Біомаркер для передбачення результату протиракової імунотерапії

Реферат: Винахід стосується способу передбачення ефективності протиракової імунотерапії у пацієнта на базі біомаркера Аполіпопротеїну А1 (ApoA1). UA 111952 C2 (12) UA 111952 C2 UA 111952 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Цей винахід стосується методів передбачення ефекту від протиракової імунотерапії у пацієнта за допомогою нових біомаркерів. Цей винахід також стосується прогнозу результату лікування на базі згаданих біомаркерів. Цей винахід також стосується наборів біомаркерів для використання у вищезгаданих методах Отже, за цією заявкою на винахід заявляється пріоритет заявки GB1021289.6, поданої 15 грудня 2010 р., заявки US 61/416,981, поданої 24 листопада 2010 р., та US 61/423,652, поданої 16 грудня 2010 р. Ця заявка включає перелік 50 послідовностей. Для цілей цього винаходу всі цитовані джерела включені в цей документ шляхом посилання в усій повноті. Передумова створення винаходу Стимуляція імунної відповіді залежить від присутності антигенів, що сприймаються імунною системою хазяїна як чужорідні. Відкриття існування пухлино-асоційованих та пухлиноспецифічних антигенів збільшує можливість використання імунної системи хазяїна для втручання в ріст пухлини. Зараз вивчається можливість використання для імунотерапії раку різних механізмів задіяння як гуморальної, так і клітинної ланки імунної системи. Певні елементи клітинної ланки імунної системи здатні специфічно розпізнавати та знищувати пухлинні клітини. Виділення цитотоксичних Т-лімфоцитів (ЦТЛ) із популяції пухлиноінфільтруючих клітин або з периферичної крові дозволяє припустити, що такі клітини відіграють важливу роль у природному імунному захисті від раку (Cheever et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 1993 690:101-112; Zeh HJ, Perry-Lalley D, Dudley ME, Rosenberg SA, Yang JC; J Immunol. 1999, 162(2):989-94). Важливу роль у цій відповіді відіграють, зокрема, CD8-позитивні Т-клітини + (CD8 ), які розпізнають комплекси, що утворені молекулами головного комплексу гістосумісності I класу (MHC) та пептидами. Ці пептиди зазвичай складаються з 8-10 амінокислотних залишків, що отримані з цитозольних білків або дефектних рибосомальних продуктів (DRIP) (Schubert U, Antón LC, Gibbs J, Norbury CC, Yewdell JW, Bennink JR. Nature 2000; 404(6779):770-774). Молекули MHC людини також визначаються як лейкоцитарні антигени людини (HLA). Існує два класи молекул MHC. Молекули MHC I класу можна виявити в більшості клітин, що мають ядра, ці молекули презентують пептиди, які утворюються в результаті протеолітичного розщеплення ендогенних білків, продуктів DRIP та великих за розміром пептидів. Молекули MHC II класу містяться головним чином на професійних антиген-презентуючих клітинах (АПК) і презентують пептиди екзогенних білків, які поглинаються клітинами АПК і згодом процесуються (Cresswell P. Annu. Rev. Immunol. 1994; 12:259-93). Комплекси пептидів і молекул MHC I класу розпізнаються CD8-позитивними цитотоксичними Т-лімфоцитами, що несуть відповідний Тклітинний рецептор (ТКР), в той час як комплекси пептиду і молекул MHC II класу розпізнаються CD4-позитивними Т-хелперами, що несуть відповідний ТКР. Загальновідомо, що ТКР, пептид і MHC, таким чином, є присутніми у стехіометричних кількостях у співвідношенні 1:1:1. Щоби пептид викликав клітинну імунну відповідь, він має зв’язатися з молекулою MHC. Цей процес залежить від алеля молекули MHC і від амінокислотної послідовності пептиду. Пептиди, що зв’язують молекули MHC I класу, зазвичай мають довжину 8, 9 або 10 амінокислотних залишків і містять консервативні залишки («якорі») у своїх послідовностях, які взаємодіють з відповідною зв'язувальною щілиною молекули MHC. Таким чином, кожний алель MHC має «зв'язувальний мотив», що визначає, які пептиди зможуть специфічно зв’язатися зі зв'язувальною щілиною (Rammensee H. G., Bachmann J. and Stevanovic, S; MHC Ligands and Peptide Motifs, Chapman & Hall 1998). Щоби викликати імунну реакцію, пептиди не тільки мають бути здатними зв’язатися з певними молекулами MHC, але вони також мають розпізнаватися Тклітинами, що несуть специфічні Т-клітинні рецептори (ТКР). Іншою передумовою ефективних імунних реакцій є відсутність імунологічної толерантності до цього антигену. Пухлино-асоційовані антигени (TAA), частиною яких є епітопи, що розпізнаються ЦТЛ, можуть бути молекулами білків будь-якого класу, такими як ферменти, рецептори, фактори транскрипції тощо, які експресуються на високому рівні у клітинах відповідної пухлини. Крім того, антигени можуть бути пухлино-специфічними , тобто унікальними для пухлинних клітин, наприклад, такі як продукти мутованих генів, або з альтернативних відкритих рамок зчитування (ВРЗ), або білкового сплайсингу (Vigneron N, Stroobant V, Chapiro J, Ooms A, Degiovanni G, Morel S, van der Bruggen P, Boon T, Van den Eynde BJ. Science 2004 Apr 23; 304 (5670):587-90). Іншим важливим класом антигенів є тканино-специфічні антигени, такі як CT («раково-тестикулярні»)антигени, які експресуються у різних видах пухлин і у здорових тканинах яєчок. Таким чином, TAA є стартовою точкою для розробки протипухлинних вакцин. Методи ідентифікації і визначення характеристик TAA базуються, наприклад, на використанні ЦТЛ, які можна виділити з організму пацієнтів або здорових суб’єктів, або вони ґрунтуються на генерації різних профілів транскрипції або різному характері експресії пептидів тканинами пухлин і нормальними тканинами (Lemmel C., Weik S., Eberle U., Dengjel J., Kratt T., Becker H. D., 1 UA 111952 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Rammensee H. G., Stevanovic S. Nat. Biotechnol. 2004 Apr.; 22(4):450-4, T. Weinschenk, C. Gouttefangeas, M. Schirle, F. Obermayr, S. Walter, O. Schoor, R. Kurek, W. Loeser, K. H. Bichler, D. Wernet, S. Stevanovic, and H. G. Rammensee. Cancer Res. 62 (20):5818-5827, 2002). Однак ідентифікація генів, що надмірно експресовані або селективно експресовані в тканинах пухлин або в лініях клітин пухлин людини, не надає достатньої інформації щодо того, чи є відповідний антиген корисним як мішень для імунотерапії з використанням Т-клітин. Це пов’язано з тим, що лише певна субпопуляція епітопів цих антигенів а) презентується і b) розпізнається Т-клітинами з відповідними ТКР. Крім цього, імунологічна толерантність для саме цього епітопу має бути відсутньою або незначною. Тому важливо вибрати тільки такі пептиди з тих, що належать до надмірно експресованих або селективно експресованих білків, які презентуються в сполученні з молекулами MHC і яких можуть бути мішенями для функціональних Т-клітин. Функціональна Т-клітина визначається як Т-клітина, яка при стимуляції конкретним антигеном може бути клонована і здатна виконувати ефекторні функції («ефекторна Т-клітина»). Т-хелперні клітини відіграють важливу роль в регуляції ефекторної функції ЦТЛ у протипухлинному імунітеті. Епітопи Т-хелперів, які запускають реакцію цих клітин типу T H1, підтримують ефекторні функції CD8-позитивних ЦТЛ, котрі включають цитотоксичні функції, спрямовані проти клітин пухлини, що експресують комплекси пухлино-асоційованого пептиду/MHC на поверхнях своїх клітин. У такий спосіб пухлино-асоційовані епітопи T-клітинхелперів, самостійно або в комбінації з іншими пухлино-асоційованих пептидами, можуть служити активними фармацевтичними інгредієнтами композицій вакцин, які стимулюють протипухлинні імунні відповіді. Оскільки обидва типи відповіді, залежні від CD8 та CD4, спільно та синергічно роблять свій внесок у протипухлинну дію, то ідентифікація та визначення характеристик пухлиноасоційованих антигенів, які розпізнаються CD8-позитивними ЦТЛ (ліганд: молекула MHC I класу + пептидний епітоп), так само як і TAA, які розпізнаються CD4-позитивними Т-хелперами (ліганд: молекула MHC II класу + пептидний епітоп), є важливими для розробки ефективних протипухлинних вакцин і ефективних методів лікування з використанням цих вакцин. У Європі нирково-клітинна карцинома (НКК) займає сьоме місце серед найбільш поширених злоякісних захворювань у чоловіків, серед яких щорічно реєструється 29 600 нових випадків (3,5% від усіх видів раку). Серед жінок НКК займає дванадцяте місце, 16 700 випадків щорічно (2,3% від усіх видів раку). НКК рідко спостерігається у віці до 40 років, а після цього віку вона удвічі частіше вражає чоловіків, ніж жінок. Захворюваність з віком швидко зростає від менш ніж 2 випадків на 100 000/рік серед пацієнтів молодше 40 років до 38 на 100 000/рік у віковій групі 65–69 років. Після цього віку захворюваність зростає до 46 випадків на 100 000/рік у віковій групі понад 75 років. Загалом у 25–30% пацієнтів із НКК діагностуються очевидні метастази при першому виявленні захворювання. Приблизно у третьої частини пацієнтів із НКК згодом розвивається метастатична хвороба. Таким чином, у приблизно 50–60% усіх пацієнтів із НКК кінець кінцем розвивається метастатична хвороба. Серед хворих із метастазами у приблизно 75% спостерігаються метастази у легені, у 36% - у лімфовузли та/або з розповсюдженням на м’які тканини, у 20% - у кістки і у 18% - у печінку. НКК є карциномою з найвищим рівнем летальності серед пухлин сечостатевої системи з п’ятирічною виживаністю 65% у порівнянні з 82% і 100% п’ятирічною виживаністю для раку сечового міхура і передміхурової залози, відповідно (інформація для США за станом на 19722001 рр.). Середні значення виживаності через 5 років (до 1999 р.) після встановлення діагнозу (1990-1994 рр.) раку нирки були приблизно 58% у Європі, і НКК була класифікована декількома дослідниками як рак із лише сумнівним прогнозом. Загалом НКК є фатальним захворюванням приблизно для 80% пацієнтів. Таке високе значення свідчить про нагальну потребу медицини в ефективному та своєчасному методі клінічного спостереження та лікування рецидивів. Виживаність сильно залежить від стадії розвитку пухлини, на якій був встановлений діагноз: 5-річна виживаність становить лише 12% у пацієнтів з пухлинними ураженнями з віддаленими метастазами, але 80% у пацієнтів із локалізованими злоякісними пухлинами. Колоректальна карцинома (КРК) займає третє місце за розповсюдженістю в світі. Вперше діагностується близько 1 мільйона нових випадків раку товстої та прямої кишки щорічно, і, на відміну від більшості інших пухлин, він вражає чоловіків і жінок майже однаково (співвідношення 1,2:1). У Європі КРК є другим найбільш поширеним видом раку і другою найпоширенішою причиною смерті від раку як у чоловіків, так і у жінок. Щорічно вперше діагностується приблизно 380 000 випадків цього раку і приблизно 200 000 випадків смерті, пов’язаних із цією хворобою. За необробленими даними, захворюваність чоловіків та жінок у 2002 р. складала 88,3 і 2 UA 111952 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 84,0/100 000 населення, відповідно; необроблені дані по смертності - 34,8 і 35,2/100 000населення, відповідно. Ці дані чітко відображають, наскільки важким тягарем є КРК як для кожної людини окремо, так і для суспільства в цілому. КРК є раковою хворобою людей похилого віку, оскільки середній вік появи клінічних проявів хвороби у чоловіків та жінок становить 69 і 75 років, відповідно. Крім факторів, пов’язаних із харчуванням та способом життя (наприклад, ожирінням, браком фізичних навантажень, палінням, регулярним вживанням алкоголю), іншими факторами ризику є сімейний анамнез щодо КРК, спадкові види КРК (сімейний аденоматозний поліпоз [САП], атенуйований САП [атенуйований аденоматоз поліпоз coli], спадковий неполіпозний колоректальний рак [СНПКР], гамартомний поліпоз) та запальні захворювання кишечника, такі як виразковий коліт та хвороба Крона. КРК здебільшого виникає як аденокарцинома слизових оболонок прямої кишки, сигмоподібної кишки, поперечної ободової/низхідної ободової і висхідної ободової/сліпої кишки. Ранні стадії колоректальної карциноми можна лікувати первинною хірургічною операцією. Однак віддалені метастази розповсюджуються на реґіонарні лімфатичні вузли і на печінку, легені та інші органи (такі як ЦНС). У зв’язку з неспецифічними симптомами КРК часто діагностується на відносно пізній стадії, і приблизно у 25% пацієнтів, хворих на КРК, спостерігаються метастази (мКРК), коли вони вперше проходять обстеження у лікаря, який їх лікує. На додаток, у 30% пацієнтів із вперше діагностованою локалізованою резектабельною КРК згодом з’являються рецидиви метастазів. У заявці EP2105740 описується, що деякі білки, включаючи аполіпопротеїн AI (APOA1), регулюються підвищеною експресією c-myc у суб’єктів, що хворіють на рак або сприйнятливі до нього. Таким чином, у EP2105740 описується використання біомаркера APOA1 в діагностиці, визначенні прогнозу та/або моніторингу лікування ракової хвороби, зокрема раку легенів, але не для передбачення ефективності лікування, тим більше не імунотерапії. У заявці WO2010/076322 описується метод передбачення відповіді на хіміотерапію та/або користі від її застосування у пацієнта, що страждає на рак, що включає (i) класифікацію пухлини щонайменше на два класи, (ii) визначення у зразку пухлини експресії щонайменше одного генамаркера, що є свідченням відповіді пухлини кожного відповідного класу на хіміотерапію, (iii) і, залежно від згаданої експресії гена, передбачення згаданої відповіді та/або користі, де одним геном-маркером є CXCL13. У заявці WO2010/076322 також не описується передбачення ефективності лікування, тим більше імунотерапії. Так само, у заявці WO2010/003773 описуються методи передбачення результатів лікування ракової хвороби у пацієнта, що страждає на рак, причому згаданому пацієнтові було раніше діагностовано ураження лімфовузлів, і він пройшов лікування методом цитотоксичної імунотерапії, де одним геном-маркером є CXCL13. У заявці WO2010/003773 не описується передбачення ефективності імунотерапії. Заявка EP 1 777 523 A1 має відношення до прогнозу результату лікування ракового захворювання у пацієнта, прогноз якого базується на кількісному визначенні одного чи декількох біологічних маркерів, які свідчать про наявність або, альтернативно, на рівень адаптивної імунної відповіді згаданого пацієнта, що спрямована проти ракового захворювання. Загалом, розкрита надзвичайно велика кількість маркерів. Крім цього, EP 1 777 523 A1 стосується прогнозу (але не передбачення) результату лікування ракового захворювання у пацієнта, прогноз якого базується на виявленні та/або кількісному визначенні одного чи декількох біологічних маркерів, які свідчать про наявність або, альтернативно, на рівень адаптивної імунної відповіді згаданого пацієнта, що спрямована проти ракового захворювання в місці локалізації пухлини. Незважаючи на нещодавній прогрес у діагностиці та веденні багатьох видів раку, як це описано вище, таких як, наприклад, НКК і КРК, існує необхідність у біологічних маркерах, які можна було б застосовувати з метою підвищення якості діагностики і особливо для передбачення того, чи можна очікувати користь від імунотерапії, з метою подальшого підвищення виживаності і розширення можливостей вносити корективи у лікування людей, що його потребують. Крім цього, маркери мають також дозволити передбачувати кінцевий результат згаданого лікування раку. Тому метою цього винаходу є розробка відповідних біологічних маркерів і методів діагностики, передбачення ефекту від лікування і прогностичних методів. У першому аспекті цього винаходу згадану мету досягають за рахунок розробки методу передбачення ефективності імунотерапії у пацієнта, хворого на рак, що включає: a) визначення рівня щонайменше одного маркера, який вибраний із групи, що містить аполіпопротеїн A1 (ApoA1), CCL17/TARC, еозинофіли (абсолютну кількість або %), моноцити (абсолютну кількість 3 UA 111952 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 або %), CD95/Fas, аспартатамінотрансферазу/глутаматоксалоацетаттрансаміназу (АсАТ/СГОТ) сироватки, раковий антиген 19-9 (CA19-9), лактатдегідрогеназу (ЛДГ), треонін, імуноглобулін E (IgE) та матричну металопротеїназу 3 (MMP-3) у зразку, отриманому від пацієнта, хворого на рак, в якому вищий (або підвищений) рівень маркера у порівнянні з медіанним значенням для даної популяції пацієнтів, хворих на рак, є свідченням користі від застосування імунотерапії у згаданого пацієнта, або b) визначення рівня щонайменше одного маркера, вибраного з групи, що містить CXCL13/BCA-1, нейтрофіли (у %), інтерлейкін 6 (ІЛ-6) та ацилкарнітини з коротким ланцюгом у зразку, отриманому від пацієнта, хворого на рак, в якому більш низький (знижений) рівень маркера у порівнянні з медіанним значенням (+/-10%) для даної популяції пацієнтів, хворих на рак, є свідченням користі від застосування імунотерапії у згаданого пацієнта. У цьому втіленні винахід стосується одиничних (які також мають назви «моноваріантних» та «окремих») маркерів для передбачення ефекту, зокрема користі від застосування імунотерапії у пацієнта, хворого на рак, як описано в цьому документі, такого як подовження загальної виживаності, одна чи декілька Т-клітинних відповідей, що були викликані імунотерапією, уповільнення росту пухлини, скорочення пухлини або поліпшення виживаності без прогресування. У контексті цього винаходу терміни «маркер», «біомаркер», «аналіт» або «параметр» є взаємозамінними і всі вони стосуються маркера(ів), що аналізуються в контексті методу(ів) відповідно до цього винаходу. У контексті цього винаходу використання термінів «передбачення», «маркер для передбачення» виходить з поняття «маркери» згідно з цим винаходом, які є інформативними з точки зору ефективності протиракової імунотерапії, такої, наприклад, як терапія з використанням вакцин(и), як описано в цьому документі. Як з’ясувалося, CXCL13/BCA-1, ApoA1, нейтрофіли, еозинофіли, моноцити, CD95/Fas, АсАТ/СГОТ, CCL17/TARC, ацилкарнітини з коротким ланцюгом і CA19-9 є маркерами, що передбачають загальну виживаність і в деяких випадках відповідь Т-клітин за допомогою одновимірних аналізів. Переважним є метод відповідно до цього винаходу, в якому згаданий маркер вибраний із ApoA1 та/або CCL17/TARC. Рівні CCL17/TARC, що перевищують медіанне значення для відповідної досліджуваної популяції, і рівні ApoA1, що перевищують медіанне значення, як це зазначено виробником відповідного аналітичного засобу (наприклад, компанією Rules Based Medicine (RBM), 0,288 мг/мл), є позитивними. Переважним є метод відповідно до цього винаходу, в якому згаданий маркер вибраний із CXCL13/BCA-1 або моноцитів. Однак цей винахід включає також комбінації маркерів, такі як, наприклад, вибрані з ApoA1 і CCL17/TARC; ApoA1 і CXCL13/BCA-1; ApoA1, CXCL13/BCA-1 і моноцити; ApoA1, CCL17/TARC, CXCL13/BCA-1 і моноцити; CCL17/TARC і CXCL13/BCA-1; CCL17/TARC, CXCL13/BCA-1 і моноцити; CCL17/TARC, ApoA1 і моноцити; CCL17/TARC, ApoA1 і CXCL13/BCA-1; CCL17/TARC і моноцити; CXCL13/BCA-1 і моноцити; ApoA1 і моноцити. Всі ці комбінації маркерів є особливо переважними. Інші переважні комбінації маркерів вибрані з CXCL13/BCA-1, нейтрофілів у %, ApoA1, еозинофілів у %, еозинофілів у абсолютних числах (абсолютна кількість), моноцитів у %, FAS, TARC; ЛДГ, Thr, ІЛ-6, альбуміну, IgE, MMP-3, CA19-9; моноцитів у абсолютних числах, АсАТ, білірубіну, ацилкарнітинів (scAC); і ІЛ-33. Всі ці комбінації маркерів також є особливо переважними ApoA1 є основним білком ліпопротеїнів високої щільності (ЛПВЩ), і його можна міряти замість ЛПВЩ у клінічних аналізах. У нормальних умовах ЛПВЩ демонструють антисклеротичні, антиоксидантні, антитромботичні та протизапальні властивості. Однак в умовах хронічного запального процесу/окислювального стресу (наприклад, за наявності хронічних інфекційних процесів, аутоімунних захворювань, метаболічного синдрому і раку) ЛПВЩ втрачають ці властивості і набувають прозапальні властивості. У прозапальних ЛПВЩ (piHDL) рівень ApoA1 – негативного білка гострої фази - знижується, а інших білків, таких як амілоїд А сироватки (SAA) – позитивного білка гострої фази - підвищується. Таким чином, низькі рівні ApoA1 є свідченням хронічного запального процесу і окислювальних умов, і вони можуть, у свою чергу, сприяти виникненню таких станів, котрі, як відомо, сприяють розвитку ракового захворювання. Про знижені рівні ApoA1 повідомлялося у зв’язку з багатьма видами ракових захворювань, і вони також спостерігалися у пацієнтів із НКК у когорті дослідження IMA901-202 (фази II). Заслуговує на увагу, що повідомлялося про те, що споріднений білок ApoA2 є позитивним прогностичним маркером метастатичної НКК, і в дослідах на мишах була показана функціональна причетність ApoA1 до пригнічення прогресування раку (Su et al., 2010; Vermaat et al., 2010). На додаток до їхньої здатності сприяти розвитку ракового захворювання, як відомо 4 UA 111952 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 також, реакції хронічної та гострої фази та окислювальний стрес також несприятливо діють на відповідь адаптивної імунної системи (Haeryfar and Berczi, 2001; Muller et al., 2008; Vallejo et al., 2004). CCL17/TARC є хемокіном, що спочатку був класифікований як хемокін, що притягує клітини TH2, однак він має також інші клітинні мішені, такі як ефекторні клітини/Т-клітини пам’яті типів TH1 і TH2, особливо ті, що здатні мігрувати у шкіру, субпопуляцію CD8+ T-клітин, T-клітини пам’яті TH17, NK- і NKT-клітини, дендритні клітини тощо. Досліди на мишах показали, що внутрішньопухлинна експресія CCL17/TARC є сприятливою для реакцій імунного відторгнення. Рівні у сироватці можуть свідчити про активність мієлоїдних дендритних клітин, макрофагів і моноцитів, які є основними джерелами цього хемокіну. Як було показано, постійна продукція CCL17 дендритними клітинами є передумовою їхньої унікальної функції з ініціації антигеннезалежних відповідей у Т-клітинах. На відміну від таких хвороб як атопічний дерматит і деяких інших алергічних або аутоімунних хвороб, за яких рівень CCL17/TARC є патологічно підвищеним, що вважають за свідоцтво підвищеної активності TH2, рівні CCL17/TARC залишалися у межах норми у популяції суб’єктів клінічного дослідження IMA901-202 і співвідносилися з цитокінами типу TH1, такими як ІЛ-12 та IFN-гама. У контексті цього винаходу рівні ApoA1 та рівні CCL17/TARC, що були вищими за медіанні рівні у пацієнтів із НКК на пізніх стадіях, вважалися такими, що сприяють успіху лікування. Для пацієнтів, у яких щонайменше один фактор перевищує згадані порогові значення (статистично близько 75%), передбачається покращений кінцевий клінічний результат після вакцинації протираковою вакциною IMA901 (Immatics Biotechnologies, Тюбінген, Німеччина) у порівнянні з пацієнтами, обидва фактори яких є нижчими, ніж порогові значення. У пацієнтів з обома факторами, що перевищують указані порогові значення (статистично - близько 25%), передбачається найбільша користь від лікування. Нижня межа норми (НМН) для ApoA1 залежить від методу аналізу. Якщо користуватися мультиплексним аналізом з мікросферами Luminex (компанії RBM), НМН дорівнює 0,288 мг/мл. Якщо користуватися іншими методами аналізу, НМН треба відкоригувати або виходячи з інформації, наданої виробником, шляхом проведення паралельних експериментів з порівнянням результатів з результатами, що отримані загальноприйнятим методом, або вимірюванням статистично значущої кількості зразків від здорових донорів.Медіанні рівні CCL17/TARC та/або ApoA1 для певної популяції пацієнтів залежіть від популяції та від методу кількісного аналізу. Переважні методи визначення рівня маркерів і конкретно ApoA1 та CCL17/TARC вибрані із групи імунологічних методів, таких як ELISA, мультиплексний імунохімічний аналіз з використанням мікросфер, чипів або планшетів, методи протеоміки, або з мас-спектрометрії, аналізів біологічної активності, електрофорезу, імунонефелометрії, імунотурбідиметрії, ферментативних методів аналізу, колориметричних або флюорометричних методів аналізу, з оцінкою, наприклад, за допомогою фотометрії і методів, на основі сортування клітин з активованою флуоресценцією (FACS). Нейтрофіли, еозинофіли і моноцити можна визначити за допомогою сортування FACS або інших загальноприйнятих у клінічній практиці гематологічних методів. ApoA1 має високий рівень кореляції з холестерином ЛПВЩ і тому може бути визначеним усіма методами визначення холестерину ЛПВЩ. Крім цього, як маркер був ідентифікований хемокін 1(CXCL13/BCA-1), що притягує В-клітини. Очевидно, CXCL13/BCA-1 є необхідним для організації заселення лімфоїдних органів лімфоцитами. Підвищені рівні для деяких видів пухлин пов’язані з метастазами і несприятливим прогнозом і, можливо, з порушеннями протипухлинних імунних відповідей. Еозинофіли, чиї рівні у відсотках і абсолютних числах були ідентифіковані як маркер, якщо взяти до уваги повідомлення, що суперечать одне одному, можуть відігравати декілька, причім протилежних, функцій при захворюванні на рак. Рекрутинг еозинофілів у місце локалізації пухлини є напевне позитивним явищем у декількох випадках. Рекрутинг еозинофілів у місце ін’єкції Г-КСФ був виявлений у випадку меланоми. Моноцити, рівні яких у відсотках і абсолютних числах були ідентифіковані як маркер, рекрутуються до місць запалення або місць введення Г-КСФ. Вони здатні диференціюватися у мікрофаги або дендритні клітини і можуть самі відігравати роль АПК. Вони можуть заміняти тканинні дендритні клітини, що емігрували, такі як клітини Лангерганса. Навпаки, моноцитоз описували як негативний фактор при хворобі на рак і терапії НКК введенням ІЛ-2, ймовірно, у зв’язку з утворенням активних форм кисню (АФК) і інгібуванням NK- і T-клітин. Розчинний CD95/Fas генерується шляхом альтернативного сплайсингу і конкурує з CD95, що зв’язаний з мембраною, за зв’язування CD95L/FasL. Таким чином, він може відвертати апоптоз Т-клітин, наприклад, в місці локалізації пухлини (контратака на пухлину). Він також може протидіяти неапоптотичним функціям сигнальних шляхів CD95, що сприяє рухливості та 5 UA 111952 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 інвазивності ракових клітин. CD95 може також мати зв’язок із еозинофілами, відвертаючи їхній апоптоз. Навпаки, CD95 може також інгібувати CD95L-опосередковане знищення Т-клітин, у деяких видах це корелює з високим пухлинним навантаженням і несприятливим прогнозом. Відомо, що нейтрофіли є негативним прогностичним маркером при захворюванні на рак. вЗокрема, високе співвідношення нейтрофілів і лімфоцитів вказує на несприятливий прогноз для декількох видів раку. У цьому випадку припускається можливість додаткового несприятливого впливу на імунотерапію Ракового захворювання. Нейтрофіли можуть протидіяти імунним реакціям шляхом інгібування Т- і NK-клітин. Рівень ацилкарнітинів з коротким ланцюгом підвищується у випадку зниженої швидкості клубочкової фільтрації (ШКФ), що свідчить про більш серйозне ушкодження нирки, яке може призвести до зниженого доступу кров’яних клітин до пухлини (Wanner 1988). З іншого боку, повідомлялося, що рівень розчинних у кислотах ацилкарнітинів (вільних і з коротким ланцюгом) є нижчим у хворих на рак, ніж у пацієнтів групи контролю (Sachean 1987). CA19-9 є епітопом на сіальованій структурі Льюіса A, вуглеводним антигеном муцинового типу, такого як MUC1. Його присутність у сироватці може корелювати з експресією MUC у пухлині і, у такий спосіб, із присутністю одного з антигенів вакцини. Навпаки, пухлинні маркери у сироватці зазвичай є негативними прогностичними маркерами. АсАТ/СГОТ є ферментом, задіяним у метаболізмі амінокислот. Як і у випадку ЛДГ, підвищений рівень у сироватці слугує індикатором підвищеного обігу клітин, як це відбувається у випадку ураження печінки та інших органів, а також при раковому захворюванні. Отримані нами результати підтверджують, що високі рівні АсАТ/СГОТ і ЛДГ є негативними прогностичними факторами при раковому захворюванні, але неочікуваним є те, що результати також показали, що, напевно, вони є позитивними передбачувальними факторами кінцевого результату імунотерапії. Причина цього досі не зрозуміла. Можна зробити припущення, що загибель клітин усередині пухлини, особливо у формі некрозу, сприяє імунним реакціям в місці локалізації пухлини. В іншому аспекті метод за цим винаходом додатково включає: c) визначення рівня щонайменше одного маркера, який вибраний із групи, що містить альбумін і прямий білірубін у згаданому зразку від пацієнта, хворого на рак, де більш високий рівень у порівнянні з медіанними значеннями (+/-10%) для даної популяції пацієнтів, хворих на рак, є свідченням користі від застосування імунотерапії у згаданого пацієнта, або d) визначення рівня маркера інтерлейкіна 33 (ІЛ-33) у зразку, отриманому від пацієнта, хворого на рак, в якому більш низький рівень маркера у порівнянні з медіанним значенням (+/-10%) для даної популяції пацієнтів, хворих на рак, є свідченням користі від застосування імунотерапії у згаданого пацієнта. Згідно з цим аспектом винаходу, вказані маркери використовуються з метою додаткової підтримки одиничних маркерів, згаданих вище у першому аспекті цього винаходу. Таким чином, ці маркери використовуються для створення набору чи панелі маркерів для «багатовимірного» аналізу для цілей діагностики. Особливо переважним є метод відповідно до цього винаходу, в якому згаданий набір або панель маркерів для багатовимірного аналізу складається з таких маркерів як CXCL13/BCA-1, ApoA1, нейтрофіли, еозинофіли (у відсотках і абсолютних числах), моноцити (у відсотках і абсолютних числах), CD95/FAS, АсАТ/СГОТ, CCL17/TARC, ЛДГ, Thr, ІЛ-6, ацилкарнітини з коротким ланцюгом, альбумін, білірубін, IgE, ІЛ-33, MMP-3 і CA19-9. Згідно з метою цього винаходу референтне значення рівню маркера є пороговим значенням для кожного маркера, яке визначає, чи отримає пацієнт користь від імунної терапії. Залежно від того, чи є маркер негативним або позитивним, більш високий або більш низький його рівень у пацієнта у порівнянні з референтним значенням є ознакою того, чи можна очікувати користь від імунної терапії. Референтне значення в одному варіанті втілення складає +/-10% від медіанного значення концентрації, що спостерігається у даної популяції пацієнтів, хворих на рак. Більш переважно, якщо референтне значення, залежно від того, чи є воно негативним чи позитивним, відповідає верхній чи нижній квартилі, або верхній чи нижній квінтилі, або верхній чи нижній децилі даної популяції пацієнтів, хворих на рак. Найбільш переважно, якщо референтне значення негативного маркера, аж до якого пацієнтів вважають за таких, що отримують користь від лікування, відповідає 70-й процентилі, 80-й процентилі і, найбільш переважно, 90-й процентилі. Для позитивних маркерів найбільш переважно, якщо референтне значення, починаючи з якого, як вважається, пацієнти мають отримати користь від лікування, відповідає 30-й процентилі, 20-й процентилі і, найбільш переважно, 10-й процентилі. Інший важливий аспект цього винаходу стосується методу відповідно до цього винаходу, в якому згадана імунотерапія включає вакцинацію протираковою вакциною, необов’язково - разом із ад’ювантом, таким як, наприклад, Г-КСФ. 6 UA 111952 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Імунотерапія і відповідні вакцини описані в існуючому рівні техніки. Імунотерапія хворих на рак пацієнтів націлена на специфічну активацію клітин імунної системи, особливо так званих цитотоксичних Т-клітин (ЦТК, також відомих як «кілерні клітини», також відомих як CD8+ Tклітини) проти клітин пухлини, але не проти клітин здорової тканини. Пухлинні клітини відрізняються від здорових клітин експресією пухлино-асоційованих та пухлино-специфічних білків. Молекули HLA презентують назовні на клітинних поверхнях частину вмісту клітин, у такий спосіб надаючи ЦТЛ можливість відрізняти здорові клітини від пухлинних. Це відбувається шляхом розщеплення усіх білків всередині клітини на короткі пептиди, які потім прикріплюються до молекул HLA і презентуються на клітинній поверхні. Пептиди, які презентуються на пухлинних клітинах, але не презентуютьс або у набагато менший мірі презентуються на здорових клітинах організму, мають назву пухлино-асоційованих пептидів (TUMAP). Антигенами, епітопи яких розпізнаються пухлино-специфічними Т-клітинами, можуть бути молекули усіх класів білків, таких як , рецептори, фактори транскрипції тощо. Однак примування одного типу ЦТЛ зазвичай недостатньо для знищення всіх пухлинних клітин. Пухлинам властива сильна мутагенна дія і, таким чином, вони здатні швидко реагувати на атаки ЦТЛ шляхом змінення їхньої білкової структури, щоб уникати розпізнавання цитотоксичними клітинами. Для протидії механізмам уникнення пухлин від атаки для вакцинації використовувалися різноманітні специфічні пептиди. У такий спосіб можна здійснити загальну одночасну атаку на пухлину декількома клонами ЦТЛ. Це може зменшити шанси пухлини ухилитися від імунної відповіді. Ця гіпотеза нещодавно одержала підтвердження у клінічному дослідженні лікування пацієнтів з меланомою на пізніх стадіях. За лише кількома виключеннями, пацієнти, що дали щонайменше три чіткі Т-клітинні відповіді, демонстрували об’єктивні клінічні відповіді або стабілізацію захворювання, а також підвищену виживаність, у той час як переважній більшості пацієнтів з менш ніж трьома Т-клітинними відповідями будо діагностовано прогресування захворювання (Banchereau et al., 2001). Переважним препаратом/композицією, що застосовується в контексті методів за цим винаходом, є протипухлинна вакцина на основі пептидів. Інші переважні препарати включають вакцини на основі ДНК і РНК, наприклад, описані Weide і співавт. (Weide B, Garbe C, Rammensee HG, Pascolo S. Immunol. Lett. 2008 Jan 15;115(1):33-42. Epub 2007 Oct 26) вакцини на основі дендритних клітин, вакцини з використанням лізатів клітин або клітинних ліній первинних пухлин, або окремих компонентів пухлинних клітин, які включають цільні білки або білки теплового шоку. Медикамент може вводитися безпосередньо пацієнтові, тобто в уражений орган, або системно в/ш, в/м, п/ш, в/ч, п/о і в/в, або вноситися ex vivo у клітини, отримані від пацієнта чи у клітинну лінію людини, котрі згодом вводяться пацієнту, або використовуватись in vitro для вибору субпопуляції з імунних клітин, які отримані від пацієнта і які потім знов вводяться йому. Вакцинні антигени, наприклад, пептиди, можуть бути, по суті, чистими, або у комбінації з імуностимулюючим ад’ювантом (див. нижче), чи використовуватись в комбінації з імуностимулюючими цитокінами, або вводитися належною системою доставки, наприклад, ліпосомами. Пептиди також можуть бути кон’юговані з належним носієм, таким як гемоціанін фісурели (KLH) або маннан (див. патентну заявку WO 95/18145 та працю Longenecker et al (1993)). Пептиди також може бути міченими або бути злитими білками чи гібридними молекулами. Очікується, що пептиді, послідовності яких наведені у цьому винаході, стимулюють CD4+ або CD8+ T-клітини. Проте стимуляція CD8+ ЦТЛ є більш ефективною за умови сприяння з боку CD4+ Т-хелперних клітин. Таким чином, для епітопів MHC I класу, які стимулюють CD8+ ЦТЛ, партнер по злиттю або сегменти гібридної молекули принагідно постачають епітопи, які стимулюють CD4+ T-клітини. CD4+-стимулюючі епітопи добре відомі фахівцям в цій галузі техніки і включають епітопи, що були ідентифіковані в правцевому анатоксині. В ще одному переважному втіленні пептид є злитим білком, зокрема, таким, що містить N-термінальні амінокислоти HLA-DR антиген-асоційованого інваріантного ланцюга (Ii). В одному втіленні пептид за винаходом є усіченим білком людини або злитим білком, отриманим із білкового фрагмента і іншої поліпептидної частки за умови, що частка біологічного компонента людини включає одну або більше амінокислотних послідовностей за винаходом. Для застосування вакцина може також містити один або більше ад’ювантів. Переважними ад’ювантами є іміквімод, резиквімод, Г-КСФ, циклофосфамід, сунітиніб, бевацизумаб, інтерферон-альфа, CpG олігонуклеотиди та їх похідні, полі-(I:C) та її похідні, РНК, сілденафіл і композиції з твердих мікрочастинок з PLG або віросоми. Як згадувалося вище, медикамент застосовується для парентерального введення, такого як підшкірне, внутрішньошкірне, внутрішньом’язове або оральне введення. Для цього пептиди і необов’язково інші молекули розчиняють або суспендують у фармацевтично прийнятному, переважно водному носію. Крім того, композиція може містити допоміжні речовини, такі як буфери, зв’язувальні речовини, 7 UA 111952 C2 5 баластні речовини, розріджувачі, ароматизатори, антифрикційні речовини тощо. Пептиди можна також ввести разом із імуностимуляторами, такими як цитокіни. Великий перелік допоміжних речовин, які можна використовувати у такій композиції, можна знайти, наприклад, у праці A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd Ed. 2000, вид. «American Pharmaceutical Association and pharmaceutical press». Композиція може застосовуватися для попередження, профілактики та/або терапії ракових захворювань, таких як, наприклад, НКК і КРК. Приклади комбінацій пептидів для вакцин, які можна застосовувати у контексті цього винаходу, наведені нижче у таблицях 1A – 1D і мають назви IMA901, IMA910, IMA941 і IMA950, відповідно. Таблиця 1A IMA901 (наприклад, використання при НКК) SEQ ID No: 1 Скороч. MMP-001 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ADF-002 ADF-001 APO-001 CCN-001 GUC-001 K67-001 MET-001 MUC-001 RGS-001 Білок Матрична металопротеїназа 7 Адипофілін Адипофілін Аполіпопротеїн L1 Циклін D1 GUCY1A3 KIAA0367 Протоонкоген c met MUC1 RGS 5 Послідовність SQDDIKGIQKLYGKRS VMAGDIYSV SVASTITGV ALADGVQKV LLGATCMFV SVFAGVVGV ALFDGDPHL YVDPVITSI STAPPVHNV LAALPHSCL 10 Таблиця 1B IMA910 (наприклад, використання при раку товстої кишки) SEQ ID No: 11 12 13 14 15 16 17 18 5 9 1 19 8 Скороч. C20-001 NOX-001 ODC-001 PCN-001 TGFBI-001 TOP-001 TGFBI-004 CEA-006 CCN-001 MUC-001 MMP-001 CEA-004 MET-001 Послідовність ALSNLEVTL ILAPVILYI ILDQKINEV KLMDLDVEQL ALFVRLLALA KIFDEILVNA TPPIDAHTRNLLRNH SPQYSWRINGIPQQHT LLGATCMFV STAPPVHNV SQDDIKGIQKLYGKRS YLSGANLNL YVDPVITSI 8 UA 111952C2 Таблиця 1C IMA941 (наприклад, використання при раку шлунка) SEQ ID NO 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Ід. № пептиду CDC2-001 ASPM-002 UCHL5-001 MET-006 PROM1-001 UQCRB-001 MST1R-001 PPAP2C-001 SMC4-001 MMP11-001 Послідовність LYQILQGIVF SYNPLWLRI NYLPFIMEL SYIDVLPEF SYIIDPLNL YYNAAGFNKL NYLLYVSNF AYLVYTDRL HYKPTPLYF VWSDVTPLTF Таблиця 1D IMA950 (наприклад, використання при гліобластомі) SEQ ID NO 30 31 32 33 34 35 36 37 Ід. № пептиду CSP-001 FABP7-001 NLGN4X-001 TNC-001 NRCAM-001 IGF2BP3-001 BCA-002 MET-005 Послідовність TMLARLASA LTFGDVVAV NLDTLMTYV AMTQLLAGV GLWHHQTEV KIQEILTQV ALWAWPSEL TFSYVDPVITSISPKYG Таблиця 1E IMA990a (наприклад, використання при раку передміхурової залози) SEQ ID NO 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 5 Ід. № пептиду PSA-001 PSA-002 PSA-003 PSCA-001 PSCA-002 PSMA-001 PSMA-002 Сурвівін-004 Сурвівін-005 TRP-P8-001 PROSTEIN-001 PSMA-001 Сурвівін-001 Послідовність FLTPKKLQCV KLQCVDLHV VISNDVCAQV* ALQPGTALL* AILALLPAL LLHETDSAV* ALFDIESKV ELTLGEFLKL TLPPAWQPFL GLMKYIGEV CLAAGITYV NYTLRVDCTPLMYSL TLGEFLKLDRERAKN * Необов’язково не включений Таким чином, у ще одному переважному варіанті методу відповідно до цього винаходу згадана протиракова вакцина вибрана з протиракової вакцини, що включає щонайменше один 9 UA 111952 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 імуногенний пептид, вибраний із групи SEQ ID No. 1 до 37, наприклад, що включає SEQ ID No. 1 до 10; SEQ ID No. 11 до 19 і 1, 5, 8 і 9; SEQ ID No. 20 до 29, і SEQ ID No. 30 до 37. В іншому варіанті методу відповідно до цього винаходу згаданий пацієнт отримує лікування або пройшов попереднє лікування. Види такого попереднього лікування можуть включати, наприклад, лікувальну хірургічну операцію, променеву терапію та/або хіміотерапію. Переважним попереднім лікуванням є терапія на основі протиракового препарату, вибраного з цитокінів і інгібіторів тирозинкінази (ІТК), таких як сорафеніб і сунітиніб, та циклофосфаміду. В цьому варіанті згаданий метод лікування ракового захворювання можна вибрати з методів, які описані вище; переважним є імунотерапія, переважно яка включає використання протиракової вакцини, необов’язково - разом із Г-КСФ. Раковими захворюваннями, які належить лікувати, можуть бути всі види ракових захворювань, чутливих до імунотерапії, переважно, якщо вони вибрані з групи, що включає НКК, КРК, рак шлунка (РШ), меланому, немілкоклітинного раку легенів (НМРЛ), гліобластому і, в цілому, аденокарциному будь-якого виду. Зразки, які аналізують у контексті цього винаходу, можна вибрати з цільної крові, периферичної крові та її фракцій, сироватки, лейкоцитарної плівки, пухлинної тканини, лімфатичної рідини, сечі, кісткового мозку, плазми з ЕДТА, гепаринізованої плазми, цитратної плазми, гепаринізованої цільної крові і замороженої гепаринізованої цільної крові. Вибір зразка для аналізу залежить також від маркера(ів), який(і) має(ють) бути проаналізований(і), і фахівець у цій галузі здатний вибрати належний зразок відповідно до цього. У переважному втіленні метод за цим винаходом може додатково включати прогноз ефективності протиракової імунотерапії у пацієнта, де згаданий пацієнт переважно отримав попереднє лікування циклофосфамідом (як це описано вище). У контексті цього винаходу терміни «прогноз» або «прогностичний маркер» базуються на маркерах, згаданих у цьому документі, які є інформативними щодо ефективності, виходячи зі звичайних або стандартних методів лікування раку, таких як, наприклад, із застосуванням таксолів, сполук платини та інших загальновідомих речовин, що використовуються в хіміотерапії ракового(их) захворювання(нь). Прогнозована ефективність може бути вибрана з загальної виживаності, наявності однієї або декількох Т-клітинних відповідей на імунотерапію, уповільнення росту пухлини або виживаності без прогресування. Таким чином, маркери за цим винаходом можуть використовуватися за «змішаними» сценаріями з передбачувальними та прогностичними функціями. В іншому аспекті винаходу метод відповідно до цього винаходу додатково включає моніторинг ефективності згаданого лікування ракового захворювання у пацієнта, що включає повторення етапу визначення a) та/або b) і неозов’язково c) та/або d), як це розкрито тут щонайменше один раз. Зазвичай моніторинг виконується під час лікування через регулярні проміжки часу, наприклад, щотижнево, двічі на тиждень або навіть щомісяця. Переважним є метод відповідно до цього винаходу, у якому згадана процедура визначення включає щонайменше один метод, вибраний із імунохімічного аналізу, імунохімічниого аналізу з використанням мікросфер, мультиплексного імунохімічного аналізу, ELISA, методів на базі мікрочипів, епігенетичних методів, аналізу експресії, сортуванні клітин FACS, мас-спектрометрії, методів клінічної гематології та інших стандартних клінічних методів, таких як електрофорез, імунонефелометрія, імунотурбідиметрія, ферментативні методи аналізу, колориметричні або флюорометричні методи. Усі ці методи добре відомі фахівцю у цій галузі і описані в літературі. Ще один аспект цього винаходу стосується діагностичного набору, що включає матеріали для проведення методу відповідно до цього винаходу як описано тут, в одному чи декількох контейнерах, які переважно містять (i) щонайменше одне маркер-специфічне антитіло, специфічне до ApoA1, CCL17/TARC, Fas, АсАТ/СГОТ, CA19-9, ЛДГ, IgE, матричної металопротеїнази 3 (MMP-3), CXCL13/BCA-1, нейтрофілів, інтерлейкіну-6 (ІЛ-6), інтерлейкіну-33 (ІЛ-33), альбуміну і білірубіну, необов’язково разом із (ii) інструкціями з виконання згаданого методу. Набір може додатково включати один або більше iii) буферів, (iv) розріджувачів, (v) фільтрів, (vi) голок або (v) шприців. Контейнер є переважно бутелем, флаконом, шприцом або пробіркою; і він може бути контейнером багаторазового застосування. Контейнер може бути виготовленим із багатьох видів матеріалів, таких як скло або пластмаса. Переважно, якщо набір та/або контейнер містить(ять) інструкції із застосування контейнера або пов’язані з контейнером, які містять вказівки щодо відновлення та/або застосування. Наприклад, на етикетці може бути наведена інформація щодо відновлення ліофілізованої композиції до певних концентрацій антитіл, що відповідають характеристикам вищезгаданих методів, таких як ELISA. Ще один переважний аспект цього винаходу стосується удосконаленого методу лікування раку у пацієнта, хворого на рак і який має потребу у цьому лікуванні, що включає a) проведення 10 UA 111952 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 методу відповідно до цього винаходу як описано вище, і b) введення пацієнту, хворому на рак, відповідного імунотерапевтичного засобу, виходячи з результатів, отриманих на етапі a), і c) необов’язково, повторення етапів a) і b). У цих терапевтичних аспектах винаходу методи відповідно до цього винаходу застосовуються з метою забезпечення удосконалених способів лікування у межах терапії, зокрема імунотерапії, ракових захворювань. Методи відповідно до цього винаходу надають додаткову та завчасну передбачувальну або передбачувальну та прогностичну інформацію щодо необхідності і ефективності імунологічного лікування раку і, таким чином, дозволяють прийняти більш інформовані рішення щодо подальшого лікування згаданого ракового захворювання. Таким чином, переважним є метод як описано вище, який додатково включає моніторинг ефективності згаданого лікування раку для пацієнта, що включає повторення етапу визначення щонайменше один раз. Як описано вище, переважні лікарські засоби або препарати для попереднього лікування на додаток до імунотерапевтичних вакцин, які описані вище, вибрані з протиракового засобу, вибраному з цитокінів, сорафенібу, сунітинібу, циклофосфаміду та інгібіторів тирозинкіназ (ІТК). Раковими захворюваннями, які належить лікувати, можуть бути всі види ракових захворювань, чутливих до імунотерапії, переважно, якщо вони вибрані з нирково-клітинної карциноми (НКК), колоректальної карциноми (КРК), раку шлунка (РШ), меланоми, немілкоклітинного раку легенів (НМРЛ), гліобластоми і аденокарциноми. Слід розуміти, що ознаки винаходу, які розкриті і описані тут, можуть використовуватися не лише у відповідній комбінації, описаній вище, але також поодинці, не виходячи за обсяг патентних претензій цього винаходу. Нижче винахід буде описаний докладніше шляхом наведення прикладів і посилань на перелік послідовностей. Наведені нижче приклади описані лише для ілюстрації і не мають на меті обмежити обсяг винаходу. На фігурах: На Фігурі 1 зображена оцінка впливу рівнів (A) ApoA1, (B) CXCL13/BCA-1, (C) моноцитів і D) CCL17/TARC на загальну виживаність усіх пацієнтів і підгруп згідно з моделлю Каплан-Мейера. Для кожного параметра на верхній фігурі показана виживаність усіх пацієнтів, що мають високий (червоні лінії) і низький (зелені лінії) рівень параметра. На нижній фігурі наведені результати аналізу у підгрупах (+CY у порівнянні з –CY) для пацієнтів, що мають високий рівень параметра (червоні і сині лінії) і для пацієнтів, що мають низький рівень параметра (зелені і жовті лінії). На Фігурі 2А наведений розподіл значень одиничних біомаркерів ApoA1, CXCL13/BCA-1, моноцитів і CCL17/TARC, як це показано на фігурі, для підгруп –CY (сірий колір) і +CY (чорний колір), що свідчить або про відсутність Т-клітинної відповіді (no), або про відповідь на один пептид (1), або про відповідь на комплекс пептидів (>1). На планках похибок наведена середньоквадратична похибка для середнього значення. На Фігурі 2В наведено в інший спосіб розподіл показників рівня множинного біомаркера у пацієнтів підгруп –CY (сірий колір) і +CY (чорний колір), що свідчить або про відсутність Т-клітинної відповіді (no), або про відповідь на один пептид (1), або про відповідь на комплекс пептидів (>1). Точки відповідають окремим значенням, лінії відображають середнє значення. На Фігурі 3 зображена оцінка впливу комбінації ApoA1 і CCL17/TARC на загальну виживаність усіх пацієнтів і пацієнтів підгруп за методом Каплан-Мейера. На А) визначено, що біомаркер-позитивна популяція має складатися з пацієнтів, що мають щонайменш один із двох параметрів у позитивному діапазоні (бал = 1 або 2), у той час як біомаркер-негативні пацієнти не мають жодного параметра в межах позитивного діапазону (бал = 0). На В) визначено, що біомаркер-позитивна популяція має складатися тільки з тих пацієнтів, що мають обидва параметри у позитивному діапазоні (бал = 2), у той час як пацієнти з хоча б одним параметром в межах негативного діапазону (бал = 0 або 1) вважаються біомаркер-негативними. На верхніх фігурах наведена виживаність усіх біомаркер-позитивних пацієнтів (зелені лінії) відносно всіх біомаркер-негативних пацієнтів (червоні лінії). На нижніх фігурах наведений аналіз у підгрупах (+CY у порівнянні з –CY) для біомаркер-позитивних пацієнтів (зелені лінії у порівняннні з жовтими) і біомаркер-негативних пацієнтів (червоні лінії у порівнянні з синіми). На Фігурі 4А наведені середні значення рівня маркера, що складається з комбінації ApoA1 і CCL17/TARC у пацієнтів підгруп –CY (сірий колір) і +CY (чорний колір), що свідчить або про відсутність Т-клітинної відповіді (no), або про відповідь на один пептид (1), або про відповідь на комплекс пептидів (>1). На планках похибок наведена середньоквадратична похибка для середнього значення. На Фігурі 4В наведений в інший спосіб розподіл показників рівня подвійного біомаркера у пацієнтів підгруп –CY (сірий колір) і +CY (чорний колір), що свідчить 11 UA 111952 C2 5 10 15 20 або про відсутність Т-клітинної відповіді (no), або про відповідь на один пептид (1), або про відповідь на комплекс пептидів (>1). Точки відповідають окремим значенням, лінії відображають середнє значення. Фігура 5 демонструє оцінку впливу множинного біомаркера на загальну виживаність за методом Каплан-Мейера. На верхній фігурі показана виживаність усіх пацієнтів, що мають високий (червоні лінії) і низький (зелені лінії) рівень параметра. На нижній фігурі наведені результати аналізу у підгрупах (+CY у порівнянні з –CY) для пацієнтів, що мають високий рівень параметра (червоні і сині лінії) і для пацієнтів, що мають низький рівень параметра (зелені і жовті лінії). Значення 0,019076043 використовували як порогове значення для поділу пацієнтів на групи з високим і низьким вмістом біомаркера. На Фігурі 6А наведені середні значення рівня множинного біомаркера у пацієнтів підгруп – CY (сірий колір) і +CY (чорний колір), що свідчить або про відсутність Т-клітинної відповіді (no), або про відповідь на один пептид (1), або про відповідь на комплекс пептидів (>1). На планках похибок наведена середньоквадратична похибка для середнього значення. На Фігурі 6В наведений в інший спосіб розподіл показників рівня множинного біомаркера у пацієнтів підгруп – CY (сірий колір) і +CY (чорний колір), що свідчить або про відсутність Т-клітинної відповіді (no), або про відповідь на один пептид (1), або про відповідь на комплекс пептидів (>1). Точки відповідають окремим значенням, лінії відображають середнє значення. Послідовності SEQ ID No. 1 до 50 відображають амінокислотні послідовності, наведені вище у таблицях з 1А до 1Е. Таблиця 2 Одиночні біомаркери Усі пацієнти Біомаркер-позитивні у порівнянні з біомаркернегативними Підгрупа +CY, Біомаркер-позитивні у порівнянні з біомаркернегативними Підгрупа -CY, Біомаркер-позитивні у порівнянні з біомаркернегативними Біомаркер-позитивна група, Підгрупа +CY у порівнянні з –CY Біомаркер-негативна група, Підгрупа +CY у порівнянні з –CY Взаємодія Параметр сприятливий, якщо значення високі/низькі Порогове значення 25 ВР і логранговий критерій p ApoA1 CXCL13/BCA-1 0,42 (0,01) 0,39 (0,006) Моноцити 0,44 (0.012) CCL17/TARC 0,41 (0,011) 0,3 (0,017) 0,25 (0,004) 0,24 (0,001) 0,18 (0,003) 0,6 (0,253) 0,7 (0,448) 0,93 (0,874) 0,67 (0,392) 0,36 (0,061) 0,35 (0,051) 0,29 (0,014) 0,22 (0,017) 0,84 (0,696) 1,07 (0,876) 1,31 (0,538) 0,85 (0,715) 0,43 (0,24) високі 0,3271 (0,13) низькі 0,22 (0,03) високі 0,26 (0,094) високі 0,264 мг/мл (МЕДІАНА) 64,21 пг/мл (МЕДІАНА) 7,7% (МЕДІАНА) 161,99 пг/мл (МЕДІАНА) У Таблиці 2 наведені значення відношення ризиків (ВР) і лонгрангового критерію р (модель пропорційних ризиків Кокса) для передбачення загальної виживаності за допомогою одиничних біомаркерів у всіх пацієнтів і підгруп +/-CY, ВР і лонгрангового критерію р для оцінки ефективності попереднього лікування циклофосфамідом серед біомаркер-позитивних і біомаркер-негативних пацієнтів і для ефекту взаємодії біомаркерів і попереднього лікування циклофосфамідом. 12 UA 111952 C2 Таблиця 3 Значення p (t-критерій Уелча) Усі пацієнти з імунними відповідями Усі пацієнти з імунними відповідями на комплекс пептидів Підгрупа +CY, пацієнти з імунними відповідями Підгрупа +CY, пацієнти з імунними відповідями на комплекс пептидів Підгрупа -CY, пацієнти з імунними відповідями Підгрупа -CY, пацієнти з імунними відповідями на комплекс пептидів Параметр сприятливий, якщо значення високі/низькі 5 ApoA1 0,016 0,000074 CXCL13/BCA-1 0,28 0,031 Моноцити 0,24 0,34 CCL17/TARC 0,032 0,0028 0,014 0,064 0,0021 0,013 0,42 0,29 0,37 0,53 0,034 0,15 0,065 0,017 0,00014 0,13 0,73 0,068 високі низькі високі високі У Таблиці 3 наведені p-значення, розраховані за допомогою одновимірного статистичного аналізу (t-критерій Уелча) для передбачення Т-клітинних відповідей і Т-клітинних відповідей на комплекс пептидів з використанням вибраних параметрів для всіх пацієнтів і підгруп +/-CY. Таблиця 4 Таблиця 4 Множинний біомаркер (OSCY_CHEAP_UNIF_20) Усі пацієнти Біомаркер-позитивні у порівнянні з біомаркер-негативними Підгрупа +CY, Біомаркер-позитивні у порівнянні з біомаркер-негативними Підгрупа -CY, Біомаркер-позитивні у порівнянні з біомаркер-негативними Біомаркер-позитивна група, Підгрупа +CY у порівнянні з –CY Біомаркер-негативна група, Підгрупа +CY у порівнянні з –CY Взаємодія Параметр сприятливий, якщо значення високі/низькі Порогове значення 10 15 20 25 ВР (95% НІ (надійний інтервал) і логранговий критерій p 0,47; P=0,041 0,07; P=0,000008 1,58; P=0,203 0,08 (0,02-0,38); P=0,000135 2,5 (0,95-6,58); P=0,055 0,032 (0,0055-0,1863); P=0,000128 Високі 0,019076043 пункту У Таблиці 4 наведені значення відношення ризиків (ВР) і лонгрангового критерію р для передбачення загальної виживаності за допомогою множинного біомаркера у всіх пацієнтів і підгруп +/-CY, ВР і лонгрангового критерію р для оцінки ефективності попереднього лікування циклофосфамідом серед біомаркер-позитивних і біомаркер-негативних пацієнтів і для ефекту взаємодії біомаркера і попереднього лікування циклофосфамідом. Приклади Введення IMA901 є вакциною на основі пептидів, яка була розроблена з метою індукування специфічних Т-клітинних реакцій проти комплексів пептид-MHC, виявлених на клітинах НКК. В дослідженні IMA901-202 (фази II) використовувався одновимірний і багатовимірний аналіз для ідентифікації параметрів, які поодинці і в комбінації слугують передбачувальними біомаркерами успіху що стосується індукції імунної відповіді і збільшення загальної виживаності пацієнтів з метастатичною НКК, що отримували лікування вакциною IMA901. З цією метою було проаналізовано близько 450 параметрів (параметри пацієнта та пухлини, а також рівні аналітів у сироватці або сечі і параметри клітин) з використанням зразків популяції суб’єктів дослідження IMA901-202 (фази II), що були зібрані до лікування. З метою зниження витрат на виміри під час майбутніх досліджень параметри, які потребують обробки мононуклеарних клітин периферичної крові (PBMC), не були включені в багатовимірний аналіз, 13 UA 111952 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 для якого відбирався набір із декількох параметрів. Параметри аналізували на їхній зв’язок із загальною виживаністю та Т-клітинними відповідями. Оскільки лікування вакциною IMA901 привело до набагато більшого ефекту на загальну виживаність після попереднього лікування циклофосфамідом та оскільки тільки у підгрупі пацієнтів +CY наявність імунних відповідей асоціювалася з покращеною загальною виживаністю, підгрупа +CY була вибрана як досліджувальна група, і результати для неї порівнювали з підгрупою –Cy, яку вважали за контроль. Таким чином, були вибрані параметри, які показували взаємодію з попереднім лікуванням циклофосфамідом та/або які передбачали загальну виживаність краще в підгрупі +CY, ніж у підгрупі –CY. У такий спосіб уникали вибору чисто прогностичних маркерів, які за визначенням показували б взаємозв’язок із загальною виживаністю в обох підгрупах. 2. Порівняння пацієнтів дослідження з сумісними за віком здоровими донорами Для порівняння рівнів до лікування з рівнями здорових донорів були вибрані тільки пацієнти, що підлягали лікуванню (ITT), молодше 70 років, щоб забезпечити відповідність щодо віку найбільш літнім здоровим донорам групи контролю. Сформовані групи пацієнтів (N=52) і здорові донори (N=22) були збалансовані щодо віку, статі і статусу ЦМВ (цитомегаловірус)серопозитивності. 3. Матеріали і методи Збір зразків Усі зразки були зібрані до будь-якого терапевтичного втручання у межах дослідження, або за три дні до вакцинації, або безпосередньо перед введенням циклофосфаміду у підгрупі +CY, або безпосередньо перед вакцинацією. Зразки сироватки були зібрані за допомогою пробірок VACUTAINER з розділювальним гелем (Becton Dickinson, 5 мл), які перевертали та інкубували протягом не менш ніж 30 хвилин. Пробірки центрифугували протягом 15 хвилин при не менш ніж 1200 g, і сироватку (приблизно 2 мл) переносили у кріопробірку NUNC (3,6 мл). Кріопробірки негайно поміщали на зберігання при ≤ -20°C до проведення вимірів. Кров з ЕДТА для аналізу гематологічних параметрів збирали у пробірки VACUTAINER з ЕДТА на 3 мл, які не центрифугували та зберігали при кімнатній температурі до проведення аналізу. Пробу сечі відбирали незадовго до вакцинації. Для аналізу за допомогою тест-смужок використовували тільки свіжу сечу. Цитратну плазму для аналізу коагуляції збирали приблизно за два тижні до вакцинації. Зразки збирали за допомогою пробірок з цитратом VACUTAINER і центифугували протягом 30 хвилин при не менш ніж 1200 g при кімнатній температурі. Супернатант плазми переносили у мікропробірки. Виміри Методи визначення рівню біомаркерів включали ELISA, мультиплексний імунохімічний аналіз, епігенетичні методи, мас-спектрометрію, клітинне сортування FACS, стандартні методи клінічної гематології, клінічні хімічні аналізи, аналізи сечі та інші методи. Параметри, які були зрештою вибрані, вимірювали за допомогою мультиплексного аналізу на наборах компаній RBM (ApoA1, CD95/FAS, ІЛ-6, IgE, MMP-3, CA19-9), Millipore (CXCL13/BCA-1, CCL17/TARC), ІЛ-33) і методом мас-спектрометрії на діагностикумах компанії Biocrates (треонін, ацилкарнітини з коротким ланцюгом). Дані з інших параметрів були надані лабораторією центру і були отримані стандартними гематологічними методами (нейтрофіли, еозинофіли, моноцити) і клінічними хімічними аналізами (АсАТ/СГОТ, ЛДГ, альбумін, білірубін). Оцінка Т-клітинних відповідей Оскільки проводили аналіз не лише для встановлення взаємозв’язку між біомаркерами та загальною виживаністю, але й між біомаркерами та однією або декількома Т-клітинними відповідями, проводили вимірювання специфічних Т-клітинних відповідей декілька разів до та після вакцинації методом ELISPOT і тетрамерним забарвлюванням відповідних комплексів пептидів з молекулами MHC. Одновимірний статистичний аналіз: Оцінку взаємозв’язку параметрів з Т-клітинними відповідями проводили за допомогою tкритерію Уелча. Параметри, які дозволяють передбачати Т-клітинні відповіді у всіх пацієнтів та/або всередині підгрупи +CY з p < 0,05, вважали за значущі. Взаємодію параметрів з попереднім лікуванням для підгрупи CY оцінювали за допомогою моделі пропорційних ризиків Кокса. Кандидати, які мали p-значення ~5% пацієнтів), вважалися як такі, що становлять інтерес. Окрім того, щоб виключити параметри із значущою взаємодією у зв’язку зі зворотнім взаємозв’язком попереднього лікування циклофосфамідом із загальною виживаністю в групі з 14 UA 111952 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 несприятливими значеннями біомаркерів, використовували додатковий критерій значущого взаємозв’язку (p < 0,05) з загальною виживаністю у біомаркер-позитивної групи. Значущий (p < 0,05) взаємозв’язок із загальною виживаністю у підгрупі +CY, але не в підгрупі –CY, вважали за додаткову ознаку того, що параметр має передбачувальне, але не прогностичне, значення. Додаткові критерії вибору параметрів базувалися на їхніх біологічних властивостях і на збереження ними моделі взаємодії з попереднім лікуванням циклофосфамідом і на взаємозв’язку із загальною виживаністю у підгрупі +CY, але не в підгрупі –CY, у таких пацієнтів, що отримували попереднє лікування ІТК або цитокінами. Були розраховані кореляції між параметрами. Параметри з високим ступенем кореляції з іншими параметрами у наборі даних, що залишилися (скориговане p-значення < 0,005), були виключені. Після ідентифікації окремих параметрів за допомогою цих етапів були проведені тести, чи демонструють ці параметри і у яких комбінаціях найкращі результати щодо передбачення загальної виживаності і Т-клітинних відповідей, а також була проаналізована їхня стабільність у підгрупах пацієнтів, згаданих вище. Багатовимірний статистичний аналіз: Множинні біомаркери були визначені згідно з моделлю пропорційних ризиків Кокса, їхні властивості і додатки описані нижче. Як коваріанти у генералізованій лінійній моделі розглядалися усіпараметри, хоча й вони були лінійно трансформовані у нульове середнє значення та одиничне стандартне відхилення («стандартизовані» параметри) для того, щоб запобігти зайвого впливу на параметри, що були представлені невеликими значеннями. З метою зниження витрат на вимірювання параметрів набору, включені лише такі параметри, що не потребують виділення PBMC. Оскільки відповідна модель максимальної правдоподібності при неповній відповіді була недовизначена, тобто кількість параметрів перевищувала кількість пацієнтів, модель доповнили апріорним Гаусовським розподілом, який обмежує відносний вплив кожного параметра в оптимальному біомаркері. Відомо, що відповідний алгоритм оптимізації за максимумом апостеріорної ймовірності (MAP) покращує передбачувальну здатність результатів («регуляризація»), отриманих за допомогою методу максимальної правдоподібності. Модель була доповнена апріорним розподілом Лапласа, що забезпечує використання для оптимізації лише однієї підмножини параметрів, що розглядаються. У такий спосіб кількість параметрів, включених у біомаркер, була обмежена до 20. Додатково є бажаним, щоби множинний біомаркер не мав передбачувального значення для підгрупи -CY або щоб він щонайменше мав менше передбачувальне значення для цих пацієнтів, ніж для пацієнтів підгрупи +CY. З цією метою для підгрупи -CY були оптимізовані ітеративні передбачувальні моделі, і отримані напрями проецювали з простору параметрів, доки не залишилися тільки по суті не передбачувані напрями. Самий біомаркер був потім визначений на підпросторі параметрів, що залишився, для підгрупи +CY. Щоби оцінити передбачувальну точність біомаркера, весь процес оптимізації провели методом послідовного виключення об’єктів аналізу один за одним. У такий спосіб передбачення для всіх пацієнтів були розраховані, згруповані і потім порівняні з відомими термінами виживання. Результати: Одновимірний аналіз Вибір параметрів Із приблизно 450 досліджених параметрів 59 значуще передбачали наявність Т-клітинних відповідей як/або для усіх пацієнтів, так і/або для підгрупи +CY. 118 параметрів показали значущу взаємодію з попереднім лікуванням циклофосфамідом за умови оптимального вибору порогових значень. Використовуючи вищезгадані критерії передбачення Т-клітинної відповіді, взаємодію з попереднім лікуванням циклофосфамідом, кращий взаємозв’язок із загальною виживаністю в підгрупі +CY, ніж у підгрупі –CY, відсутність статистичної невизначеності по відношенню до інших параметрів і наявність мотивованого біологічного обґрунтування, можна ідентифікувати чотири параметри (ApoA1, CXCL13/BCA-1, моноцити і CCL17/TARC) як найкращі кандидати в одиничні біомаркери. Визначення порогових значень Для кожного з чотирьох параметрів, що були ідентифіковані вище, визначали певне порогове значення, за яким пацієнтів розділяли на дві групи (позитивну і негативну стосовно біомаркера), які давали значуще різний кінцевий результат лікування препаратом IMA901. Вибір порогових значень був необхідним, оскільки параметри, хоча вони і пов’язані з загальною виживаністю і Т-клітинними відповідями у безперервній, а не дискретній формі, мають використовуватися для прийняття рішень щодо лікування, які обмежені відповідями так/ні. З цієї 15 UA 111952 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 причини належні порогові значення мають а) включати достатню кількість пацієнтів і b) бути об’єктивними. Що стосується ApoA1, для якого у більш ніж 50% пацієнтів дослідження IMA901-202 спостерігалися патологічно низькі рівні, за порогове значення була вибрана нижня межа норми, встановлена у здорових донорів згідно з рекомендаціями виробника діагностикума (компанія RBM, 0,288 мг/мл), що ідентифікує пацієнтів з рівнями ApoA1 у межах норми як біомаркерпозитивну групу. Це порогове значення було близьким до медіанного значення для пацієнтів дослідження IMA901-202 (0,264 мг/мл). Таким чином, це порогове значення є максимально об’єктивним і пов’язане з біологічним обґрунтуванням відносно ApoA. Як альтернатива для ApoA1 використовувалося також медіанне значення. Всі інші параметри пацієнтів дослідження IMA901-202 знаходилися, головним чином, у межах норми. Для цих параметрів як порогові значення були вибрані медіанні значення для популяції дослідження, оскільки вони також є об’єктивними і включають достатню кількість пацієнтів (50%). Передбаченя загальної виживаності і Т-клітинних відповідей окремими одиночними біомаркерами Аналіз з використанням моделі пропорційних ризиків Кокса показав, що всі чотири параметри, вибрані за допомогою одновимірного аналізу, значуще передбачають загальну виживаність у всіх пацієнтів і в підгрупі пацієнтів, які отримали попереднє лікування циклофосфамідом, але не у підгрупі, яка не отримувала попереднього лікування циклофосфамідом (Таблиця 2, Фігура 1). У біомаркер-позитивних групах, визначених відповідним пороговим значенням для біомаркера, попереднє лікування циклофосфамідом мало значущий (p < 0,05) позитивний вплив на загальну виживаність (CCL17/TARC, моноцити) або виявило тенденцію (p < 0,1) у бік позитивного впливу на загальну виживаність (ApoA1, CXCL13/BCA-1). Аналіз взаємодії показав, що вплив попереднього лікування циклофосфамідом був значуще відмінним (p < 0,05) у пацієнтів, класифікованих як позитивні або негативні щодо їхніх рівнів моноцитів. CCL17/TARC продемонстрував тенденцію взаємодії з попереднім лікуванням циклофосфамідом. ApoA1 і CXCL13/BCA-1 не досягли статистичної значущості при вибраних порогових значеннях. Слід відзначити, що в підгрупі +CY найкраще відношення ризиків (ВР) можна отримати, якщо класифікувати пацієнтів за їхніми рівнями CCL17/TARC (Таблиця 2, ВР=0,18, p=0,003). Навпаки, CCL17/TARC-позитивні пацієнти отримували найбільшу користь від попереднього лікування циклофосфамідом (Таблиця 2, ВР=0,22, p=0,017). CCL17/TARC також має виняткові властивості, якщо взяти до уваги той факт, що 75% CCL17/TARC-позитивних пацієнтів, що отримали попереднє лікування циклофосфамідом, все ще були живими на час закінчення дослідження (Фігура 1D). Картина, яку спостерігали відносно передбачення загальної виживаності, залишалася стабільною для субпопуляції пацієнтів, що отримали попереднє лікування ІТК або цитокінами (дані не показані). Відносно передбачення Т-клітинної відповіді, найкращі результати показали CCL17/TARC і ApoA1, обидва з яких значуще передбачували пацієнтів з імунною відповіддю серед усіх пацієнтів і в обох підгрупах, +CY і –CY, і передбачували пацієнтів з відповіддю на комплекс пептидів серед усіх пацієнтів. Навпаки, CXCL13/BCA-1 і моноцити мали слабку передбачувальну здатність (Таблиця 3). 5. Результати: Багатовимірний аналіз Вибір параметрів Для всієї популяції пацієнтів був розрахований набір біомаркерів, що включає 20 параметрів, який краще передбачає загальну виживаність після лікування препаратом IMA901 у підгрупі +CY, ніж у підгрупі –CY. Параметри цього набору наведені у Таблиці 4. Вони включають цитокіни, хемокіни та інші білки, вміст яких можна виміряти у сироватці, клітинні параметри, які можна виміряти стандартними гематологічними методами, і метаболомічні параметри, які можна виміряти за допомогою мас-спектрометрії. Окрім оптимізації для усіх пацієнтів (тренувальна версія), набір біомаркерів був розрахований методом перехресної валідації одинарними виключеннями (тестова версія). Останній з цих аналізів є більш доречним, оскільки він гарантує стійкість оцінки результатів під час наступного спостереження. Дані, отримані у цих експериментах, відображають результати тестів. 16 UA 111952 C2 Таблиця 5 Вага -47.3867 38.38821 -38.1861 34.36199 34.10915 33.89069 32.72272 32.01683 31.7325 31.47377 -31.3839 -31.2785 30.83843 30.78772 29.57142 28.89882 28.63935 -27.8701 27.72058 27.204 5 10 15 20 25 30 35 Ранг 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Назва параметра CXCL13/BCA-1 ApoA1 Нейтрофіли (%) Еозинофіли (%) Моноцити (%) CD95/FAS АсАТ/СГОТ CCL17/TARC ЛДГ Thr ІЛ-6 Ацилкарнітини з коротким ланцюгом Альбумін Еозинофіли (абс.) Моноцити (абс.) Білірубін (прямий) IgE ІЛ-33 MMP-3 CA19-9 У Таблиці 5 наведені параметри, включені у множинний біомаркер із 20 параметрів, та вага і ранг, що характеризують їх відносну важливість у наборі. Значення біомаркера для кожного пацієнта є лінійною комбінацією значень, виміряних для 20 параметрів, включених в набір. Сталі множники в цьому рівнянні були вибрані таким чином, щоби медіанне значення розподілу маркера було близьким до нуля. Значення біомаркера, розраховані у такий спосіб, мали приблизно нормальний розподіл в популяції пацієнтів дослідження IMA901-202, і вони були рівномірно розподілені між пацієнтами підгруп +CY і –CY. Передбаченя загальної виживаності і Т-клітинних відповідей набором множинного біомаркера Щоб продемонструвати передбачувальну здатність біомаркера, проводили аналіз виживання, поділивши пацієнтів на дві групи відповідно до значення біомаркера. Медіанне значення щільності розподілу рівня біомаркера по всій популяції пацієнтів було вибране як порогове значення, що включає 50% пацієнтів зі значеннями вище цього порогового значення у біомаркер-позитивну групу. У підгрупі пацієнтів +CY біомаркер-позитивні пацієнти отримали високо значущу користь від вакцинації, в той час як біомаркер на засвідчив ніякого ефекту в підгрупі –CY. Навпаки, у біомаркер-позитивній групі попереднє лікування циклофосфамідом привело до значно кращої виживаності, у той час як ефект був незначущим або навіть (за тенденцією) протилежним у біомаркер-негативній групі (Таблиця 4, Фігура 5). Відповідно, спостерігалася високо значуща взаємодія між множинним біомаркером і попереднім лікуванням циклофосфамідом. Хоча біомаркер не оптимізували для передбачення імунних відповідей, автори винаходу перевірили, чи існує також зв’язок розподілу значень біомаркера с наявністю або відсутністю Тклітинних відповідей. Дійсно, спостерігалася тенденція у бік більш високих рівнів біомаркера у групах, що відповідали на пептид та на комплекс пептидів, особливо в підгруппі пацієнтів +CY (Фігура 6). Передбаченя загальної виживаності і Т-клітинних відповідей за допомогою комбінації параметрів Окремі параметри можна комбінувати у такий спосіб, щоби пацієнтам можна було встановити бали за шкалою на базі біомаркерів залежно від значень усіх параметрів, які включені у комбінацію. У разі комбінації двох параметрів кожний параметр може бути або позитивним, або негативним відповідно до його порогового значення, і пацієнти могли отримати два бали за шкалою на базі біомаркерів (обидва параметри позитивні), один (один параметр позитивний) або нуль (жодного позитивного параметра) відносно комбінації маркерів. 17 UA 111952 C2 5 10 15 20 Комбінація декількох параметрів для розрахунку числа балів за шкалою біомаркерів може бути корисною з декількох причин. По-перше, це веде до більшої стійкості оцінки, оскільки a) у деякій мірі вирішується проблема фіксованих порогових значень всупереч безперервному взаємозв’язку параметрів з результатом лікування, b) знижується вплив викидів результатів вимірів і с) більша кількість параметрів дозволяє врахувати більшу кількість біологічних процесів, які можуть мати значення для протиракового імунітету. По-друге, бальна модель забезпечує більшу гнучкість відносно вибору пацієнтів. В той час як окремий параметр із медіанним значенням у ролі об’єктивного порогового значення неминуче дозволяє вибрати для лікування лише 50% пацієнтів, бальна оцінка на базі двох параметрів (з пороговим значенням окремих параметрів, що дорівнює медіанному значенню розподілу) поділяє пацієнтів на три групи. Якщо виключити лише пацієнтів без позитивних маркерів (тобто тих, чий бал за біомаркерною шкалою дорівнює нулю), близько 75% пацієнтів будуть включені в групу лікування. Однак якщо бажаний рівень значущості не досягнутий у цій групі, можуть бути виключені пацієнти з нулем балів і одним балом, що залишає у групі лікування близько 25% пацієнтів з двома балами за шкалою на базі біомаркерів. З цих причин було перевірено, чи дає комбінація окремих параметрів, визначених вище, кращі результати щодо передбачення загальної виживаності і Т-клітинних відповідей. Крім того, оцінювали стабільність ефекту для субпопуляцій пацієнтів, визначених вище. Декілька комбінацій маркерів у цьому відношенні переважали за своїми якостями застосування окремих параметрів, кращою з них була комбінація ApoA1 і CCL17/TARC (Фігура 3, Фігура 4). 6. Рівні маркерів: 6.1 Сироваткові рівні ApoA1 Стан Джерело Здорові особи групи контролю Учасники дослідження IMA901202 (Riesen, 2008) Виробник (RBM) Діапазон (медіана) ApoA1 [мгg/мл]; Діапазон або середнє +/- ст. відх. 1,0–1,5 0,288–1,17 0,0808–0,514 (0,264) Середнє +/- ст. відх. 0,27 +/- 0,09 25 6.2 Сироваткові рівні CCL17/TARC Стан Здорові особи групи контролю Атопічний дерматит Астма Алергічний риніт Системний склероз Дерматоміозит Системна червона вовчанка Учасники дослідження IMA901202 Джерело (Shimada et al., 2004) (Fujii et al., 2004) (Sugawara et al., 2002) (Sekiya et al., 2002) (Echigo et al., 2006) (Saeki and Tamaki, 2006) (Leung et al., 2003) (Shimada et al., 2004) (Sugawara et al., 2002) (Saeki and Tamaki, 2006) (Sugawara et al., 2002) (Sekiya et al., 2002) (Sugawara et al., 2002) (Fujii et al., 2004) TARC [пг/мл]; Діапазон або середнє +/- ст. відх. 200 +/- 100 101 +/- 81 31,9 +/- 14,8 88,8 +/- 58,2 93,3 +/- 25,3 215,34 +/-26,79 1125-3070 (1469) 96400 +/- 38100 325 +/-287 2338,7 +/-301,83 271 +/- 264 192,0 +/- 143,6 147 +/- 101 313 +/- 294 262 +/- 291 254 +/- 326 Діапазон (медіана) 25,5–623 (162) Середнє +/- ст. відх. 174 +/- 118 18 UA 111952 C2 6.3 Сироваткові рівні BCA-1 Стан Джерело Здорові особи групи контролю (Panse et al., 2008) (Sansonno et al., 2008) (Panse et al., 2008), рак молочної залози (Sansonno et al., 2008), інфіковані гепатитом С пацієнти зі змішаною кріоглобулинемією та без неї Діапазон (медіана) Захворювання Учасники дослідження IMA901202 5 Середнє +/- ст. відх. BCA-1 [пг/мл]; Діапазон або середнє +/- ст. відх. ~40 48,2 +/-11,0 ~80 273,6 113,9 +/-98; +/-40,2 13,09–1429,6 (64,21) 114,23 +/- 196,98 6.4 Рівні нейтрофілів у відсотках і абсолютних числах Стан Джерело Здорові особи групи контролю LKF Kiel Laboratory, Німеччина Захворювання (Rashid et al., 2010), стравоходу (Donskov et al., 2006), НКК Учасники дослідження IMA901-202 рак Діапазон (медіана) Середнє +/- ст. відх. Нейтрофіли; Діапазон або середнє +/- ст. відх. 34–71 %; 1,5–6.2 x 10^9/л 58–71 % 2,6–15,9 x 10^9/л 47–86,9 (67,3) %; 2,18–10,39 (4,44) x 10^9/л 68,05 +/-8,2 %; 4,88 +/-1,86 x 10^9/л 6.5 Рівні еозинофілів у відсотках і абсолютних числах Стан Джерело Здорові особи групи контролю LKF Kiel Laboratory, Німеччина Захворювання Учасники дослідження IMA901-202 (Simon and Simon, 2007) (Moroni et al., 2000), НКК Діапазон (медіана) Середнє +/- ст. відх. Еозинофіли; Діапазон або середнє +/- ст. відх. 0–7 %; 0,04–0,6 x 10^9/л 0–0,4 x 10^9/л 0,15 +/-0,1 x 10^9/л 0,2–6,5 (2) %; 0,02–0,55 (0,12) x 10^9/л 2,35 +/-1,62 % 0,16 +/-0,13 x 10^9/л 10 6.6 Рівні моноцитів у відсотках і абсолютних числах Стан Джерело Здорові особи групи контролю LKF Kiel Laboratory, Німеччина Захворювання (Sasaki et al., 2006), печінковоклітинний рак (Donskov et al., 2006), НКК Учасники дослідження IMA901-202 Діапазон (медіана) Середнє +/- ст. відх. 19 Моноцити; Діапазон або середнє +/- ст. відх. 4–13 %; 0,2-0,9 x 10^9/л 0,03–1,04 x 10^9/л 0,69–0,74 x 10^9/л 3,1–17,7 (7,6) %; 0,2–1,31 (0,48) x 10^9/л 8,19 +/-3,15 %; 0,57 +/-0,25 x 10^9/л UA 111952 C2 6.7 Сироваткові рівні розчинного CD95/FAS Стан CD95/FAS [нг/мл]; Діапазон або середнє +/- ст. відх. Учасники дослідження IMA901-202 5 Джерело Діапазон (медіана) 4,09–20,4 (9,89) Середнє +/- ст. відх. 9,76 +/-3,06 6.8 Сироваткові рівні АсАТ/СГОТ Джерело Стан Здорові особи групи контролю Учасники дослідження IMA901-202 АсАТ/СГОТ [Од/л]; Діапазон або середнє +/- ст. відх. LKF Kiel 12–35,4 Діапазон (медіана) Середнє +/- ст. відх. 14–109 27,9 (23,5) +/-17,3 6.9 Сироваткові рівні ЛДГ Джерело Стан Здорові особи групи контролю Учасники дослідження IMA901-202 ЛДГ [Од/л]; Діапазон або середнє +/- ст. відх. LKF Kiel 129–230 Діапазон (медіана) Середнє +/- ст. відх. 94–734 190,63 (161,5) +/-98,97 10 6.10 Сироваткові рівні треоніну 15 Thr мін./макс.: 21 – 157 мкМ Thr середнє/ст. відх.: 84,5 +/- 24,1 мкМ МЕДІАННЕ: 82 мкМ 6.11 Сироваткові рівні альбуміну Нормальні показники у сироватці та відхилення при патологічних станах: Лабораторні показники: Альбумін 35-50 г/л (3,5-5 г/дл) 20 Параметр альбумін крові СЕРЕДНЄ 39,95 Од. вимір. г/л Ст. відх. 4,39 Мін 26 Макс. 48 МЕДІАННЕ 41 6.12 Рівні прямого білірубіну Лабораторні показники: 0 – 5,1 мкМ 25 Сироваткові рівні у дослідженні IMA-901: мін./макс.: 0,5 – 4,4 мкМ (21 окреме значення) СЕРЕДНЄ/СТ. ВІДХ.: 2,0 – 0,89 мкМ МЕДІАННЕ: 1,7 мкМ 30 6.13 Рівні MMP-3 Діапазон у дослідженні IMA-901: мін./макс.: 1,85 – 41,2 нг/мл (лише 3 були вищими за 17; 58 різних значень) СЕРЕДНЄ/СТ. ВІДХ.: 8,5 +/- 6,0 нг/мл МЕДІАННЕ: 6,7 нг/мл Нормальні рівні у сироватці: Діапазон згідно з даними виробника: 0,2 – 2,17 нг/мл 35 20 UA 111952 C2 6.14 Рівні CA19-9 Розширений діапазон значень у сироватці (виробник) 52 5 Параметр СЕРЕДНЄ Од. вимір. Ст. відх. МІН. Раковий_ антиген_19-9 15,63 Ед/мл 29,73 0 МАКС. 167 МЕДІАННЕ Підрахунок 5,94 45 6.15 Рівні IgE Параметр СЕРЕДНЄ Од. вимір. Ст. відх. Мін. IgE 104,09 нг/мл 261,00 Виробник (RBM): Нормальний рівень - аж до 606 нг/мл IgE Макс. 1362 МЕДІАННЕ 22,5 Макс. 0 6.16 Рівні ІЛ-6 10 Параметр ІЛ-6 СЕРЕДНЄ 16,32 Од. вимір. пг/мл Ст. відх. 67,65 Мін. 0 532 МЕДІАННЕ 2,86 Мін. 55,0672 Макс. 1867 МЕДІАННЕ 75,73 Виробник (RBM): нормальний рівень - аж до 42,6 пг/мл ІЛ-6 6,17 Рівні ІЛ-33 15 Параметр СЕРЕДНЄ ІЛ-33 166,95 нормальні рівні не визначені 20 25 30 35 40 45 Од. вимір. пг/мл Ст. відх. 293,28 Перелік посилань Donskov F, Hokland M, Marcussen N, Torp Madsen HH, von der MH (2006). Monocytes and neutrophils as 'bad guys' for the outcome of interleukin-2 with and without histamine in metastatic renal cell carcinoma--results from a randomised phase II trial. Br. J Cancer 94, 218-226. Echigo T, Hasegawa M, Shimada Y, Inaoki M, Takehara K, Sato S (2006). Both Th1 and Th2 chemokines are elevated in sera of patients with autoimmune blistering diseases. Arch. Dermatol. Res 298, 38-45. Fujii H, Shimada Y, Hasegawa M, Takehara K, Sato S (2004). Serum levels of a Th1 chemoattractant IP-10 and Th2 chemoattractants, TARC and MDC, are elevated in patients with systemic sclerosis. J Dermatol. Sci. 35, 43-51. Haeryfar SM, Berczi I (2001). The thymus and the acute phase response. Cell Mol. Biol. (Noisy. le-grand) 47, 145-156. Leung TF, Ma KC, Hon KL, Lam CW, Wan H, Li CY, Chan IH (2003). Serum concentration of macrophage-derived chemokine may be a useful inflammatory marker for assessing severity of atopic dermatitis in infants and young children. Pediatr. Allergy Immunol. 14, 296-301. Moroni M, Porta C, De AM, Quaglini S, Cattabiani MA, Buzio C (2000). Eosinophils and C4 predict clinical failure of combination immunotherapy with very low dose subcutaneous interleukin-2 and interferon in renal cell carcinoma patients. Haematologica 85, 298-303. Muller AJ, Sharma MD, Chandler PR, Duhadaway JB, Everhart ME, Johnson BA, III, Kahler DJ, Pihkala J, Soler AP, Munn DH, Prendergast GC, Mellor AL (2008). Chronic inflammation that facilitates tumor progression creates local immune suppression by inducing indoleamine 2,3 dioxygenase. Proc Natl. Acad. Sci. U. S. A 105, 17073-17078. Panse J, Friedrichs K, Marx A, Hildebrandt Y, Luetkens T, Barrels K, Horn C, Stahl T, Cao Y, Milde-Langosch K, Niendorf A, Kroger N, Wenzel S, Leuwer R, Bokemeyer C, Hegewisch-Becker S, Atanackovic D (2008). Chemokine CXCL13 is overexpressed in the tumour tissue and in the peripheral blood of breast cancer patients. Br. J Cancer 99, 930-938. Rashid F, Waraich N, Bhatti I, Saha S, Khan RN, Ahmed J, Leeder PC, Larvin M, Iftikhar SY (2010). A pre-operative elevated neutrophil: lymphocyte ratio does not predict survival from oesophageal cancer resection. World J Surg Oncol 8, 1. 21 UA 111952 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 Riesen, WF (2008). Fettstoffwechsel, Referenzbereich. In Labor und Diagnose, L.Thomas, ed. (Frankfurt/Main: TH-Books Verlagsgesellschaft mbH), p. 236. Saeki H, Tamaki K (2006). Thymus and activation regulated chemokine (TARC)/CCL17 and skin diseases. J Dermatol. Sci. 43, 75-84. Sansonno D, Tucci FA, Troiani L, Lauletta G, Montrone M, Conteduca V, Sansonno L, Dammacco F (2008). Increased serum levels of the chemokine CXCL13 and up-regulation of its gene expression are distinctive features of HCV-related cryoglobulinemia and correlate with active cutaneous vasculitis. Blood 112, 1620-1627. Sasaki A, Iwashita Y, Shibata K, Matsumoto T, Ohta M, Kitano S (2006). Prognostic value of preoperative peripheral blood monocyte count in patients with hepatocellular carcinoma. Surgery 139, 755-764. Sekiya T, Yamada H, Yamaguchi M, Yamamoto K, Ishii A, Yoshie O, Sano Y, Morita A, Matsushima K, Hirai K (2002). Increased levels of a TH2-type CC chemokine thymus and activationregulated chemokine (TARC) in serum and induced sputum of asthmatics. Allergy 57, 173-177. Shimada Y, Takehara K, Sato S (2004). Both Th2 and Th1 chemokines (TARC/CCL17, MDC/CCL22, and Mig/CXCL9) are elevated in sera from patients with atopic dermatitis. J Dermatol. Sci. 34, 201-208. Simon D, Simon HU (2007). Eosinophilic disorders. J Allergy Clin Immunol 119, 1291-1300. Su F, Kozak KR, Imaizumi S, Gao F, Amneus MW, Grijalva V, Ng C, Wagner A, Hough G, FariasEisner G, Anantharamaiah GM, Van Lenten BJ, Navab M, Fogelman AM, Reddy ST, Farias-Eisner R (2010). Apolipoprotein A-I (apoA-I) and apoA-I mimetic peptides inhibit tumor development in a mouse model of ovarian cancer. Proc Natl. Acad. Sci. U. S. A. Sugawara N, Yamashita T, Ote Y, Miura M, Terada N, Kurosawa M (2002). TARC in allergic disease. Allergy 57, 180-181. Vallejo AN, Weyand CM, Goronzy JJ (2004). T-cell senescence: a culprit of immune abnormalities in chronic inflammation and persistent infection. Trends Mol. Med 10, 119-124. Vermaat JS, van dT, I, Mehra N, Sleijfer S, Haanen JB, Roodhart JM, Engwegen JY, Korse CM, Langenberg MH, Kruit W, Groenewegen G, Giles RH, Schellens JH, Beijnen JH, Voest EE (2010). Two-protein signature of novel serological markers apolipoprotein-A2 and serum amyloid alpha predicts prognosis in patients with metastatic renal cell cancer and improves the currently used prognostic survival models. Ann Oncol 21, 1472-1481. Wanner, C., P. Schollmeyer, and W. H. Horl. 1988. Serum carnitine levels and carnitine esters of patients after kidney transplantation: role of immunosuppression. Metabolism 37:263-267. Longenecker, B. M., M. Reddish, R. Koganty, and G. D. MacLean. 1993. Immune responses of mice and human breast cancer patients following immunization with synthetic sialyl-Tn conjugated to KLH plus detox adjuvant. Ann N.Y.Acad.Sci. 690:276-291. Sachan, D. S. and W. L. Dodson. 1987. The serum carnitine status of cancer patients. J Am Coll.Nutr. 6:145-150. Banchereau, J., A. K. Palucka, M. Dhodapkar, S. Burkeholder, N. Taquet, A. Rolland, S. Taquet, S. Coquery, K. M. Wittkowski, N. Bhardwaj, L. Pineiro, R. Steinman, and J. Fay. 2001a. Immune and clinical responses in patients with metastatic melanoma to CD34(+) progenitor-derived dendritic cell vaccine. Cancer Res. 61:6451-6458. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 45 50 55 60 1. Спосіб передбачення ефективності імунотерапії у пацієнта, хворого на рак, що включає: визначення рівня маркера Аполіпопротеїн А1 (ApoAl), у зразку, отриманому від згаданого пацієнта, хворого на рак, - в якому рівень зазначеного маркера принаймні на 10 % вищий за рівень маркера у порівнянні з медіанним значенням для даної популяції пацієнтів, хворих на рак, є свідченням ефективності від застосування імунотерапії для згаданого пацієнта, хворого на рак, - в якому пацієнт, хворий на рак, має вид раку, вибраний з нирково-клітинної карциноми (НКК), колоректальної карциноми (КРК), раку шлунка (РШ), меланоми, немілкоклітинного раку легенів (НМРЛ), гліобластоми і аденокарциноми будь-якого виду; - в якому зразок вибраний із цільної крові, периферичної крові або її фракцій, сироватки, лейкоцитарної плівки, пухлинної тканини, лімфатичної рідини, сечі, кісткового мозку, плазми з ЕДТА, гепаринізованої плазми, цитратної плазми, гепаринізованої цільної крові і її заморожених зразків, включаючи заморожену гепаринізовану цільну кров; - де визначення включає щонайменше один метод, вибраний із методів імунохімічних аналізів, імунохімічних аналізів з використанням мікросфер, мультиплексних імунохімічних аналізів, 22 UA 111952 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 ELISA, методів на базі мікрочипів, епігенетичних методів, аналізу експресії, аналізів FACS, загальноприйнятних методів гематології, протеоміки і мас-спектрометрії; - в якому імунотерапія включає вакцинацію протираковою вакциною, де зазначена вакцинація являє собою принаймні одну вакцину, що включає щонайменше один імуногенний пептид, вибраний з групи, яка складається з пептидів відповідно до послідовностей SEQ ID NО: 1-37; та - в якому ефективність вибрана з більш тривалої загальної виживаності, наявності однієї та/або декількох Т-клітинних відповідей на імунотерапію, уповільнення росту пухлини, скорочення пухлини та більш тривалої виживаності без прогресування. 2. Спосіб за п. 1, який додатково включає стадію визначення рівня щонайменше одного маркера, вибраного з групи, що містить хемокін (CXCL13/BCA-1), що притягує В-клітини, нейтрофіли, інтерлейкін 6 (ІЛ-6) та ацилкарнітини з коротким ланцюгом у зразку, отриманому від пацієнта, хворого на рак, причому рівень зазначеного маркера принаймні на 10 % нижчий за рівень маркера у порівнянні з медіанним значенням для даної популяції пацієнтів, хворих на рак, є свідченням ефективності від застосування імунотерапії для згаданого пацієнта. 3. Спосіб за п. 1 або п. 2, у якому зазначена вакцина включає ад'ювант, такий як, наприклад, ГМ-КСФ. 4. Спосіб за будь-яким з пп. 1-3, який додатково включає стадію визначення рівня щонайменше одного маркера, який вибраний із групи, що містить альбумін і прямий білірубін у згаданому зразку від пацієнта, причому рівень зазначеного маркера принаймні на 10 % вищий за рівень маркера у порівнянні з медіанним значенням для даної популяції пацієнтів, хворих на рак, є свідченням ефективності від застосування імунотерапії для згаданого пацієнта, та, необов'язково, визначення рівня маркера інтерлейкіну 33 (ІЛ-33) у зразку, отриманому від пацієнта, хворого на рак, причому рівень зазначеного маркера принаймні на 10 % нижчий за рівень маркера у порівнянні з медіанним значенням для даної популяції пацієнтів, хворих на рак, є свідченням ефективності від застосування імунотерапії для згаданого пацієнта. 5. Спосіб за будь-яким з пп. 1-4, в якому згаданий пацієнт отримує лікування або пройшов попереднє лікування методами, що включають хірургічну операцію, променеву терапію та/або хіміотерапію, і переважно, в якому згаданий пацієнт отримує лікування або пройшов попереднє лікування протираковим препаратом, вибраним з цитокінів і інгібіторів тирозинкінази (ІТК), таких як сорафеніб і сунітиніб та циклофосфамід. 6. Спосіб за будь-яким з пп. 1-5, який додатково включає прогнозування ефективності згаданої імунотерапії для пацієнта, на основі вказаного способу. 7. Спосіб за будь-яким з пп. 1-6, який додатково включає моніторинг ефективності згаданого лікування ракового захворювання у пацієнта, на основі вказаного способу, що включає повторення етапу визначення щонайменше один раз. 8. Спосіб за будь-яким з пп. 1-7, у якому зазначений щонайменше один пептид вибраний із групи, яка складається з послідовностей SEQ ID NО: 1-10. 9. Спосіб за будь-яким з пп. 1-7, у якому зазначений щонайменше один пептид вибраний із групи, яка складається з послідовностей SEQ ID NО: 1, 5, 8, 9 та 11-19. 10. Спосіб за будь-яким з пп. 1-7, у якому зазначений щонайменше один пептид вибраний із групи, яка складається з послідовностей SEQ ID NО: 20-29. 11. Спосіб за будь-яким з пп. 1-7, у якому зазначений щонайменше один пептид вибраний із групи, яка складається з послідовностей SEQ ID NО: 30-37. 23 UA 111952 C2 24 UA 111952 C2 25 UA 111952 C2 26 UA 111952 C2 27 UA 111952 C2 28