом приблизно 4 днів у присутності однієї тільки протеази. Найнижче розведення протеази, у якої немає ніякої токсичності або дуже незначна токсичність для клітин, може потім використовуватися. Діапазон концентрацій трипсину, які можуть використовуватися на клітинах культури тканин ссавця, наприклад клітинах Vero, є від приблизно 0,5 мкг/мл до приблизно 10 мкг/мл, але більш звичайно приблизно 2,5 мкг/мл середовища. Як тільки оптимальний рівень протеази ідентифікований, вірус може бути розведений у середовищі інфекції відповідною кількістю протеази, (наприклад, трипсином) таким чином, що оптимальний рівень досягається, коли вірус доданий до клітинного середовища. Оптимальна кількість трипсину може використовуватися для клонування граничного розведення, щоб одержати ізолят, адаптований до культури тканини, так само як культивування і збір ізоляту. C. Клонування методом серійних розведень Типова вірусна культура є гетерогенною. Таким чином, наприклад індивідуальні вірусні частинки у лунці мікротирувального планшету можуть змінитися відносно інфекційності, реплікації, і т.п.. Серійне розведення використовується, щоб вибрати субпопуляції вірусів у культурі, субпопуляції, які найкраще адаптовані до клітин, наприклад. Серійне розведення включає розведення вірусної культури послідовно до зникнення, наприклад, щоб визначити кращу кратність інфікування (КІ). Звичайно це включає ряд 10-кратних розчинень, але може змінитися залежно від титру вірусу. Типове граничне розведення використовується, щоб ідентифікувати найвище розведення, що приводить до вірусного ефекту на клітину. Вірусний ефект може бути цитопатичним ефектом (CPE). Цитопатичні ефекти - будь-які ефекти на клітину, викликані грипозною вірусною інфекцією. Вони включають, не обмежуючись, наступні: округлення клітини, дегенерацію, відторгнення, апоптоз, індукцію оксиген-реактивних видів (ROS), грануляцію і наступну фрагментацію клітин, і відділення клітин від основи (такі, як планшет культури тканини). Лунка найвищого розведення була зібрана. Цей зібраний вірус потім розводили до зникнення, і процес повторювали. Як правило, серійні 10-кратні розведення одержані у відповідному середовищі (з або без трипсину) і 0,2 мл кожного розведення були додані до планшетів або лунок мікротитрувального планшету, що містить клітини культури тканини та культивували достатній час, щоб ідентифікувати CPE клітини. Оскільки сироватка інактивує трипсин, середовище звичайно не містить сироватки. Лунку або планшет, що містять найвище розведення, що викликає CPE, збирали, потім розводили і процес повторювали. Процес звичайно повторюється принаймні два рази, але може бути повторений до 5 разів. У деяких випадках, процес повторювали 3 рази. 7 UA 100849 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Вірусні культури, одержані способами винаходу, охарактеризовані гомогенністю послідовності НА протеїнів у вірусах. Багато способів можуть використовуватися, щоб визначити ступінь гомогенності послідовності. Наприклад, послідовність НА протеїнів безпосередньо або секвенуванням кодування РНК таких протеїнів. Як правило, вірусні препарати, одержані способами винаходу, будуть містити віруси, у яких принаймні 70 % НА протеїнів мають ту ж саму амінокислотну послідовність. У деяких втіленнях 80 %, або принаймні 90 % НА протеїнів мають ту ж саму амінокислотну послідовність. D. Способи тестування вірусу грипу Тести можуть бути виконані, щоб підтвердити активність і присутність вірусу грипу в будьякий час у процесі для способів тут. Наприклад, гемаглютинація може бути ідентифікована наступним способом. Якщо у віруса є поверхневий НА протеїн, він може з„єднуватися з RBCs та аглютинувати. Якщо концентрація вірусу в зразку буде висока, коли зразок буде змішаний з RBCs, то буде утворена решітка вірусів і RBC. Це явище називають гемаглютинацією. Це простий спосіб виявити присутність і титр вірусів, що утворюють гемаглютинат, таких як віруси грипу. Якщо вірусів у зразку недостатньо для гемаглютинації з RBCs, вони утворюють кульку на дні лунки. Найвище розведення, що показує повну гемаглютинацію було взяте за кінцеву точку. Вірусний титр виражали у НА одиницях (HAU), які є інверсією розведення на мілілітр. Наприклад, якщо є повна гемаглютинація у лунці, при 1/32 розчиненні в 50 мкл, але не в лунці з наступним найвищим розведенням титр вірусу - 32 HAU на 50 мкл або 640 HAU на мл. Інші дослідження, що можуть використовуватися, щоб ідентифікувати та визначити кількість вірусів грипу, включають ідентифікацію CPE (як обговорено тут), Western blot, ELISA, PCR і інші способи ідентифікації вірусу грипу, використовуючи антитіла та/або проби, які є специфічними для деякої частини вірусу, зокрема НА антиген. II. Способи культивування і збирання Після продукування штаму вірусу ізолят може бути зібраний. Можуть використовуватися стандартні способи. Зібраний ізолят може бути збережений для майбутнього використання або використовуватися, щоб одержати вакцину, використовуючи стандартні способи. Вірус може бути зібраний, коли одержана максимальна кількість вірусу; коли одержана максимальна кількість гемаглютиніну, як визначено НА дослідженням; і/або, коли клітини лізовані(лізовані). Після одержання адаптованого до культури тканини ізоляту, ізолят може бути культивований і зібраний. Спосіб культивування і збирання адаптованого до культури тканини вірусу не є критичним щодо винаходу, і можуть використовуватися стандартні способи. Однак, у деяких втіленнях, вірус культивується у клітині культури тканини, до якої він найкраще адаптований. Зібраний вірусний ізолят може бути збережений для майбутнього використання або використовуватися, щоб одержати вакцину, використовуючи стандартні способи. Вірус може бути культивований на відповідних клітинах культури тканини, додаючи вірус при прийнятній кратності інфікування (КІ) у відповідну кількості протеази (наприклад, трипсину) до клітин, протягом достатнього часу, щоб одержати високий титр вірусу та/або до лізис клітин. Вірус може бути зібраний, коли одержана максимальна кількість вірусу, коли одержана максимальна кількість гемаглютиніну та/або коли клітини лізовані. Було знайдено тут, що оптимальне прекультивування вірусу в яйцях (в алантоїдній порожнині або інокуляцією через амніотичну мембрану) може збільшити адаптацію вірусу в клітинах культури тканини. A. Пре-культивування у яйцях Пасаж у культуру яєць, як показав, полегшив адаптацію вірусу в клітині культури тканини. Таким чином, може бути бажаним пре-культивувати вірусний ізолят в курячих ембріонах відповідно до стандартних технологій. Наприклад, вірус вводили в алантоїдну порожнину або через амніотичну мембрану 9-12 денних курячих ембріонів, і дозволяли розмножуватися протягом приблизно трьох днів. Потім алантоїдну або амніотичну рідину збирали, і зібраний матеріал може бути культивований у культурі тканини при прийнятній кратності інфікування (КІ) для використання у виробництві вакцини. Альтернативно, зібраний матеріал може безпосередньо використовуватися в клонуванні граничного розведення. Було знайдено, що інокуляція яєць через амніотичну мембрану збагачує вірус, що реплікуватися й може забезпечити високі рівні НА протеїну, коли культивують у клітинах Vero. B. Кратність інфікування (КІ) Тут було ідентифіковано, що низька кратність інфікування (КІ) приводить до кращого та/або більш високого титру вірусного ізоляту. Без обмеження до певної теорії, покладається, що низька кратність інфікування (КІ) зменшує кількість дефектних вірусних частинок і приводить до більш ефективного інфекційного процесу. У деяких втіленнях використовувана кратність інфікування (КІ) є менше, ніж приблизно 0,01 (один вірус на 100 клітин). В інших втіленнях кратність інфікування (КІ) - менше, ніж приблизно 0,003. У деяких втіленнях кратність 8 UA 100849 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 інфікування (КІ) - менше, ніж приблизно 0,001. Кратність інфікування (КІ) може бути вибрана як найнижча кратність інфікування (КІ), що приводитьдо високого титру вірусу і/або до лізису клітин приблизно через 3-4 дні. III. Виробництво Вакцини Як тільки бажаний ізолят отримано від адаптованого щодо культури тканини вірусу, вірус може використовуватися, щоб одержати вакцину. Багато типів вірусних вакцин відомі, включаючи, але не обмежуючись атенуйованими, інактивованими, субодиничними і розщеленими вакцинами. A. Способи продукування атенуйованого вірусу Атенуйовані вакцини є живими вірусними вакцинами, які були атенуйовані(ослаблені) або змінені, щоб більше не викликати захворювання. Вони можуть бути одержані різними способами, наприклад, культивуванням у культурі тканини для повторного розмноження і генетичної маніпуляції, щоб видозмінити або видалити гени, залучені в патогенність. Ізолят, адаптований до культури тканини, може використовуватися, щоб одержати атенуйований (ослаблений) вірус, використовуючи стандартні способи. Наприклад, як тільки вірусні гени та/або протеїни ідентифіковані, які залучені в патогенність або залучені в прояв захворювання, вони можуть бути піддані мутації або змінені таким чином, що вірус усе ще в стані інфікувати та реплікуватися в межах клітини, але це не може викликати захворювання. Приклад цього мутагенезом розщеплений сайт HA1/HA2. Адаптований до культури тканини вірус може бути атенуйований(ослаблений), використовуючи будь-які стандартні способи, наприклад холод, що пристосовує вірус. Після продукування атенуйованого вірусу вакцина може бути одержана, використовуючи стандартні способи (наприклад, способи описані тут). Вірус може бути очищений, використовуючи стандартні способи, наприклад використовуючи ексклюзійно-гранулометричну хроматографію. Вакцина потім може бути одержана, використовуючи стандартні ад„юванти та вакцинні препарати, наприклад, ISCOM, нано-гранули, мінеральне масло, рослинне масло, гідроксид алюмінію, сапонін, неіонні детергенти, сквален, і блок-співполімери можуть використовуватися самостійно або в комбінації як ад„юванти. Поточні комерційні вакцини в Сполучених Штатах й Європі не містять ад„ювантів (і живі й убиті вакцини), і це частково, чому така висока концентрація НА (15 мкг НА на вірусний штам, 45 мкг НА для тривалентної композиції) необхідна у вакцині. B. Способи одержання інактивованої, субодиничної, і розщепленої вірусної вакцини Як тільки бажаний вірус отриманий, він може використовуватися, щоб одержати імуногенну композицію, наприклад, вакцину. Приклади "убитих" вакцин - інактивовані, розщеплені й субодиничні вакцини. Вони можуть бути одержані, обробляючи вірус грипу, використовуючи стандартні способи. Наприклад, субодиничні вакцини взагалі включають ізоляцію тільки частини вірусу, що активізує імунну систему. У випадку грипу субодиничні вакцини були одержані, використовуючи очищений НА і NA, але будь-яка суміш вірусних протеїнів може використовуватися, щоб одержати субодиничну вакцину. Взагалі, вірусний протеїн, такий як НА - екстрагований з рекомбінантних вірусних форм, і субодинична вакцина утворена, щоб включати суміш цих вірусних протеїнів від штамів, рекомендованих ВОЗ. Наприклад, 1995-1996 вакцин містили НА і NA від двох А штамів й одного В штаму (A/Singapore/6/86 (H1N1); A/Johannesburg/33/94 (H3N2); і B/Beijing/84/93). Для H3N8 CIV можуть використовуватися H3 та/або N8 антигени. Взагалі, вірусний протеїн(и) екстраговані з вірусу, і субодинична вакцина утворена, щоб містити суміш цих вірусних протеїнів. Протеїни можуть бути виділені від адаптованих до культури тканин вірусних ізолятів для субодиничної вакцини, використовуючи стандартні способи. Альтернативно, протеїни можуть бути одержані, використовуючи рекомбінантні способи. Способи для того, щоб одержати специфічний протеїн відомі в даній галузі. Розщеплені вакцини взагалі включають оброблені детергентом капсульні віруси, щоб одержати солюбільні протеїни. У випадку вірусу грипу, НА і NA стають розчинними. Наприклад, неіонні детергенти, такі як Тритон X-100 можуть використовуватися для того, щоб одержати розщеплені вакцини. Інактивовані вірусні вакцини одержані, інактивуючи зібраний вірус і утворюючи це, використовуючи відомі способи для застосування у якості вакцини, для індукування імунної реакції у ссавця. Стадія інактивації, очищення субодиниць, і/або розщеплення можуть бути виконані до або після очищення вірусу виключенням розміру. Наприклад, виробництво інактивованої вакцини, може включати видалення клітинного матеріалу, інактивацію вірусу, очищення й солюбілізацію капсули вірусу. Інші втілення можуть включати очищення вірусу та потім інактивацію, наприклад використовуючи формальдегід. 9 UA 100849 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Після одержання, будь-яка з вакцин (наприклад, атенуйована, розщеплена, субодинична або інактивована) може бути перевірена, щоб ідентифікувати що вірус та/або вакцина підтримують подібну антигенність, індукують серологічну відповідь у ссавця, і/або забезпечують захист від захворювання у ссавця. C. Подальша обробка зібраного вірусу 1. Очищення зібраного вірусу Після збору та/або після інактивації зібраного вірусу, клітинний матеріал й інші інтерферуючі матеріали, можуть бути вилучені, наприклад, седиментацією, щоб видалити мікроносії і концентрувати супернатант ультрафільтрацією. Грип, культивований у клітинах культури тканини, буде містити протеїни клітин хазяїна. Деяке подальше очищення супернатанту може бути необхідно. Клітинна ДНК може бути вилучена ферментативною обробкою (наприклад, Бензоназою). Після початкового видалення інтерферуючого матеріалу, вірус може бути інактивований, використовуючи стандартні способи. Альтернативно, інактивація може бути виконана після подальшого очищення, наприклад, розмір-ексклюзійною хроматографією. 2. Інактивація вірусу Вірус грипу може бути інактивований будь-яким способом і будь-якою кількістю агентів. Спосіб інактивації не є критичним щодо винаходу. Інактивація може відбутися після вилучення контамінуючого або інтерферуючого матеріалу. Інактивація може включати використання відомих інактивувальних агентів. Такі інактивувальні агенти включають, не обмежуючись, наступні: УФ опромінення, формальдегід, глутаральдегід, бінарний етиленімін (BEI) і бетапропіолактон. У деяких втіленнях використовується BEI, тому що він, як відомо, руйнує вірусну нуклеїнову кислоту, не ушкоджуючи вірусні протеїни. Крім того, BEI не впливає на вміст протеїну та температуру. Інактивувальні агенти використовуються при досить високій концентрації, щоб інактивувати кожну вірусну частинку в розчині. Наприклад, BEI може використовуватися в кінцевій концентрації між приблизно 0,5 й 10 мМ, включаючи, але не обмежуючись: 1,5, 3, 4, 5 і 6 мМ і включаючи діапазони приблизно 1-6 і 1-3 мМ. В одному втіленні BEI використовується при концентрації приблизно 6 мМ. Як правило, BEI o використовується при концентрації приблизно 1,5 мМ і інкубуванні при 37 С протягом 48 годин. У виготовленні вакцин проти CIV, BEI може використовуватися в кінцевій концентрації між приблизно 0,5 й 10 мМ, звичайно між 4-8 і часто між 5-7 мМ. В одному втіленні, BEI використовується при концентрації приблизно 6 мМ. У деяких втіленнях інактивація відбувається у відповідному pН факторі й температурі для інактивувального агента. PH фактор і температура можуть бути обрані, щоб гарантувати, що одержаний інактивований вірус усе ще є імуногеном. Інактивація може бути продовжена з відповідною кількістю струшування, щоб гарантувати, що агент зв'язується з усіма вірусними частинками в розчині. Після інактивації інактивувальні агенти можуть бути вилучені, використовуючи способи, включаючи, але не обмежуючись, наступні: інактивація інактивувального агента, осадження інактивувального агента, фільтрація інактивувального агента, і хроматографія, або суміш цих способів. Наприклад, BEI може бути інактивований доповненням тіосульфату натрію. Залишковий BEI може також бути відділений від вірусу/вірусних протеїнів, використовуючи гранулометрично-ексклюзійні способи. Як тільки нешкідливість (відсутність живого вірусу) підтверджена, вірусний розчин може бути додатково оброблений, щоб одержати вакцину. 3. Додаткова технологічна обробка Вірусний розчин може бути додатково оброблений, наприклад, видалити контамінанти, додатково сконцентрувати вірус і забезпечити більш сильну імунну реакцію. Деякі приклади подальшої обробки включають початкове видалення клітинного матеріалу, видалення клітинної ДНК, концентрування і утворення в ад„юванті, використовуючи стандартні способи. Грип, культивований у клітинах культури тканини, буде містити протеїни клітин хазяїна. Наприклад, грип, розмножений у клітинах ембріональної нирки людини (НЕК), буде мати протеїни НЕК або бичачі або мавпячі протеїни, якщо культивували в MDBK або клітинах VERO, відповідно. Ці протеїни можуть бути виявлені способами, відомими фахівцям у даній галузі. Багато способів відомі для видалення ДНК, включаючи додавання чисельних ферментів дезоксирибонуклеази, відомих, як деграданти клітинної ДНК, наприклад, Бензоназа. Початкова стадія концентрування може бути виконана, щоб забезпечити вірусний розчин при концентрації, найбільш прийнятній для додаткового очищення хроматографією. Це може бути зроблено, використовуючи будь-які стандартні способи, включаючи, але не обмежуючись ультрафільтрацією, використовуючи мембрану, що має молекулярну масу приблизно 100 К (наприклад, полісульфонова мембрана з MWCO 100 К). Вірусний розчин може бути сконцентрований приблизно у 100 разів, включаючи, але не обмежуючись 90 разів, 80 разів, 70 разів, 60 разів, 50 разів, 40 разів, 30 разів, 20 разів, 10 разів і 5 разів. У деяких втіленнях вірусний розчин сконцентрований приблизно у 50 разів, 10 UA 100849 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 але більш звичайно включаючи 20 разів і 30 разів. 4. Очищення Вірус може бути очищений, використовуючи стандартні способи, такі як центрифугування щільності. У деяких втіленнях вірус очищений гранулометрично-ексклюзійною гельхроматографією. Одна перевага використання виключення розміру полягає в тому, що вихід є кращим, ніж при використанні центрифугування щільності. будь-який гранулометричноексклюзійний гель може використовуватися, щоб надати очищений вірус. Будь-який стандартний гель може використовуватися, такі як гель Sepharose (наприклад CL-2B Sepharose). У деяких втіленнях колонка приблизно 70-120 см у довжині, щоб досягти необхідного поділу, включаючи, але не обмежуючись приблизно 80, 90, 100, і 110. В інших втіленнях колонка приблизно від 80-100 см у довжині, наприклад колонка приблизно 90 см у довжині. У деяких втіленнях довжина досягнута послідовною кратністю колонок, наприклад двома колонками по 45 см або трьома колонками по 30 см (наприклад, колонка 30-32 см у довжині та 30 см у діаметрі). Сконцентрований вірус може бути застосований, використовуючи стандартні способи, наприклад, вірус застосовується 5-10 % від об„єму колонки (ок), звичайно 5-7% від об„єму колонки. Вірусний пік від колонки потім може бути зібраний і додатково сконцентрований використовуючи стандартні способи, наприклад ультрафільтрацію. У деяких втіленнях використовуються 2-3 колонки, що послідовно мають у цілому 90 см довжини, і заключний пік об‟єднують і концентрують ультрафільтрацією. 5. Солюбілізація капсульних протеїнів Вірусний матеріал пікової концентрації може бути солюбілізований, використовуючи стандартні способи, такі як, з неіонним детергентом. Солюбілізація може бути виконана, щоб одержати матеріал для композиції ISCOMS (див. нижче). Приклади неіонних детергентів, включають, але не обмежуються, наступними: нонаноїл-N-Метилфукамід (Мега 9), Тритон X100, Октилглікозид, Дигітонін, C12E8, Луброл, Нонідет P-40 і Tween (наприклад Tween 20, 80 або 120). Після солюбілізації вірус може використовуватися, щоб одержати вакцину, і/або ад„ювант може бути доданий. Наприклад, для одержання ад„юванта ISCOM, ліпідна суміш може бути додана, щоб сприяти утворенню ISCOM. Ліпідна суміш може включати фосфатидилхолін і синтетичний холестерин. У деяких втіленнях вірус деструктований Мега 9 при кімнатній температурі при перемішуванні, і потім ліпідна суміш (фосфатидилхолін і холестерин) можуть додаватися й безперервно перемішуватися. 6. Утворення ад„ювантів Відповідні ад„юванти можуть бути додані до вакцини та/або фармацевтичної композиції. Приклади ад„ювантів включають ті, які включають масляну та водну емульсію, так само як ті, що додатково включають гідроксид алюмінію. В останньому випадку, гідроксид алюмінію від комерційного джерела може використовуватися, наприклад, Альгідрогель, (Superfos Biosector, Frederikssund, Данія) і Регідрогель (Reheis Inc). Масляна та водна емульсія звичайно включає мінеральне масло або, що перетворяться в ході обміну речовин масла (наприклад, рослинне масло, риб'ячий жир). Неіонні детергенти або сурфактанти можуть використовуватися як емульгатори. Приклади емульгаторов включають Tween 80/Span 80, Arlecel 80/Tween 80 і Montanides (Seppic, Париж, Франція). У випадку ад„ювантних емульсій взагалі 5-25 % об„єму масло, і 75-95 % об„єму є водним. У деяких втіленнях ад„ювантна емульсія - 20% масло та 80 % об„єму - вода. Кількість гідроксиду алюмінію звичайно приблизно між 5 % й 15 % водної фази. У деяких втіленнях Emunade® - ад„ювант. Для деяких втілень ISCOM використовується як ад„ювант. ISCOM - абревіатура для ІмунноСтимулювального Комплексу, і технологія була описана Morein та ін. (Nature 308:457-460 (1984)). ISCOM's - нова система доставки вакцини та несхожий на звичайні ад„ювантні технології. ISCOM може зручно утворений одним із двох способів. У деяких втіленнях антиген фізично включений у структуру під час її утворення. В інших втіленнях ISCOM-матриця (як поставляється, наприклад, Isconova) не містить антигену, але змішана з антигеном вибору кінцевим користувачем до імунізації. Після змішування антигени присутні в розчині з ISCOMматрицею, але не включені фізично в структуру. Взагалі, очищені ISCOM антигени представлені у мультимерній формі, базуючись на здатності Quil А спонтанно утворювати міцели при критичній концентрації і гідрофобним/гідрофільним зв„язком, захоплюючи очищені імуногени. Ці міцелярні структури перебувають у ромірі 35 нм й легко розпізнаються імунною системою. На відміну від звичайних ад„ювантів, ISCOMS швидко звільнявся від ділянки ін'єкції та викликав місцеву, гуморальну і клітнинно-опосередковану імунну відповідь. У специфічних втіленнях ISCOMs утворені наступним чином. Вірус солюбілізують, використовуючи стандартні способи, такі як з неіонним детергентом (наприклад, Мега-9, Тритон X-100, Октилглікозид, Дигітонін, Нонідет P-40, C12E8, 11 UA 100849 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Луброл, Tвін-80). Ліпідну суміш додавали, щоб сприяти утворенню ISCOM. Ліпідна суміш може включати фосфатидилхолін і синтетичний холестерин. У деяких втіленнях суміш спочатку обробляють неіонним детергентом при кімнатній температурі при перемішуванні, потім додавали ліпідну суміш (рівні частини фосфатидилхоліну і холестерину, наприклад) й безперервно перемішували. Quil А (очищений глікозид сапоніну) додавали до вірусної ліпідної суміші, і перемішування продовжували. Quil А може бути доданий, щоб отримати кінцеву концентрацію Quil А приблизно 0,01 до 0,1 %, включаючи, але не обмежуючись 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08 і 0,09. У деяких втіленнях кінцева концентрація становить приблизно 0,05 %. Неіонний детергент видаляють (наприклад, діафільтрацією з ацетатом амонію). Матриця ISCOM утворена Quil А. Морфологія частинки ISCOM, як визначено електронною мікроскопією, показує звичайну клітинно-подібну структуру приблизно 35 нм у розмірі. Стадія утворення ISCOM може бути удосконалена за допомогою діафільтрації тангенціального потоку. ISCOMs представляють очищені антигени у мультимерній формі, базуючись на здатності Quil А спонтанно утворювати міцели при критичній концентрації і гідрофобним/гідрофільним зв„язком, захоплюючи очищені антигени. Утворення ISCOMs може бути перевірено електронною мікроскопією, щоб перевірити, що типові, подібні до клітини структури були утворені. Імунна реакція від представленого ISCOM, як показано, була принаймні в десять разів краще, ніж від подібного антигену, представленого як міцели одного тільки агрегованого мембранного протеїну. ISCOMs, як також було знайдено, виявляли клітинно-опосередковану відповідь, не помічену у звичайних цільних вірусних вакцин. У деяких втіленнях кінцева концентрація становить приблизно 0,05 %. Імуностимулятори можуть також бути додані до вакцини та/або фармацевтичної композиції. Імуностимулятори включають: цитокіни, фактори росту, хемокіни, супернатанти від клітинних культур лімфоцитів, моноцитів, або клітин від лімфатичних органів, клітинні препарати та/або екстракти з рослин, клітинні препарати та/або екстракти з бактерій, паразитів, або мітогенів, і нові нуклеїнові кислоти, отримані з інших вірусів та/або інших джерел (наприклад, парноланцюгова РНК, CpG), блок-співполімери, нано-гранули або інші композиції, відомі в даній галузі, використовували самостійно або в комбінації. Конкретні приклади ад„ювантів і інших імуностимуляторів включають, не обмежуючись, наступні: лізолецитин; глікозиди (наприклад, сапонін і похідні сапоніну, такі як Quil А або GPI0100); катіоноактивні сурфактанти (наприклад, DDA); галогеніди вуглеводнів четвертинного амонію; поверхнево-активні поліоли; поліаніони та поліатомні іони; поліакрилові кислоти, неіоногенні блок-співполімери (наприклад, Pluronic F-127); і MDP (наприклад, N-ацетил-мурамілL-треоніл-D-ізоглутамін (thr-MDP), N-ацетил-нор-мураміл-L-аланіл-D-ізоглутамін, Nацетилмураміл-L-аланіл-D-ізоглутамініл-L-аланін-2-(1'-2'-дипальмітоїл-sn-гліцеро-3гідроксифосфорилокси)етиламін). D. Ефективність вакцин Способи є відоми в даній галузі для визначення, чи підтримує субодинична, атенуйована, розщеплена і/або інактивована вірусна вакцина подібну антигенність щодо клінічного ізоляту або адаптованого до культури тканини ізоляту, виділена з них. Такі відомі способи включають використання антисироваток або антитіл, НА і NA активність і інгібування й ДНК скринінг (такий, як гібридизаційний зонд або PCR), щоб підтвердити, що донорські гени, що кодують антигенні детермінанти присутні в інактивованому вірусі. Способи ідентифікації, чи викликає вакцина серологічну відповідь, також відомі в даній галузі й включають імунізацію піддослідної тварини з вакциною, наступною інокуляцією вірусом, що спричиняє захворювання й ідентифікацією присутності або відсутності симптомів захворювання. Таким чином, ефективність вакцини грипу може бути перевірена на тваринах, звичайно, тхори, миші, і морські свинки використовуються. Титр антитіл може бути перевірений, використовуючи інгібування Гемаглутинатину (НІ) або спосіб інгібування Нейрамінідази (NI), або тестуючи на вірус-нейтралізуючі антитіла (мікротест нейтралізації) у культурі тканини, і такими способами, які є загальновідомими. Дослідження сенсибілізації можуть надати важливу інформацію, щоб оцінити вакцину. Фармацевтичні композиції та/або вакцини, що підходять для обробки, включають вірус або вірусну субодиницю в суміші з стерильними водними або неводними розчинами. Процес одержання фармацевтичної композиції та/або вакцини може включати ізоляцію адаптованого до культури тканини штаму, ріст й очищення вірусного ізоляту, інактивування та або атенуацію вірусу та змішування відповідного титру з фізіологічно прийнятним розбавником і імуностимулятором. Альтернативно, вірусні протеїни можуть бути очищені для субодиничної вакцини та відповідну кількість змішують з фізіологічно прийнятним розбавником і імуностимулятором. Вірус може бути досить очищеним, якщо не буде ніякого забруднювального матеріалу або речовини, що інтерферує із стадією інактивації та/або імуногенністю вірусу. 12 UA 100849 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Відповідний титр вірусу або концентрація вірусних протеїнів може бути змішана з розбавником і імуностимулятором. Визначення TCID50 - один спосіб визначити вірусний титр 5 12 (50% інфікувальної дози культури тканини). Наприклад, титр приблизно від 10 до 10 TCID50 (базуючись на пре-інактиваційних титрах) може використовуватися, включаючи, але не 6 7 8 9 10 11 обмежуючись 10 , 10 , 10 , 10 , 10 і 10 . Довільно, титр може бути проаналізований шляхом НА титру і може містити від приблизно від 1 до 30 мкг НА на вірус, включений у вакцину, включаючи, але не обмежуючись від 1 до 10 мкг для ад„ювантних композицій і від 1 до 30 мкг для не-ад„ювантних вакцин. У деяких втіленнях титр приблизно 15 мкг. Таким чином, наприклад, коли 3 віруси включені в не-ад„ювантну вакцину, 1 доза для дорослих містить еквівалент 45 мкг НА (15 мкг для кожного з 3 вірусних штамів). В інших втіленнях кількість від кожного штаму може відрізнятися (наприклад, залежно від антигенності), але кінцева концентрація - від приблизно 1 приблизно до 60 мкг НА, включаючи 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 і 55 мкг. В іншому втіленні, ад„ювантні вакцини, як очікують, будуть містити кількості НА приблизно від 1 до 30 мкг, включаючи 2, 5, 10 і 20 мкг. Вакцина має звичайно об„єм приблизно між 50 мкл і 5000 мкл, включаючи 100, 500, 1000, 2000 і 5000 мкл. Стандартні фізіологічно прийнятні розбавники можуть використовуватися, включаючи, наприклад, EMEM, збалансований сольовий розчин Хенкса, і фосфатний сольовий буфер (РВS) і фізіологічний сольовий розчин. Прийнятні імуностимулювальні ад„юванти можуть бути додані до вакцини та/або фармацевтичної композиції. Приклади імуностимулюючих ад„ювантів, включають, але не обмежуються: мінеральна масло, рослинне масло, гідроксид алюмінію, сапонін, неіонні детергенти, сквален, блок-співполімери, нано-гранули, ISCOM, матриця ISCOM або інші сполуки, відомі в даній галузі, використовувані самостійно або в комбінації. На додаток до ад„юванта, будь-які прийнятні антивірусні агенти, які корисні проти грипу, можуть також бути включені у фармацевтичну композицію. Такі антивірусні агенти включають, наприклад, ремантадин, амантадин, інгібітори нейрамінідази (такі як занамівір й оселтамивір), гама інтерферон, гуанідин, гідроксибензімідазол, альфа-інтерферон, бета-інтерферон, тіосемікарбазони, метіасазон, рифампін, рибавірин, піримідин або аналоги пурину, і фоскарнет. Вакцини, що мають більше, ніж один вірус або штам вірусних протеїнів, можуть бути одержані, використовуючи способи, описані тут. Суміші можуть бути імуногенно протитровані, щоб забезпечити приблизно еквівалентну імуногенність. Імуногенно протитровані означає, що кінцевий продукт одержаний, щоб вирівняти розходження в імуногенності. Наприклад, якщо одержана суміш штамів A і B і штам A в 5 разів більше імуногенний, штами змішані при співвідношенні - штам A:штам В 1:5. IV. Введення вакцини Введення вакцинної композиції та/або фармацевтичної композиції може бути в профілактичних цілях. Коли вводяться профілактично, композиції вводять перед будь-якими очевидними симптомами грипозної інфекції. Профілактичне введення композиції служить для запобігання або зменшення будь-якої наступної інфекції. Фармацевтична композиція та/або вакцина можуть призначатися будь-яким шляхом, відомим в даній галузі, включаючи інгаляційний, інтраназальний (наприклад ослаблені вакцини), оральний і парентеральний. Приклади парентеральних шляхів введення включають інтрадермальний, внутрішньом„язовий, внутрішньовенний, інтраперитонеальний і підшкірний. У деяких втіленнях вакцину вводять внутрішньом„язово або глибоко підшкірною ін‟єкцією у верхню кінцівку. Друга доза може бути введена після 2-4 тижневого інтервалу деяким дітям, які не були раніше вакциновані для або піддані грипу (непримировані). Одна або більше ревакцинацій можуть призначатися в підходящий час після початкової імунізації. Вводять ефективну кількість вакцини та/або фармацевтичної композиції. Ефективна кількість - кількість, достатня, щоб досягти бажаного біологічного ефекту, наприклад, викликати достатній гуморальний або клітинний імунітет. Це може залежати від типу вакцини, віку, статі, здоров'я, і ваги реціпієнта. Приклади бажаних біологічних ефектів включають, не обмежуючись, наступні: не викликання симптомів, зменшення симптомів, зменшення вірусного титру в тканинах або назальних секретах, повний захист від інфікування вірусом грипу, і частковий захист від інфікування вірусом грипу. У деяких втіленнях, імунологічно ефективна кількість СIV вакцини є приблизно від 100 HAU до приблизно 1500 HAU на дозу. Композиція звичайно - між 250 й 750 HAU на дозу. В одному втіленні вакцинна композиція включає приблизно 500 HAU на дозу. Коли вводиться як розчин, вакцина може бути одержана у формі водного розчину, сиропу, еліксиру, або настойки. Такі композиції відомі в даній галузі, і одержані розчиненням антигену та інших відповідних добавок у відповідних розчинюючих системах. Такі розчинники включають 13 UA 100849 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 воду, сольовий розчин, етанол, етиленгліколь, гліцерин, і рідина A1, наприклад. Прийнятні добавки включають сертифіковані барвники, ароматизатори, підсолоджувачі, і антибактеріальні консерванти, такі як тимеросал (натрій етилмеркутіосаліцилат). Такі розчини можуть бути стабілізовані, використовуючи стандартні способи, наприклад, додавання частково гідролізованого желатину, сорбітолу, або середовища культури клітини та можуть бути забуферовані, використовуючи стандартні способи, використовуючи, наприклад, реактиви, такі як гідофосфат натрію, дигідофосфат натрію, гідофосфат калію та/або дигідофосфат калію. Рідкі композиції можуть також включати суспензії і емульсії. Суспензії одержували, наприклад, використовуючи колоїдний млин, і емульсії, наприклад, використовуючи гомогенізатор. V. Вірусні штами та ВОЗ Щоб дати час для адекватних запасів вакцин, які будуть одержані, рішення повинно бути прийняте задовго до сезону грипу, щоб щодо якого використовувати штами грипу А і В у цьому році (протягом зимового сезону). В усьому світі є ретельні й складні епідеміологічні системи моніторингу, що допомагає цим рішенням. Крім того, ВОЗ звичайно готує посіви вірусів для використання у виробництві вакцин. Є 16 відомих НА підтипів і 9 відомих підтипів NA. Багато різних комбінацій НА й протеїнів NA можливі. Тільки деякі підтипи грипу А (тобто, H1N1, H1N2, і H3N2) у цей час перебуває в загальному циркулюванню серед людей. Інші підтипи знайдені звичайно в інших видах тварин. Наприклад, H7N7 і H3N8 віруси викликають захворювання у коней, і H3N8 також, як недавно показано, викликав захворювання у собак. Три явні підтипи вірусу А пташиного грипу, які, як відомо, інфікують і птахів і людей, є грипом А H5-H5, такі як HPAI H5N1 віруси, грип А H7, і грип А H9. Однак, наступні штами, які інфікують людей і викликають епідемії або пандемії, могли виникнути з будь-яких підтипів. Вірус може бути отриманий, використовуючи стандартні способи, наприклад, від зразків пацієнтів, від америкаських типів колекцій культури (або інших колекцій) або від певних вірусологічних лабораторій. У деяких втіленнях вірус отриманий від ВОЗ або ЦКЗ (центр контролю захворювань) , включаючи сезонні віруси та можливі пандемічні штами. VI. Виявлення серологічної відповіді Способи ідентифікації, чи індукує вакцина серологічну відповідь, також відомі в даній галузі. Наприклад, можна ввести тестованій тварині імуногенну сполуку/вакцину та ідентифікувати противірусні антитіла в сироватці крові. Способи ідентифікації, чи є вакцина захисною, відомі в даній галузі й включають імунізацію піддослідної тварини вакциною, наступною інокуляцією вірусом, що спричиняє захворювання та ідентифікацією присутності або відсутністю симптомів захворювання. Тест інгібування гемаглютинації може бути виконаний, щоб ідентифікувати присутність серологічної відповіді на гемаглютинін. Дослідження інгібування гемаглютинації (ДІГ) може бути виконане на еритроцитах індика (RBCs) на всіх тестових зразках сироватки, наприклад, використовуючи відомий підтип грипу, такий як CIV (H3N8). Коротко, серійне двократне розведення тестової сироватки виконано в PBS на 96-лунковому мікротитрувальному планшеті з V-подібним дном. Еквівалентний об„єм вірусної суспензії, що містить 4-8 HAU/50 мкл CIV, додавали у кожну лунку що містить тестову сироватку, і планшети інкубували при кімнатній температурі протягом 30 хвилин. Потім, еквівалентний об„єм 0,5 % суспензії еритроцитів індика додавали. Планшети потім інкубували при кімнатній температурі протягом 30 хвилин, і зчитували результати HAI. Аналог найвищого розведення сироватки, що показує НА інгібування, розглядають як титр HAI тестового зразка. Інші способи визначення присутності антитіл до вірусу грипу включають тест інгібування Нейрамінідази, Western blot, ELISA, PCR, і інші способи для ідентифікації антитіл проти вірусу грипу. Це дослідження відомо в даній галузі. VII. Приклади Наступні приклади забезпечують процедури для ізоляції, адаптації і очищення вірусу грипу, щоб створити гомологічну вірусну популяцію для одержання вихідного вакцинного вірусу. Приклади використовують клітини Vero (америкаський тип колекції культури, CCL 81), але будьякий тип клітини міг використовуватися, що є пермісивним для вірусу грипу. ПРИКЛАД 1: Хімічні і біологічні Використовуване середовище інфекції містило 1-літр DMEM (Cambrex, Catalog No. 04-096) або еквівалент; зберігали при 2-7ºC, 20 мл L-глутаміну (Cellgro, Catalog No. 25 005 ок) або еквівалент; зберігали замороженим при -10°C або більше. Після розтанення, зберігали при 27°C протягом 4 тижнів, і Трипсин IX типу (Sigma Product No. T0303, CAS No. 9002-07-7) або еквівалент; робили аліквотним і зберігали замороженим при -5 до -30°C. Середовище інфекції було свіжоодержаним перш, ніж інфікувати клітини. 14 UA 100849 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Одержання середовища культури клітин було наступне: 1-літр DMEM, L-глутамін 20 мл, Ембріональна Бичача Сироватка 50 мл (Сatalog Gibco No. 04-4000DK) або еквівалент (Примітка: Джерело - країна, вільна від коров„ячої губчатої енцефалопатії (КГЕ)). Готове o середовище зберігали при 2-7 протягом не більше, ніж 30 днів після виготовлення. EDTA-Трипсин (Сatalog Cellgro No. 98 102-CV або еквівалент), використовуваний для o пасування клітин, зберігали при -5 -30 , строк придатності, був призначений виробником. ПРИКЛАД 2: Одержання культури клітин Оскільки розведення протеази, що буде використовуватися для стадії вірусного інфікування, може варіюватися залежно від серії, нові серії трипсину були протитровані, щоб встановити оптимальний рівень до використання. Приклад титрування - серійне розведення -1 Трипсину IX типу в DMEM, що містить L-глутамін, використовуючи 1/2 log розведення (10 , 10 1,5 -2 -2,5 , 10 , 10 і т.д.) . Використовували 96 лунковий планшет, що містить свіжо злитий моношар клітин Vero, кожну лунку планшету промивали 2 рази, використовуючи 280 мкл PBS. Негайно після промивання, додавали 200 мкл кожного розведення Трипсину IX типу до ряду планшету. o o Планшет потім інкубували при 37 С плюс або мінус 2 С з 5% CO2, і клітини спостерігали після 4 днів. Найнижче розведення трипсину, що не показує або незначний ефект на здоров'я клітин, відбирали як відповідну концентрацію трипсину, щоб використовувати та для ізоляції і для оптимізації грипозної інфекції. Бажано, щоб була незначна варіація або, щоб була відсутня між лунками, інокульованими в межах кожної концентрації. Для клонування граничного розведення вірусу в клітинах Vero використовувася конфлуентний моношар, звичайно 3-4 денний; культивували при 96 лункових мікротестових планшетах Falcon. Клітини були отримані від ATCC CCL 81 і використовувалися між пасажами 132 й 156. Одержання клітин Vero з рідкого азоту (LN2) було наступне: одна ампула клітин Vero була o o вилучена від LN2 і танула при 36 С плюс або мінус 2 С на водяній бані. Весь зміст пробірки 2 введений піпеткою в 25 cм флакон культури тканини, що містить 10 мл середовища культури o клітини, збагаченого 10% ембріональною бичачою сироваткою. Флакон інкубували при 36 С o плюс або мінус 2 С в 4-6 % CO2. Приблизно після 1 години супернатант і нез„єднані клітини м„яко вилучали і додавали 10 мл свіжого культурального середовища тканини. Клітини були o o культивовані при 36 С плюс або мінус 2 С в 4-6 % CO2, поки 90-100 % злиття не було досягнуто. Пасаж клітин Vero був наступним: моношари промивали, використовуючи 10-20 мл PBS протягом приблизно 3 хвилин. PBS фільтрували і заміщували 3 мл EDTA-Трипсином (Cellgro, Catalog No. 98 102-CV), моношар культивували протягом приблизно 3 хвилин або поки клітини були відділялися від флакону. Суспензію розчиняли, додаючи 17 мл одержаного культивувального середовища (що містить РBS), щоб розчинити та нейтралізувати трипсин. Клітини були потім полічені, використовуючи гемоцитометр, щоб визначити кількість клітини на мл суспензії. Число флаконів, які могли бути одержані, використовуючи цю суспензію, було обчислено: Клітини на мл (суспензія) X мл бажаної суспензії = мл з планшету для кожного флакону. Клітини на мл (бажано) Загальні мл суспензії, загальні мл суспензії повинні бути менше доступного об„єму. Якщо щільність клітин посіву не може бути врегульована, щоб пристосувати це, потрібно відзначити, що відрізок часу поки клітини зливаються, буде більше довгим з більш низькою щільністю клітин посіву. Флакони звичайно висівали на планшети, 4 5 використовуючи суспензію клітин із щільністю клітин 1x10 - 1x10 клітин на мл. Клітини були культивовані протягом 3-4 днів, або до злиття. Ці способи для підтримки та розмноження клітин Vero були так само застосовані до інших клітинних ліній, таких як клітини Madin Darby собачої нирки (MDCK) і НЕК 293 (клітини ембріональної нирки людини). Клітини НЕК 293, які особливо прийнятні для розмноження вірусних ізолятів, клонували. Цей субклон НЕК 293, позначений GT-D22 (або D22), був ізольований від початкового препарату Клітин НЕК 293 (ATCC No. CRL-1573; Партія ATCC No. F-11285 при Пасажі 33). Клітини НЕК 293 були субклоновані й відібрані на основі поліпшеної продуктивності рекомбінантного аденовірусу Типу 5, що несе ген для експресії p53. Клони, що мають 6 нормальну морфологію та адекватні темпи росту, були трипсинизовані і посіяні - 1-2 x 10 клітин на лунку для подальшого аналізу. Головні клони продукування були піддані подальшому субклонуванню й відбору. Субклон D22 був нарешті відібраний. Здатність субклона D22 до розмноження грипу була продемонстрована, використовуючи Вірус Грипу Свині (SIV). Обережності біологічної безпеки були дотримані, працюючи з живим вірусом грипу. Грип етіологічний агент 2 класу і рекомендації, знайдені в ЦКЗ (центр контролю захворювань) - NIH, Публікація HHS, No. (ЦКЗ) 88-8395 (Біологічна безпека в Мікробіологічних й Біомедичних 15 UA 100849 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Лабораторіях) для того, для послідуючого маніпулювання вірусом у лабораторії. ПРИКЛАД 3: Клонування методом серійних розведень Одержання пробірок розведення й зразка розведення для клонування граничного розведення була наступні. Пробірки (12 x 75 мм) були встановлені в стійках і маркіровані. 1 -1 -10 зразок - на планшет і серії розведення для кожного зразка були 10 - 10 . Середовище розведення було розподілено в кількості 1,8 мл на кожну пробірку, використовуючи серологічну піпетку. Перша пробірка була маркірована вірусною ідентифікацією. Кілька додаткових пробірок були одержані до використання як контроль розведення й для заміщення, якщо які-небудь помилки будуть одержані під час розведення. Зразки струшували протягом приблизно 5 секунд, -1 потім початкове розведення було зроблено, вносячи піпеткою 200 мкл зразка в 10 пробірку -10 розведення. Серійні розведення були продовжені до 10 . Для кожного розведення зразок струшували і наконечник піпетки замінювали між розведеннями. Розбавлення переносили на планшети з клітинами таким чином. Негайно до використання, середовище асептично зливали з планшетів з клітинами. Кожну лунку промивали, використовуючи піпетор з 12 каналами 2-3 рази з 280 мкл стерильного PBS. Планшети опорожнювали в асептичних умовах, але їм не дозволяли висохнути. Планшети були маркіровані вірусною ідентифікацією, датою, і схемою розведення. Кожне розведення було швидко струшене до додавання до планшетів. Використовуючи моторизований Finnpipette або інший відповідний піпетор з 1000 мкл наконечником, 200 мкл на лунку зразка інокулювали в єдиний ряд планшету. Зразки були завантажені відповідно до вірусної концентрації. По-перше, 2 ряди контрольного розведення додавали до планшетів, з наступним найвищим розведенням -10 -10 вірусу (10 ) і залишали з залишками зразків. Зразки були завантажені в послідовності від 10 -1 до 10 . ПРИКЛАД 4: Одержання вірусу Збір вірусу та CPE оцінювали наступним способом. Після 4-денного інкубаційного періоду цитопатичний ефект (CPE) аналізували мікроскопічним дослідженням. Присутність продуктів розпаду клітин, поява мертвих клітин і недостача життєздатних клітин використовувалися, щоб характеризувати CPE, тому що вони типові для вірусу грипу. Іноді невизначена інтерференція спостерігалася в початкових вірусних розведеннях, тому було важливо досліджувати кілька розчинень для CPE. Оцінюючи CPE було важливо визначити ступінь CPE у лунках найвищого розведення, що демонструють CPE. Найвищі рівні успіху були досягнуті, вибираючи лунки зразка найвищого розведення, що показують CPE, але ті лунки, перевага яким була надана або лунки, які показали найменший ступінь CPE. Після відбору, вміст лунок збирали використовуючи одноканальну 1000 мкл піпетку для аспірації рідини. Звичайно, рідина була взята піпеткою повторно, щоб видалити прикріплені клітини з дна лунки та допомогти зруйнувати будь-які скупчення клітин або вірусу в суспензії. Зібрані рідини потім використовувалися, щоб виконати додатковий цикл, або цикли клонування методом серійних розведень або іноді використовувалися, щоб інокулювати свіжий моношар для одержання посіву після клонування. Звичайно здійснювали 2-3 цикли клонування методом серійних розведень в безпосередній послідовності, щоб одержати однорідну популяцію вірусу. НА титр був проаналізований на кожній стадії процесу і результати показані у Таблиці 1. A/Indonesia/05/2005 (INDOH5N1), A/Vietnam/1203/04 (VNH5N1), A/New Caledonia/20/99 (A/NC/20/99 (R)), і A/Wisconsin/67/05 (A/Wis/67/05R) є рекомбінатними вірусами грипу, наданими ЦКЗ (центр контролю захворювань). Для рекомбінантних вірусів гени, що кодують поверхневі глікопротеїни НА і NA - від штамів грипу (INDOH5N1, VNH5N1, A/New Caledonia/20/99 іі A/Wis/67/05), у той час внутрішні гени залишаються від A/PR/8/34. Клонування методом серійних розведень застосовували до дикого типу (без рекомбінованого PR8), штам грипу A/New Caledonia/20/99 (A/NC/20/99), A/Wisconsin/67/05 (A/Wis/67/05) і B/Malaysis/2506/04. Віруси були одержані при використанні зворотних генетичних способів і пасажів у яйця ембріонів, що розвиваються. Матеріали яйця безпосередньо використовувалися для клонування граничного розведення в клітинах Vero (процедура для НА титрування показана у Прикладі 5). 16 UA 100849 C2 Таблиця 1 НА Титр* до і після клонування граничного розведення (КГР, LDC) Після 2Оригінальні ** До *** Після 3-го Роллерштам грипу ого матеріали КГР(LDC) КГР(LDC) флакон КГР(LDC) Indo5N1 20 480 160 1 280 2 560 5 120 VNH5N1 2560